Name: Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 + (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w komórkach nerwowych i glejowych z użyciem genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺. Technika umożliwia monitorowanie sygnałów wapniowych w czasie rzeczywistym z rozdzielczością subkomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez następujące granty: Japońska Agencja Nauki i Technologii (JST)/ Prekursorskie Badania nad Embrionalną Nauką i Technologią (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japonia); Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS)/Granty na Pomoc dla Badań Naukowych (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Fundacja Takeda. Autorzy dziękują Haruhiko Bito (Uniwersytet Tokijski) za dostarczenie RCaMP2 oraz Arthurowi J.Y. Huangowi i Thomasowi McHugh (RIKEN CBS) za dostarczenie wektorów AAV i instrukcje dotyczące przygotowania AAV. Autorzy chcieliby również podziękować redaktorom Journal of Visualized Experiments za ich pomoc w kręceniu i montażu filmów.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca%282%2B%29+Sensing%3A+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li>
<li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+local+Ca%282%2B%29+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li>
<li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li>
<li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+Ca2%2B+signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li>
<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+high-affinity%2C+fast%2C+red+calcium+indicator+R-CaMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li>
<li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li>
<li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li>
<li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).</li>
<li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+subtle%2C+transient%2C+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li>
<li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TI+Workbench%2C+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxford%2C+UK%29%22%5BJournal%5D)">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li>
<li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różne wyjścia biologiczne są inicjowane przez sygnały Ca2+ . Ca2+ jest wszechstronnym wewnątrzkomórkowym przekaźnikiem sygnałowym. Dekodowanie sygnałów Ca2 + w celu wywołania określonych wyjść było fundamentalnym pytaniem biologicznym i potrzebne są techniki obrazowania Ca2 + w celu opisania różnorodności sygnałów Ca2 + . Obecnie szczegółowy protokół umożliwia wykrywanie wyraźnych sygnałów Ca2 + na błonie plazmatycznej i ER (Figura 3 i Figura 4) oraz lokalnych mikrodomen Ca2+ wewnątrz komórki (Figura 4 i Figura 5). Przyczynia się to do opisania różnorodności wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2 + . Rozdzielczość czasowa sygnałów Ca2 + została również poprawiona poprzez ukierunkowanie GECI w błonie plazmatycznej i ER, ponieważ może uniknąć efektu trójwymiarowej dyfuzji Ca2 + i samych GECI i ma potencjał do wykrycia samego momentu napływu Ca2 + lub uwolnienia Ca2 + , które następuje na błonie.
Protokół ma pewne ograniczenia. Użytkownicy powinni pamiętać, że wykrywane sygnały są sumą "momentu napływu lub uwolnienia Ca2+ " oraz "Ca2+ dyfundowanego z oryginalnego źródła Ca2+ ", szczególnie w przypadku dużych sygnałów Ca2+ . Na przykład, chociaż jego stymulacja w komórkach HeLa wywołuje uwalnianie Ca2 + z ER, jego wynikowe sygnały Ca2 + są wykrywane nie tylko przez OER-GCaMP6f ukierunkowany na ER, ale także przez Lck-RCaMP2 ukierunkowany na błonę plazmatyczną (Figura 3). Innym ograniczeniem jest to, że czasoprzestrzenny wzorzec sygnałów Ca2+ może nie być jedynym wyznacznikiem wyjścia sygnałów Ca2+ . Dystrybucja dalszych białek efektorowych (takich jak kinazy i fosfatazy zależne odCa2+) może być również czynnikiem decydującym2. Aby całkowicie zdekodować wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2 + , absolutnie konieczna jest analiza zachowania enzymów w dalszej części procesu, która nie jest objęta tym protokołem.
Jednym z najbardziej krytycznych aspektów udanego obrazowania Ca2+ jest konfiguracja obrazowania i warunki akwizycji obrazu, a także w innych badaniach obrazowania na żywo. Wcześniej wykazaliśmy, że odpowiedzi Ca2 + w komórce są silnie zależne od czasu trwania i intensywności wzbudzenia oraz od warunków akwizycji obrazu, w tym czasu ekspozycji i częstotliwości akwizycji16. Moc oświetlenia wzbudzenia jest najbardziej krytycznym czynnikiem, ponieważ może powodować toksyczność światła i fotowybielanie GECI. Warunki zapisu czasu ekspozycji, częstotliwości zapisu, natężenia światła wzbudzenia i czasu trwania zapisu powinny być zoptymalizowane zgodnie z celem eksperymentu. Zalecamy maksymalne skrócenie czasu ekspozycji i intensywności światła wzbudzającego, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności dla komórki. Częstotliwość rejestrowania i czas trwania zapisu powinny być wystarczające, aby objąć zdarzenia związane z wysokościąCa2+ będące przedmiotem zainteresowania, ale powinny być utrzymywane na jak najniższym poziomie, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności. Zalecamy najpierw określenie częstotliwości i czasu nagrywania oraz optymalizację natężenia światła i czasu naświetlania, aby zminimalizować fotowybielanie GECI. Kolejnym ważnym czynnikiem jest poziom ekspresji GECI. GECI mają efekt buforowania Ca2 +, ponieważ są białkami wiążącymi Ca2 +. Dlatego nadekspresja GECI powoduje buforowanie Ca2 +, który jest fizjologicznie niezbędny dla komórek. Ilość ekspresji GECI powinna być zminimalizowana, aby uniknąć obrazowania komórek wyrażających duże ilości GECI.   Podsumowując, rozbiór sygnałów Ca2 + w rozdzielczości subkomórkowej jest jednym z najważniejszych etapów dekodowania wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2 + , które określają wyjściowe zjawisko biologiczne. Protokół ten zapewnia nową metodę analizy sygnałów Ca2+ w celu opisania różnorodności między tymi sygnałami. Obecnie technika ta jest ograniczona do eksperymentów in vitro. Jednak Lck-GCaMP6f jest już stosowany do obrazowania in vivo Ca2 + u myszy17, a potwierdzono OER-GCaMP6f do monitorowania sygnałów Ca2 + in vivo w neuronach ruchowych VD u C. elegans7. W związku z tym celowanie w GECI w przedziale subkomórkowym może zostać w przyszłości rozszerzone na obrazowanie in vivo, umożliwiając w ten sposób rozwarstwienie Ca2+ in vivo.

Ca2+ sygnały reprezentują podwyższenie wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+. Ca2+ jest uniwersalnym drugim przekaźnikiem dla komórek eukariotycznych. Wykorzystując Ca2+, komórki działają poprzez różne wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe i indukują różne wyjścia biologiczne. Na przykład w neuronach uwalnianie pęcherzyków synaptycznych na końcu presynaptycznym, ekspresja genów w jądrze i indukcja plastyczności synaptycznej w postsynapsie są regulowane przez wyraźne sygnały Ca2 +, które precyzyjnie aktywują odpowiednie enzymy w odpowiednich miejscach i z precyzyjnym wyczuciem czasu1. 
Specyficzne czasoprzestrzenne wzorce sygnałów Ca2+ aktywują specyficzne enzymy znajdujące się poniżej. Sygnały Ca2 + są generowane przez koordynację między dwoma różnymi źródłami Ca2 +: napływem Ca2 + z przestrzeni zewnątrzkomórkowej i uwalnianiem Ca2 + z retikulum endoplazmatycznego (ER), które służy jako wewnątrzkomórkowy magazyn Ca2 +. Znaczący czasoprzestrzenny wzorzec sygnalizacji Ca2 + w celu wywołania określonej funkcji komórki jest również wspierany przez nanodomeny 10–100 μM Ca2+ generowane w pobliżu kanałów Ca2+ na błonie plazmatycznej lub błonie ER2. Co ważne, źródło sygnałów Ca2+ jest jednym z najbardziej krytycznych czynników decydujących o dalszym wybiegu biologicznym. W neuronach napływ Ca2 + i uwalnianie Ca2 + mają przeciwny wpływ na grupowanie receptorów kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) A (GABAAR) w synapsach GABAergicznych, co jest odpowiedzialne za hamowanie pobudliwości neuronów3. Napływ Ca2 +, któremu towarzyszy masywne pobudzenie neuronów, indukuje dyspersję synaptycznych klastrów GABAAR, podczas gdy trwałe uwalnianie Ca2 + z ER sprzyja grupowaniu synaptycznych GABAARs. Inne grupy zgłosiły również, że kierunek dostrajania stożków wzrostu jest krytycznie zależny od źródła sygnału Ca2 +: napływ Ca2 + indukuje odpychanie, podczas gdy uwalnianie Ca2 + kieruje przyciąganiem stożka wzrostu neuronów 4. Dlatego, aby w pełni zrozumieć szlaki sygnałowe Ca2 + leżące u podstaw określonych wyjść komórkowych, ważne jest zidentyfikowanie źródła sygnałów Ca2 + poprzez opisanie sygnałów Ca2 + w rozdzielczości subkomórkowej.
W tym protokole opisujemy metodę obrazowania Ca2+ do raportowania sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej, co pozwala na oszacowanie źródeł sygnału Ca2+ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Mikrodomeny Ca2 + znajdujące się tuż pod błoną plazmatyczną są z powodzeniem monitorowane przez genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI) ukierunkowane na błonę plazmatyczną poprzez przyłączenie sygnału lokalizacji błony plazmatycznej Lck w kinazie Src do N-końców GECIs5. Aby wykryć wzorzec sygnału Ca2+ w pobliżu ER w lepszej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, niedawno opracowaliśmy OER-GCaMP6f, w którym GCaMP6f6 celuje w zewnętrzną błonę ER, używając białka transbłonowego ER. OER-GCaMP6f może z wyczuciem zgłaszać uwolnienie Ca2+ z ER w lepszej rozdzielczości czasoprzestrzennej niż konwencjonalny nieukierunkowany GCaMP6f w komórkach COS-77 i HEK293 cells8, unikając dyfuzji Ca2+ i GECIs. Potwierdziliśmy również, że spontaniczne podwyższenie poziomu Ca2 + w hodowanych astrocytach hipokampa zgłoszone przez OER-GCaMP6f wykazało inny wzorzec czasoprzestrzenny w porównaniu do tego monitorowanego przez GCaMP6f ukierunkowanego na błonę plazmatyczną (Lck-GCaMP6f)7,9, co wskazuje, że obrazowanie Ca2+ za pomocą OER-GCaMP6f w połączeniu z Lck-GCaMP6f przyczynia się do rozwarstwienia Ca2+ sygnały w rozdzielczości subkomórkowej w celu identyfikacji ich źródeł.
Obecnie szczegółowo opisujemy protokół sekcji sygnału Ca2+ w komórkach HeLa i mieszanych kulturach neuronów i astrocytów na szklanych szkiełkach nakrywkowych. Wskazana tutaj technika obrazowania Ca2+ z GECI, Lck-GCaMP6f, RCaMP210 (Lck-RCaMP2) i OER-GCaMP6f (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) mają zastosowanie do wszystkich komórek, w których te GECI mogą być wyrażane.

<table><tbody><tr><td>(RS)-3,5-Dihydroksyfenyloglicyna (DHPG)</td><td>Tocris</td><td>#0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5% roztwór podstawowy DNazy I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#11284932001</td><td>Przygotować 0,5% DNazy I (w/v) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa&nbsp; uzupełnionym 120 mM MgSO4. Przygotuj 160 &mikro; L porcji i przechowywać w temperaturze -30 °C.</td></tr><tr><td>0,5% roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25300054</td><td></td></tr><tr><td>100 mM L-glutamina (&razy; 100 zapasów)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25030081</td><td>Przygotowanie małych porcji 250-750 &mikro; L i przechowywać w temperaturze -30 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>100 mM pirogronian sodu (&razy; 100 zapasów)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11360070</td><td>Podwielokrotności (10 ml) można przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Po rozmrożeniu roztwór można utrzymywać w temperaturze 4 & stopni; C przez 2 miesiące.</td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli wielodołkowej z pokrywką o niskiej parowaniu</td><td>Falcon</td><td>#353043</td><td>Pokrywka o niskiej parowaniu ma kluczowe znaczenie dla hodowli mieszanej kultury neuronów i gleju. W przypadku komórek linii komórkowej można zastosować alternatywne szalki hodowlane.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe okrągłe o średnicy 18 mm</td><td>Karl Hecht "Assistent"</td><td>#41001118</td><td>Grubość 1, szkiełka nakrywkowe okrągłe o średnicy 18 mm; można stosować alternatywne szkiełka nakrywkowe.</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15630080</td><td>pH 7,2-7,6</td></tr><tr><td>2,5% roztwór podstawowy trypsyny (&razy; 20 zapasów)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T4674</td><td>Przygotuj 150 &mikro; L i przechowywać w temperaturze -30 °C.</td></tr><tr><td>50% roztwór poli(etyleniminy) (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3143</td><td>Przygotować 2% (V/V) roztwór podstawowy PEI (&razy; 50) z wodą destylowaną sterylizowaną przez filtrację. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -30 stopni Celsjusza. C po przygotowaniu małych porcji 250-750 &mikro;L. Przygotować 0,04% roztwór PEI z wodą destylowaną w dniu powlekania szkiełka nakrywkowego.</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td>Przechowywany w butelce z rozpylaczem do dezynfekcji powierzchni.</td></tr><tr><td>Wirus związany z adenowirusem (AAV) dla ekspresji Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-RCaMP2 pod kierunkiem promotora</td><td></td><td></td><td>EF1a AAV można przygotować przy użyciu AAV Helper Free System (Agilent Technologies) i komórek HEK293 lub metod alternatywnych. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 i&nbsp; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f są dostępne na życzenie.</td></tr><tr><td>B-27 suplement (&razy; 50 stock)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#17504044</td><td>Można go zastąpić suplementem B-27 plus (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) lub MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Niemcy; #130-093-566).</td></tr><tr><td>B57BL/6</td><td>Japonia SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera do rejestracji</td><td></td><td></td> obrazu mikroskopowego <td>Dostępne były następujące kamery: chłodzona kamera CCD (np. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), kamera EM-CCD (np. Hamamatsu Photonics,&nbsp; ImagEM; Andor, iXon) lub&nbsp; Kamera CMOS (np. Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania komórek</td><td>Sarstedt K.K.</td><td>#95.64.253</td><td>Można użyć alternatywnego pojemnika do zamrażania komórek.</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> CO2 <td>Utrzymuj na poziomie 37 &deg; C, 5% CO2.</td></tr><tr><td>Rurka kriogeniczna</td><td>Corning</td><td>#430661</td><td>Można zastosować alternatywne rurki kriogeniczne.</td></tr><tr><td>Pożywka do kriokonserwacji</td><td>Zenoaq</td><td></td><td>"CELLBANKER1"</td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana (dla komórek HeLa)</td><td></td><td></td><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i roztworem penicyliny-streptomycyny (końcowe stężenie: penicylina 100 U/ml i Streptomycyna 100 &mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Podłoże preparacyjne&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Jeden mililitr 1 M HEPES (stężenie końcowe 20 mM) do 49 ml DMEM&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>Można użyć alternatywnego DMEM.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>#08456-65</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>do transfekcji DNA</td> o niskim poziomie glukozy <td>Sigma-Aldrich</td> <td># 6366244001</td> <td>"Odczynnik do transfekcji DNA X-tremegene HP" Można stosować alternatywne odczynniki do transfekcji.</td></tr><tr><td>Szklany słoik z pokrywką</td><td></td><td></td><td>Słoik 500 ml (dla myszy) lub słoik 1 500 ml (dla szczura) do znieczulenia zwierzęcia&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#14170161</td><td>HBSS bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10100147</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HeLa</td><td>RIKEN BioResource Center</td><td>#RCB0007</td><td></td></tr><tr><td>Histamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H7125</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do</td><td></td><td></td> <td>analizy obrazuTakich jak Metamorph (urządzenia molekularne), ImageJ (NIH) i TI Workbench14 (wykonane na zamówienie)&nbsp;</td></tr><tr><td>Optyka dzieląca obraz</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>#A12801-01</td><td>W-view GEMINI</td></tr><tr><td>Optyka rozdzielająca obraz zwierciadło dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>#FF560-FDi01-25&razy; 36</td><td>Do oddzielania białka fluorescencyjnego zielonego/białka fluorescencyjnego czerwonego&nbsp; Sygnał (GFP/RFP)</td></tr><tr><td>Filtry emisyjne optyki rozszczepiającej obraz</td><td>Semrock</td><td>#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td><td>Do emisji sygnału GFP/RFP, odpowiednio</td></tr><tr><td>Medium obrazowania i bufor</td><td></td><td></td><td>Użyj optymalnego podłoża lub bufora do eksperymentu. W przypadku stosowania pożywki pożądane jest podłoże bez czerwieni fenolowej w celu zmniejszenia fluorescencji tła. Dodać 20 mM HEPES, aby utrzymać pH poza inkubatorem CO2.</td></tr><tr><td>Inkubacja soli fizjologicznej&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Dodaj 1 ml 1 M HEPES (20 mM) do 49 ml HBSS</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop</td><td></td><td></td> fluorescencyjny, <td>taki jak IX73 (Olympus) lub&nbsp; Eclipse TI (Nikon Instech)</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Używany do znieczulenia</td></tr><tr><td>Pożywka podtrzymująca (na 4 i 12 dołków)</td><td></td><td></td> <td>48,5 ml Pożywka Neurobaseal-A uzupełniona 1 ml B-27, 500 &mikro; L zapasu L-glutaminy i 25 &mikro; L Roztwór penicyliny-streptomycyny.</td></tr><tr><td>Pożywka konserwacyjna dla zamrożonych komórek korowych (na 1 i 12 dołków)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>12,2 ml Neurobasal plus pożywka uzupełniona o 250 &mikro; L B-27, 125 &mikro; L zapasu L-glutaminy i 6,2 &mikro; L Roztwór penicyliny-streptomycyny.</td></tr><tr><td>MEM (Minimum Essential Medium)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów mikroskopowych do obrazowania</td><td></td><td></td> GCaMP6f <td>Odpowiedni filtr do GFP (wzbudzenie, 480 &plusmn; 10 nm; emisja, 530 &plusmn; 20 nm)</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów mikroskopowych do obrazowania</td><td></td><td></td> RCaMP2 <td>Odpowiedni filtr do RFP (wzbudzenie, 535 &plusmn; 50 nm; emisja, 590 nm długi przepust)</td></tr><tr><td>Zestawy filtrów mikroskopowych do podwójnego obrazowania RCaMP2 i GCaMP6f</td><td>Semrock</td><td>#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25&razy; 36, #FF01-512 / 630-25</td><td>Podwójny filtr wzbudzenia, podwójne zwierciadło dichroiczne i filtr emisyjny do obrazowania GFP / RFP.</td></tr><tr><td>System</td><td></td><td></td> grzewczy <td>mikroskopu System grzewczy do utrzymywania komórek w temperaturze 37 & stopni; C podczas obrazowania. Aby uniknąć dryftu spowodowanego rozszerzalnością cieplną, zaleca się stosowanie systemów grzewczych obejmujących cały mikroskop (np. Tokai Hit, Thermobox).</td></tr><tr><td>Mikroskopowe źródło światła do wzbudzenia</td><td></td><td></td><td>Lampa rtęciowa (100 W), lampa ksenonowa (75 W), system oświetlenia diodą elektroluminescencyjną (LED) (np. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., źródło LED o 4 długościach fali; Lumencor, lekki silnik SPECTRA X). W przypadku bryły rtęci i lampy ksenonowej należy użyć filtra ND, aby zmniejszyć intensywność wzbudzenia.</td></tr><tr>Soczewka <td></td><td></td><td>obiektywu mikroskopu</td><td>Plan-apochromatyczny obiektyw immersyjny z olejkiem o aperturze numerycznej większej niż 1,3 jest wysoce zalecany do rejestrowania spontanicznej aktywności Ca2+ w neuronach i astrocytach.</td></tr><tr><td>Neurobasal plus medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10888022</td><td>Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) może być stosowane zamiast podłoża Neurobasal-A.</td></tr><tr><td>PBS(-): Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, wolna od Ca2+ i Mg2+&nbsp;</td><td>Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation</td><td>#164-23551</td><td>Brak Ca2+ i Mg2+ ma kluczowe znaczenie, aby nie hamować aktywności trypsyny. Można zastosować alternatywę dla PBS(-).</td></tr><tr><td>Komputer i oprogramowanie do</td><td></td><td></td> akwizycji obrazu<td>, takie jak Metamorph (urządzenia molekularne); Mikromenedżer; TI Workbench14.</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15140122</td><td>Penicylina 10 000 U/ml i Streptomycyna 10 000 &mikro; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Plazmid do ekspresji Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-RCaMP2 pod promotorem wirusa cytomegalii 7-9</td><td></td><td></td><td>Dostępne na żądanie</td></tr><tr><td>Pożywka galwaniczna (na 4 i 12 dołków)</td><td></td><td></td><td>48 ml MEM uzupełniony 1 ml suplementu B-27, 500 &mikro; L L-glutamina (stężenie końcowe: 2 mM), 500 &mikro; L pirogronianu sodu (1 mM) i 25 &mikro; L roztwór penicyliny-streptomycyny (penicylina 5 j./ml, streptomycyna 5 i mikro; g/ml). To stężenie penicyliny-streptomycyny, które wynosi 1/20 z&nbsp; Stężenie zalecane przez producenta, ma kluczowe znaczenie dla przeżycia neuronów.</td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Elveflow</td><td>Ludin Chamber</td><td>Ta komora nagraniowa jest przeznaczona do okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm.</td></tr><tr><td>Zredukowane podłoże w surowicy</td><td>Termo Fisher</td><td>#11058021</td><td>Stereomikroskop</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Opti-MEM <td>Służy do preparowania hipokampów. Dostępne są mikroskopy stereoskopowe Olympus SZ60 lub ich odpowiedniki.</td></tr><tr><td>Narzędzia</td><td></td><td></td> chirurgiczne <td>Standardowe nożyczki preparacyjne do cięcia brzucha myszy lub szczura, pęseta do szczypania macicy, delikatne nożyczki preparacyjne do cięcia macicy i głowy zarodka, kleszcze pierścieniowe do szczypania zarodków, 13 cm zakrzywione kleszcze Semken (Fine Science Tools #11009-13) do ekstrakcji mózgu,&nbsp; 3 kleszcze z cienkimi końcówkami&nbsp; (Dumont Inox #5)</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji do neuronu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#L3000008</td> <td>odczynnik "Lipofectamine 3000". Składa się z "suplementu (P3000)", który należy wymieszać z plazmidowym DNA w kroku 2.2.3, oraz "odczynnika do transfekcji (lipofektamina 3000)" użytego w kroku 2.2.4.</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#15250061</td><td></td></tr><tr><td>Środek myjący do zamrożonych komórek korowych&nbsp;</td><td></td><td></td><td>25 ml DMEM, uzupełniony 250 &mikro; L inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca + 12,5 &mikro; L Penicylina Streptomycyna.</td></tr><tr><td>Szczury Wistar</td><td>Japonia SLC, Inc</td><td></td><td>Ciężarne szczury (E18)</td></tr></tbody></table>

analiza lokalnych sygnałów ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników ca2 +

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Jon wapnia (Ca2+) jest uniwersalną wewnątrzkomórkową cząsteczką przekaźnikową, która napędza wiele szlaków sygnałowych, prowadząc do różnorodnych wyników biologicznych. Uważa się, że koordynacja dwóch źródeł sygnału Ca2 + - "napływ Ca2 + " z zewnątrz komórki i "uwolnienie Ca2 +" z wewnątrzkomórkowej retikulum endoplazmatycznego Ca2 + magazynowania (ER) - leży u podstaw różnorodnych czasoprzestrzennych wzorców sygnałów Ca2 +, które powodują wiele funkcji biologicznych w komórkach. Celem tego protokołu jest opisanie nowej metody obrazowaniaCa2+, która umożliwia monitorowanie samego momentu "napływu Ca2+" i "uwolnienia Ca2+". OER-GCaMP6f jest genetycznie kodowanym wskaźnikiem Ca2 + (GECI) zawierającym GCaMP6f, który jest ukierunkowany na zewnętrzną błonę ER. OER-GCaMP6f może monitorować uwalnianie Ca2+ w wyższej rozdzielczości czasowej niż konwencjonalny GCaMP6f. W połączeniu z GECI ukierunkowanymi na błonę plazmatyczną, przestrzenno-czasowy wzorzec sygnału Ca2+ można opisać w rozdzielczości subkomórkowej. Opisane tutaj wskaźniki Ca2+ ukierunkowane na subkomórkę są w zasadzie dostępne dla wszystkich typów komórek, nawet do obrazowania in vivo neuronów Caenorhabditis elegans. W tym protokole wprowadzamy obrazowanie Ca2 + w komórkach z linii komórkowych, neuronów i komórek glejowych w zdysocjowanych kulturach pierwotnych oraz opisujemy przygotowanie zamrożonego materiału neuronów korowych szczura.

Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wyeksprymowano w komórkach HeLa, a oba sygnały rejestrowano jednocześnie przy użyciu optyki rozdzielającej obraz, 24 h po transfekcji (Rysunek 3A oraz Wideo 1). Obrazy pozyskiwano z częstotliwością 10 Hz. Podczas rejestracji dodano histaminę (His, 1 µM), która indukuje uwalnianie Ca2+ z ER. Po zastosowaniu His intensywność sygnału Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wzrosła, co obrazuje pseudokolorowy wyświetlacz ΔF/F0, reprezentujący zmianę względem początkowej intensywności fluorescencji (Rysunek 3B). Porównano przebiegi czasowe wzrostu stężenia Ca2+ (ΔF/F0) rejestrowane przez Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w tym samym obszarze zainteresowania (ROI) (Rysunek 3C). Wartości ΔF/F0 znormalizowano do ich wartości szczytowych, aby umożliwić porównanie przebiegów czasowych dwóch różnych GECI, które charakteryzują się różnymi poziomami ekspresji i rozkładem. Oba sensory wykazały oscylacyjny wzrost poziomu Ca2+. Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wykazały taki sam przebieg czasowy wzrostu Ca2+ w dwóch komórkach spośród pięciu badanych typów komórek (Rysunek 3C, ROI 1 i 3). Jednakże wzrosty Ca2+ wykazane przez Lck-RCaMP2 utrzymywały się na wyższym poziomie w porównaniu do wzrostów wykazanych przez OER-GCaMP6f (Rysunek 3C, ROI 2, 4 i 5). Wyniki wskazują, że wzrost poziomu Ca2+ jest przedłużony w sąsiedztwie błony komórkowej, podczas gdy kończy się on wcześniej wokół ER, która stanowi źródło tego sygnału Ca2+ indukowanego stymulacją His.
Spontaniczne sygnały Ca2+ z astrocytów w mieszanych kulturach neuronowo-astrocytarnych z hipokampów szczura (Rycina 4A) i kory mózgu (Rycina 4B) zostały wykazane przy użyciu Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f (Rycina 4, Wideo 2, Wideo 3, Wideo 4 oraz Wideo 5). Kultury korowe odzyskano z zapasów mrożonych, przygotowanych zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Sygnały Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f rejestrowano sekwencyjnie z częstotliwością 2 Hz z tych samych komórek. Wybrano trzy obszary ROI w miejscu, w którym każdy z wskaźników GECI wykazywał wzrost stężenia Ca2+, a przebieg czasowy ΔF/Fbase (tj. intensywność fluorescencji) określono jako zmianę względem średniej intensywności fluorescencji z całego okresu rejestracji (Fbase). Gdy fluorescencja bazowa jest stabilna, a wzrosty Ca2+ występują rzadziej, Fbase staje się użyteczną linią bazową do wykrywania zdarzeń wzrostu Ca2+. Spontaniczne wzrosty Ca2+ były widoczne wyłącznie w wypustkach astrocytarnych, a nie w ciele komórki. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami na temat spontanicznych sygnałów Ca2+ w astrocytach przy użyciu innych wskaźników GECI wizualizowanych in vitro13 oraz in vivo14. Zarówno w astrocytach hipokampalnych, jak i korowych, wzrosty Ca2+ wykazane przez Lck-RCaMP2 (góra) występowały częściej niż te wykazane przez OER-GCaMP6f. Wynik ten jest zgodny z naszym wcześniejszym wykazaniem, że wzrosty Ca2+ w astrocytach wywołane przez Lck-GCaMP6f były wykrywane częściej niż te wywołane przez OER-GCaMP6f7, co sugeruje, że teza ta jest możliwa do zastosowania również na poziomie pojedynczych komórek.
Spontaniczne wzrosty stężenia Ca2+ za pomocą Lck-GCaMP6f w niedojrzałych neuronach hipokampa szczura (10 DIV) zaobserwowano przy częstotliwości 2 Hz (Rysunek 5A i Wideo 6). Przebiegi czasowe ΔF/F0 w pięciu różnych obszarach zainteresowania (ROI) sugerują, że wzrosty Ca2+ są ograniczone lokalnie do domen subkomórkowych. Rysunek 5B (Wideo 7>) przedstawia odpowiedzi Ca2+ w dojrzałych neuronach hipokampa myszy (30 DIV) zainfekowanych wektorami AAV wykazującymi ekspresję OER-GCaMP6f. Neurony stymulowano 10 µM DHPG, który jest agonistą metabotropowych receptorów glutaminianu, indukującym uwalnianie Ca2+. Wykryto uwalnianie Ca2+ indukowane przez DHPG dzięki zastosowaniu OER-GCaMP6f.
<img alt="Schemat komórkowy przedstawiający sygnalizację Ca2+ z zastosowaniem wskaźników Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający GECI skierowane do błony. Schematyczny rysunek GECI celowanych w błonę plazmatyczną (Lck-GCaMP6f i Lck-RCaMP2) oraz GCaMP6f celowanego w zewnętrzną błonę retikulum endoplazmatycznego (OER-GCaMP6f). 
<img alt="Schemat przygotowania komórek kory mózgu: etapy hodowli, mrożenia, rozmrażania i transfekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Schemat przygotowania komórek hipokampa i kory, transfekcji plazmidowej oraz infekcji AAV. Zdjęcia mikroskopowe są reprezentatywne; po lewej stronie znajdują się świeżo wysiane komórki korowe DIV-6, a po prawej komórki odnowione z zamrożonego banku. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej i dane dotyczące dynamiki Ca2+ przy użyciu Lck-RCaMP2 oraz OER-GCaMP6f po podaniu histaminy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykład jednoczesnego obrazowania Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komórkach HeLa. (ASchematyczne przedstawienie separacji sygnału za pomocą optyki rozdzielającej obraz. Ten sam obszar widzenia dla Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f jest jednocześnie rzutowany na kamerę. Reprezentatywne nagranie pozyskane przy częstotliwości 10 Hz za pomocą kamery CMOS przedstawiono w Wideo 1, a jedna klatka tego nagrania została przedstawiona na panelu A (prawo). (B) Obrazy w pseudokolorach ΔF/F0 dla Lck-GCaMP2 (góra) oraz OER-GCaMP6f (dół). Histamina (His, 1 µM) dodano w 0 s. (C) Reprezentatywny znormalizowany przebieg czasowy ΔF/F0 dla Lck-GCaMP2 (magenta) oraz OER-GCaMP6f (zielony). Dane znormalizowano do maksymalnej wartości ΔF/F0 dla każdego wykresu. Szare paski wskazują czas aplikacji histaminy (His). Dane przeanalizowano przy użyciu autorskiego oprogramowania TI Workbench.15Pasek skali = 50 µm (obraz mikroskopowy)  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obrazowania wapniowego w neuronach; ślady fluorescencji; analiza ΔF/F." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Spontaniczne Ca2+2+ wzrost w astrocytach monitorowany pod kątem ekspresji Lck-RCaMP2 oraz OER-GCaMP6f. (A) reprezentatywne obrazy hipokampa i (B) astrocyty korowe przetransfekowane Lck-RCaMP2 (góra) i OER-GCaMP6f (dół). Komórki korowe odzyskano z zamrożonych kultur stokowych. Obrazy Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f pozyskiwano sekwencyjnie w tej samej komórce, z częstotliwością 2 Hz, przy użyciu kamery EM-CCD. Wykresy po lewej stronie przedstawiają przebieg czasowy ΔF/Fbase mierzony w obszarach ROI zaznaczonych na obrazie mikroskopowym. Dane analizowano za pomocą oprogramowania TI Workbench. Rzeczywiste filmy znajdują się w Wideo 2, Wideo 3, Wideo 4i Wideo 5Pasek skali = 20 µm (obraz mikroskopowy). Dryft linii bazowej sugeruje zmiany w globalnym stężeniu Ca2+2+ poziom w komórce.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie wapnia w neuronach z wykresem ΔF/F₀; mikroskop fluorescencyjny; analiza aktywności synaptycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5: Przykłady Ca2+ obrazowanie w neuronach z użyciem Lck-GCaMP6f i OER-GCaMP6f. (A) Reprezentatywne neurony hipokampa szczura wykazujące ekspresję Lck-GCaMP6f w 10. dniu in vitro (DIV 10) (lewo) oraz wykresy przedstawiające przebiegi czasowe ΔF/F0 zmierzone w obszarach zainteresowania (ROI; żółte okręgi) wskazane na obrazie (prawo). Numery na wykresach przebiegów czasowych odpowiadają numerom ROI na obrazie. Należy zauważyć, że wzorzec czasowy Ca2+ poziom różni się pomiędzy poszczególnymi obszarami zainteresowania. Dryft linii bazowej sugeruje wzrost globalnego stężenia Ca2+ poziom w tym neuronie. (B) Przykład dojrzałych neuronów hipokampa mysiego (DIV 30) zainfekowanych wektorami AAV wykazującymi ekspresję OER-GCaMP6f (po lewej). Wykres przebiegu czasowego zmierzonego ΔF/F0 pokazuje Ca2+ odpowiedź na 100 µM (RS)-3,5-dihydroksyfenyloglicyna (DHPG) podana w czasie wskazanym przez szary pasek. Żółte okręgi wskazują położenie ROI, w których uzyskano przebieg czasowy. Obrazy pozyskano z częstotliwością 2 Hz przy użyciu kamery CCD z chłodzeniem (panel A) lub kamerę EM-CCD (panel B) i przeanalizowano za pomocą programu TI Workbench. Pasek skali = 20 µm (obraz mikroskopowy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna Lck-RCaMP2, OER-GCaMP6f; obrazowanie komórkowe, dynamika wapnia." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Film 1"> 
Wideo 1: Przykład jednoczesnego obrazowania Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f w komórkach HeLa. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 10 Hz i przedstawiony w Rysunek 3Skala = 50 µm.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, wizualizacja aktywności neuronów, hipokamp, fluorescencja, mapowanie sieci neuronalnych." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 2"> 
Wideo 2: Spontaniczne Ca2+2+ przejściowy wzrost sygnału zaobserwowany w Lck-RCaMP2 w astrocycie hipokampa. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rycina 4A), zarejestrowane w tym samym polu widzenia co Wideo 3Skala = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Obrazowanie wapnia w neuronach, hipokamp, mikroskopia fluorescencyjna, śledzenie aktywności dynamicznej." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 3"> 
Wideo 3: Spontaniczne oscylacje Ca2+2+ przejściowy wzrost poziomu wapnia zaobserwowany w OER-GCaMP6f w astrocycie hipokampa. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rysunek 4A), w tym samym polu widzenia co Wideo 2Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, Lck-RCaMP2, obrazowanie aktywności neuronów kory mózgu, analiza komórek mózgowych." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 4"> 
Wideo 4: Spontaniczne zdarzenia wapniowe (Ca)2+ przejściowy sygnał zaobserwowany w Lck-RCaMP2 w astrocycie korowym Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rycina 4B), zarejestrowane w tym samym polu widzenia co Film 5Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Aktywność neuronalna w korze mózgu, obrazowanie wapniowe, obraz mikroskopowy, wizualizacja fluorescencyjna." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 5"> 
Wideo 5: Spontaniczne Ca2+2+ przejściowy wzrost sygnału zaobserwowany w OER-GCaMP6f w astrocycie korowym. Reprezentatywny zapis uzyskany przy częstotliwości 2 Hz (Rycina 4B), w tym samym polu widzenia co Wideo 4Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Obrazowanie komórek neuronalnych, mikroskopia fluorescencyjna, struktura neuronalna, wizualizacja dendrytów, skala 20 μm." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Wideo 6"> 
Wideo 6: Przykład Ca2+ obrazowanie w neuronie hipokampa szczura (DIV 10) za pomocą Lck-GCaMP6f. Przykład neuronalnego Ca2+2+ sygnały rejestrowane z częstotliwością 2 Hz (Rysunek 5A). Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej neuronów sieci neuronowej, uwydatniający strukturę i połączenia między komórkami." src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Film 7"> 
Film 7: Ca2+ uwalnianie w neuronie hipokampalnym myszy (DIV 30) wykazującym ekspresję OER-GCaMP6f. Przykład neuronalnego Ca2+2+ sygnały zarejestrowane w neuronie hipokampa myszy zainfekowanym wektorami AAV wykazującymi ekspresję OER-GCaMP6f (Rysunek 5B). Neuron stymulowano za pomocą 100 µM podano dihydroksyfenyloglicynę (DHPG) w 30 s w celu wywołania Ca2+ uwalnianie z ER. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Analiza sygnałów wapniowych w rozdzielczości subkomórkowej jest jednym z najważniejszych etapów dekodowania wewnątrzkomórkowych sygnałów wapniowych, które określają wyjściowe zjawisko biologiczne. Protokół ten opisuje nową metodę obrazowania wapnia, która umożliwia monitorowanie samego momentu napływu i uwalniania wapnia. Protokół ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.Uważamy, że nasza metoda ma potencjał, aby zostać rozszerzona o sekcję sygnałów wapnia w rozdzielczości subkomórkowej u żywych zwierząt w hodowli laboratoryjnej. W demonstracji procedury pomoże Matsumi Hirose, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 milimetrów w każdym dołku 12-dołkowej płytki.Użyj wysterylizowanej wody i przygotuj 12,5 mililitra 0,4% roztworu PEI na każdą używaną 12-dołkową płytkę. Dodaj jeden mililitr roztworu PEI do każdej studzienki i upewnij się, że pod szkiełkami nakrywkowymi nie ma pęcherzyków. Inkubować przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia użyj aspiratora, aby usunąć roztwór PEI. Dodaj jeden mililitr wysterylizowanej wody do każdej studzienki i potrząśnij płytką, aby roztwór PEI między szkiełkiem nakrywkowym a płytką został dokładnie wypłukany. Powtórz ten proces mycia jeszcze dwa razy ze świeżą wysterylizowaną wodą.Po ostatnim umyciu całkowicie odessaj wodę z każdej studzienki. Wewnątrz kaptura użyj światła ultrafioletowego, aby wysuszyć i wysterylizować szkiełka nakrywkowe przez co najmniej 15 minut. Naczynie pokryte PEI można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch miesięcy.Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, oświetl naczynia światłem ultrafioletowym przez 15 minut, tuż przed użyciem. Dodaj pięć mililitrów sterylnej wody destylowanej w przestrzeni między studzienkami, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej. Najpierw umyj korę solą fizjologiczną do inkubacji.Następnie inkubuj korę z trypsyną i DNAzą w inkubacji soli fizjologicznej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie trzykrotnie umyj korę lodowatą solą fizjologiczną do inkubacji. Usunąć supernatant i dodać dwa mililitry pożywki galwanicznej uzupełnionej 150 mikrolitrami bulionu DNAzy I.Oddzielić komórki przez pipetowanie dwadzieścia razy lub mniej i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości porów 70 mikrometrów. Następnie umyj sitko komórkowe 20 mililitrami podłoża galwanicznego. W celu przygotowania zamrożonego materiału komórkowego należy przemyć komórki 20 mililitrami środka myjącego.Rozcieńczyć komórki korowe pożywką galwaniczną do gęstości 140 000 żywotnych komórek na mililitr. Następnie dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny komórek do szkiełek nakrywkowych pokrytych PEI w 12-dołkowych płytkach hodowlanych. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni.Gdy komórki są stabilne, dwa do trzech dni po posiewie, zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę konserwacyjną. W celu przygotowania zamrożonego materiału komórkowego należy odwirować komórkę za pomocą rotora obrotowego do odwirowania komórek w temperaturze 187 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant i dodać pożywkę do kriokonserwacji, utrzymywaną w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać gęstość komórek 10 milionów komórek na mililitr.Podwielokrotność jednego mililitra zawiesiny komórkowej do probówek kriogenicznych. Umieść probówki w pojemniku do zamrażania komórek o szybkości zamrażania minus jeden stopień Celsjusza na minutę, aż do osiągnięcia temperatury minus 80 stopni Celsjusza. Przenieś pojemnik do zamrażania do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby ożywić zamrożone komórki, należy wstępnie podgrzać pożywkę myjącą i pożywkę konserwacyjną dla zamrożonych komórek korowych. Następnie szybko rozmrozić zamrożone komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie rozcieńczyć komórki wstępnie podgrzanym roztworem myjącym i odwirować z wirnikiem obrotowym o sile 187 razy G przez trzy minuty.Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki myjącej i zmierzyć gęstość żywotnych komórek. Następnie rozcieńczyć komórki pożywką konserwacyjną dla zamrożonych komórek korowych, aby uzyskać gęstość komórek 300 000 komórek na mililitr. Scedować jeden mililitr tej zawiesiny komórkowej do dołków 12-dołkowych płytek pokrytych PEI.W przypadku transfekcji od trzech do ośmiu dni po posiewie oznacz dwie probówki, jedną dla DNA osocza, a drugą dla odczynnika do transfekcji. Dodać 50 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy na dołek do każdej probówki. Dodać 0,5 mikrograma DNA osocza na szkiełko nakrywkowe i jeden mikrolitr suplementu wraz z odczynnikiem do transfekcji neuronów, na basenik, do probówki DNA osocza.W celu jednoczesnej transfekcji Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f należy zmieszać 0,5 mikrograma każdego plazmidu i jeden mikrolitr suplementu w 50 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy na studzienkę. Następnie dodaj jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji na studzienkę do probówki z odczynnikiem do transfekcji. Wiruj obie rurki przez jedną do dwóch sekund.Następnie dodaj mieszaninę odczynników do transfekcji do mieszaniny DNA. Delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Załaduj tę mieszaninę na komórki w sposób kroplowy.Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni, aż białka markerowe ulegną ekspresji. Wymieszaj L i O, aby wywołać infekcję AAC. Dodaj trzy mikrolitry AAC na studzienkę do mieszanej kultury neuronów i astrocytów.Delikatnie kołysz naczyniem, aby się wymieszać. Utrzymuj kulturę przez jeden do dwóch tygodni, aż GECI ulegną ekspresji. Najpierw zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki transfekowane Lck-RCaMP2 i OER-CaMPG6f w komorze zapisu mikroskopu.Dodać 400 mikrolitrów pożywki do obrazowania i przykryć pokrywką komorę. Wybierz zestaw filtrów dla GCaMP6f i źródła światła. Zlokalizuj astrocyty wykazujące ekspresję OER-GCaMP6f.Następnie wybierz zestaw filtrów i źródło światła dla RCaMP2 i sprawdź, czy Lck-RCaMP2 ulega ekspresji w tych samych astrocytach. Nagrywaj obrazy poklatkowe Lck-RCaMP2 z częstotliwością dwóch herców przez dwie minuty i zapisuj dane obrazowania. Następnie zmień filtr ustawiony z powrotem na filtr dla GCaMP6f.Nagrywaj obrazy poklatkowe OER-GCaMP6f z częstotliwością dwóch Hz przez dwie minuty i zapisuj dane obrazowania. W tym badaniu Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a oba sygnały zarejestrowano jednocześnie przy użyciu optyki rozdzielającej obraz, 24 godziny po transfekcji. Po dodaniu histaminy intensywność sygnału Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wzrosła.Przebiegi czasowe podwyższenia stężenia jonów wapnia zgłaszane przez Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f są porównywane w tych samych obszarach zainteresowania. Oba czujniki informują o oscylacyjnym wzroście stężenia jonów wapnia. I oba pokazują ten sam przebieg czasowy w dwóch z pięciu badanych komórek.Jednak wzrost stężenia jonów wapnia wykazywany przez Lck-RCaMP2 pozostaje na wyższym poziomie niż OER-GCaMP6f w innych komórkach. Wyniki te wskazują, że podwyższenie stężenia jonów wapnia jest przedłużone w pobliżu błony komórkowej, podczas gdy kończy się wcześniej wokół ER, które jest źródłem tego sygnału jonów wapnia indukowanego przez stymulację histaminą. Spontaniczne sygnały jonów wapnia z astrocytów w mieszanej kulturze neuron-astrocyt z hipokampa i kory szczura są pokazane przez Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f.Spontaniczne podwyższenie stężenia jonów wapnia jest widoczne tylko w procesie astrocytowym, a nie w ciele komórki, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami. Spontaniczne zwiększenie stężenia jonów wapnia przez Lck-GCaMP6f w niedojrzałych neuronach hipokampa szczura obserwuje się przy dwóch hercach. Przebiegi czasowe dla pięciu różnych regionów zainteresowania sugerują, że te wzniesienia są lokalnie ograniczone do domen subkomórkowych.Dojrzałe mysie neurony hipokampa zakażone wektorami AAV o ekspresji OER-GCaMP6f wykazują reakcje jonów wapnia w odpowiedzi na dodanie DHPG. W przypadku obrazowania wapnia najbardziej krytycznym czynnikiem jest moc wzbudzenia luminacji. Proszę utrzymywać światło wzbudzenia na jak najniższym poziomie, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności.Źródło sygnałów wapniowych może być dodatkowo potwierdzone przez Pomakorzi za pomocą specyficznych inhibitorów kanałów wapniowych. Dekodowanie sygnałów wapniowych w celu wywołania określonego wyjścia było fundamentalnym pytaniem biologicznym. Ta technika obrazowania wapnia toruje drogę do opisania różnorodności wewnątrzkomórkowych sygnałów wapniowych.

dissection-local-ca2-signals-cultured-cells-membrane-targeted-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Obrazowanie na żywo komórek narażonych na działanie barwnika lipofilowego FM1-43 pozwala na precyzyjne określenie kinetyki, za pomocą której toksyny tworzące pory są usuwane z błony plazmatycznej. Jest to czuły test, który można wykorzystać do oceny wymagań dotyczących Ca2+, sfingomielinazy i innych czynników dotyczących naprawy błony komórkowej.

Test obrazowania na żywo do oceny roliCa2+ i sfingomielinazy w naprawie ran toksyn tworzących pory

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Tutaj udostępniamy kompleksowy protokół do rozwiązywania początkowych lokalnych sygnałów Ca2+, znanych jako mikrodomeny Ca2+, w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten służy jako cenne źródło informacji dla naukowców badających szlaki sygnałowe Ca2+ w komórkach odpornościowych i do dalszego odkrywania ich funkcji.

Obrazowanie początkowych mikrodomen Ca2+ w pierwotnych limfocytach T

Poznaj metodę obrazowania wapnia w komórkach nerwowych i glejowych z użyciem genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺. Technika umożliwia monitorowanie sygnałów wapniowych w czasie rzeczywistym z rozdzielczością subkomórkową.

Analiza lokalnych sygnałów Ca^{2 +} w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca^{2 +}

Przeglądaj więcej filmów