Name: Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Poznaj produkcję wektorów lentiwirusowych z CRISPR-dCas9-DNMT3A do edycji epigenomu w neuronach pochodzących z hiPSC. Ta metoda umożliwia precyzyjną regulację ekspresji genów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Kahn Neurotechnology Development Award (dla O.C.) oraz National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NIH/NINDS) (R01 NS085011 do O.C.).

<ol><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+epigenome%3A+technologies+for+programmable+transcription+and+epigenetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation.</a> Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Scale+CRISPR-Mediated+Control+of+Gene+Repression+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Horlbeck, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosomes+impede+Cas9+access+to+DNA+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li>
<li>Holtzman, L., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+the+Epigenome%3A+Reshaping+the+Genomic+Landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+tunable+human+gene+activation+by+combinations+of+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>McDonald, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogrammable+CRISPR%2FCas9-based+system+for+inducing+site-specific+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation.</a> Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).</li>
<li>Huang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+epigenome+editing+using+CRISPR-Cas+SunTag-directed+DNMT3A%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A.</a> Genome Biology. 18 (1), 176(2017).</li>
<li>Vojta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+the+CRISPR-Cas9+system+for+targeted+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation.</a> Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).</li>
<li>Razin, A., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+and+Subcellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in epigenetic control of gene expression.</a> Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).</li>
<li>Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+activation+of+unintegrated+HIV-1+genomes+by+gut-associated+short+chain+fatty+acids+and+its+implications+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+SNCA+Expression+by+Targeted+Editing+of+DNA+Methylation%3A+A+Potential+Strategy+for+Precision+Therapy+in+PD%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD.</a> Molecular Therapy. , (2018).</li>
<li>Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+regulates+alpha-synuclein+expression+and+is+decreased+in+Parkinson%27s+disease+patients%27+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+methyltransferase+inhibitor%2C+5-aza-2%27-deoxycytidine%2C+exacerbates+neurotoxicity+and+upregulates+Parkinson%27s+disease-related+genes+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).</li>
<li>Matsumoto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+demethylation+enhances+alpha-synuclein+expression+and+affects+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> PLOS One. 5 (11), e15522(2010).</li>
<li>Desplats, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+sequesters+Dnmt1+from+the+nucleus%3A+a+novel+mechanism+for+epigenetic+alterations+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).</li>
<li>Ai, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomethylation+of+SNCA+in+blood+of+patients+with+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease.</a> Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).</li>
<li>Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+SNCA+gene+expression%3A+implications+to+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies.</a> Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).</li>
<li>Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-Deficient+Lentiviral+Vector+as+an+All-in-One+Platform+for+Highly+Efficient+CRISPR%2FCas9-Mediated+Gene+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+alpha-synuclein+3%27+untranslated+region+and+its+corresponding+microRNAs+in+relation+to+Parkinson%27s+disease+compared+to+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies.</a> Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).</li>
<li>Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+the+SNCA+locus+exacerbates+neuronal+nuclear+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging.</a> Human Molecular Genetics. , (2018).</li>
<li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+involving+CNS+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical applications involving CNS gene transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li>
<li>Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+gene+transfer+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods for gene transfer to the central nervous system.</a> Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).</li>
<li>Vijayraghavan, S., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Production+of+Integrase-deficient+Lentiviral+Vectors+for+CRISPR%2FCas9-mediated+Gene+Knockout+in+Dividing+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56915(2017).</li>
<li>Bayer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+U3+deletion+causes+increased+in+vivo+expression+from+a+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).</li>
<li>Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bisulfite pyrosequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).</li>
<li>Truong, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intein-mediated+split-Cas9+system+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy.</a> Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9.</a> Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+using+Staphylococcus+aureus+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.</a> Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).</li>
<li>Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+regulatory+element+is+associated+with+a+nuclease-hypersensitive+site+in+the+pol+gene+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1.</a> Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).</li>
<li>Van Lint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+downstream+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+transcription+start+site+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity.</a> Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).</li>
<li>Goffin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+in+the+pol+gene+intragenic+regulatory+region+of+HIV-1+are+important+for+virus+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+zinc+finger+fusions+targeting+Sp1-binding+sites+and+the+trans-activator-responsive+element+potently+repress+transcription+and+replication+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).</li>
<li>Kantor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notable+reduction+in+illegitimate+integration+mediated+by+a+PPT-deleted%2C+nonintegrating+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).</li>
</ol>

Uniwersytet Duke'a złożył tymczasowy wniosek patentowy związany z tym badaniem.

LV zaczęły pojawiać się jako narzędzie z wyboru do edycji epigenomu, zwłaszcza w kontekście chorób genetycznych, głównie ze względu na ich zdolność do (i) przyjmowania dużych ładunków DNA oraz (ii) wydajnej transdukcji szerokiego zakresu komórek dzielących się i niedzielących się. Duża skuteczność pakowania LV jest szczególnie korzystna w zastosowaniach obejmujących pakowanie systemów CRISPR/dCas9, które są ponadwymiarowe. Z tej perspektywy LV stanowią platformę z wyboru do dostarczania kompleksowych systemów CRISPR/Cas9...

Ostatnio opracowano wiele platform do edycji epigenomu, które celują w dowolne sekwencje DNA w regionach kontrolujących ekspresję genów1,2. Stworzone narzędzia do edycji epigenomu mają na celu (i) regulację transkrypcji, (ii) zmianę potranslacyjnych modyfikacji histonów, (iii) modyfikację metylacji DNA oraz (iv) modulację interakcji elementów regulatorowych. Podejście polegające na zakotwiczeniu modyfikatorów transkrypcji/chromatyny w dezaktywowanym (martwym) Cas9 (dCas9) powstało na podstawie wcześniej opracowanych platform edycji epigenomu, takich jak białka palca cynkowego (ZFP) i efektory podobne do aktywatorów transkrypcji (TALE), zawierające silną domenę efektorową transkrypcji (ED) połączoną z zaprojektowaną domeną wiążącą DNA (DBD)3. Wyniki pożądanego fenotypu, takie jak aktywacja lub represja, są definiowane przez cząsteczkę efektorową zakotwiczoną w endogennych loci (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Aby stworzyć programowalne aktywatory transkrypcji, moduły dCas9/gRNA są połączone z VP164,5,6 (Rysunek 1A), domeną aktywacji wirusa, która rekrutuje Pol II i ogólną maszynerię transkrypcyjną. Modyfikacja tego systemu obejmowała VP64, tetramer domen VP16, zapewniający jeszcze bardziej solidny współczynnik aktywacji5,6. System został z powodzeniem wykorzystany do aktywacji regionów kodujących i niekodujących poprzez ukierunkowanie na promotory i elementy regulacyjne. Co ważne, mimo że cząsteczki VP64 nie modyfikują bezpośrednio struktury chromatyny w regionie docelowym, rekrutują modyfikatory chromatyny, które wiążą wyniki w osadzaniu się znaczników aktywnych (euchromatyny), w tym jako acetylacja H3/H4 i H3-K4 di/trimetylacja5,6. Oprócz VP64, podjednostka p65 ludzkiego kompleksu NF-κB została podłączona do modułu dCas9/gRNA7. Co ciekawe, wiązanie tych efektorów z regionami przed miejscami rozpoczęcia transkrypcji (TSS) i w obrębie promotorów powoduje silną indukcję genów. Niemniej jednak, efektory VP64 i p65 mogą również wywierać efekty aktywacyjne, będąc połączonym z regionami znajdującymi się poniżej TSS i w dystalnych wzmacniaczach7,8. Aby wywołać bardziej solidną odpowiedź transkrypcyjną, należy zrekrutować wiele fuzji dCas9-VP64 lub dCas9-p65 do jednego docelowego locus9,10. W związku z tym niedawny rozwój aktywatorów nowej generacji, które rekrutują wiele domen efektorowych przez pojedynczy kompleks dCas9-gRNA, takich jak SunTag, zaowocował większą zdolnością aktywacji w porównaniu z odpowiednikami fuzji dCas9-VP6411,12. Ulepszoną aktywację transkrypcyjną uzyskano poprzez fuzję VP64, p65 i Rta (VPR), domeny transaktywacyjnej z gamma-herpeswirusów, do C-końca dCas913 (Rysunek 1A). Podobne systemy CRISPR/dCas9 zostały opracowane do represji specyficznej dla celu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).
Endogenna represja genów może być osiągnięta za pomocą inżynieryjnych fuzji represorów za pomocą różnych mechanizmów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Wykazano, że systemy CRISPR/dCas9, połączone z represorem DBD (nawet bez domeny efektorowej), mogą skutecznie wyciszać ekspresję genów, gdy są przywiązane do promotora lub regionów upstream/downstream-TSS3,6,14. Wpływ na transkrypcję jest spowodowany steryczną interferencją wiązania czynnika transkrypcyjnego i przetwarzania polimerazy RNA. Niemniej jednak potrzebne są bardziej kompleksowe podejścia, ponieważ represja genów przez samą przeszkodę steryczną często nie wystarcza do solidnego wyciszenia. Niedawny rozwój nowej generacji tłumików opartych na systemach CRISPR/dCas9 przenoszących domeny represorowe transkrypcji (TRD), modyfikatory histonów (di-/trimetylacja H3-K9, di-/trimetylacja H3-K27; H3-K36 di-/tri-metylacja, deacetylacja H3/H4) i metylacja DNA (CpG) doprowadziły do skonstruowania narzędzi epigenetycznych, które pozwoliły na bardziej silne efekty wyciszania4,5,15,16,17,18,19,20. Wykazano, że rekrutacja tych modyfikatorów epigenetycznych do DNA może prowadzić do powstania bardziej zamkniętej i skondensowanej chromatyny, która zazwyczaj generuje silniejszy wynik wyciszania21,22. Najczęściej używaną domeną wyciszającą z DBD jest skrzynka powiązana z Krüppel (KRAB)4,5. Wykazano, że rekrutacja czynnika odpowiada zmianom chromatyny; Niemniej jednak mechanizmy tych modyfikacji nie zostały jeszcze wyjaśnione16,17,18. Ostatnio wykazano, że lokalizacja KRAB w DNA może sprzyjać składaniu się metylotransferazy histonowej SETDB1 i kompleksów NuRD deacetylacji histonów (HDAC), co sugeruje możliwość, że te interakcje pośredniczą w tworzeniu kondensacji chromatyny i wyciszaniu transkrypcji3,13. Alternatywnym podejściem jest fuzja domen efektorowych z DBD w celu stworzenia niestandardowego epigenetycznego białka wyciszającego. System ten bezpośrednio katalizuje represyjne znaczniki DNA lub modyfikacje histonów.
Ostatnio, użycie syntetycznych systemów CRISPR/dCas9 związanych z enzymem DNMT3A zostało ponownie wykorzystane do dezaktywacji transkrypcji. DNMT3A katalizuje metylację DNA, która wywiera represję transkrypcyjną podczas tworzenia heterochromatyny na endogennych promotorach genów i innych regionach regulatorowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)18,20. McDonald et al.18 oraz Vojta et al.20 byli pierwszymi autorami, którzy poinformowali, że metylacja DNA może być wykorzystana do wyciszania lub represji genu epigenomu, wykazując, że system fuzyjny dCas9-DNMT3A dostarczany przez plazmid może silnie zwiększać metylację cytozyny wokół klasy TSS<sup="xref">18,20. McDonald i współpracownicy wykazali, że zastosowanie tej strategii może skutkować znacznym zmniejszeniem (około 40%) poziomu mRNA genu supresorowego nowotworu, CDKN2A mRNA18. Podobnie, celowanie w niemetylowany region promotora genów BACH lub IL6ST pokazuje zwiększoną metylację CpG, która została skorelowana z dwukrotnym zmniejszeniem ekspresji genu20. Nasze laboratorium niedawno zmieniło przeznaczenie metylacji DNA do łagodzenia patologicznych skutków nadekspresji SNCA (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2) 23. Strategia opiera się na selektywnym zwiększaniu metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1, ponieważ wcześniej donoszono, że jest on hipometylowany w PD i demencji z ciałami Lewy'ego (DLB) mózgi24,25,26. Ta hipometylacja została powiązana z nadekspresją SNCA, oferując w ten sposób atrakcyjny cel dla interwencji terapeutycznej24,27,28. Niedawno wykazaliśmy niski poziom metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1 w dopaminergicznych NPC pochodzących z hiPSC uzyskanych od pacjenta z PD z potrójnym SNCA 23. Zaletą tego modelu eksperymentalnego jest to, że NPC mogą być silnie rozmnażane w kulturze lub dalej różnicowane w dojrzałe neurony, co umożliwia skuteczne badanie przesiewowe w celu identyfikacji czynników genetycznych, które pośredniczą w fenotypach komórkowych, w tym stresu oksydacyjnego i apoptozy29. Co więcej, ten system modelowy umożliwia naukowcom podsumowanie zdarzeń rozwojowych, które wystąpiły przed wystąpieniem objawów u pacjentów. Ponadto NPC pochodzące z hiPSC stanowią doskonałe narzędzie do testowania szlaków komórkowych i molekularnych związanych z ekspresją genów. Co ważne, NPC pochodzące z hiPSC w połączeniu z najnowocześniejszą technologią epigenomu CRISPR/Cas9 mogą znacznie ułatwić opracowywanie "leków nowej generacji" na wiele chorób neurodegeneracyjnych.
Aby zmniejszyć patologiczne poziomy ekspresji SNCA, niedawno opracowaliśmy system oparty na lentiwirusie, przenoszący białko fuzyjne dCas9-DNMT3A i gRNA, aby specyficznie celować w metylację CpG w intronie SNCA 1 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)23. Protokół ten szczegółowo opisuje projektowanie i produkcję wektora lentiwirusowego (LV). Pojazdy LV stanowią skuteczny sposób dostarczania komponentów CRISPR/dCas9 z kilku powodów, a mianowicie: (i) ich zdolności do przenoszenia dużych insercji DNA, (ii) wysokiej wydajności transdukcji szerokiego zakresu komórek, w tym zarówno komórek dzielących, jak i niedzielących się30, oraz (iii) ich zdolności do wywoływania minimalnych odpowiedzi cytotoksycznych i immunogennych. Niedawno zastosowaliśmy system LV do neuronów dopaminergicznych pochodzących z hiPSC od pacjenta z potrojeniem locus SNCA i wykazaliśmy potencjał terapeutyczny LV w dostarczaniu narzędzi metylacji do edycji epigenomu23 (<silna klasa="xfig">Figura 2B). Rzeczywiście, układ LV-gRNA/dCas9-DNMT3A powoduje znaczny wzrost metylacji DNA w regionie intronu SNCA 1. Wzrost ten odpowiada obniżeniu poziomów mRNA SNCA i białka23. Co więcej, regulacja w dół SNCA ratuje fenotypy związane z PD w neuronach dopaminergicznych pochodzących z potrójnej i hiPSC SNCA (np. produkcja mitochondrialnych ROS i żywotność komórek)23. Co ważne, wykazaliśmy, że zmniejszenie ekspresji SNCA przez system LV-gRNA-dCas9-DMNT3A jest w stanie odwrócić fenotypy, które są charakterystyczne dla neuronów dopaminergicznych pochodzących z hiPSC od pacjenta z chorobą Parkinsona, który był nosicielem potrojenia SNCA, takich jak mitochondrialna produkcja ROS i żywotność komórek23. Celem tego protokołu jest: 1) nakreślenie protokołu produkcji i koncentracji zoptymalizowanej platformy LV do generowania preparatów wirusowych o wysokiej daweczkowaniu oraz 2) opisanie różnicowania hiPSC w NPC o wzorcu dojrzałych neuronów dopaminergicznych31,32 oraz charakterystyka poziomów metylacji docelowego regionu w obrębie intronu SNCA 1.
Platformy lentiwirusowe mają dużą przewagę nad najpopularniejszą platformą wektorową, a mianowicie wektorami związanymi z adenowirusami (AAV), którą jest zdolność tych pierwszych do przyjmowania większych wstawek genetycznych33,34. AAV mogą być generowane ze znacznie wyższą wydajnością, ale mają niską pojemność pakowania (<4,8 kb), co ogranicza ich zastosowanie do dostarczania kompleksowych systemów CRISPR/Cas9. W związku z tym wydaje się, że LV byłyby platformą z wyboru w aplikacjach związanych z dostarczaniem narzędzi CRISPR/dCas9. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół będzie cennym narzędziem dla badaczy pragnących skutecznie dostarczyć komponenty do edycji epigenomu do komórek i narządów. Protokół dodatkowo nakreśla strategię zwiększania możliwości produkcyjnych i ekspresyjnych wektorów poprzez modyfikację w cis elementów w wyrażeniu wektorowym cassette30,35. Strategia opiera się na nowatorskim systemie opracowanym i badanym w naszym laboratorium i podkreśla jego zdolność do wytwarzania cząsteczek wirusa w zakresie 1010 jednostek wirusowych (VU)/ml30,35.

<table><tbody><tr><td>Wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; M jednostka filtrująca, 1 L</td><td>Corning</td><td>430513</td><td></td></tr><tr><td>0,45-&mu; m jednostka filtrująca, 500 ml</td><td>Corning</td><td>430773</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Naczynia do hodowli komórkowych z siatką 20 mm</td><td>Corning</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 800</td><td>StemCell Technologies</td><td>34811</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa Allegra 25R</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS</td><td>Becton Dickinson</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe dolne probówki ultrawirówkowe</td><td>Seton Scientific</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>Adaptery do rur stożkowych</td><td>Seton Scientific</td><td>PN 4230</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka do obrazowania komórek</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>30742060</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki o wysokim poziomie wiązania</td><td>Corning</td><td>3366</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DM IRB2</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Odwracalne sitko</td><td>StemCell Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>SW32Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Jednorazowe pipety serologiczne, szklane, niepirogenne</td><td>VWR</td><td>93000-694</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Systemy filtracji próżniowej</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>xMark&trade; Czytnik płytek absorbancyjnych do mikropłytek</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Odczynniki do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki nerki embrionalnej 293T (HEK 293T)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FOXA2</td><td>Abcam</td><td>Ab60721</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-nestynowe</td><td>Abcam</td><td>Ab18102</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy, 100x</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50x), bez witaminy A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9879 - BES</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca frakcja V (7,5% roztwór)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>StemCell Technologies</td><td>72052</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel z kwalifikacją hESC</td><td>Matryca Corning</td><td>08-774-552</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon kosmicznej surowicy cielęcej</td><td></td><td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Lonza</td><td>12-719</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, podłoże o wysokiej zawartości glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>EpiTect PCR Control Zestaw DNA</td><td>Qiagen</td><td>596945</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Zymo</td><td>Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1800-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Delikatny odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>stemCell Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Technologie ludzkich rekombinowanych</td><td>komórek macierzystych</td> bFGF <td>78003</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludz&nbsp; EGF</td><td>StemCell Technologies</td><td>78006</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki rekombinowany Shh (C24II)</td><td>StemCell Technologies</td><td>78065</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr> <tr><td>Hyklon</td> z<td>aminokwasami endogennymi (NEAA)</td> <td>SH30087.04</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Zestaw do PCR</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>StemCell Technologies</td><td>72232</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td> <td>soduSigma Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff&nbsp; Indukcja neuronalna Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5835</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium</td><td>StemCell Technologies</td><td>5838</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan FOXA2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs00232764</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999905</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan Nestin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HS04187831</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan OCT4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs04260367</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan PPIA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hs99999904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>StemCell Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy<</td><td>strong>Komentarze</td></tr><tr><td>p24 Odczynniki ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało anty-p24</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>3537</td><td></td></tr><tr><td>Kozia peroksydaza anty-króliczo-chrzanowa IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12-348</td><td>Stężenie robocze 1:1500</td></tr><tr><td>Surowica kozia, sterylna, 10 ml</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Stężenie robocze 1:1000</td></tr><tr><td>Normy HIV-1</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP968F</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica mysie, sterylna, 500 ml</td><td>Equitech-Bio</td><td>SM30-0500</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało anty-p24</td><td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td><td>SP451T</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże peroksydazy TMB</td><td>KPL</td><td>5120-0076</td><td>Stężenie robocze 1:10 000</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0580S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0195S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>SphI</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>R0182S</td><td></td></tr></tbody></table>

platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

Wykorzystanie komórek pochodzących z hiPSC stanowi wartościowe podejście do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół różnicowania hiPSC pochodzących od pacjenta z potrojeniem locus genu alfa-synukleiny (SNCA) do populacji neuronów dopaminergicznych istotnych dla choroby Parkinsona (PD). Coraz więcej dowodów wykazało, że wysoki poziom SNCA jest przyczyną rozwoju choroby Parkinsona. Uznając niezaspokojoną potrzebę ustanowienia nowych podejść terapeutycznych dla PD, zwłaszcza tych ukierunkowanych na regulację ekspresji SNCA, niedawno opracowaliśmy system oparty na metylacji DNA CRISPR/dCas9 do epigenetycznej modulacji transkrypcji SNCA poprzez wzbogacanie poziomów metylacji w SNCA Region regulacyjny Intron 1. Do dostarczenia systemu, składającego się z martwej (dezaktywowanej) wersji Cas9 (dCas9) połączonej z domeną katalityczną enzymu metylotransferazy DNA 3A (DNMT3A), stosuje się wektor lentiwirusowy. System ten jest stosowany do komórek z potrojeniem locus SNCA i zmniejsza poziom SNCA-mRNA i białka o około 30% poprzez ukierunkowaną metylację DNA intronu SNCA 1. Precyzyjnie dostrojona regulacja w dół poziomów SNCA ratuje fenotypy komórkowe związane z chorobą. W obecnym protokole staramy się opisać krok po kroku procedurę różnicowania hiPSC w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) oraz ustanowienie i walidację testów pirosekwencjonowania w celu oceny profilu metylacji w intronie SNCA 1. Aby bardziej szczegółowo przedstawić system lentivirus-CRISPR/dCas9 używany w tych eksperymentach, w niniejszym protokole opisano sposób produkcji, oczyszczania i koncentracji wektorów lentiwirusowych oraz podkreślono ich przydatność do zastosowań związanych z edycją epigenomu i genomu przy użyciu hiPSC i NPC. Protokół jest łatwy do dostosowania i może być stosowany do produkcji lentiwirusów o wysokim mianie do zastosowań in vitro i in vivo.

Walidacja mian produkcji wektorów LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro w porównaniu do naiwnego odpowiednika GFP
Przeprowadziliśmy test ELISA dla p24gag, aby porównać miana fizyczne LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro z odpowiadającymi im kontrolnymi wektorami GFP/Puro. Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 5A wykazują, że fizyczne wydajności wektorów wygenerowanych zgodnie z opisanym...

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Platforma wektorów lentiwirusowych ma dużą przewagę nad najpopularniejszą platformą wektorową, szczególnie ze względu na zdolność wektorów lentiwirusowych do przyjmowania większych wkładek genetycznych. Wydaje się więc, że wektor lentiwirusowy byłby platformą z wyboru w aplikacji obejmującej dostarczenie narzędzi CRISPR/Cas. Technika ta imituje naturalny mechanizm regulacyjny ekspresji alfa-synukleiny, która po zaburzeniu jest związana z chorobą.Pozwala to na precyzyjne dostrojenie poziomu ekspresji w porównaniu z solidnymi zmianami w ekspresji genów. Zdecydowanie zalecałbym walidację tego lub podobnego podejścia przy użyciu wielu przewodnikowych RNA do badań przesiewowych. Istnieje duża zmienność w potencji przewodnikowego RNA.Jedynym sposobem, aby to ustalić, jest solidna i kompleksowa kontrola i walidacja. Opracowany system można łatwo dostosować do innych systemów modelowych, takich jak modele zwierzęce, w tym gryzonie i naczelne. Te kolejne eksperymenty mogą posłużyć jako dowód słuszności koncepcji dla przyszłych badań klinicznych.Procedurę zademonstruje dr Ekaterina Ilich, starszy pracownik mojego laboratorium, koncentrując się na wykonaniu procedury klonowania molekularnego w celu stworzenia plazmidów wektorowych lentiwirusowych związanych z tym projektem. Zademonstruje również kluczowe etapy związane z produkcją wektorów lentiwirusowych. Procedurę zademonstruje również dr Lidia Tagliafierro, doktor habilitowany z mojego laboratorium, zajmująca się różnicowaniem ludzkich komórek iPS w komórki o znaczeniu patologicznym.Zademonstruje kluczowe kroki w kierunku ustanowienia testów do oceny profili metylacji intronu synukleinowego1. Ahila Sriskanda, pracownica mojego laboratorium zajmująca się hodowlą ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek iPS. Aby rozpocząć, opracuj domenę katalityczną DNMT3A z d-Cas9-DNMT3A-GFP poprzez amplifikację części DNMT3A wektora.Po strawieniu fragmentu DNMT3A za pomocą enzymu restrykcyjnego BamH1. Umieść go w miejscu BamH1 zmodyfikowanego wektora PBK-301 przenoszącego d-Cas9 i zweryfikowanego przez bezpośrednie sekwencjonowanie Sangera, aby zastąpić czysty gen reporterowy Miśni i powstały plazmid trawieniem GFP d-Cas9-DNMT3A-P2A czystym Miśnią i plazmidem FSC 1. Oczyść fragment wektora za pomocą metody oczyszczania żelowego.Przygotować wkładkę, trawiąc PBK-201 za pomocą FSC-1. Sklonuj fragment FSC 1 do wektora, aby utworzyć d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Posmaruj 15-centymetrowe płytki 0,2% żelatyną do transfekcji i odczekaj 10 minut.Następnie odessać żelatynę i dodać 22,5 mililitra pożywki o wysokiej zawartości glukozy i 2,5 mililitra wcześniej hodowanej zawiesiny komórek HEK-293T. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, aż do osiągnięcia 70 do 80% konfluencji. Aby przygotować mieszankę plazmidową wystarczającą na 115-centymetrową płytkę, użyj czterech plazmidów opisanych w manuskrypcie.Dodaj 312,5 mikrolitra jednego molowego chlorku wapnia do tej samej 15-mililitrowej probówki z plazmidami i doprowadź końcową objętość do 1,25 mililitra za pomocą sterylnej podwójnie destylowanej wody. delikatnie dodaj 1,25 mililitra dwóch roztworów X BBM kroplami do probówki podczas wirowania. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Odessać pożywkę z komórek i dodać 22,5 mililitra świeżo przygotowanego DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy. Dodaj kroplami 2,5 mililitra mieszanki transfekcyjnej do każdej płytki. Zamieszaj płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez dwie do trzech godzin po inkubacji, dodaj 2,5 mililitra surowicy na płytkę, aby uzyskać 10% rozcieńczenie i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Aby zebrać wirusa, należy zebrać supernatant ze wszystkich transfekowanych komórek i wciągnąć je do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Wirować przy 400 do 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltrować supernatant przez filtr próżniowy o średnicy 0,45 mikrometra. Następnie utwórz gradient sacharozy, przygotowując stożkowe ultra probówki wirówkowe.Ostrożnie dodać przefiltrowany supernatant do gradientu, równomiernie rozprowadzając supernatant wirusowy w każdej probówce ultrawirówkowej, wypełniając co najmniej trzy czwarte każdej probówki. Odwirować próbki w temperaturze 70000 g przez dwie godziny w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Delikatnie zbierz od 30% do 60% frakcji sacharozy do czystych probówek, dodaj zimny 1X PBS do 100 mililitrów całkowitej objętości i kilkakrotnie pipetuj do wymieszania.Ostrożnie dodaj cztery mililitry 20% sacharozy w 1X PBS do każdej probówki, aby rozwarstwić preparat wirusowy, kontynuuj pipetowanie około 20 do 25 mililitrów roztworu wirusa na każdą probówkę. Ostrożnie zrównoważyć probówki, a następnie odwirować w temperaturze 70000 g przez dwie godziny w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać pozostałą ciecz, aby całkowicie usunąć cały płyn, pozostawiając wirusa zawierającego granulki, które są ledwo widoczne jako małe półprzezroczyste plamki.Po opróżnieniu supernatantu odwróć probówki na ręcznikach papierowych, aby umożliwić spłynięcie pozostałej cieczy. Dodaj 70 mikrolitrów 1X PBS do pierwszej probówki i dokładnie odpipetować, aby ponownie zawiesić granulkę. Przenieść zawiesinę do następnej probówki i powtarzać pipetowanie i przenoszenie, aż wszystkie granulki zostaną ponownie zawieszone.Dodaj dodatkowe 50 mikrolitrów 1X PBS do pierwszej probówki i wymieszaj, aby ją umyć. Następnie przenieść zawiesinę do drugiej probówki w celu przemycia i kontynuować mycie i przenoszenie jak poprzednio, uzyskując około 120 mikrolitrów lekko mlecznej zawiesiny końcowej. Wirować przy 10000 g przez 60 sekund, aby uzyskać klarowną zawiesinę, przenieść supernatant do nowej probówki i zrobić pięć mikrolitrów podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, umieścić Cryovial z MD NPC w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty i przenieść rozmrożone komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki z 10 mililitrami ciepłego DMEM-F12.Wirować przy 300 g przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki N2B2. Dodać dwa mililitry N2B27 do zawiesiny komórek i umieścić dwa mililitry komórek w każdym dołku wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej zakodowanej przez BMM.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez noc. Gdy NPC MD osiągną 70% konfluencji, transdukuj je, dodając dwa mikrolitry wektorów przewodnika RNA d-Cas9-DNMT3A lentiwirusa i delikatnie zakręć płytką. Po inkubacji komórek w tych samych warunkach, co poprzednio, przez 16 godzin, zastąp pożywkę N2B27 48 godzin po transdukcji.Dodaj N2B27 z pięcioma mikrogramami na mililitr czystego Meissena, aby uzyskać stabilne linie NPC MD, hoduj komórki przez trzy tygodnie w N2B27 plus czystym Meissen, aby scharakteryzować profil metylacji intronu SNCA 1. Najpierw wyekstrahuj DNA z każdej stabilnej linii komórkowej przetwornika za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, następnie użyj 800 nanogramów DNA do przeprowadzenia konwersji wodorosiarczku za pomocą dostępnego na rynku zestawu, a następnie wodorosiarczek przekształcił DNA do 20 nanogramów na mikrolitr. Do analizy pirosekwencjonowania należy przygotować główną mieszaninę PCR w probówce bez jądra, przenieść płytkę reakcyjną do termocyklera i rozpocząć PCR.Wizualizacja amplikonów za pomocą dwóch mikrolitrów produktu PCR z barwieniem 30 i bromkiem po elektroforezie w żelu agarozowym. Do testów pirosekwencjonowania stosowano mieszaniny niemetylowanych i metylowanych przez siarczkowe DNA oraz odczynników do sekwencjonowania pirologicznego, jak opisano w manuskrypcie. Oblicz wartości metylacji dla każdego miejsca CPG za pomocą oprogramowania do sekwencjonowania pirologicznego, fizyczne plony wektora d-Cas9-DMMT3A-GFP lentiwirusa i wektora naiwnego GFP wygenerowanego przy użyciu tego protokołu są porównywalne.Sugeruje to, że użyteczność zoptymalizowanego szkieletu wektora w połączeniu ze zoptymalizowanym protokołem produkcji skutkuje wysoką wydajnością, ściślejszymi wskaźnikami transdukcji wektorów CRISPR-dCas9, wektor GFP d-Cas9-DNMT3 Lentivirus był czterokrotnie niższy niż w przypadku wektora Naive GFP, co sugeruje, że wydajność pakowania CRISPR d-Cas9-RNA jest zmniejszona. Szybkość transdukcji naiwnego wektora PURO była pięciokrotnie wyższa w porównaniu z wektorem d-Cas9-DNMT3A. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przy użyciu naiwnego GFP i d-Cas9-DNMT3A-GFP.Opisany tutaj protokół oparty na EB pozwala na różnicowanie NPC MD. hiPSC wyrażają marker siły przyjemności Oct4, podczas gdy NPC MD jest wyrażany zarówno Nestin, jak i FoxA2. Zaprojektowano i zwalidowano siedem testów sekwencjonowania pirologicznego w celu ilościowego określenia stanu metylacji w intronie SNCA 1.Wszystkie 7 testów zostało zwalidowanych i wykazało korelację liniową, przy użyciu zwalidowanych testów możliwe było określenie poziomów metylacji na 23 CPG w intronie SNCA 1 Najważniejszą rzeczą do zapamiętania przed uczestnictwem w tej procedurze jest praca z komórkami, które wykazują prawidłowy wzrost i zdrowie, aby zapewnić spójność między eksperymentami. Produkcja wektorów soczewicowych przedstawionych w tej prezentacji może być łatwo zaadaptowana do produkcji całek z niedoborem antywirusów, a także może być łatwo skalowana w celu generowania większych ilości lub bardziej skoncentrowanych wektorów. Technika ta może utorować drogę do zbadania patogennego wpływu deregulacji genów na zaburzenia związane z wiekiem ani z zaburzeniami generatywnymi, w tym chorobą Alzheimera i pokrewnymi demencjami.Zaletą wektorów soczewicy jest to, że nie stanowią zagrożenia ani nie są zakaźne, wektory soczewicy mają tylko minimalny wpływ na cykl komórkowy, są bezpieczną i niezawodną platformą dostarczania do zastosowań terapii genowej.

lentiviral-vector-platform-for-efficient-delivery-epigenome-editing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Źródło: Tagliafierro, L., et al. Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje transdukcję lentiwirusową nerwowych komórek progenitorowych (NPC) w celu ukierunkowanej modyfikacji epigenetycznej alfa-synukleiny, kluczowego białka w chorobie Parkinsona. Protokół umożliwia metylację DNA za pośrednictwem metylotransferazy,...

Transdukcja lentiwirusowa nerwowych komórek progenitorowych w celu epigenetycznej regulacji ekspresji alfa-synukleiny

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj produkcję wektorów lentiwirusowych z CRISPR-dCas9-DNMT3A do edycji epigenomu w neuronach pochodzących z hiPSC. Ta metoda umożliwia precyzyjną regulację ekspresji genów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów