Podział neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych na wstępnie zmontowane plastikowe chipy mikroprzepływowe

Podzielone na przedziały urządzenia mikroprzepływowe pozwalają na badanie neuronów w ich wysoce spolaryzowanej formie. Urządzenia te odgrywają zasadniczą rolę zarówno w podstawowych, jak i translacyjnych badaniach neurobiologicznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać cyklicznych chipów kopolimeru olefin do podziału neuronów zróżnicowanych od ludzkich komórek macierzystych.

Te chipy COC wytwarzają zdrowsze kultury zróżnicowanych neuronów w porównaniu z urządzeniami wielokompartmentowymi PDMS. W tym protokole demonstrujemy hodowlę neuronów zróżnicowanych z zatwierdzonej przez NIH linii komórek macierzystych H9. Podobne procedury można zastosować do różnicowania neuronów od mIPSC.

Wielokomorowe wióry należy umieścić w wtórnym pomieszczeniu z dodatkowym nawilżaniem. Kanały wielokomorowych chipów należy wypełnić roztworem do wstępnej powłoki, a następnie przepłukać PBS. Na początek rozpuść poli-L-ornitynę w wodzie destylowanej klasy do hodowli komórkowych, aby uzyskać 600 mikrolitrów roztworu na chip.

Odessać pozostały PBS z dołków, upewniając się, że końcówka pipety znajduje się z dala od otworu kanału. Załaduj 150 mikrolitrów roztworu roboczego poli-L-ornityny do prawej górnej studzienki. Odczekaj 90 sekund i dodaj 150 mikrolitrów roztworu do prawego dolnego dołka.

Odczekaj pięć minut i powtórz proces ładowania roztworem dla lewych studzienek. Następnie umieść tackę nawilżacza z frytkami na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jeśli używasz szalki Petriego, owiń ją Parafilmem i umieść na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie należy zassać roztwór ze studzienek, upewniając się, że końcówka pipety jest umieszczona z dala od otworu kanału. I powtórz dwukrotne ładowanie prawej i lewej studzienki po 150 mikrolitrów sterylnej wody. Przygotuj roztwór roboczy z lamininą.

Załaduj prawą i lewą studzienkę po 150 mikrolitrów roztworu roboczego lamininy. Inkubuj frytki na tacy przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Opłucz chip PBS bez wapnia i magnezu.

Załaduj prawą i lewą studzienkę po 150 mikrolitrów PBS. Poczekaj pięć minut. Odessać PBS ze studzienek i przepłukać chip pożywką NSC.

Załaduj prawą i lewą studzienkę po 150 mikrolitrów każdego z mediów NSC. Inkubuj wiór na tacy przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, aby wstępnie kondycjonować chip. Aby wprowadzić ludzkie nerwowe komórki macierzyste do wielokompartmentowego chipa, najpierw policz stężenie komórek za pomocą hemocytometru.

Następnie odessaj pożywkę ze studni. Odpipetować pięć mikrolitrów roztworu komórkowego do prawego górnego dołka, a następnie pięć mikrolitrów do prawego dolnego dołka. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki dostały się do kanału.

Poczekaj pięć minut, aż komórki przylgną do dolnej części chipa. Odpipetować około 150 mikrolitrów pożywki NSC do prawej i lewej studzienki. Inkubować w temperaturze 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza w odpowiednim nawilżonym pojemniku.

Po 48 godzinach odessać pożywkę NSC ze studzienek i zastąpić ją pożywką różnicującą neurony, dodając 150 mikrolitrów do każdej górnej studzienki i każdej dolnej studzienki. Hodowla neuronów w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 stopni Celsjusza w tacy nawilżacza. Usuń pozostałe pożywki różnicujące neurony z komory aksonalnej i umieść je w probówce wirówkowej.

Przechowywać w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wymieszać 50 mikrolitrów roztworu wirusa ze 150 mikrolitrami podgrzanej pożywki. Odpipetować 100 mikrolitrów mieszaniny do obu studzienek komory aksonowej.

Inkubować przez dwie godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wyjmij i wyrzuć nośniki zawierające wirusy. Delikatnie odpipetować 75 mikrolitrów świeżej pożywki do jednej studzienki aksonu i pozwolić pożywce przepłynąć przez kanał do drugiej studzienki aksonowej.

Powtórz ten proces raz. Na koniec napełnij komorę aksonu zapisaną pożywką i przenieś chip do inkubatora. Po tygodniu spędzonym w chipie z pożywką różnicującą, ludzkie nerwowe komórki macierzyste zróżnicowały się w neurony, przyczepione i równomiernie rozmieszczone w przedziale somatycznym.

Dla porównania, neurony w urządzeniach PDMS agregowały się już pięć dni po dodaniu pożywki różnicującej, co prowadziło do pogorszenia zdrowia komórek. Wizualizacja znakowanych neuronów i kolców dendrytycznych za pomocą białka fluorescencyjnego mCherry wykazała, że neurony pochodzące z NSC, zróżnicowane w obrębie chipów, tworzą dojrzałe synapsy. Neurony zostały oznaczone pod kątem pobudzającego markera synaptycznego, vGlut1.

Wyniki barwienia immunologicznego pokazują, że neurony znakowane wirusowo mogą kolokalizować się z vGlut1 i markerem specyficznym dla neuronu, beta-tubuliną trzy. Transdukowane wirusowo neurony mCherry rozszerzają projekcje do mikrośrodowiska zlokalizowanego w aksonach utworzonego we wstępnie zmontowanym chipie. Porównanie obrazów neuronów znakowanych mCherry przed i bezpośrednio po aksotomii wykazało całkowicie odcięte aksony.

Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że kanały pozostają wypełnione płynem, z wyjątkiem wykonywania zabiegu aksotomii. Chipy z przedziałami COC są łatwe w użyciu i mogą otworzyć drzwi do licznych badań związanych z uszkodzeniem neuronów, synaptogenezą, plastycznością synaptyczną i patofizjologią choroby.