Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Przedstawione tu metody pozwalają na badanie molekularnych mechanizmów migracji komórek odpornościowych przez bariery mózgowe w eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego, zwierzęcym modelu stwardnienia rozsianego. Badając przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność metaloproteazy macierzy w tym samym czasie w korelacji przestrzennej z infiltracją komórek odpornościowych w skrawkach tkanki mózgowej, możemy precyzyjnie powiązać te zdarzenia neurozapalne z klinicznymi objawami EAE. Profesjonalne obchodzenie się z chorymi myszami wymaga dogłębnego szkolenia, a także prawidłowej oceny objawów klinicznych EAE.

W związku z tym demonstracja wizualna jest korzystna. Rozpocznij tę procedurę od znieczulenia myszy C57-Black/6, które były trzymane w warunkach wolnych od specyficznych patogenów, jak opisano w protokole tekstowym. Zamocuj znieczuloną mysz w jednej ręce i wstrzyknij 30 mikrolitrów peptydu MOG i uzupełnij emulsję adiuwantową Freunda podskórnie do każdego z boków tylnej nogi, w bliskiej odległości od pachwinowych węzłów chłonnych.

Teraz połóż mysz na brzuchu i wstrzyknij 20 mikrolitrów emulsji peptydowej MOG do miękkiej tkanki tłuszczowej zarówno po lewej, jak i prawej stronie u nasady ogona. Wstrzyknąć również niewielką kroplę emulsji w szyjkę myszy. Wstrzyknąć myszu 100 mikrolitrów roztworu toksyny krztuścowej dootrzewnowo.

Trzymaj głowę myszy poniżej środka ciała, aby uniknąć wstrzyknięcia do jelita. Zastąp dietę podtrzymującą dietą hodowlaną, aby zapewnić myszom pokarm o wyższej zawartości energii przed i w trakcie spodziewanej choroby klinicznej. Iniekcję z toksyną krztuścową należy powtórzyć 48 godzin po pierwszym zabiegu.

Każdego ranka sprawdzaj stan zdrowia myszy EAE, zaglądając do wnętrza klatek. Oceniaj myszy EAE każdego popołudnia. Wyjmij z klatki każdą pojedynczą mysz biorącą udział w eksperymencie EAE i sprawdź, czy ogon ma tonus.

Przesuń ogon palcem w górę. Zdrowa mysz będzie trzymać ogon w górze. Jeśli rozpoczął się kliniczny EAE, tonus ogonowy będzie niższy, widoczny przez stopniowe opadanie ogona.

W końcu mysz nie będzie w stanie w ogóle podnieść ogona. Umieść każdą pojedynczą mysz biorącą udział w eksperymencie EAE na czystej ławce, aby obserwować i dokumentować zachowanie podczas chodzenia. Zapoznaj się z tekstem, aby zapoznać się z kryteriami punktacji do oceny ciężkości choroby, czyli punktacją EAE.

Oceń i udokumentuj wagę każdej myszy biorącej udział w eksperymencie. Aby przygotować roztwory podstawowe dekstranu, rozpuścić 10 miligramów trzykilodaltonowego Dekstranu Texas Red w 500 mikrolitrach 0,9% roztworu chlorku sodu i pięć miligramów 10-kilodaltonowego Dekstranu Alexa Fluor 488 w 250 mikrolitrach 0,9% roztworu chlorku sodu. W przypadku roztworu roboczego dekstranu, tuż przed wstrzyknięciem, należy odpipetować 55 mikrolitrów 10-kilodaltonowego roztworu podstawowego Dextran Alexa Fluor 488 na kawałek folii uszczelniającej.

Następnie dodaj 55 mikrolitrów trzykilodaltonowego roztworu podstawowego Dextran Texas Red. Wymieszaj i zbierz 100 mikrolitrów do jednorazowej drobnej strzykawki. Następnie umieść znieczuloną mysz w pozycji bocznej na stole.

Wstrzyknij dożylnie 100 mikrolitrów fluorescencyjnych znaczników myszy, zanim mysz się obudzi. Pozwól znacznikowi krążyć przez 15 minut przed wykonaniem perfuzji myszy, jak opisano w protokole tekstowym. Napełnij płaski pojemnik Dewara pokruszonym suchym lodem i dodawaj 2-metylobutan, aż płyn osiągnie około jednego centymetra powyżej okładu z suchego lodu.

Przykryj luźną pokrywką, taką jak pokrywa wiaderka na lód. Po odcięciu głowy perfundowanej myszy ostrymi nożyczkami, usuń skórę i uszy za pomocą mniejszego zestawu nożyczek. Ostrożnie rozetnij jarmułkę, przecinając ją od otworu wielkiego w kierunku przodu po lewej i prawej stronie, aby umożliwić zwinięcie jarmułki nad mózgiem.

Następnie ostrożnie wyjmij nienaruszony mózg z podstawy czaszki, przecinając nerwy wzrokowe za pomocą płaskiej metalowej szpatułki. Umieść mózg na folii aluminiowej. Przetnij mózg na trzy części, umieszczając dwa nacięcia koronalne.

Trzy części reprezentują mózg czołowy, mózg środkowy i móżdżek z pniem mózgu. Napełnij Cryomold do pierwszej ćwiartki matrycą do cięcia w optymalnej temperaturze. Następnie umieść plastry mózgu w Cryomold, tak aby przednia strona każdego kawałka mózgu była skierowana w dół.

Całkowicie przykryj tkankę matrycą. Umieść Cryomold wraz z tkanką w orientacji poziomej w kąpieli 2-metylobutanowej. Upewnij się, że chusteczka zamarznie od dołu do góry w ciągu jednej minuty, unikając zanurzania całego bloku tkanki w kąpieli.

Przenieś zamrożoną tkankę do minus 80 stopni Celsjusza w celu przechowywania. Zapoznaj się z protokołem tekstowym dotyczącym przygotowania zamrożonych skrawków tkanek. Pobierz sześciomikronowe, nieutrwalone skrawki tkanki mózgowej, które zostały przygotowane od myszy EAE.

W dygestorium rozmrozić sekcje wewnątrz plastikowego pojemnika do zamrażania zawierającego żel krzemionkowy w pokrywie, aby uniknąć zatrzymywania wody w tkance. Oddziel dwie sekcje tkanki na jednym szkiełku, rysując linie za pomocą pisaka odpychającego wodę. Odwirować roztwory reakcyjne przez pięć minut w temperaturze 13, 300 razy g w temperaturze pokojowej i wstępnie ogrzać do 37 stopni Celsjusza za pomocą łaźni wodnej.

Następnie nawadniaj skrawki tkanki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą buforu reakcyjnego 1X. Po pięciu minutach odlej bufor reakcyjny 1X. Dodać roztwór reakcyjny na skrawki tkanki i inkubować przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie umyj szkiełka pięć razy w wodzie podwójnie destylowanej. Teraz utrwal skrawki przez pięć minut lodowatym metanolem w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, a następnie umyj je raz PBS w temperaturze pokojowej. Dodać 1% BSA w PBS do sekcji i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie wyrzuć bufor z sekcji, obracając szkiełko na chusteczce. Dodaj pierwszorzędowy koktajl przeciwciał do sekcji i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym umyciu skrawków PBS, dodać drugorzędowy koktajl przeciwciał i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj sekcje dwukrotnie PBS i zamontuj szkiełka za pomocą roztworu do zatapiania. Po pozostawieniu zamontowanych skrawków do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, przeanalizuj wybarwione skrawki tkanek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Nasilenie choroby EAE zwiększa się aż do szczytu choroby, którego można się spodziewać między 16 a 20 dniem po indukcji EAE.

W szczytowym okresie klinicznego EAE myszy wykazywały również najniższą masę ciała, która wzrasta w korelacji z poprawą EAE w fazie remisji choroby. Pokazano tutaj reprezentatywny obraz splotu naczyniówkowego i przylegającego do niego miąższu mózgu myszy C57-Black/6 cierpiącej na EAE. Myszowi wstrzyknięto dożylnie 15 minut przed złożeniem w ofierze.

Znaczniki łatwo dyfundują przez mikronaczynia z okienkami do stomii splotu naczyniówkowego, podczas gdy bariera krew-mózg nie pozwala na dyfuzję krążących znaczników do miąższu mózgu, który jest w ten sposób pozbawiony jakiegokolwiek sygnału fluorescencyjnego. Obrazy te pokazują reprezentatywne nieszczelne naczynia krwionośne w móżdżku myszy C57-Black/6 cierpiącej na EAE. Groty strzałek wskazują na znaczniki rozproszone przez mikronaczynia mózgowe do miąższu OUN, co sugeruje, że funkcja bariery krew-mózg jest upośledzona w tych naczyniach.

W miąższu OUN zielony i czerwony sygnał fluorescencyjny jest widoczny na zewnątrz ścian naczyń krwionośnych. Prawidłowe podanie podskórne emulsji MOG-CFA jest niezbędne do uzyskania odpowiedniej odpowiedzi immunologicznej prowadzącej do EAE. Należy unikać wstrzykiwań dootrzewnowych i domięśniowych.

Przygotować CFA pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania atenuowanych prątków. Należy również unikać samodzielnego wstrzykiwania emulsji MOG-CFA, ponieważ może to spowodować kłykciny kończyste lub nawet doprowadzić do EAE u osób predysponowanych genetycznie. Komórki odpornościowe naciekające mózg można wyizolować z OUN myszy cierpiących na EAE w celu ilościowego określenia naciekających podzbiorów komórek odpornościowych podczas zapalenia nerwów za pomocą cytometrii przepływowej.

Ocenę integralności bariery śródbłonkowej i glejowej w mózgu można przełożyć na analizę genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy lub na modele innych zaburzeń neurologicznych.