Name: Paraliż wywołany pływaniem w celu oceny sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj metodę SWIP do badania sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans. Ten protokół behawioralny umożliwia szybką identyfikację genów związanych z synapsą dopaminergiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Osama Refai z laboratorium dr Randy'ego Blakely'ego za wskazówki dotyczące automatycznej analizy SWIP. Prace te były wspierane przez finansowanie z NIH R01 DA042156 LC.

1. Przygotowanie rozwiązań i mediów
<ol>
	<li>Przygotować bufor M9 rozpuszczając KH2PO4 3,0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6,0 g (42,2 mM) i NaCl 5,0 g (85,5 mM) w 1 l autoklawowanej wody dejonizowanej. Dodać 1,0 ml 1 MMgSO4 (12 g w końcowej objętości 100 ml autoklawowanej wody dejonizowanej) po autoklawowaniu. Wymieszaj 100 ml powstałego 10x M9 z 900 ml autoklawowanej wody dejonizowanej, aby uzyskać 1x roztwór.</li>
	<li>Aby przygotować bufor jaj, rozpuść 6,896 g NaCl (118 mM), 3,578 g KCl (48 mM), 0,294 g CaCl2-2H 2O (2 mM), 0,406 g MgCl2-6H 2O (2 mM) i 5,958 g (25 mM) HEPES w 1 l autoklawowanej wody dejonizowanej. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór podchlorynu sodu/NaOH, dodając 1 ml 5-6% podchlorynu sodu (wybielacz) i 180 μl 10 N NaOH do 3,8 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Odważyć 60 g sacharozy i rozpuścić w autoklawowanej wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 100 ml, aby uzyskać 60% roztwór sacharozy.</li>
	<li>Rozpuść 0,684 g sacharozy w 10 ml autoklawowanej wody dejonizowanej, aby uzyskać 200 mM sacharozy. Sprawdź i dostosuj do tej samej osmolarności za pomocą osmometru. Przygotować 1 ml porcji w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Odważyć 0,184 g AMPH (masa cząsteczkowa 184,75 g/mol) i rozpuścić w 10 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać 100 mM roztwór podstawowy. Zmieszać 2 μl roztworu podstawowego z 400 μl wody, aby uzyskać 0,5 mM roztworu roboczego.</li>
	<li>Przygotuj płytki z pożywką (NGM)
	<ol>
		<li>Zmieszać 3 g NaCl (52,65 mM), 20 g peptonu, 25 g bakto-agaru i 975 ml wody dejonizowanej w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera. Dołącz mieszadło magnetyczne i autoklaw (121 °C, 15 PSI) na 1 godzinę w cyklu cieczy.</li>
		<li>Schłodzić i utrzymać temperaturę około 50 °C, umieszczając kolbę na podgrzewaczu podczas mieszania. Dodać 0,5 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2 i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu o pH 7,4 (108,3 g KH2PO4, 35,6 g K2HPO4, woda dejonizowana do 1 l).</li>
		<li>Odpipetować po 25 ml na płytki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i pozostawić podłoże do zestalenia. Przechowywać płytki do góry nogami w temperaturze 4 °C w pudełku do 4 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bulionu lizogennego (LB)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5 g mieszaniny proszku LB w 200 ml wody dejonizowanej w kolbie Erlenmeyera. Autoklaw przez 30 minut z wykorzystaniem cyklu sterylizacji cieczy. Pozostaw bulion do ostygnięcia. Przechowywać w temperaturze pokojowej przez 1-2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek bakteryjnych NA22
	<ol>
		<li>Użyj sterylnej końcówki pipety lub sterylnej pętli bakteryjnej, aby pokryć płytkę LB niewielką objętością bakterii NA22 E. coli z wywaru glicerolu i inkubować płytkę do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez noc, aby wyhodować izolowane kolonie. Zbierz i wprowadź pojedynczą rodzinę do 200 ml bulionu LB przygotowanego w kroku 1.8 i pozostaw na noc do wzrostu w temperaturze 37 °C na platformie do wytrząsania.</li>
		<li>Aby wysiać płytki, należy nanieść 200 μl kultury bakteryjnej na płytki NGM przygotowane wcześniej w kroku 1.7 i rozprowadzić sterylnym szklanym kijem hokejowym. Pozostaw talerze do wyschnięcia na noc lub dłużej pod kapturem i przechowuj do góry nogami w hermetycznym pudełku w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zrobić narzędzie do rzęs/platyny do zbierania robaków, przyklej grubą rzęsę lub platynowe włókno do szklanej pipety Pasteura za pomocą super kleju. Odetnij końcówkę rzęsy pod kątem za pomocą żyletki. Alternatywnie można użyć palnika Bunsena do stopienia końcówki szklanej pipety wokół włókna platynowego.</li>
</ol>
2. Hodowla C. elegans
UWAGA: Szczep N2C. elegans typu dzikiego na płytkach Escherichia coli NA22. Szczegółowe metody hodowli opisano poniżej.
<ol>
	<li>Przygotowanie kultury robaków
	<ol>
		<li>Aby przygotować kulturę starterową robaków, wytnij mały kawałek agaru z płytki zawierającej dobrze odżywione zwierzęta i przenieś go na płytkę z bakteriami NA22 E. coli przygotowaną w kroku 1.9 za pomocą sterylnej szpatułki. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez 3-4 dni. Pod mikroskopem stereoskopowym wizualnie potwierdź obecność ciężarnych dorosłych osobników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zsynchronizowanej populacji robaków
	<ol>
		<li>Zbierz ciężarne dorosłe osobniki z co najmniej 2 talerzy, dozując autoklawowaną wodę dejonizowaną dookoła talerza za pomocą butelki ze spryskiwaczem. Delikatnie zakręć płytką, aby usunąć robaki i zbierz robaki do stożkowej rurki polistyrenowej o pojemności 15 ml za pomocą jednorazowej plastikowej pipety.</li>
		<li>Wirować probówkę w wirówce o sile 140 x g przez 2 minuty, aby osadzać robaki, a następnie odessać supernatant za pomocą pompy próżniowej lub z wbudowanym odkurzaczem laboratoryjnym.</li>
		<li>Ponownie zawiesić i umyć robaki, napełniając probówkę autoklawowaną wodą dejonizowaną, a następnie wymieszać i odwirować przy 140 x g przez 2 minuty. Odessać supernatant i powtórzyć ten ostatni krok jeszcze dwa razy lub do momentu, gdy robaki zostaną usunięte z bakterii (woda wydaje się czysta po zmieszaniu z robakami).</li>
		<li>Dodać 5 ml świeżo przygotowanego roztworu podchlorynu sodu/NaOH (krok 1.3) do osadu robaka i szybko wymieszać za pomocą wiru. Inkubuj rurkę na bujaku przez około 4-8 minut. Czas inkubacji z roztworem podchlorynu sodu/NaOH waha się między 4-8 minut w zależności od jakości podstawowego roztworu podchlorynu sodu (wybielacza).</li>
		<li>Umieść kroplę (2-50 μl) roztworu zawierającego robaki na szklanym szkiełku mikroskopowym i sprawdzaj co 2 minuty pod mikroskopem pod mikroskopem pod kątem lizy robaków. Gdy około 70% robaków zostanie poddanych lizie i jaja zostaną uwolnione, napełnij probówkę buforem do jaj przygotowanym w kroku 1.2 i natychmiast odwiruj przez 1 minutę przy 140 x g w celu osadzenia zarodków i tuszek robaków.</li>
		<li>Odessać supernatant i umyć osad jeszcze 3 razy, za każdym razem napełniając probówkę buforem do jaj. Wirować przy 140 x g przez 1 minutę i za każdym razem usuwać supernatant. Granulka zmienia kolor na biały pod koniec prania.</li>
		<li>Po ostatnim płukaniu oddzielić zarodki od martwych tusz w 30% roztworze sacharozy. Dodać 5 ml autoklawowanej wody dejonizowanej do osadu, ponownie zawiesić i dodać 5 ml 60% sacharozy przygotowanej w kroku 1.4. Dokładnie wymieszać i odwirować przy 160 x g przez 6 min.</li>
		<li>Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś zarodki unoszące się na górnej łąkotce do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Nie należy przyjmować więcej niż 3-4 ml. Aby usunąć pozostałą sacharozę, przemyj zarodki 3 razy wodą w autoklawie, wirując przy 140 x g przez 3 minuty, usuwając supernatant i ponownie zawieszając osad (i napełniając probówkę) za każdym razem.</li>
		<li>Powtórz pranie z 1x buforem M9. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić granulkę w 10 ml M9. Pozostaw probówki na shakerze na noc (nie dłużej niż 14 godzin), aby z jaj wylęgły się larwy L1. Robaki pozostaną w stadium larwalnym L1 z powodu braku pożywienia.</li>
		<li>Przemyj larwy L1 3 razy wodą z autoklawizem, aby usunąć wszelkie feromony uwalniane przez larwy przez odwirowanie przy 140 x g przez 2 min. Ponownie zawiesić larwy w 1 ml wody. Rozcieńczyć robaki w wodzie w stosunku 1:10, odpipetować kroplę o pojemności 10 μl na szkiełko podstawowe, nałożyć szkiełko nakrywkowe i policzyć liczbę robaków pod stereoskopem. Powtórz to dwa razy i uśrednij wyniki.</li>
		<li>Odpipetuj objętość robaków odpowiadającą około 1000 robaków na płytkę NA22 (która została wcześniej doprowadzona do temperatury pokojowej), umieszczając małe krople na płytce. Pozostaw talerz do połowy otwarty, aż kropla wyschnie. Następnie przykryć płytkę i inkubować do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 20 °C przez około 44-48 godzin lub do momentu, gdy robaki osiągną późne stadium L4, co zostanie potwierdzone wizualnie pod mikroskopem stereoskopowym. Teraz robaki są gotowe do przetestowania pod kątem SWIP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. SWIP
UWAGA: Opisujemy ręczną metodę oceny SWIP u dzikich robaków leczonych AMPH. Pokrótce omawiamy również śledzenie robaków i dalszą analizę kinetyki robaków za pomocą automatycznego śledzenia robaków i oprogramowania śledzącego, które zostały wcześniej opisane przez Hardaway et al.10.
<ol>
	<li>Ręczna metoda testowania SWIP
	<ol>
		<li>Podwielokrotność 40 μl roztworu sacharozy o stężeniu 200 mOsm/l, z 0,5 mM AMPH lub bez, do szklanej płytki punktowej. Pod stereoskopem wybierz 8-10 robaków w późnym stadium L4 za pomocą szpikulca lub platynowego kilofa i zanurz szpikulec w płytce zawierającej roztwór, aż robaki odejdą od kilofa i wpłyną do roztworu. Zanotuj liczbę robaków pobranych do studni, uruchom stoper, obserwuj i zapisuj liczbę robaków wykazujących SWIP w każdej minucie.</li>
		<li>Skopiuj surowe dane do arkusza kalkulacyjnego i oblicz procent robaków sparaliżowanych, dzieląc liczbę robaków sparaliżowanych co minutę przez całkowitą liczbę robaków testowanych w całym teście i pomnóż przez 100. Skopiuj wartości procentowe do dowolnego oprogramowania do tworzenia wykresów i statystyk i wykreśl dane z wartościami procentowymi na osi Y i czasem na osi X przy użyciu formatu wykresu XY.</li>
		<li>Wykonaj dwukierunkową ANOVA, a następnie analizę post-hoc (np. test Bonferroni po teście) w celu zbadania istotności statystycznej wśród grupy kontrolnej, AMPH i czasu leczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zautomatyzowana analiza SWIP
	<ol>
		<li>Wykonuj automatyczną analizę pojedynczego robaka na raz. Protokół konfiguracji kamery, oprogramowanie do śledzenia robaków oraz skrypt do uruchamiania analizy oprogramowania śledzącego są szczegółowo opisane w Hardaway et al.16.</li>
		<li>Krótko mówiąc, umieść pojedynczy hermafrodytę późnego stadium L4 w szklanej płytce punktowej za pomocą szpikulca do rzęs, jak opisano w metodzie ręcznej w sekcji 3.1.2. Nagrywaj filmy z pływania jednego robaka na raz i użyj oprogramowania do śledzenia robaków, aby obliczyć częstotliwość zgięć ciała.</li>
		<li>Postępuj zgodnie ze skryptem dostarczonym z oprogramowaniem śledzącym, aby uzyskać częstotliwość młócenia robaków i wygenerować mapy cieplne na podstawie danych o młóceniu robaków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li>
<li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Transporter%2FSyntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192(2008).</li>
<li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li>
<li>Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRefai%2C+O+%22Neurochemistry+International%22">Neurochemistry International</a>. , (2018).</li>
<li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13%2FERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li>
<li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li>
<li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).</li>
<li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li>
<li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li>
<li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li>
<li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+%2F+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li>
<li>Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li>
<li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+%28TSP-17%29+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767(2014).</li>
<li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy krok po kroku protokół wykonywania testu behawioralnego, SWIP, u C. elegans. Protokół ten jest prosty i nieskomplikowany, bez większych przeszkód technicznych, dzięki czemu ten test jest bardzo przyjazny dla użytkownika. Niemniej jednak istnieją pewne krytyczne aspekty, które należy wziąć pod uwagę, aby skutecznie przeprowadzić test.
Należy dołożyć starań, aby upewnić się, że robaki użyte do testu są dobrze odżywione, ponieważ ograniczenia dietetyczne mają wpływ na SWI...

Zwierzęta wykonują różnorodne wrodzone i złożone zachowania, które są pośredniczone przez różne neuroprzekaźniki koordynowane przez skomplikowane procesy sygnalizacyjne. Neuroprzekaźnik dopamina (DA) pośredniczy w wysoce konserwatywnych zachowaniach u różnych gatunków, w tym w uczeniu się, funkcjach motorycznych i przetwarzaniu nagrody.
Nicień glebowy C. elegans, z stosunkowo prostym i dobrze odwzorowanym układem nerwowym składającym się tylko z 302 neuronów, wykazuje wyraźnie złożone zachowania, w tym wiele regulowanych przez DA, takich jak krycie, nauka, żerowanie, poruszanie się i składanie jaj1. Wśród innych cech, krótki cykl życia, łatwość obsługi i zachowanie cząsteczek sygnałowych, podkreślają zalety wykorzystania C. elegans jako modelu do badania neuronalnych podstaw zachowań.
Hermafrodyta C. elegans zawiera osiem neuronów dopaminergicznych; Oprócz tego samiec zawiera sześć dodatkowych par do celów godowych. Podobnie jak u ssaków, neurony te syntetyzują DA i wyrażają transporter DA (DAT-1), białko błonowe występujące wyłącznie w neuronach dopaminergicznych, które transportuje DA uwolnione w szczelinie synaptycznej z powrotem do neuronów dopaminergicznych. Co więcej, większość białek biorących udział w każdym etapie syntezy, pakowania i uwalniania DA jest wysoce konserwatywna między robakami a ludźmi i, podobnie jak u ssaków, DA moduluje zachowania żywieniowe i lokomocję u C. elegans2.
C. elegans pełza po twardych powierzchniach i pływa z charakterystycznym miotaniem się w wodzie. Co ciekawe, mutanty pozbawione ekspresji DAT-1 (dat-1) normalnie pełzają po twardej powierzchni, ale nie są w stanie utrzymać pływania, gdy są zanurzone w wodzie. To zachowanie zostało nazwane paraliżem wywołanym pływaniem lub SWIP. Wcześniejsze eksperymenty wykazały, że SWIP jest częściowo spowodowany nadmiarem DA w szczelinie synaptycznej, która ostatecznie nadmiernie stymuluje receptory postsynaptyczne podobne do D2 (DOP-3). Chociaż pierwotnie zidentyfikowany w dat-1 knockout animals3, SWIP jest również obserwowany u zwierząt typu dzikiego leczonych lekami, które blokują aktywność DAT (np. imipramine4) i/lub indukują uwalnianie DA (np. amfetamina5). Z drugiej strony, farmakologiczne lub genetyczne manipulacje zapobiegające syntezie i uwalnianiu DA oraz blokujące funkcję receptora DOP-3 uniemożliwiają SWIP6. Podsumowując, te już opublikowane dane ustaliły, że SWIP jest wiarygodnym narzędziem do badania efektów behawioralnych powodowanych przez zmutowane białka w synapsach dopaminergicznych3,4,7 i może być stosowany do badań genetycznych w celu identyfikacji nowych szlaków regulacyjnych zaangażowanych w sygnalizację DA7,8,9,10,11,12. Dodatkowo, dostarczając łatwo mierzalnego odczytu zachowań wywołanych przez narkotyki u żywych zwierząt, SWIP umożliwia wyjaśnienie mechanizmów działania leków, takich jak amfetamina (AMPH) i azaperon, w synapsach dopaminergicznych5,6,13,14,15.
Protokoły przeprowadzania testów SWIP zostały opisane wcześniej16. W tym miejscu szczegółowo opisujemy metodologię i konfigurację do przeprowadzenia testu w celu zapewnienia wizualnego przewodnika dla społeczności C. elegans w celu skutecznego przeprowadzenia SWIP.

<table><tbody><tr><td>Folia</td><td>aluminiowa Reynolds wrap</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>Amfetamina</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawikowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator bakteryjny</td><td>New Brunswick scientific</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>Klasa bakteriologiczna, Agar</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&nbsp; A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) Pepton</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia (dwuwodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Camera&nbsp;</td>Wirówka <td>Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>Milli-Q</td></tr><tr><td>Szklana płytka punktowa depresja</td><td>Corning</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>Rzęsa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>szklane Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów i statystyk</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>Podchloryn</td><td>Hawkins</td><td>Podchloryn sodu 4-6%, USP" 1 gal</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (sześciowodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=M0250</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (siedmiowodny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 bakterie</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>Model 3320</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>Rurki stożkowe z polistriny</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu - DIBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu - MONOBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>10ml=89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan sodu</td><td>Fisher</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny</td><td>MS office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Model tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet</td><td>Różne</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB=S5016</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Loctite</td><td>1647358 .14 uncji.</td><td></td></tr><tr><td>SwimR sofware</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie do nagrywania wideo</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

paraliż wywołany pływaniem w celu oceny sygnalizacji dopaminy w caenorhabditis elegans

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Test pływacki opisany w tym protokole jest dobrym narzędziem do identyfikacji białek regulujących synapsy dopaminergiczne. Podobnie jak u ssaków, dopamina (DA) kontroluje kilka funkcji u C. elegans, w tym uczenie się i aktywność motoryczną. Stany, które stymulują uwalnianie DA (np. Leczenie amfetaminą (AMPH)) lub które uniemożliwiają klirens DA (np. zwierzęta pozbawione transportera DA (dat-1), które nie są zdolne do reakumulacji DA do neuronów) generują nadmiar zewnątrzkomórkowego DA, co ostatecznie prowadzi do zahamowania lokomocji. Takie zachowanie jest szczególnie widoczne, gdy zwierzęta pływają w wodzie. W rzeczywistości, podczas gdy zwierzęta typu dzikiego nadal pływają przez dłuższy czas, mutanty zerowe dat-1 i dzikie typy traktowane AMPH lub inhibitorami transportera DA opadają na dno studni i nie poruszają się. Takie zachowanie określa się mianem "paraliżu wywołanego pływaniem" (SWIP). Chociaż test SWIP jest dobrze znany, brakuje szczegółowego opisu metody. W tym miejscu opisujemy przewodnik krok po kroku, jak wykonać SWIP. Aby przeprowadzić test, późne larwy w stadium 4 umieszcza się na szklanej płytce punktowej zawierającej kontrolny roztwór sacharozy z AMPH lub bez. Zwierzęta są oceniane pod kątem ich zachowania podczas pływania ręcznie poprzez wizualizację pod stereoskopem lub automatycznie poprzez nagrywanie za pomocą kamery zamontowanej na stereoskopie. Filmy są następnie analizowane za pomocą oprogramowania śledzącego, które zapewnia wizualną reprezentację częstotliwości uderzeń i paraliżu w postaci map cieplnych. Zarówno ręczne, jak i zautomatyzowane systemy gwarantują łatwy do oszacowania odczyt zdolności pływania zwierząt, a tym samym ułatwiają badania przesiewowe zwierząt z mutacjami w obrębie układu dopaminergicznego lub genów pomocniczych. Ponadto SWIP może być wykorzystany do wyjaśnienia mechanizmu działania leków stosowanych w narkomanii, takich jak AMPH.

Przedstawiamy przykład testu SWIP indukowanego traktowaniem AMPH. Rycina 1 przedstawia schematyczne ujęcie konfiguracji testu opisanego powyżej. W przypadku testu ręcznego, około 8-10 zsynchronizowanych wiekowo nicieni w późnym stadium L4 zbiera się za pomocą rzęsy lub platynowej igły i umieszcza w szklanej płytce z dołkami wypełnionej 40 µL 200 mOsm/L sacharozy (roztwór kontrolny) lub sacharozy z 0,5 mM AMPH, a następnie bada się występowanie SWIP.
<p cl...

Paraliż wywołany pływaniem (SWIP) jest dobrze znanym testem behawioralnym używanym do badania mechanizmów leżących u podstaw sygnalizacji dopaminowej u Caenorhabditis elegans (C. elegans). Brakuje jednak szczegółowej metody przeprowadzenia testu. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół SWIP.

Paraliż wywołany pływaniem w celu oceny sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie paraliżu wywołanego pływaniem lub SWIP, testu behawioralnego do oceny sygnalizacji dopaminy u C. elegans. SWIP umożliwia szybką identyfikację genów w obrębie synapsy dopaminergicznej lub z nią związanych. Metoda ta pozwala na zbadanie efektów wywoływanych przez nadmiar dopaminy zewnątrzkomórkowej, który jest spowodowany na przykład przez leki lub mutacje w transporterze dopaminy.Aby zapewnić, że wszystkie robaki badane podczas testu pływają przez ten sam czas, zwierzęta muszą być szybko przeniesione do roztworu. Procedurę zademonstrują Sirisha Kudumala i Serene Sossi. Oboje pracują w moim laboratorium.Aby założyć kultury starterowe robaków, użyj sterylnej szpatułki, aby wyciąć małe kawałki agaru z płytki zawierającej dobrze odżywione C.elegans i przenieść kawałki agaru na indywidualne płytki NA22 E.coli. Po inkubacji płytek w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni, wizualnie potwierdź obecność grabilnych dorosłych osobników pod mikroskopem stereoskopowym. Aby uzyskać zsynchronizowaną populację robaków, spryskaj wodą talerz pełen grawitacyjnych dorosłych.Delikatnie zakręć płytką, aby usunąć robaki i użyj pipety d

swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wykorzystania C. elegans do oceny neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych jako modelu choroby Parkinsona. Ponadto zastosowano przesiewy genetyczne w celu zidentyfikowania czynników, które albo nasilają degenerację, albo wykazują działanie neuroprotekcyjne.

Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w sposób komplementarny do badania funkcji synaptycznych u nicienia C. elegans. To komplementarne podejście może być również wykorzystane do wyjaśnienia ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów modulujących synchronizację neuronalną i ma znaczenie w badaniach nad epilepsją oraz napadami drgawkowymi.

Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Tutaj wprowadzamy test do pomiaru SWIP, behawioralnego fenotypu C. elegans, który występuje podczas energicznych ruchów, takich jak pływanie. Przykładowy protokół omawia zarówno ręczne, jak i automatyczne podejścia do analizy.

Test paraliżu wywołanego pływaniem (SWIP): metoda ilościowego określania lokomocji za pośrednictwem dopaminy u C. elegans

Ten film demonstruje zastosowanie testu lokomocji promieniowej do oceny dysfunkcji motorycznej u C. elegans wykazujących ekspresję ludzkiego białka TDP-43 typu dzikiego lub z mutacją ALS. Robaki o różnym poziomie ekspresji TDP-43 typu dzikiego lub zmutowanego mogą pełzać, a ich ruch jest mierzony odległością promieniową przebytą od centralnego punktu na płytce testowej. Test rozróżnia łagodne, umiarkowane i ciężkie upośledzenie motoryczne na podstawie odległości przebytej przez różne szczepy C.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach C. elegans za pomocą testu lokomocji radialnej

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Opisana jest skuteczna i prosta metodologia komputerowej analizy zachowania nicieni podczas pływania w cieczy. Metoda ta wymaga niewielkich lub żadnych inwestycji dla laboratoriów C. elegans. Używany sprzęt jest standardowy, a oprogramowanie komputerowe do analizy behawioralnej (CeleST) jest oprogramowaniem typu open source.

Zautomatyzowana analiza zachowania C. elegans podczas pływania przy użyciu oprogramowania CeleST

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Obecny protokół opisuje test określający odpowiedź na lewamizol, farmakologicznego agonistę jednej klasy receptorów acetylocholiny Caenorhabditis elegans. W tym płynnym teście pływania z lewamizolem naukowcy wizualnie obserwują i określają ilościowo zależny od czasu paraliż zwierząt hodowanych na 24-dołkowych płytkach.

Pomiar wrażliwości Caenorhabditis elegans na lewamizol, agonistę receptora acetylocholiny

Protokół ten opisuje ilościowy test defekacji u młodych mutantów RAC1/CED-10 Caenorhabditis elegans, oferując prosty model do badania stadij choroby Parkinsona prodromalnej. Przezwycięża ograniczenia innych modeli zwierzęcych i ułatwia testowanie strategii terapeutycznych skierowanych do wczesnej patologii Parkinsona.

Ocena ruchliwości przewodu pokarmowego u mutantów Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 jako narzędzie do badania wczesnej choroby Parkinsona

Poznaj metodę SWIP do badania sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans. Ten protokół behawioralny umożliwia szybką identyfikację genów związanych z synapsą dopaminergiczną.

Paraliż wywołany pływaniem w celu oceny sygnalizacji dopaminy w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów