Ważne punkty końcowe i markery proliferacyjne do oceny uszkodzenia jelita cienkiego i adaptacji przy użyciu mysiego modelu zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią

Ten model zapalenia błony śluzowej wywołanego chemioterapią może być wykorzystany do określenia ważnych punktów końcowych i proliferowanych markerów uszkodzenia jelita cienkiego i hiperproliferacji kompensacyjnej u myszy. Ta metoda jest efektywna czasowo i kosztowo oraz łatwa do przeprowadzenia. Dzięki ustandaryzowanej metodzie, takiej jak ta, łatwiej jest porównać analityczne punkty końcowe z kilkoma wariantami.

W przypadku indukcji zapalenia błony śluzowej 5-Floraracyl lub 5FU należy załadować strzykawkę o pojemności 1 mililitra wyposażoną w igłę o wymiarach 27 na 19 milimetrów o odpowiedniej objętości 5FU i ręcznie przytrzymać mysz biorcy. Trzymając mysz w mocnym, ale delikatnym uścisku, odsłoń brzuszną stronę zwierzęcia i włóż igłę do jamy śródporodowej w jednym z dolnych kwadrantów brzucha. Następnie należy odessać, aby zapewnić prawidłowe umieszczenie igły i wstrzyknąć 5FU.

Przy odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym, oznaczaniu ilościowym 4-bromo-deoksyurydyny lub BrdU, zważyć zranioną mysz zwierzęcą o wartości 5FU i dostarczyć 5 miligramów na kilogram BrdU we wstrzyknięciu dootrzewnowym do dygestoria. 150 minut po injecji BrdU potwierdź brak reakcji na szczypanie palca, zapisz wagę znieczulonej myszy i ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Wykonaj laparotomię, aby odsłonić jamę brzuszną i wykonaj nacięcie jamy klatki piersiowej w celu wprowadzenia odmy opłucnowej.

Przetnij górną część odźwiernika i ostrożnie wyciągnij tkankę jelitową z dala od zwierzęcia, aż dojdziesz do jelita ślepego. Za pomocą kleszczy delikatnie zaciśnij proksymalne światło i użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25, aby przepłukać jelito cienkie solą fizjologiczną. Następnie umieść opróżnione jelito na czystej bibułce, aby ostrożnie usunąć nadmiar roztworu soli.

W celu pobrania tkanek należy pobrać jelito cienkie od zwierzęcia, któremu wstrzyknięto strzyknięcie, jak właśnie pokazano, i zapisać wagę zaczerwienionej tkanki. Po przetworzeniu histologicznym tkankę można zobrazować pod 10-krotnym obiektywem mikroskopu świetlnego podłączonego do kamery w celu uzyskania histologicznych zdjęć pobranej tkanki. Aby zmierzyć obszar komórek immunoreaktywnych BrdU, otwórz interesujący obraz na obrazie J i otwórz obraz mikrometru stolika.

Użyj narzędzia do zaznaczania linii prostej, aby narysować linię prostą na obrazie mikrometrycznym, aby zdefiniować znaną odległość i wybrać opcję ustaw skalę w menu analizy. Wprowadź wartość w polu znana odległość i zdefiniuj jednostkę długości w polu Jednostka długości. Otwórz interesujący Cię obraz, aby zmierzyć obszar komórek immunoreaktywnych BrdU na kryptę, a następnie ustaw kolorową grafikę na 8-bitową w menu typu obrazu.

Zwiększ kontrast obrazu przy wzmocnionym kontraście procesowym i ustaw nasycone piksele na 0,4%Zastosuj próg do obrazu, aby podzielić immunopozytywność i wybierz opcję Dostosuj obraz. Wybierz opcję próg i kolor czerwony, przesuwając pasek progu, aby wybrać próg o wartości około 10 do 20 procent. Następnie wybierz dobrze zorientowaną kryptę i użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby zaznaczyć obszar wokół niej.

Aby zmierzyć obszar progowy, otwórz kartę analizy i wybierz opcję analizuj cząstki. W oknie analizy cząstek ustaw rozmiar na 20 do nieskończoności, a następnie kliknij pole jednostek pikseli. Ustaw okrągłość na zero na jeden i ustaw show na kontury.

Następnie kliknij pola wyświetlania wyników, podsumowania i uwzględnienia otworów. Wyniki pomiarów zostaną wyświetlone w oknie podsumowania. Aby zmierzyć głębokość krypty, otwórz obraz w Zen Light i połącz się z kamerą.

Rób zdjęcia w trybie aparatu z obiektywem 20x i przełącz się w tryb przetwarzania, aby otworzyć migawkę. Przełącz się do widoku miary. Użyj narzędzia linii, aby rozpocząć linię na dole dobrze zorientowanej krypty, kończąc linię na górze krypty.

Następnie wyeksportuj pomiary i oblicz średnią głębokości krypty i wypełnienia jako wysokość. Masa jelita cienkiego zmniejsza się od 2 do 4 dnia, co sugeruje utratę masy enterocytów. Warto zauważyć, że w dniu 5 waga nie różni się znacząco od masy ciała w dniu 0 u leczonych zwierząt.

Mierzona proliferacja przez inkorporację BrdU jest prawie zniesiona w dniach 1 i 2, ale w dniach 4 i 5 następuje około cztero- i pięciokrotny wzrost ich proliferacji, odpowiednio. Tę hiperproliferację obserwuje się również podczas pomiaru głębokości krypty. W fazie regeneracyjnej zapalenia błony śluzowej istnieje silna korelacja między włączeniem BrdU a głębokością krypty, której nie obserwuje się w ostrej fazie, co sugeruje, że użycie głębokości krypty jako punktu końcowego może być odpowiednie w ostrej fazie zapalenia błony śluzowej.

Myszy transgeniczne, z niewystarczającym wydzielaniem limfocytów L, wykazują znaczną utratę masy ciała i spadek masy jelita cienkiego w fazie rekonwalescencji, w porównaniu z obserwowanym u dzikich myszy typu 5-FU. Co więcej, myszy transgeniczne nie wykazują kompensacyjnej hiperproliferacji, ponieważ krypty są znacznie krótsze niż u myszy typu dzikiego i zdrowych osób z grupy kontrolnej. Próbując wykonać tę procedurę, upewnij się, że całkowicie opróżniłeś jelito cienkie i usunąłeś nadmiar soli fizjologicznej przed zważeniem tkanki, aby uzyskać tylko masę jelita cienkiego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać, zbierać i określać ważne punkty końcowe uszkodzenia jelita cienkiego. I aby skutecznie uzyskiwać powtarzalne dane. Nie zapominaj, że praca ze związkami chemicznymi, takimi jak 5FU i BrdU, może być niebezpieczna i że podczas wykonywania tych zabiegów należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i dygestoriów.