Name: Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę chemogenetycznej manipulacji obwodami nerwowymi w celu badania proliferacji komórek macierzystych w dorosłym hipokampie. Technika ta pozwala precyzyjnie regulować aktywność obwodów przy minimalnym stresie zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

L.J.Q. był wspierany przez Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach Dodatku do Różnorodności R01MH111773 oraz grant szkoleniowy T32 T32NS007431-20. Projekt ten był wspierany z grantów przyznanych J.S. z NIH (MH111773, AG058160 i NS104530).

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132 (4), 645-660 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hippocampal+neurogenesis+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans.</a> Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).</li>
<li>Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+is+Sufficient+to+Reduce+Anxiety+and+Depression-Like+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors.</a> Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, (2009).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).</li>
<li>Anacker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+confers+stress+resilience+by+inhibiting+the+ventral+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus.</a> Nature. , 1(2018).</li>
<li>Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Phenotypic+Characterization+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Multiple+Labeling+with+Antibodies+from+the+Same+Host+Species+to+Study+Adult+Hippocampal+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).</li>
<li>Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+S-Phase+Labeling+of+Dividing+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optogenetic+Stimulation+of+the+Rodent+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+Optogenetics+in+Neural+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer Optogenetics in Neural Systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+Cells+Control+Adult+Neural+Stem+Cell+Quiescence+and+Maintenance+through+a+Dynamic+Balance+between+Direct+and+Indirect+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways.</a> Neuron. , 1-18 (2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+Stereotaxic+Surgery+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+5-ethynyl-2+%E2%80%B2+-deoxyuridine+staining+as+a+sensitive+and+reliable+method+for+studying+cell+proliferation+in+the+adult+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system.</a> Brain Research. 1319, 21-32 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).</li>
<li>Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Thompson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadd+Agonist+21+%28C21%29+Is+an+Effective+Agonist+for+Muscarnic-Based+Dreadds+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacology+%26+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo.</a> ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Celem tego protokołu jest ocena, w jaki sposób manipulowanie określonymi obwodami neuronalnymi reguluje neurogenezę dorosłego hipokampa in vivo przy użyciu szeregu technik immunohistochemicznych. Testowanie zależnej od aktywności regulacji neurogenezy dorosłych, w której pośredniczą określone obwody neuronalne, jest cenną techniką o dużym potencjale modyfikacji w celu badania różnorodnego zakresu obwodów neuronalnych. Powodzenie tego typu eksperymentów zależy od wielu czynników, w tym dokładnego dostarczania wirusa, właś...

Neurogeneza dorosłego człowieka to proces biologiczny, w którym nowe neurony rodzą się u dorosłego człowieka i integrują się z istniejącymi sieciami neuronowymi1. U ludzi proces ten zachodzi w zakręcie zębatym (DG) hipokampa, gdzie każdego dnia rodzi się około 1400 nowych komórek2. Komórki te znajdują się w wewnętrznej części DG, w której znajduje się nisza neurogenna, zwana strefą subgranularną (SGZ). W tym przypadku dorosłe nerwowe komórki macierzyste hipokampa (NSC) przechodzą złożony proces rozwojowy, aby stać się w pełni funkcjonalnymi neuronami, które przyczyniają się do regulacji określonych funkcji mózgu, w tym uczenia się i pamięci, regulacji nastroju i reakcji na stres3,4,5,6. Aby wpływać na zachowania, dorosłe NSC są silnie regulowane przez różne bodźce zewnętrzne w sposób zależny od aktywności, reagując na szereg lokalnych i dystalnych sygnałów chemicznych. Te sygnały chemiczne obejmują neuroprzekaźniki i neuromodulatory i działają w sposób specyficzny dla obwodu z różnych obszarów mózgu. Co ważne, konwergencja tych sygnałów chemicznych w NSC w całym obwodzie pozwala na unikalną i precyzyjną regulację aktywacji, różnicowania i decyzji dotyczących losu komórek macierzystych.
Jednym z najskuteczniejszych sposobów badania regulacji obwodów u dorosłych NSC in vivo jest połączenie analizy immunofluorescencji z manipulacjami obejmującymi cały obwód. Analiza immunofluorescencyjna dorosłych NSC jest powszechnie stosowaną techniką, w której przeciwciała przeciwko określonym markerom molekularnym są wykorzystywane do wskazania stadium rozwojowego dorosłych NSC. Markery te obejmują: nestynę jako radialną komórkę glejową i wczesny marker progenitorowy neuronów, Tbr2 jako pośredni marker progenitorowy oraz dcx jako marker neuroblastów i niedojrzałych neuronów7. Dodatkowo, podając analogi tymidyny, takie jak BrdU, CidU, Idu i Edu, populacje komórek przechodzące fazę S mogą być indywidualnie oznaczane i wizualizowane8,9,10. Łącząc te dwa podejścia, można zbadać szeroki zakres pytań, począwszy od tego, w jaki sposób proliferacja jest regulowana na określonych etapach rozwoju, a skończywszy na tym, jak różne sygnały wpływają na różnicowanie NSC i neurogenezę.
Istnieje kilka opcji skutecznego manipulowania obwodami neuronalnymi, w tym stymulacja elektryczna, optogenetyka i chemogenetyka, każda z własnymi zaletami i wadami. Stymulacja elektryczna obejmuje rozległą operację, w której elektrody są wszczepiane do określonego obszaru mózgu, a następnie są wykorzystywane do przesyłania sygnałów elektrycznych w celu modulowania docelowego obszaru mózgu. Jednak w tym podejściu brakuje zarówno specyficzności komórkowej, jak i obwodowej. Optogenetyka polega na dostarczaniu cząsteczek wirusa, które kodują receptor aktywowany światłem, który jest stymulowany przez laser emitowany przez wszczepiony światłowód, ale wymaga rozległych manipulacji, dużych kosztów i skomplikowanych operacji11. Chemogenetyka polega na dostarczaniu cząstek wirusa, które kodują receptor projektanta aktywowany wyłącznie przez lub DREADDs, które są następnie aktywowane przez specyficzny i biologicznie obojętny ligand znany jako N-tlenek klozapiny (CNO)12. Zaletą wykorzystania DREADD do manipulowania lokalnymi obwodami neuronalnymi, które regulują dorosłe NSC, jest łatwość i różne drogi podawania CNO. Pozwala to na mniej czasochłonne podejście przy ograniczonym obchodzeniu się ze zwierzętami, które można łatwo dostosować do długoterminowych badań w celu modulacji obwodów neuronalnych.
Podejście opisane w tym protokole to obszerny zbiór różnych protokołów wymaganych do skutecznego zbadania regulacji obwodów neurogenezy dorosłego hipokampa, który łączy zarówno techniki immunofluorescencji, jak i manipulacje obwodami za pomocą chemogenetyki. Metoda opisana w poniższym protokole jest odpowiednia do jednoczesnego stymulowania lub hamowania jednego lub wielu obwodów in vivo w celu określenia ich funkcji regulacyjnej w neurogenezie dorosłych. Takie podejście najlepiej sprawdza się, jeśli pytanie nie wymaga wysokiego stopnia rozwiązania czasowego. Pytania wymagające precyzyjnej kontroli czasowej stymulacji/hamowania przy określonej częstotliwości można lepiej rozwiązać za pomocą optogenetics13,14. Opisane tutaj podejście można łatwo zaadaptować do długoterminowych badań przy minimalnym obchodzeniu się ze zwierzętami, zwłaszcza tam, gdzie stres jest głównym problemem.

<table><tbody><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>48 Płytka studzienkowa</td><td>Denville Scientific</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-etynylo-2'-deoksyurydyna (Edu)</td>Alkohol <td>NE08701</td><td></td> <td>karbosynterowy</td></tr><tr><td>70% Izopropyl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki nasączone alkoholem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 Azide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>Gniazdo przeciw kurczakom</td><td>Aves</td><td>NES; RRID: AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Koza DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz Tbr2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-4875-82; RRID: AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betadyny (powidon-jod)</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy [.1M] Kwas cytrynowy (21g/L kwas cytrynowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>N-tlenek klozapiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie konfokalne (Zen Black)</td><td>Zeiss Microscopy</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 ()</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II) Pentahydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Amazon</td> Szkiełko nakrywkowe Denville <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>Delikatna chusteczka do zadań Kimwipes</td><td>Wiertło Kimtech Science</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>Igła Hamilton 2 cale</td><td>Hmailton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton 5 &mu; L Model 75 RN</td><td>Hmailton Company</td><td>Nr ref.: 87931</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka szybkoobrotowa</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>Pompa infuzyjna</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej do wstrzykiwań</td><td>Mountainside Health Care</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD Ultra-drobne strzykawki do insuliny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax dla małych zwierząt</td><td>Instrumenty KOPF</td><td>Model 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Mikroskopia</td><td></td><td></td>Zeiss</tr><tr><td>Nair (produkt do depilacji)</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldahyde 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>158127 Plus Naładowana szkiełko</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Maść weterynaryjna</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Rack 20 suwaków Mikroskopia</td><td>elektronowa Science</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na stojak na slajdy</td><td>Nauka o mikroskopii elektronowej</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza dla małych zwierząt</td><td>K& H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen końcówka 4 mm</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel chirurgiczny</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trójsodowy [0,1 M] Cytrynian trójsodowy (29,4 g/l cytrynian trójsodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vet Bond Klej tkankowy</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Neurogeneza u dorosłych jest dynamicznym procesem, w którym nowo aktywowane nerwowe komórki macierzyste (NSC) w strefie subkrystalicznej (SGZ) zakrętu zębatego (DG) generują nowe neurony, które integrują się z istniejącym obwodem neuronalnym i przyczyniają się do określonych funkcji hipokampa. Co ważne, neurogeneza dorosłych jest wysoce podatna na bodźce środowiskowe, co pozwala na zależną od aktywności regulację różnych funkcji poznawczych. Szeroki zakres obwodów neuronalnych z różnych regionów mózgu koordynuje te złożone funkcje poznawcze. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób określone obwody neuronalne regulują neurogenezę dorosłych. W tym miejscu opisujemy protokół manipulowania aktywnością obwodów nerwowych za pomocą receptora projektanta aktywowanego wyłącznie przez technologię (DREADDs), która reguluje NSC i nowonarodzone potomstwo u gryzoni. Ten kompleksowy protokół obejmuje stereotaktyczne wstrzykiwanie cząstek wirusa, chemogenetyczną stymulację określonych obwodów nerwowych, podawanie analogu tymidyny, przetwarzanie tkanek, znakowanie immunofluorescencyjne, obrazowanie konfokalne i analizę obrazową różnych etapów nerwowych komórek prekursorowych. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące technik pobierania antygenu stosowanych do wizualizacji NSC i ich potomstwa oraz opisuje prosty, ale skuteczny sposób modulowania obwodów mózgowych za pomocą N-tlenku klozapiny (CNO) lub wody pitnej zawierającej CNO i wirusów eksprymujących DREADD. Siła tego protokołu polega na jego zdolności adaptacyjnej do badania różnorodnego zakresu obwodów neuronalnych, które wpływają na neurogenezę dorosłych pochodzącą z NSC.

Po przeprowadzeniu procedur eksperymentalnych opisanych powyżej (Rycina 1A,B) byliśmy w stanie określić wpływ stymulacji kontralateralnych rzutów komórek mchowych na niszę neurogenną w hipokampie. Wykorzystując wirusa DREADD sprzężony z białkiem Gq w sposób zależny od Cre, w połączeniu z linią komórek mchowych opisanych za pomocą 5-HT2A Cre, mogliśmy selektywnie aktywować rzuty pobudzające komórek mchowych na kontralateralny DG i stwierdziliśmy, że silna stymulacja komórek m...

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

Protokół ten może odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób różne obwody w mózgu regulują neurogenezę u dorosłych, a w szczególności, jak stymulowanie lub hamowanie obwodów nerwowych wpływa na proliferację dorosłych nerwowych komórek macierzystych. Zaletą tej techniki jest to, że jest ona w stanie ukierunkować się na pożądane obwody neuronalne, a także zmniejszyć ilość stresu wprowadzanego do zwierząt. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób różne obwody mózgowe regulują neurogenezę dorosłych, w szczególności, w jaki sposób określone typy komórek, które uwalniają pewne neuroprzekaźniki, regulują proliferację dorosłych nerwowych komórek macierzystych.Aby rozpocząć tę procedurę, umieść skrawki tkanki w PBS i zamontuj od pięciu do ośmiu odcinków na dodatnio naładowanym szkiełku w kolejności szeregowej od przodu do tyłu. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut i całkowicie przylegaj do szkiełek. Następnie przygotuj bufor cytrynianowy w pojemniku.Podgrzej bufor cytrynianu w kuchence mikrofalowej przez pięć minut, aż roztwór się zagotuje. W międzyczasie umieść zamontowane sekcje w szklanym uchwycie na prowadnice. P

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Neuronalne komórki macierzyste przygotowano z hipokampa dorosłych, niehibernujących, rocznych wiewiórek arktycznych (AGS). Komórki te można namnażać w wielu pasażach, różnicować i utrzymywać jako kulturę neuronów i gleju w stosunku bliskim 50:50.

Wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa wiewiórki syberyjskiej

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Podczas neurogenezy dorosłego hipokampa, wyraźny zestaw markerów genetycznych ulega ekspresji, gdy spokojna nerwowa komórka macierzysta sekwencyjnie rozwija się i rozwija w funkcjonalnie zintegrowany neuron w obwodzie. Korzystając z indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu, typy komórek progenitorowych, które w innym przypadku są trudne do wykrycia, są identyfikowane z większą skutecznością.

Odzyskiwanie antygenu wywołane ciepłem: skuteczna metoda wykrywania i identyfikacji typów komórek progenitorowych podczas neurogenezy dorosłego hipokampa

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Mózg psa jest cennym modelem do badania neurogenezy dorosłych. Przedstawiono tutaj protokoły izolowania i namnażania nerwowych komórek prekursorowych hipokampa dorosłych psów z pierwotnej tkanki mózgowej.

Izolacja i ekspansja prekursorów neuronalnych hipokampa u dorosłych psów

Sekcja kriogeniczna pozwala na świeże, zamrożone przygotowanie największej niszy neurogennej w mysim mózgu do głębokiej ilościowej analizy proteomu. Metoda jest precyzyjna, skuteczna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek. Dlatego idealnie nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy, a także innych narządów, regionów i gatunków.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Tutaj opisujemy protokół inżynierii chemicznie przeprogramowanych komórek macierzystych w celu osiągnięcia precyzyjnej modulacji neuronalnej poprzez różnicowanie tych komórek w dopaminergiczne komórki prekursorowe, przeszczepianie ich do mysich modeli choroby Parkinsona oraz ocenę wyników behawioralnych i elektrofizjologicznych w celu potwierdzenia udanej integracji i funkcjonalnej skuteczności przeszczepionych komórek.

Regulacja chemogenetyczna w przeprogramowanych komórkach prekursorowych pochodzących z komórek macierzystych w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych

Poznaj metodę chemogenetycznej manipulacji obwodami nerwowymi w celu badania proliferacji komórek macierzystych w dorosłym hipokampie. Technika ta pozwala precyzyjnie regulować aktywność obwodów przy minimalnym stresie zwierząt.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Przeglądaj więcej filmów