Analiza lokalnych sygnałów Ca^{2 +} w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca^{2 +}

Analiza sygnałów wapniowych w rozdzielczości subkomórkowej jest jednym z najważniejszych etapów dekodowania wewnątrzkomórkowych sygnałów wapniowych, które określają wyjściowe zjawisko biologiczne. Protokół ten opisuje nową metodę obrazowania wapnia, która umożliwia monitorowanie samego momentu napływu i uwalniania wapnia. Protokół ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Uważamy, że nasza metoda ma potencjał, aby zostać rozszerzona o sekcję sygnałów wapnia w rozdzielczości subkomórkowej u żywych zwierząt w hodowli laboratoryjnej. W demonstracji procedury pomoże Matsumi Hirose, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 milimetrów w każdym dołku 12-dołkowej płytki.

Użyj wysterylizowanej wody i przygotuj 12,5 mililitra 0,4% roztworu PEI na każdą używaną 12-dołkową płytkę. Dodaj jeden mililitr roztworu PEI do każdej studzienki i upewnij się, że pod szkiełkami nakrywkowymi nie ma pęcherzyków. Inkubować przez noc w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia użyj aspiratora, aby usunąć roztwór PEI. Dodaj jeden mililitr wysterylizowanej wody do każdej studzienki i potrząśnij płytką, aby roztwór PEI między szkiełkiem nakrywkowym a płytką został dokładnie wypłukany. Powtórz ten proces mycia jeszcze dwa razy ze świeżą wysterylizowaną wodą.

Po ostatnim umyciu całkowicie odessaj wodę z każdej studzienki. Wewnątrz kaptura użyj światła ultrafioletowego, aby wysuszyć i wysterylizować szkiełka nakrywkowe przez co najmniej 15 minut. Naczynie pokryte PEI można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch miesięcy.

Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, oświetl naczynia światłem ultrafioletowym przez 15 minut, tuż przed użyciem. Dodaj pięć mililitrów sterylnej wody destylowanej w przestrzeni między studzienkami, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej. Najpierw umyj korę solą fizjologiczną do inkubacji.

Następnie inkubuj korę z trypsyną i DNAzą w inkubacji soli fizjologicznej przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie trzykrotnie umyj korę lodowatą solą fizjologiczną do inkubacji. Usunąć supernatant i dodać dwa mililitry pożywki galwanicznej uzupełnionej 150 mikrolitrami bulionu DNAzy I.

Oddzielić komórki przez pipetowanie dwadzieścia razy lub mniej i przefiltrować komórki przez sitko o wielkości porów 70 mikrometrów. Następnie umyj sitko komórkowe 20 mililitrami podłoża galwanicznego. W celu przygotowania zamrożonego materiału komórkowego należy przemyć komórki 20 mililitrami środka myjącego.

Rozcieńczyć komórki korowe pożywką galwaniczną do gęstości 140 000 żywotnych komórek na mililitr. Następnie dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny komórek do szkiełek nakrywkowych pokrytych PEI w 12-dołkowych płytkach hodowlanych. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni.

Gdy komórki są stabilne, dwa do trzech dni po posiewie, zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę konserwacyjną. W celu przygotowania zamrożonego materiału komórkowego należy odwirować komórkę za pomocą rotora obrotowego do odwirowania komórek w temperaturze 187 razy G przez trzy minuty. Odessać supernatant i dodać pożywkę do kriokonserwacji, utrzymywaną w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać gęstość komórek 10 milionów komórek na mililitr.

Podwielokrotność jednego mililitra zawiesiny komórkowej do probówek kriogenicznych. Umieść probówki w pojemniku do zamrażania komórek o szybkości zamrażania minus jeden stopień Celsjusza na minutę, aż do osiągnięcia temperatury minus 80 stopni Celsjusza. Przenieś pojemnik do zamrażania do zamrażarki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby ożywić zamrożone komórki, należy wstępnie podgrzać pożywkę myjącą i pożywkę konserwacyjną dla zamrożonych komórek korowych. Następnie szybko rozmrozić zamrożone komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie rozcieńczyć komórki wstępnie podgrzanym roztworem myjącym i odwirować z wirnikiem obrotowym o sile 187 razy G przez trzy minuty.

Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki myjącej i zmierzyć gęstość żywotnych komórek. Następnie rozcieńczyć komórki pożywką konserwacyjną dla zamrożonych komórek korowych, aby uzyskać gęstość komórek 300 000 komórek na mililitr. Scedować jeden mililitr tej zawiesiny komórkowej do dołków 12-dołkowych płytek pokrytych PEI.

W przypadku transfekcji od trzech do ośmiu dni po posiewie oznacz dwie probówki, jedną dla DNA osocza, a drugą dla odczynnika do transfekcji. Dodać 50 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy na dołek do każdej probówki. Dodać 0,5 mikrograma DNA osocza na szkiełko nakrywkowe i jeden mikrolitr suplementu wraz z odczynnikiem do transfekcji neuronów, na basenik, do probówki DNA osocza.

W celu jednoczesnej transfekcji Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f należy zmieszać 0,5 mikrograma każdego plazmidu i jeden mikrolitr suplementu w 50 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy na studzienkę. Następnie dodaj jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji na studzienkę do probówki z odczynnikiem do transfekcji. Wiruj obie rurki przez jedną do dwóch sekund.

Następnie dodaj mieszaninę odczynników do transfekcji do mieszaniny DNA. Delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Załaduj tę mieszaninę na komórki w sposób kroplowy.

Inkubować w inkubatorze dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni, aż białka markerowe ulegną ekspresji. Wymieszaj L i O, aby wywołać infekcję AAC. Dodaj trzy mikrolitry AAC na studzienkę do mieszanej kultury neuronów i astrocytów.

Delikatnie kołysz naczyniem, aby się wymieszać. Utrzymuj kulturę przez jeden do dwóch tygodni, aż GECI ulegną ekspresji. Najpierw zamontuj szkiełko nakrywkowe zawierające komórki transfekowane Lck-RCaMP2 i OER-CaMPG6f w komorze zapisu mikroskopu.

Dodać 400 mikrolitrów pożywki do obrazowania i przykryć pokrywką komorę. Wybierz zestaw filtrów dla GCaMP6f i źródła światła. Zlokalizuj astrocyty wykazujące ekspresję OER-GCaMP6f.

Następnie wybierz zestaw filtrów i źródło światła dla RCaMP2 i sprawdź, czy Lck-RCaMP2 ulega ekspresji w tych samych astrocytach. Nagrywaj obrazy poklatkowe Lck-RCaMP2 z częstotliwością dwóch herców przez dwie minuty i zapisuj dane obrazowania. Następnie zmień filtr ustawiony z powrotem na filtr dla GCaMP6f.

Nagrywaj obrazy poklatkowe OER-GCaMP6f z częstotliwością dwóch Hz przez dwie minuty i zapisuj dane obrazowania. W tym badaniu Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f ulegają ekspresji w komórkach HeLa, a oba sygnały zarejestrowano jednocześnie przy użyciu optyki rozdzielającej obraz, 24 godziny po transfekcji. Po dodaniu histaminy intensywność sygnału Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f wzrosła.

Przebiegi czasowe podwyższenia stężenia jonów wapnia zgłaszane przez Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f są porównywane w tych samych obszarach zainteresowania. Oba czujniki informują o oscylacyjnym wzroście stężenia jonów wapnia. I oba pokazują ten sam przebieg czasowy w dwóch z pięciu badanych komórek.

Jednak wzrost stężenia jonów wapnia wykazywany przez Lck-RCaMP2 pozostaje na wyższym poziomie niż OER-GCaMP6f w innych komórkach. Wyniki te wskazują, że podwyższenie stężenia jonów wapnia jest przedłużone w pobliżu błony komórkowej, podczas gdy kończy się wcześniej wokół ER, które jest źródłem tego sygnału jonów wapnia indukowanego przez stymulację histaminą. Spontaniczne sygnały jonów wapnia z astrocytów w mieszanej kulturze neuron-astrocyt z hipokampa i kory szczura są pokazane przez Lck-RCaMP2 i OER-GCaMP6f.

Spontaniczne podwyższenie stężenia jonów wapnia jest widoczne tylko w procesie astrocytowym, a nie w ciele komórki, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami. Spontaniczne zwiększenie stężenia jonów wapnia przez Lck-GCaMP6f w niedojrzałych neuronach hipokampa szczura obserwuje się przy dwóch hercach. Przebiegi czasowe dla pięciu różnych regionów zainteresowania sugerują, że te wzniesienia są lokalnie ograniczone do domen subkomórkowych.

Dojrzałe mysie neurony hipokampa zakażone wektorami AAV o ekspresji OER-GCaMP6f wykazują reakcje jonów wapnia w odpowiedzi na dodanie DHPG. W przypadku obrazowania wapnia najbardziej krytycznym czynnikiem jest moc wzbudzenia luminacji. Proszę utrzymywać światło wzbudzenia na jak najniższym poziomie, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności.

Źródło sygnałów wapniowych może być dodatkowo potwierdzone przez Pomakorzi za pomocą specyficznych inhibitorów kanałów wapniowych. Dekodowanie sygnałów wapniowych w celu wywołania określonego wyjścia było fundamentalnym pytaniem biologicznym. Ta technika obrazowania wapnia toruje drogę do opisania różnorodności wewnątrzkomórkowych sygnałów wapniowych.