Chirurgia nerwu twarzowego w modelu szczurzym w celu zbadania hamowania i regeneracji aksonów
5 maja 2020
Ten protokół opisuje powtarzalne podejście do chirurgii nerwu twarzowego w modelu szczurzym, w tym opisy różnych indukowalnych wzorców urazów.
Protokół ten może pomóc naukowcom w badaniu wyników po uszkodzeniu nerwu twarzowego i metodach poprawy regeneracji w wielu różnych parametrach. Główną zaletą tej techniki jest to, że anatomia szczura umożliwia łatwy dostęp do nerwu twarzowego, a jej duża skala pozwala nam badać wszystkie istotne wzorce urazów. Zastosowania tej techniki rozciągają się w kierunku rehabilitacji pacjentów po uszkodzeniu nerwu twarzowego.
Jako potencjał regeneracyjny szczur zapewnia powtarzalny i zwięzły model eksperymentalny. A ta metoda może zapewnić wgląd w chirurgiczne i medyczne terapie niedowładu nerwu twarzowego lub paraliżu. Można to przetłumaczyć na inne modele głowy i szyi lub inne nerwy obwodowe.
Obsługa pod mikroskopem przy użyciu obu rąk może być wyzwaniem. Polecam ćwiczenie używania wersji lornetkowej pod mikroskopem przed przystąpieniem do sekcji nerwu twarzowego. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca u nogi nałóż maść na oczy szczura i ogol obszar operacyjny.
Ustal metodę identyfikacji szczurów i umieść zwój gazy pod szyją. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę trzema naprzemiennymi peelingami z chlorheksydyną i 70% etanolem i umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym. Manipuluj uchem ipsilateralnym w kierunku przednim i tylnym, aby określić naturalne fałdowanie skóry zausznej.
Użyj ostrza numer 15, aby wykonać dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w zagięciu zausznym. Planowanie i umiejscowienie nacięcia są najważniejszymi krokami zapewniającymi wiarygodną identyfikację nerwu twarzowego przy jednoczesnym zminimalizowaniu rozmiaru rany. Tępo przeciąć bezpośrednią powięź podskórną i umieścić retraktor mikro-Weitlanera, aby zwiększyć ekspozycję tkanki.
Zidentyfikuj przedni mięsień dwubrzuścowy, gdy porusza się w kierunku od niższego do wyższego w kierunku jego przyczepu wzdłuż podstawy czaszki. Delikatnie rozprowadź przez brzuch mięśniowy wzdłuż punktu przyczepu mięśnia, aby odsłonić ścięgno przedniego brzucha dwubrzusznego. Ścięgno pojawi się jako biały wyrostek emanujący z mięśnia z solidnym przyczepem do podstawy czaszki.
Po zidentyfikowaniu mięśnia dwubrzuścowego przedniego i jego ścięgna, wyreguluj retraktor Weitlander, aby jeszcze bardziej cofnąć brzuch mięśniowy. Odsłonięty obszar to trójwymiarowa przestrzeń, w której znajduje się główny pień nerwu twarzowego. Rozetnij wzdłuż nerwu w kierunku niższym dystalnie od wyjścia otworu rylcowo-sutkowego.
Aby wywołać wzorzec zmiażdżenia, użyj kleszczy jubilerskich o gładkiej powierzchni, aby mocno chwycić i ścisnąć nerw, wywierając stały i powtarzalny nacisk przez 30 sekund, aby zapewnić odpowiednie zmiażdżenie. Aby uzyskać prostą transsekcję, chwyć natychmiastowe epineurium pokrywające nerw za pomocą kleszczy o drobnych zębach i użyj ostrych mikronożyczek, aby czysto przeciąć nerw w żądanym miejscu za pomocą jednego cięcia. W przypadku modelu przerwy nerwowej użyj regulowanych suwmiarek, aby ustawić żądaną długość szczeliny nerwowej, aby zapewnić podobne wzorce urazów między zwierzętami i przeciąć nerw, jak właśnie pokazano.
Po dostarczeniu eksperymentalnego urazu, przepłukać ranę sterylnym roztworem soli fizjologicznej i osuszyć tkankę sterylną gazą. przed zamknięciem nacięcia skóry zgodnie z wytycznymi instytucji. Tutaj pokazano obrazowanie na żywo głównego pnia nerwu twarzowego z urazem zmiażdżenia około dwóch do trzech milimetrów dystalnie do punktu rozgałęzienia pierwszego PES u dorosłego transgenicznego szczura Thy1-GFP.
Ocena stopniowego powrotu fluorescencji po jednym, dwóch, trzech i czterech tygodniach po urazie może być wykorzystana jako marker do monitorowania regeneracji nerwów u tych transgenicznych zwierząt. Analiza histomorfometryczna może być wykorzystana do uzyskania obrazów przekrojowych brzeżnego podziału żuchwy, co pozwala na ilościowe określenie średnicy aksonów, ilości zanieczyszczeń, włókien nerwowych, procentu nerwu i pomiarów gęstości. Ważne jest, aby w razie potrzeby często dostosowywać położenie retraktora, aby upewnić się, że odpowiednie nerwy anatomiczne są widoczne podczas identyfikacji nerwu twarzowego.
Po tej procedurze można pobrać odpowiednie nerwy i mięśnie do analizy immunohistochemicznej w celu oceny stopnia regeneracji w stosunku do innych grup eksperymentalnych. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom do badania wyników funkcjonalnych po uszkodzeniu nerwu twarzowego. W szczególności, jak wpłynąć na zjawisko synkinezy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje powtarzalne podejście do operacji nerwu twarzowego w modelu szczura, ze szczególnym uwzględnieniem wzorców uszkodzeń i efektów regeneracyjnych. Umożliwia on badanie technik chirurgicznych oraz terapii medycznych w zakresie rehabilitacji po uszkodzeniu nerwu twarzowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Medycyna regeneracyjna
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Model szczura zapewnia łatwy dostęp do nerwu twarzowego.
- Ta technika chirurgiczna może pomóc w ocenie uszkodzeń nerwów oraz metod ich regeneracji.
- Cechy anatomiczne szczura umożliwiają szczegółowe badanie różnych wzorców uszkodzeń.
Cel badania
- Ocena podejść terapeutycznych w przypadku niedowładu lub porażenia nerwu twarzowego.
- Pogłębienie zrozumienia procesu regeneracji po urazach nerwu twarzowego.
- Opracowanie szczegółowej techniki chirurgicznej, która jest powtarzalna w różnych badaniach.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano model szczura do interwencji chirurgicznej na nerwie twarzowym.
- Kluczowe procedury obejmują zmiażdżenie oraz przecięcie nerwu, z określonymi krokami chirurgicznymi w celu zapewnienia powtarzalności.
- Do monitorowania efektów regeneracji zastosowano obrazowanie na żywo oraz analizy histomorfometryczne.
- Kładzie się nacisk na metodyczną dysekcję pod mikroskopem, która wymaga odpowiednich umiejętności i przygotowania.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja i manipulacja nerwem twarzowym umożliwiają ocenę procesów regeneracyjnych.
- Obrazowanie fluorescencyjne oraz analiza histomorfometryczna zapewniają mierzalne wskaźniki regeneracji nerwu.
- Technika ta dostarcza istotnych informacji na temat zjawisk synkinezy po uszkodzeniu nerwu.
Wnioski
- Niniejsza praca ustanawia podstawowy protokół analizy uszkodzenia i regeneracji nerwu twarzowego.
- Umożliwia ona badaczom zgłębianie efektów funkcjonalnych oraz podejść terapeutycznych w rehabilitacji neurologicznej.
- Zastosowana metodologia wykazuje istotny potencjał w zakresie szerszych zastosowań w badaniach nad nerwami obwodowymi.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model uszkodzenia nerwu twarzowego u szczura stanowi powtarzalną platformę do oceny regeneracji i inhibicji aksonalnej, wspierając walidację celów w rozwoju terapii neuroregeneracyjnych. Jego skalowalność i dostępność anatomiczna umożliwiają spójną ocenę wzorców uszkodzeń oraz odpowiedzi regeneracyjnych, co ułatwia prekliniczne ograniczanie ryzyka w przypadku kandydatów na leki neurotroficzne lub antyinhibicyjne. Model ten łączy fazę odkryć z badaniami translacyjnymi, oferując mierzalne odczyty histomorfometryczne i funkcjonalne, istotne dla strategii naprawy nerwu twarzowego u ludzi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów hamowania aksonów oraz szlaków regeneracyjnych po zdefiniowanych urazach typu zmiażdżenie, przecięcie lub przerwa nerwu.
- Wartość operacyjna: Wspiera spójne dostarczanie neuroaktywnych odczynników lub komórek w celu oceny oddziaływania na cel i modulacji szlaków.
- Wartość prognostyczna: Histomorfometryczna kwantyfikacja średnicy aksonów, gęstości włókien i usuwania szczątków dostarcza obiektywnych wskaźników skuteczności celu oraz minimalizacji ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Gotowość do analizy: Pozwala na generowanie standaryzowanych modeli uszkodzeń, odpowiednich do wysokoreprodukowalnego przesiewania związków pro-regeneracyjnych lub antagonistów hamujących.
- Wyniki ilościowe: Obrazowanie na żywo aksonów znakowanych fluorescencyjnie oraz analiza histomorfometryczna umożliwiają podłużne, ilościowe śledzenie regeneracji.
- Skalowalność: Model szczurzy pozwala na manipulacje chirurgiczne w obrębie segmentów od wewnątrzczaszkowych po pozaczaszkowe, co wspiera ewaluację wieloparametryczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia ocenę powrotu funkcji oraz łagodzenia synkinez, co jest zgodne z punktami końcowymi w klinicznej rehabilitacji nerwu twarzowego.
- Modelowanie przedkliniczne: Umożliwia ocenę manipulacji w obrębie ośrodkowych lub obwodowych organów wykonawczych oraz terapii komórkowych w systemie nerwu obwodowego istotnym dla danej jednostki chorobowej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Niezawodne wskaźniki przeżywalności oraz spójność międzygatunkowa wspierają decyzje typu go/no-go przed przejściem do badań na gatunkach wyższego rzędu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z procesami badawczymi, umożliwiając walidację celu poprzez kontrolowane uszkodzenie nerwu, przejście do opracowywania testów do screeningu związków oraz wsparcie oceny przedklinicznej terapii regeneracyjnych za pomocą pomiarów wyników funkcjonalnych i strukturalnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących inhibitorów i promotorów wzrostu aksonów za pomocą zestandaryzowanych paradygmatów urazu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne modele urazu nerwu do oceny wpływu związków na kinetykę i wierność regeneracji.
- Analityka: Odczyty histomorfometryczne i fluorescencyjne dostarczają mierzalnych danych do analizy zależności dawka-odpowiedź oraz zaangażowania celu.
- Badania translacyjne: Łączy wskaźniki regeneracji aksonów z efektami funkcjonalnymi, takimi jak synkineza, co potwierdza istotność kliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku platformę chirurgiczną do iteracyjnego testowania różnych modalności terapeutycznych i punktów czasowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach nad regeneracją aksonów dzięki mierzalnym i powtarzalnym wskaźnikom uszkodzenia i regeneracji.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane techniki chirurgiczne oraz protokoły oceny pooperacyjnej zwiększają spójność między laboratoriami i niezawodność danych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia wczesne podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie biologii celu i zmniejszenie ryzyka niepowodzenia w późniejszych etapach programów neuroregeneracyjnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do terapii neuroregeneracyjnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną modulację celu w klinicznie istotnym modelu nerwu obwodowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii oraz znajomości neuroanatomii gryzoni pod nadzorem stereomikroskopowym.
- Zależność od specjalistycznych narzędzi, w tym mikroretraktorów Weitlanera, pincet jubilerskich, mikronożyczek i regulowanych suwmiark do standaryzowanego wywoływania urazów.
- Wymaga zastosowania transgenicznych linii reporterowych (np. Thy1-GFP) lub przetwarzania immunohistochemicznego w celu podłużnego śledzenia aksonów i analizy histomorfometrycznej.
- Konieczność stosowania protokołów opieki pooperacyjnej w celu zapewnienia przeżywalności szczurów i zminimalizowania zmiennych zakłócających ocenę regeneracji.
- Ograniczona podatność genetyczna w porównaniu z modelami mysimi może ograniczać analizę mechanizmów poprzez podejścia oparte na nokaucie genów lub nadekspresji.
