Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416
3 czerwca 2020
Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.
Protokół ten może być stosowany do indukcji nadciśnienia płucnego i wykonywania pomiarów funkcjonalnych prawej komory. Model hipoksji Sugena jest łatwy do wdrożenia i może podsumować niektóre cechy charakterystyczne nadciśnienia płucnego w ciągu dwóch do trzech tygodni od indukcji. Korzystając z tego modelu, możemy zidentyfikować nowe szlaki zaangażowane w rozwój choroby.
Możemy identyfikować nowe cele i testować ich potencjał terapeutyczny. Przed rozpoczęciem procedury indukcji należy zabezpieczyć zbiorniki z azotem w pobliżu komory hipoksyjnej i ustawić regulator tlenu w punkcie 10% tlenu. Następnie załaduj świeżo przygotowany roztwór SU5416 do jednej mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 i ręcznie przytrzymuj pierwsze zwierzę, które ma zostać wstrzyknięte.
Chwyć skórę, aby utworzyć namiot równolegle do kręgosłupa, upewniając się, że mocno chwytasz tył głowy, aby uniknąć potencjalnego ugryzienia przez mysz. Wprowadzić igłę podskórnie przez bok w luźnym fałdzie skórnym równolegle do skóry i dostarczyć 100 mikrolitrów zawartości strzykawki. Po 10 sekundach wyjmij igłę i umieść zwierzę z powrotem w klatce.
Po wstrzyknięciu wszystkim zwierzętom umieść myszy w wentylowanej komorze do hipoksji. W przypadku ekspozycji na hipoksję należy upewnić się, że komory są wyposażone w czujnik tlenu do pomiaru poziomu tlenu i otwierać komory na nie więcej niż 20 minut co trzy dni w celu oczyszczenia i dodania pokarmu i wody. Należy codziennie sprawdzać zwierzęta pod kątem oznak stresu i powtarzać wstrzyknięcie SU5416 co tydzień przez trzy kolejne tygodnie.
Przed rozpoczęciem procedury pomiaru ciśnienia należy przygotować łącznik rurki Y i użyć trybu ręcznego, aby sprawdzić działanie wentylatora. Ustaw ciśnienie wdechowe na mniej niż jeden centymetr wody, aby uniknąć barotraumy i ustaw częstość oddechów na 110 oddechów na minutę. Wytnij cewnik wewnątrznaczyniowy o rozmiarze 20, aby utworzyć rurkę dotchawiczą i włącz jednostkę kontroli objętości ciśnienia.
Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i umieść cewnik objętościowy pod ciśnieniem w 15-mililitrowej probówce wirówkowej PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie skalibruj cewnik zgodnie z protokołem producenta. Umieść mysz na poduszce grzewczej i umieść sondę doodbytniczą do monitorowania temperatury ciała.
Następnie potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u znieczulonej myszy i ogol okolice szyi i klatki piersiowej. Zabezpiecz kończyny myszy taśmą chirurgiczną i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w przyśrodkowej skórze szyjki macicy. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką tępo oddziel śliniankę przyuszną i podżuchwową, aby odsłonić mięśnie leżące pod tchawicą.
Ostrożnie przeciąć mięśnie, aby całkowicie odsłonić tchawicę i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie między chrząstkami tchawicy. Włóż przygotowaną rurkę dotchawiczą i wyjmij metalową prowadnicę cewnika wewnątrznaczyniowego. Następnie podłącz cewnik do respiratora i sprawdź położenie rurki dotchawiczej, ręcznie delikatnie napompowując płuca.
Zabezpiecz pozycję taśmą. W celu pomiaru ciśnienia w prawej komorze wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry nad wyrostkiem mieczykowatym i górną częścią brzucha i zaczynając od środkowej linii dystalnie do mieczykowatej i ostrożnie przesuwając się na boki po obu stronach, oddziel skórę nad klatką piersiową i ścianą brzucha. Otwierając jamę brzuszną, ostrożnie przetnij przeponę, uważając, aby nie uszkodzić bijącego serca lub płuc.
I użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie usunąć osierdzie. Zbliż cewnik ciśnieniowy do myszy i za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką wyposażonego w igłę wykonaj ranę kłutą w nietypowej dystalnej części prawej komory. Ostrożnie zastąp igłę cewnikiem ciśnieniowym, wprowadzając cewnik ciśnieniowy równolegle do kierunku prawej komory z końcówką skierowaną w stronę tętnicy płucnej.
Obserwuj śledzenie fali ciśnienia, aby zapewnić prawidłowe ustawienie cewnika. Gdy sygnał ciśnienia się ustabilizuje, przerwij oddychanie i wykonaj co najmniej trzy pomiary. Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów ostrożnie umieścić cewnik z powrotem w probówce wirówkowej wypełnionej PBS w łaźni wodnej.
W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne krzywe ciśnienia oraz analizę ilościową ciśnienia w prawej komorze pod koniec okresu obserwacji. Analiza histologiczna przebudowanych tętnic płucnych po niedotlenieniu w połączeniu z leczeniem SU5416 ujawnia wzrost grubości ściany przyśrodkowej w porównaniu ze zwierzętami normoksycznymi. Barwienie aglutyniną z kiełków pszenicy w celu oceny przerostu kardiomiocytów wskazuje, że niedotlenienie w połączeniu z ekspozycją na SU5416 powoduje wyraźny wzrost wielkości kardiomiocytów i przerost prawej komory.
Ponadto morfometryczna ocena przerostu prawej komory za pomocą pomiaru wskaźnika Fultona potwierdza wzrost przerostu prawej komory u zwierząt niedotlenionych. Wykonanie pomiarów funkcjonalnych jest ważne, aby uniknąć krwawienia, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na wyniki badania. Protokół ten może być również stosowany do wywoływania nadciśnienia płucnego u szczurów z niewielkimi modyfikacjami.
Warto zauważyć, że tylko jedno wstrzyknięcie leku Sugen u szczurów wystarcza do wywołania nadciśnienia płucnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy poprzez ekspozycję na hipoksję oraz wstrzyknięcie antagonisty receptora VEGF. Model ten umożliwia funkcjonalną i morfometryczną charakterystykę PH oraz przerostu prawej komory w ciągu trzech tygodni.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia układu sercowo-naczyniowego
- Patofizjologia
Wprowadzenie
- Nadciśnienie płucne jest poważnym schorzeniem wpływającym na układ sercowo-naczyniowy.
- Zrozumienie mechanizmów leżących u podłoża nadciśnienia płucnego może prowadzić do wyłonienia nowych celów terapeutycznych.
- Model Sugen Hypoxia jest powszechnie stosowaną metodą badania nadciśnienia płucnego u myszy.
- Antagoniści receptorów VEGF odgrywają rolę w rozwoju nadciśnienia płucnego.
Cel badania
- W celu wywołania nadciśnienia płucnego w kontrolowanym modelu mysim.
- W celu wykonania pomiarów czynnościowych prawej komory serca.
- W celu zidentyfikowania nowych szlaków i celów terapeutycznych w leczeniu nadciśnienia płucnego.
Zastosowane Metody
- Indukcja hipoksji poprzez ustawienie poziomu tlenu na 10%.
- Wstrzyknięcie SU5416 w celu zablokowania receptorów VEGF.
- Monitorowanie funkcji i morfologii prawej komory serca.
- Charakterystyka modelu w okresie trzech tygodni.
Główne wyniki
- Rozwój nadciśnienia płucnego i hipertrofii prawej komory serca.
- Pomiary czynnościowe wskazują na istotne zmiany w wydolności prawej komory.
- Zaobserwowano zmiany morfologiczne zgodne z nadciśnieniem płucnym.
- Identyfikacja potencjalnych nowych celów terapeutycznych do leczenia.
Wnioski
- Model hipoksji Sugen skutecznie naśladuje nadciśnienie płucne.
- Model ten może być wykorzystywany do badania nowych szlaków uczestniczących w nadciśnieniu płucnym.
- W przyszłych badaniach model ten może posłużyć do testowania nowych terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Model mysi oparty na hipoksji/SU5416 stanowi szybki i kosztowo efektywny system do badania przebudowy naczyniowej oraz dysfunkcji prawej komory w nadciśnieniu płucnym, umożliwiając walidację celów na wczesnym etapie oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Jego kompatybilność z myszami typu dzikiego oraz myszami modyfikowanymi genetycznie wspiera analizę szlaków sygnałowych i testowanie hipotez terapeutycznych w okresie trzech tygodni. Model ten łączy biologię odkrywczą z ewaluacją przedkliniczną, dostarczając mierzalnych odczytów hemodynamicznych i histologicznych, które pomagają w selekcji projektów w portfolio oraz podejmowaniu decyzji w oparciu o ocenę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków sygnałowych VEGF oraz identyfikację nowych celów terapeutycznych zaangażowanych w przebudowę naczyń płucnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybki przesiew fenotypowy interwencji genetycznych lub farmakologicznych z wykorzystaniem standaryzowanych procedur indukcji i pomiaru.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie kluczowych cech histopatologicznych nadciśnienia płucnego grupy 1 u ludzi, w tym pogrubienia ściany środkowej i przerostu prawej komory.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wyniki zmiennych zależnych, takich jak ciśnienie w prawej komorze mierzone za pomocą cewnikowania oraz indeks Fultona do oceny przerostu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne pomiary o niskiej wariancji w połączeniu ze zstandardizowaną ekspozycją na hipoksję i cotygodniowym dawkowaniem SU5416.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach typu dzikiego oraz knockout bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy chirurgicznej, co wspiera wysokoprzepustowe kampanie walidacji celów terapeutycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnego dla choroby systemu, który naśladuje patofizjologię ludzkiego nadciśnienia płucnego, umożliwiając ocenę interakcji z celem oraz modulacji szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera badania nad profilaktyką i terapią dzięki odwracalności fenotypu po powrocie do normoksji, co umożliwia zastosowanie schematów z etapem wypłukiwania leku i ponownej ekspozycji.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez dostarczenie funkcjonalnych (ciśnienie w prawej komorze) i strukturalnych (remodeling naczyniowy, hipertrofia kardiomiocytów) punktów końcowych zgodnych z biomarkerami klinicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając wczesną identyfikację celów, walidację testów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących zależnych i niezależnych od VEGF szlaków w nadciśnieniu płucnym poprzez indukowalne i odwracalne uszkodzenie naczyń.
- Przesiew: Dostarcza gotowych do analizy systemów biologicznych ze zestandaryzowaną indukcją (10% tlenu, cotygodniowo SU5416) i mierzalnymi wynikami (ciśnienie w prawej komorze, indeks Fultona, pogrubienie histologiczne).
- Analityka: Zapewnia funkcjonalne odczyty hemodynamiczne i morfometryczne, które pozwalają na porównania międzygrupowe i szacowanie wielkości efektu w celu priorytetyzacji celów terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Oferuje wgląd w mechanizmy adaptacji prawej komory i przebudowy tętnicy płucnej, wspierając decyzje go/no-go w oparciu o biomarkery.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma fenotypowa do iteracyjnego testowania celów w ramach wielu modalności chemogenetycznych lub farmakologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez modelowanie patofizjologii naczyniowej i kardiologicznej istotnej dla ludzi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej kontroli hipoksji, harmonogramowi iniekcji oraz technikom cewnikowania ciśnieniowego i objętościowego.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach badań, umożliwiając wczesną weryfikację celów w oparciu o funkcjonalną i strukturalną modyfikację choroby.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez dostarczanie danych multiparametrycznych (ciśnienie, hipertrofia, włóknienie) do obiektywnego rankingowania celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze komory hipoksycznej, pracy z SU5416 oraz technikach kateteryzacji prawej komory serca.
- Zależność od precyzyjnej kontroli poziomu tlenu (10%) oraz dostępu do butli z azotem w celu utrzymania parametrów komory.
- Konieczność standaryzacji obchodzenia się ze zwierzętami i cotygodniowego podawania dawek w celu zapewnienia spójności modelu pomiędzy kohortami.
- Ograniczenie do łagodnego lub umiarkowanego stopnia nasilenia fenotypu, co może utrudniać modelowanie zaawansowanych stadiów choroby.
- Odwracalność zmian po powrocie do normoksji wymaga starannego zaprojektowania eksperymentu w przypadku badań nad terapią przewlekłą.
