Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Platforma wektorów lentiwirusowych ma dużą przewagę nad najpopularniejszą platformą wektorową, szczególnie ze względu na zdolność wektorów lentiwirusowych do przyjmowania większych wkładek genetycznych. Wydaje się więc, że wektor lentiwirusowy byłby platformą z wyboru w aplikacji obejmującej dostarczenie narzędzi CRISPR/Cas. Technika ta imituje naturalny mechanizm regulacyjny ekspresji alfa-synukleiny, która po zaburzeniu jest związana z chorobą.

Pozwala to na precyzyjne dostrojenie poziomu ekspresji w porównaniu z solidnymi zmianami w ekspresji genów. Zdecydowanie zalecałbym walidację tego lub podobnego podejścia przy użyciu wielu przewodnikowych RNA do badań przesiewowych. Istnieje duża zmienność w potencji przewodnikowego RNA.

Jedynym sposobem, aby to ustalić, jest solidna i kompleksowa kontrola i walidacja. Opracowany system można łatwo dostosować do innych systemów modelowych, takich jak modele zwierzęce, w tym gryzonie i naczelne. Te kolejne eksperymenty mogą posłużyć jako dowód słuszności koncepcji dla przyszłych badań klinicznych.

Procedurę zademonstruje dr Ekaterina Ilich, starszy pracownik mojego laboratorium, koncentrując się na wykonaniu procedury klonowania molekularnego w celu stworzenia plazmidów wektorowych lentiwirusowych związanych z tym projektem. Zademonstruje również kluczowe etapy związane z produkcją wektorów lentiwirusowych. Procedurę zademonstruje również dr Lidia Tagliafierro, doktor habilitowany z mojego laboratorium, zajmująca się różnicowaniem ludzkich komórek iPS w komórki o znaczeniu patologicznym.

Zademonstruje kluczowe kroki w kierunku ustanowienia testów do oceny profili metylacji intronu synukleinowego1. Ahila Sriskanda, pracownica mojego laboratorium zajmująca się hodowlą ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek iPS. Aby rozpocząć, opracuj domenę katalityczną DNMT3A z d-Cas9-DNMT3A-GFP poprzez amplifikację części DNMT3A wektora.

Po strawieniu fragmentu DNMT3A za pomocą enzymu restrykcyjnego BamH1. Umieść go w miejscu BamH1 zmodyfikowanego wektora PBK-301 przenoszącego d-Cas9 i zweryfikowanego przez bezpośrednie sekwencjonowanie Sangera, aby zastąpić czysty gen reporterowy Miśni i powstały plazmid trawieniem GFP d-Cas9-DNMT3A-P2A czystym Miśnią i plazmidem FSC 1. Oczyść fragment wektora za pomocą metody oczyszczania żelowego.

Przygotować wkładkę, trawiąc PBK-201 za pomocą FSC-1. Sklonuj fragment FSC 1 do wektora, aby utworzyć d-Cas9-DNMT3A-P2A-GFP. Posmaruj 15-centymetrowe płytki 0,2% żelatyną do transfekcji i odczekaj 10 minut.

Następnie odessać żelatynę i dodać 22,5 mililitra pożywki o wysokiej zawartości glukozy i 2,5 mililitra wcześniej hodowanej zawiesiny komórek HEK-293T. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, aż do osiągnięcia 70 do 80% konfluencji. Aby przygotować mieszankę plazmidową wystarczającą na 115-centymetrową płytkę, użyj czterech plazmidów opisanych w manuskrypcie.

Dodaj 312,5 mikrolitra jednego molowego chlorku wapnia do tej samej 15-mililitrowej probówki z plazmidami i doprowadź końcową objętość do 1,25 mililitra za pomocą sterylnej podwójnie destylowanej wody. delikatnie dodaj 1,25 mililitra dwóch roztworów X BBM kroplami do probówki podczas wirowania. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Odessać pożywkę z komórek i dodać 22,5 mililitra świeżo przygotowanego DMEM o wysokiej zawartości glukozy bez surowicy. Dodaj kroplami 2,5 mililitra mieszanki transfekcyjnej do każdej płytki. Zamieszaj płytki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez dwie do trzech godzin po inkubacji, dodaj 2,5 mililitra surowicy na płytkę, aby uzyskać 10% rozcieńczenie i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.

Aby zebrać wirusa, należy zebrać supernatant ze wszystkich transfekowanych komórek i wciągnąć je do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Wirować przy 400 do 450 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przefiltrować supernatant przez filtr próżniowy o średnicy 0,45 mikrometra. Następnie utwórz gradient sacharozy, przygotowując stożkowe ultra probówki wirówkowe.

Ostrożnie dodać przefiltrowany supernatant do gradientu, równomiernie rozprowadzając supernatant wirusowy w każdej probówce ultrawirówkowej, wypełniając co najmniej trzy czwarte każdej probówki. Odwirować próbki w temperaturze 70000 g przez dwie godziny w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Delikatnie zbierz od 30% do 60% frakcji sacharozy do czystych probówek, dodaj zimny 1X PBS do 100 mililitrów całkowitej objętości i kilkakrotnie pipetuj do wymieszania.

Ostrożnie dodaj cztery mililitry 20% sacharozy w 1X PBS do każdej probówki, aby rozwarstwić preparat wirusowy, kontynuuj pipetowanie około 20 do 25 mililitrów roztworu wirusa na każdą probówkę. Ostrożnie zrównoważyć probówki, a następnie odwirować w temperaturze 70000 g przez dwie godziny w temperaturze 17 stopni Celsjusza. Ostrożnie zassać pozostałą ciecz, aby całkowicie usunąć cały płyn, pozostawiając wirusa zawierającego granulki, które są ledwo widoczne jako małe półprzezroczyste plamki.

Po opróżnieniu supernatantu odwróć probówki na ręcznikach papierowych, aby umożliwić spłynięcie pozostałej cieczy. Dodaj 70 mikrolitrów 1X PBS do pierwszej probówki i dokładnie odpipetować, aby ponownie zawiesić granulkę. Przenieść zawiesinę do następnej probówki i powtarzać pipetowanie i przenoszenie, aż wszystkie granulki zostaną ponownie zawieszone.

Dodaj dodatkowe 50 mikrolitrów 1X PBS do pierwszej probówki i wymieszaj, aby ją umyć. Następnie przenieść zawiesinę do drugiej probówki w celu przemycia i kontynuować mycie i przenoszenie jak poprzednio, uzyskując około 120 mikrolitrów lekko mlecznej zawiesiny końcowej. Wirować przy 10000 g przez 60 sekund, aby uzyskać klarowną zawiesinę, przenieść supernatant do nowej probówki i zrobić pięć mikrolitrów podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, umieścić Cryovial z MD NPC w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty i przenieść rozmrożone komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki z 10 mililitrami ciepłego DMEM-F12.

Wirować przy 300 g przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki N2B2. Dodać dwa mililitry N2B27 do zawiesiny komórek i umieścić dwa mililitry komórek w każdym dołku wcześniej przygotowanej płytki sześciodołkowej zakodowanej przez BMM.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez noc. Gdy NPC MD osiągną 70% konfluencji, transdukuj je, dodając dwa mikrolitry wektorów przewodnika RNA d-Cas9-DNMT3A lentiwirusa i delikatnie zakręć płytką. Po inkubacji komórek w tych samych warunkach, co poprzednio, przez 16 godzin, zastąp pożywkę N2B27 48 godzin po transdukcji.

Dodaj N2B27 z pięcioma mikrogramami na mililitr czystego Meissena, aby uzyskać stabilne linie NPC MD, hoduj komórki przez trzy tygodnie w N2B27 plus czystym Meissen, aby scharakteryzować profil metylacji intronu SNCA 1. Najpierw wyekstrahuj DNA z każdej stabilnej linii komórkowej przetwornika za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, następnie użyj 800 nanogramów DNA do przeprowadzenia konwersji wodorosiarczku za pomocą dostępnego na rynku zestawu, a następnie wodorosiarczek przekształcił DNA do 20 nanogramów na mikrolitr. Do analizy pirosekwencjonowania należy przygotować główną mieszaninę PCR w probówce bez jądra, przenieść płytkę reakcyjną do termocyklera i rozpocząć PCR.

Wizualizacja amplikonów za pomocą dwóch mikrolitrów produktu PCR z barwieniem 30 i bromkiem po elektroforezie w żelu agarozowym. Do testów pirosekwencjonowania stosowano mieszaniny niemetylowanych i metylowanych przez siarczkowe DNA oraz odczynników do sekwencjonowania pirologicznego, jak opisano w manuskrypcie. Oblicz wartości metylacji dla każdego miejsca CPG za pomocą oprogramowania do sekwencjonowania pirologicznego, fizyczne plony wektora d-Cas9-DMMT3A-GFP lentiwirusa i wektora naiwnego GFP wygenerowanego przy użyciu tego protokołu są porównywalne.

Sugeruje to, że użyteczność zoptymalizowanego szkieletu wektora w połączeniu ze zoptymalizowanym protokołem produkcji skutkuje wysoką wydajnością, ściślejszymi wskaźnikami transdukcji wektorów CRISPR-dCas9, wektor GFP d-Cas9-DNMT3 Lentivirus był czterokrotnie niższy niż w przypadku wektora Naive GFP, co sugeruje, że wydajność pakowania CRISPR d-Cas9-RNA jest zmniejszona. Szybkość transdukcji naiwnego wektora PURO była pięciokrotnie wyższa w porównaniu z wektorem d-Cas9-DNMT3A. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przy użyciu naiwnego GFP i d-Cas9-DNMT3A-GFP.

Opisany tutaj protokół oparty na EB pozwala na różnicowanie NPC MD. hiPSC wyrażają marker siły przyjemności Oct4, podczas gdy NPC MD jest wyrażany zarówno Nestin, jak i FoxA2. Zaprojektowano i zwalidowano siedem testów sekwencjonowania pirologicznego w celu ilościowego określenia stanu metylacji w intronie SNCA 1.

Wszystkie 7 testów zostało zwalidowanych i wykazało korelację liniową, przy użyciu zwalidowanych testów możliwe było określenie poziomów metylacji na 23 CPG w intronie SNCA 1 Najważniejszą rzeczą do zapamiętania przed uczestnictwem w tej procedurze jest praca z komórkami, które wykazują prawidłowy wzrost i zdrowie, aby zapewnić spójność między eksperymentami. Produkcja wektorów soczewicowych przedstawionych w tej prezentacji może być łatwo zaadaptowana do produkcji całek z niedoborem antywirusów, a także może być łatwo skalowana w celu generowania większych ilości lub bardziej skoncentrowanych wektorów. Technika ta może utorować drogę do zbadania patogennego wpływu deregulacji genów na zaburzenia związane z wiekiem ani z zaburzeniami generatywnymi, w tym chorobą Alzheimera i pokrewnymi demencjami.

Zaletą wektorów soczewicy jest to, że nie stanowią zagrożenia ani nie są zakaźne, wektory soczewicy mają tylko minimalny wpływ na cykl komórkowy, są bezpieczną i niezawodną platformą dostarczania do zastosowań terapii genowej.