Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Ogólnym celem tej techniki jest ocena wpływu manipulacji ekspresją genów na architekturę neuronów korowych in vivo. Naszą pierwszą kluczową przewagą tej procedury nad tymi opartymi na neutralnej elektroporacji jest dokładna kontrola poziomu ekspresji genów. W szczególności ten zintegrowany proces umożliwia ocenę in vivo defektu, uwydatnionego przez niewielkie zmiany w ekspresji genów w kontroli cytoarchitektury neuronów.

Co więcej, struktura par w teście transplantacyjnym pozwala na ogromne zmniejszenie liczby zwierząt niezbędne do uzyskania statystycznie istotnych wyników. Technika ta wykorzystuje pulę prekursorów pochodzących z transgenicznych zarodków Tau EGFP. Ta pula jest podzielona na dwie podgrupy, które są naprzemiennie zakażone dwiema mieszankami lentiwirusów.

Aby uzyskać zieloną pulę testową i żółtą pulę kontrolną, które zostaną wstrzyknięte jednocześnie. Po dwóch dniach ekspansji in vitro powstałe sfery nerwowe są rozdzielane, mieszane jeden do jednego i wstrzykiwane w naczynia włosowate w przestrzeni komorowej myszy. Dziesięć dni później przeprowadza się immunofluorescencję na odcinkach koronalnych, aby umożliwić porównanie neuronów testowych i kontrolnych.

Na koniec skrawki wybarwione immunologicznie są obrazowane i szkieletowane w celu ostatecznej oceny parametrów morfometrycznych. Przed przeszczepem in vivo należy przygotować zieloną pulę prekursorów. Zarodki E12.5, pobrane od ciężarnej matki uprzednio pokrytej założycielką Tau EGFP, umieszcza się w indywidualnych dołkach wielodołkowej płytki w roztworze PBS.

Genotypuj je szybko poprzez oględziny pod lampą światła niebieskiego. Odłącz wypreparowaną zieloną korę od pojedynczych komórek. Ponownie zawiesić komórki w pożywce proliferacyjnej i podzielić je na dwie podpule o równej wielkości.

Zainfekuj każdą podpulę dedykowaną mieszanką lentiwirusową. Każda mieszanka zawiera wirusa czerwonej etykiety lub czarnego wirusa kontrolnego. A także wirusy odpowiednio dla transgenu napędzanego przez Tet-Off lub ekspresji kontrolnej.

Każdy lentiwirus musi być podawany przy wielokrotności zakażenia wynoszącej 8. Umieść zakażone komórki w pożywce proliferacyjnej z 2 mikrogramami na mililitr doksycykliny. Przenieś komórki do inkubatora i pozostaw je na 2 dni w temperaturze 37 stopni.

Po 2 dniach dwie podpule muszą pojawić się jako zawiesiny małych neurosfer. Jednorodna ekspresja białka czerwonej fluorescencji lub nie. Po inżynierii prekursorów ustaw matrycę oceny do przeszczepu u białych szczeniąt laboratoryjnych P0.

Stosować kapilary ze szkła borokrzemianowego o średnicy wiecznej i wewnętrznej wynoszącej odpowiednio 1,5 milimetra i 1,12 milimetra. Pociągnij kapilarę za pomocą ściągacza P1000. Najpierw wprowadź program ciągnięcia.

Po drugie, umieść kapilarę w uchwytach i dokręć je. Po trzecie, uruchom program i weź dwie wyciągnięte mikrokapilary. Odetnij końcówkę kapilarną ręcznie skalpelem pod mikroskopem stereoskopowym, aby uzyskać końcówkę o średnicy zewnętrznej 200-250 mikrometrów.

Na koniec umieść naczynia włosowate na podłożu z plasteliny na zamkniętej szalce Petriego i przenieś ją pod maskę. Zdezynfekuj światłowody i umieść je pod maską. Wymieszaj mieszanki główne EGTA i Fast Green, aby przygotować roztwór znacznika komórek, a następnie umieść go ponownie pod maską.

Wytnij małe kawałki laboratoryjnej folii uszczelniającej do plamienia zawiesiny komórek. I na koniec przygotuj roztwór 1 miligrama na mililitr sterylnej doksycykliny umieszczonej w strzykawce o pojemności 0,3 mililitra. Rurka iniekcyjna jest przygotowana z dwóch rurek lateksowych.

Przymocuj twardy plastikowy ustnik do jednego końca lateksowej rurki. Następnie przymocuj uchwyt kapilary do jednego końca drugiej rurki lateksowej. Połącz wolne końce dwóch rurek lateksowych ze sterylnego filtra o średnicy 0,45 mikrometra, jako barierę przed zarazkami operatora.

Umieść powstały zespół rurki aspiratora na uchwycie z plasteliny, który ma być przechowywany pod maską. Zbieraj, testuj i kontroluj neurosfery w oddzielnych probówkach. Odwirować zawiesiny neurosfery i zastąpić supernatant PBS.

Powtórz tę sekwencję jeszcze dwa razy. Odwirować zawiesiny neurosfery, zastąpić supernatant roztworem trypsyny i pipetować osad komórkowy w górę iw dół, 4, 5 razy. Pozostaw komórki w inkubatorze na pięć minut, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Zablokuj trypsynę roztworem inhibitora trypsyny. Odwiruj komórki i ponownie zawieś je w świeżej pożywce proliferacyjnej. Policz komórki z dwóch pul i dostosuj ich stężenie do 100 000 komórek na mikrolitr w pożywce proliferacyjnej.

Następnie wymieszaj komórki testowe i kontrolne 1:1 i sprawdź otrzymaną mieszaninę pod mikroskopem fluorescencyjnym. Na koniec umieść mieszankę na lodzie pod maską. Przygotuj klatkę z matką i młodymi na stole z dala od obszaru chirurgicznego.

Umieść klatkę regeneracyjną na wózku. Połóż mieszankę trocin pobranych z klatki matki na jej dnie i umieść klatkę regeneracyjną pod lampą. Odłóż na bok pojemnik na lód przykryty folią aluminiową do znieczulenia szczeniąt P0.

Tuż przed przeszczepem dodaj od 1 do 10 objętości roztworu znacznika komórkowego do jednej objętości zawiesiny komórek i umieść trzy mikrolitry powstałej mieszaniny na kawałku laboratoryjnej folii uszczelniającej. Umieść szczeniaka na chłodnej folii aluminiowej na minutę i sprawdź, czy jest w pełni znieczulony. W międzyczasie zassaj 3 mikrolitry mieszanki iniekcyjnej do szklanej kapilary.

Delikatnie przetrzyj głowę znieczulonego szczeniaka 70% etanolem. Następnie zlokalizuj go na światłowodzie, aby wyraźnie zidentyfikować półkule korowe. Wejdź do naczynia włosowatego z przodu i uzyskaj dostęp do jamy komorowej.

Zwróć przy tym uwagę, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych. Aby zapobiec uszkodzeniu wyniosłości zwojowej, obróć igłę na boki o trzydzieści stopni. Delikatnie wstrzyknij komórki do jamy i monitoruj ich dyfuzję za pomocą Fast Green.

Poczekaj od pięciu do dziesięciu sekund. Wyjąć szklaną igłę, uważając, aby nie zassać zawiesiny komórek, i wyrzucić ją do odpowiedniego pojemnika na odpady. Przed wyzdrowieniem szczeniąt ze znieczulenia wstrzyknij dootrzewnowo 150 mikrolitrów roztworu doxy, aby utrzymać ekspresję transgeniczną po przeszczepie.

Po wstrzyknięciu należy umieścić młode bezpośrednio pod lampą w celu odzyskania sprawności. Zostaw tam szczenięta na pięć do dziesięciu minut, a gdy w pełni się obudzą, umieść je w klatce z matką. Obserwuj operowane młode przez dwie do trzech godzin, aby upewnić się, że matka je akceptuje.

Zaopatrz klatkę w wodę pitną zawierającą 0,5 mg/ml doksycykliny i sacharozy, aby utrzymać ekspresję transgeniczną. Zastąp wodę zawierającą doksycyklinę wodą wolną od doksu cztery dni po przeszczepie. W ten sposób aktywuje się trans-gen w neuronach postmitotycznych.

Trzymaj myszy w reżimie wolnym od doxy przez sześć dni i poddaj je eutanazji w wieku P10. Napraw mózgi szczeniąt poddanych eutanazji w 4% PFA, w czterech stopniach, przez noc. Usuń roztwór PFA i zastąp go 30% roztworem sacharozy.

Pozostaw mózgi w temperaturze czterech stopni, aż opadną na dno fiolki. Przenieś mózgi do jednorazowej formy do osadzania wypełnionej w przybliżeniu do połowy pożywką do krioinkluzji. Zamroź dołączony mózg w temperaturze 80 stopni.

Wytnij odcinki koronalne o grubości 60 mikronów za pomocą kriostatu. Przetwarzaj sekcje pod kątem immunofluorescencji anty-GFP, anty-RFP i przeciwbarwić je roztworem DAPI. Ustaw parametry pracy mikroskopu konfokalnego odpowiednio, jak pokazano.

Zbierz zdjęcia wycinków poddanych testom immunologicznym, wybierając pola fotograficzne bogate w neurony GFP dodatnie, ślepe na dystrybucję sygnału RFP. Eksportuj obrazy jako pliki ND2 i generuj maksymalne projekcje z nich jako pliki TIFF. Aby umożliwić późniejszą szkieletyzację neuronów w ślepej linii genotypu komórki, ukryj czerwony sygnał.

W tym celu dodaj warstwę dopasowania. Wybierz poziomy, wybierz czerwony. Ustaw wyjście na zero.

I zapisz plik jako taki. Szkieletyzacja jest następnie wykonywana przez nowego operatora, który nie miał wcześniej dostępu do oryginalnych, zwykłych czerwonych plików. Dla każdego ukrytego czerwonego pliku otwórz plik, dodaj warstwę rysunkową do obrazu głównego i wybierz narzędzie ołówka.

Śledź somer na podstawie sygnału GFP. Następnie prześledź neuryty. Na koniec zapisz plik wielowarstwowy, w tym sylwetki neuronów.

Późniejsza analiza szkieletów neuronalnych może być wykonana przez dowolnego operatora. Otwórz każdy plik mulitlayer, utwórz nowe puste 16-bitowe pliki w skali szarości z czarnym tłem. Jeden na neuron.

Kopiuj i wklejaj sylwetki pojedynczych neuronów z obrazu głównego do plików w skali szarości. Wróć do pliku wielowarstwowego i wyłącz warstwę dostosowawczą, aby odsłonić genotypy neuronów. Zapisz 16-bitowe pliki w skali szarości, dodając adnotacje do odpowiadających im genotypów neuronów.

Importuj obrazy w skali szarości do ImageJ jeden po drugim i analizuj szkielety za pomocą wtyczki NeurphologyJ. Zbierz wybrane dane pierwotne NeurofologiiJ, całkowitą powierzchnię długości neurytów, punkty przyczepu i punkty końcowe w arkuszu kalkulacyjnym i wykorzystaj je do obliczenia drugorzędowych parametrów morfometrycznych. Proponowany przez nas protokół inżynieryjny pozwala na kotransdukcję zdecydowanej większości badanych neuronów z zamierzonymi zestawami transgenów.

Ponadto pozwala na osiągnięcie znacznej jednorodności poziomów ekspresji transgenu w obrębie transdukowanej populacji komórek. Kluczową cechą naszej procedury jest jej sparowana konfiguracja. Test i kontrolna pula prekursorów są oddzielnie projektowane, mieszane 1:1, a na koniec przeszczepiane.

To sparowane podejście ułatwi wykrywanie różnic w wynikach związanych z różnymi genotypami. W tym przykładzie przeanalizowaliśmy przekroje koronalne przeszczepionych szczeniąt, dziesięć dni po międzykomorowym wstrzyknięciu prekursorów neuronów Foxg1 z nadekspresją i kontrolnych. Obrazy grup neuronów uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Pliki Z-stack zostały użyte do obliczenia maksymalnych projekcji. Sylwetki neuronów były śledzone ręcznie. Tutaj zielone i żółte sylwetki reprezentują odpowiednio neurony z nadekspresją i kontrolą Foxg1.

Na koniec wykorzystano podstawowe parametry uzyskane za pomocą analizy NeurphologyJ, aby obliczyć wtórne wskaźniki morfometryczne, jak pokazano na ilustracji. Jest to prosty protokół, który pozwala badaczowi ocenić wpływ, jaki mieszana ekspresja danego genu może wywierać na precyzyjną kontrolę rozwoju neurytów in vivo. Główne zalety tego protokołu są dwie.

Istniejąca liczba genów biorących udział w morfogenezie neuronów może być funkcjonalnie scharakteryzowana in vivo, przy braku odpowiadających im linii teratogennych. A do analizy potrzeba mniej zwierząt, aby uzyskać znaczące wyniki statystyczne.