Name: Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę indukcji nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416. Protokół obejmuje pomiary funkcjonalne prawej komory serca i charakterystykę morfometryczną zmian w ciągu trzech tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 i 18IPA34170258) oraz z National Institutes of Health NIH K01 HL135474 do Y.S. O.B było wspierane przez Deutsche Herzstiftung.

Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach uzyskaj zgodę lokalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami. Obecne eksperymenty zostały przeprowadzone po zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Icahn School of Medicine w Mount Sinai.
1. Indukcja pH
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem badania należy dokładnie zaplanować projekt eksperymentu. Upewnij się, że myszy są poddawane hipoksji w tym samym momencie, w którym wykonano pierwsze wstrzyknięcie SU5416. Przykład eksperymentalnego projektu indukowania pH przy użyciu metody hipoksji/SU5416 pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A. Myszy kontrolne otrzymały tylko pojazd. W przypadku tego modelu SU5416 będzie wstrzykiwany myszom raz w tygodniu przez 3 kolejne tygodnie.</li>
		<li>Do tego badania użyj od ośmiu do dwunastu tygodni myszy C57BL/6. Trzymaj zwierzęta w temperaturze 18-20 °C w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym. Upewnij się, że jedzenie i woda są dostępne ad libitum.</li>
		<li>Zważ zwierzęta. Przypisz je losowo do każdej grupy: Normoxia i Hypoxia/SU5416.</li>
		<li>Przygotuj komorę hipoksyjną, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. Zabezpiecz zbiorniki z azotem (N2) w pobliżu komory. Ustawić regulator tlenu (O2) w punkcie 10%O2. Pozwól, aby system osiągnął stan ustalony.</li>
		<li>Przygotować SU5416 do wstrzykiwań (stosować dawkę 20 mg/kg masy ciała). SU5416 nie rozpuszcza się w roztworach wodnych; dlatego obliczoną ilość rozpuść w 100 μL DMSO8. Na przykład w przypadku myszy o masie 25 g ilość SU5416 do wstrzyknięcia wynosi 0,5 mg rozpuszczonej w 100 μl rozpuszczalnika (DMSO). Końcowe stężenie SU5416 dla tej myszy wynosi zatem 5 mg/mL. 
		UWAGA: SU5416 jest materiałem niebezpiecznym. Należy uważnie przeczytać kartę charakterystyki dołączoną do produktu i upewnić się, że podjęto zalecane środki ostrożności podczas obchodzenia się z tą substancją. Nosić rękawice ochronne i (jak w przypadku każdego wstrzyknięcia) stosować okulary ochronne. Struktura chemiczna SU5416 jest pokazana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1C. 
		UWAGA: Obliczyć odpowiedni nadmiar roztworu, aby skompensować objętość, która zostanie utracona podczas wstrzykiwania (np. w strzykawce, fiolce itp.). W zależności od użytej strzykawki, objętość martwa wynosi około 200 μl. Dla grupy 10 myszy oblicz nadmiar 2 dawek myszy.</li>
		<li>Przygotować strzykawki do wstrzyknięcia. Używaj strzykawek o pojemności 1 ml z igłami 25 G x 5/8".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SU5416 wstrzyknięcie podskórne
	<ol>
		<li>Unieruchomić zwierzę. Umieść mysz na pokrywie klatki, aby wspomóc unieruchomienie. Chwyć skórę i uformuj namiot równolegle do kręgosłupa. Upewnij się, że mocno chwytasz za tył głowy, aby uniknąć potencjalnego ugryzienia przez mysz. 
		UWAGA: Obecność dwóch badaczy sprawia, że procedura jest szybsza i dokładniejsza, ponieważ jeden może trzymać zwierzę, podczas gdy drugi wykonuje wstrzyknięcie.</li>
		<li>Wprowadzić igłę podskórnie na bok w luźnym fałdzie skóry. Upewnij się, że igła jest wkładana równolegle do skóry. Unikaj penetracji ściany brzucha.</li>
		<li>Wstrzyknąć zawartość strzykawki (100 μl rozpuszczonego SU5416 lub nośnika). 
		UWAGA: Aby uniknąć wycieku po całkowitym podaniu, należy przytrzymać strzykawkę przez około 10 s i lekko obrócić igłę pod skórą.</li>
		<li>Wyjmij igłę i umieść zwierzę z powrotem w klatce. Po wstrzyknięciu SU5416 umieścić klatki w wentylowanej komorze do hipoksji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Narażenie na niedotlenienie
	<ol>
		<li>Monitoruj wentylację w czasie. Upewnij się, że utrzymujesz 10% dopływu tlenu. Utrzymuj zwierzęta z normoksją w półzamykanej komorze w temperaturze 21%O2.</li>
		<li>Upewnij się, że komory są wyposażone w czujnik tlenu do pomiaru poziomu tlenu. Unikaj szerokiego otwierania komór. W celu oczyszczenia i dodania pokarmu i wody należy otwierać komory na nie dłużej niż 20 minut co 3 dni.</li>
		<li>Codziennie sprawdzaj zwierzęta. Weź pod uwagę sygnały stresowe, takie jak piloerekcja lub znaczna utrata wagi. 
		UWAGA: Oczekuje się, że zwierzęta w stanie niedotlenienia/SU5416 stracą na wadze5. Jest to wskaźnik rozwoju choroby.</li>
		<li>Powtarzaj wstrzyknięcie SU5416 co tydzień przez 3 kolejne tygodnie (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A dla przeglądu projektu eksperymentalnego). 
		UWAGA: Zmiana miejsca wstrzyknięcia może pomóc w zmniejszeniu podrażnień skóry.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Charakterystyka funkcjonalna za pomocą inwazyjnych pomiarów ciśnienia w kamperze
<ol>
	<li>Przygotowanie 
	UWAGA: Wybierz schemat znieczulania. Można stosować środki znieczulające do wstrzykiwań lub wziewności. Ponieważ niewielkie przedawkowanie środków znieczulających do wstrzykiwań (zwłaszcza ketaminy/ksylazyny lub pentobarbitalu) może znacząco wpłynąć na czynność serca, zaleca się stosowanie lotnych środków znieczulających. Bardzo ważne jest, aby stosować ten sam środek znieczulający dla wszystkich myszy w badaniu.
	<ol>
		<li>Użyj waporyzatora, aby zapewnić dokładną dawkę środka znieczulającego na zwierzę. Dawka izofluranu jest następująca: indukcja 3-4%, leczenie podtrzymujące 1% zmieszane ze 100% tlenem. 
		UWAGA: Nosić środki ochrony osobistej i unikać wdychania oparów.</li>
		<li>Przygotuj poduszkę grzewczą i/lub lampy grzewcze do utrzymywania temperatury ciała. Przygotuj sondę temperatury doodbytniczej do monitorowania temperatury ciała.</li>
		<li>Zapewnij odpowiednią wentylację. Przygotuj wcześniej respirator. Przygotuj łącznik rurki Y i sprawdź działanie wentylatora w trybie ręcznym. Upewnij się, że ciśnienie wdechowe wynosi <1 cm H2O, aby uniknąć barotraumy. Ustaw częstość oddechów na 110 oddechów/min.</li>
		<li>Przygotuj rurkę dotchawiczą, przecinając cewnik wewnątrznaczyniowy o masie 20 g.</li>
		<li>Przygotuj potrzebne narzędzia: małe kleszcze, nożyczki, elastyczne zwijacze haczykowe, kauteryzator do naczyń i waciki. Na bawełnianym waciku wyreguluj małą igłę 25 G x 5/8", która zostanie użyta do wykonania małego nakłucia w prawej komorze.</li>
		<li>Przygotuj cewnik ciśnieniowy, jednostkę kontroli ciśnienia i objętości i uruchom oprogramowanie do akwizycji danych. Umieść cewnik PV w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej PBS w temperaturze 37 °C na 15 minut i skalibruj zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Do perfuzji i zespolenia narządów należy przygotować PBS i roztwór 50% PBS / 50% OCT. Przygotować 2 strzykawki po 10 ml (z igłą 25 G): jedna będzie używana do perfuzji serca i płuc za pomocą PBS in situ, a druga do wstrzykiwania roztworu OCT/PBS (50/50) do próbki płuc, która zostanie użyta do badania histologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Intubacja
	<ol>
		<li>Zważ mysz i zapisz stan zdrowia przed znieczuleniem.</li>
		<li>Wywołaj znieczulenie 3-4% izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia, testując odruch szczypania palca u nogi: mocno ściśnij palec jednej z kończyn. Jeśli zwierzę wycofa kończynę, jest to oznaką niewystarczającego znieczulenia.</li>
		<li>Po indukcji znieczulenia ogolić szyję i klatkę piersiową.</li>
		<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej. Umieść sondę temperatury w odbycie do monitorowania temperatury ciała. 
		UWAGA: Utrzymanie temperatury ciała ma znaczenie dla pomiarów funkcjonalnych. Temperatura ciała powinna wynosić około 36,5-37 °C.</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionych kleszczy przymocuj nić do szwów do górnych siekaczy myszy, rozciągnij i przymocuj do poduszki grzewczej za pomocą taśmy chirurgicznej. Zabezpiecz kończyny myszy za pomocą taśm chirurgicznych.</li>
		<li>W celu zaintubowania zwierzęcia należy wykonać małe nacięcie o długości około 1 cm w przyśrodkowej skórze szyjki macicy za pomocą małych nożyczek. 
		UWAGA: Intubacja doustna jest alternatywną metodą, która wymaga większego doświadczenia.</li>
		<li>Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką oddziel tępo śliniankę przyuszną i podżuchwową na środkowym poziomie. Spowoduje to odsłonięcie mięśni leżących nad tchawicą.</li>
		<li>Ostrożnie przetnij te mięśnie, odsłaniając tchawicę.</li>
		<li>Małymi nożyczkami wykonaj małe nacięcie między chrząstkami tchawicy i wprowadź przygotowaną rurkę dotchawiczą. Wyjmij metalową prowadnicę cewnika wewnątrznaczyniowego.</li>
		<li>Podłączyć cewnik do respiratora. Sprawdź położenie rurki dotchawiczej, ręcznie delikatnie napompowując płuca. Zabezpiecz pozycję taśmą.</li>
		<li>Utrzymuj 1% znieczulenie izofluranem przez cały czas trwania zabiegu.</li>
		<li>Regularnie monitoruj głębokość znieczulenia, testując odruch szczypania palca u nogi. Odpowiednio dostosuj znieczulenie. 
		UWAGA: Zalecane tętno podczas eksperymentów, przy znieczuleniu izofluranem o stężeniu 1%, wynosi około 400 uderzeń / min. Utrzymanie temperatury ciała i znieczulenie są niezbędne do kontrolowania tętna. Nadmiar izofluranu może zmniejszać częstość akcji serca. Jednak powrót do zdrowia można osiągnąć poprzez zmniejszenie dawki izofluranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary ciśnienia w kamperze (podejście z otwartą klatką piersiową)
	<ol>
		<li>Małymi nożyczkami wykonaj nacięcie skóry o długości około 1 cm nad wyrostkiem mieczykowatym i górną częścią brzucha. Oddziel skórę pokrywającą klatkę piersiową i ścianę brzucha w górnej części kwadrantów brzucha: zacznij od linii środkowej, dystalnie do mieczykowatej i ostrożnie przesuwaj się na boki po obu stronach. Użyj termokoagulacji, aby zatamować krwawienie. 
		UWAGA: Celem jest dostęp do jamy klatki piersiowej przez ścianę brzucha.</li>
		<li>Otwórz jamę brzuszną i ostrożnie przetnij przeponę, uważając, aby nie uszkodzić bijącego serca lub płuc. 
		UWAGA: Celem jest odsłonięcie wierzchołka i prawej komory serca. Dobra ekspozycja i widok serca mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego umieszczenia cewnika. Bardzo ważne jest, aby uniknąć krwawienia przez cały czas trwania zabiegu. Nawet niewielkie zmiany w objętości wewnątrznaczyniowej mogą zmienić obciążenie prawego serca i wpłynąć na rejestrowane parametry.</li>
		<li>Delikatnie usuń osierdzie za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.</li>
		<li>Tuż przed umieszczeniem cewnika ciśnieniowego w sercu przyłóż cewnik do myszy.</li>
		<li>Za pomocą przygotowanego aplikatora z bawełnianą końcówką z igłą tworzy się ranę kłutą w wierzchołkowej dystalnej części prawej komory. Ostrożnie wyjmij igłę i włóż cewnik ciśnieniowy do tego otworu. 
		UWAGA: Powinno to działać bez użycia siły. Jeśli nie jest to możliwe, spróbuj zrobić nowy otwór w pobliżu pierwszego, aby uniknąć przedłużającego się uszkodzenia serca. Igły nie należy wbijać głębiej niż około 3 mm.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik ciśnieniowy równolegle do kierunku prawej komory, końcówką skierowaną w stronę tętnicy płucnej.</li>
		<li>Obserwuj śledzenie fali ciśnienia, aby upewnić się, że cewnik jest prawidłowo ustawiony. Reprezentatywne ślady są pokazane w Rysunek 2.</li>
		<li>Poczekaj, aż sygnał ciśnienia się ustabilizuje. Wstrzymaj oddychanie i wykonaj co najmniej 3 pomiary. Pomiędzy poszczególnymi pomiarami można wentylować zwierzę.</li>
		<li>Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów wyjmij cewnik i umieść go z powrotem w probówce wypełnionej PBS w łaźni wodnej. 
		UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu wyczyść cewnik zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eutanazja i perfuzja płuc
	<ol>
		<li>Po zakończeniu eksperymentu poddaj mysz eutanazji przez wykrwawienie.</li>
		<li>Otwórz szeroko skrzynię. Za pomocą nożyczek przetnij cały mostek i uważaj, aby nie uszkodzić serca ani płuc.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonuje małe nacięcie w lewej komorze, aby krew mogła opuścić komorę.</li>
		<li>Umieścić igłę 25 G strzykawki zawierającej 10 ml PBS w prawej komorze i wstrzykiwać roztwór PBS do momentu oczyszczenia płuc z krwi.</li>
		<li>Po zakończeniu tego etapu potwierdź eutanazję poprzez pobranie niezbędnych tkanek (serca i płuc): przetnij przyczepy główne i aortalne oraz usuń serce i płuca en block.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka morfometryczna
<ol>
	<li>Natychmiast po usunięciu serca i płuc (Krok 2.4.5) należy odizolować serce i usunąć oba przedsionki. Za pomocą zakrzywionych nożyczek do tenotomii ostrożnie wypreparuj prawą komorę (RV) od lewej komory (LV), pozostawiając przegrodę (S) z lewą komorą. Zważ RV i LV+S i oblicz indeks Fultona= RV/LV+ S (<silna klasa="xfig">Rysunek 3)5,9.</li>
	<li>Weź część prawej komory i umieść ją w wstępnie napełnionej formie do zatapiania OCT. Użyj drugiej części prawej komory do analizy RNA i/lub białka. Zamrozić w suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Użyj nożyczek do tęczówki, aby odizolować płuca od serca i wszelkich innych pozostałych tkanek. 
	UWAGA: Dla przygotowania płuc duże znaczenie ma opisana powyżej perfuzja (kroki 2.4.3-2.4.5).</li>
	<li>Zamroź część płuc i przechowuj ją do RNA, ekstrakcji białka lub innych testów.</li>
	<li>Użyj drugiej części płuc do analizy histologicznej. W tym celu należy włożyć strzykawkę zawierającą 50% PBS i 50% OCT do oskrzela używanego lobe10,11. Eksperymentator może łatwo zauważyć, że płuco zostaje napompowane, gdy zawartość strzykawki jest perfundowana w tkance.</li>
	<li>Umieść te kawałki płuc w foremkach do osadzania wstępnie wypełnionych OCT i zatrzaskowo zamroź je w suchym lodzie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C po ich zamrożeniu.</li>
	<li>Przygotować 8 μm skrawki RV i płuc za pomocą maszyny do kriostatu. Suszyć sekcje na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Utrwal szkiełka w temperaturze pokojowej za pomocą 10% paraformaldehydu (PFA) przez 10 min. 
	UWAGA: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym dla ludzi. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w Karcie Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS).</li>
	<li>Ocena przebudowy naczyń krwionośnych za pomocą barwienia Hematoxylin/Eozyna 
	Uwaga: Wykonaj barwienie Hematoxyliną/Eozyną, aby ocenić zmiany strukturalne serca i przebudowę naczyń krwionośnych w płucach (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).
	<ol>
		<li>Barwieć roztworem Hematoksyliny przez 8 min.</li>
		<li>Spłukiwać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie szybko spłukać w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Płukać w 95% EtOH przez 1 minutę i przeciwdziałać barwieniu w roztworze Eozyny przez 1 minutę.</li>
		<li>Odwodnić (80% etanolu 10-30 s, 100 etanolu przez 1 min i 100% toluolu przez 3 min).</li>
		<li>Zamontuj i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełka suszyć przez noc w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Roztwory używane do barwienia mogą być niebezpieczne. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena zwłóknienia prawej komory za pomocą Picrosirius Red Staining 
	UWAGA: W barwieniu Picrosirius Red, Picrosirius Red, który jest kwasem, wiąże się z collagen12. Dlatego to barwienie może być wykorzystane do badania histologicznego zawartości kolagenu.
	<ol>
		<li>Inkubować szkiełka w podgrzanym roztworze Bouina w temperaturze 58 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu, aby usunąć żółty kolor z sekcji przez 10-15 minut.</li>
		<li>Bejcować w 0,1% Fast Green przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Płukać w 1% kwasie octowym przez 1 min.</li>
		<li>Płukać w wodzie z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Zabarwić w 0,1% czerwieni Syriusza przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwodnić w Toluolu. 
		UWAGA: Roztwory używane do barwienia mogą być niebezpieczne. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena przerostu kardiomiocytów RV metodą WGA Staining 
	UWAGA: Przerost prawej komory (RV) na poziomie komórkowym można ocenić, wykonując barwienie aglutyniną z kiełków pszenicy (WGA) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).
	<ol>
		<li>Zamocuj szkiełka w zimnym roztworze acetonu na 15 minut, a następnie wykonaj 3 etapy mycia w PBS (5 minut każdy).</li>
		<li>Blokuj 10% kozią surowicą w roztworze Dako przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z WGA: Dodać WGA 1:200 i inkubować przez 1 1/2 godziny w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
		<li>Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
		<li>Inkubować szkiełka z barwnikiem kwasu nukleinowego.</li>
		<li>Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą PBS.</li>
		<li>Do montażu usuń nadmiar płynu i nałóż media montażowe oraz szkiełko nakrywkowe. Suszyć szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Roztwory używane do barwienia mogą być niebezpieczne. Zmniejsz ryzyko narażenia, stosując dygestorium chemiczne, odpowiednie procedury i środki ochrony osobistej. Więcej informacji można znaleźć w karcie charakterystyki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj immunochemię płuc, aby dalej i specyficznie ocenić przebudowę naczyń krwionośnych. Na przykład barwienie komórek mięśni gładkich można wykorzystać do oceny muskularizacji naczyń, podczas gdy barwienie czynnikiem von Willebranda można wykorzystać do wizualizacji zmian śródbłonka. Metody te są opisane gdzie indziej5.</li>
</ol>

<ol><li>Galie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2015+ESC%2FERS+Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+hypertension%3A+The+Joint+Task+Force+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Pulmonary+Hypertension+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29+and+the+European+Respiratory+Society+%28ERS%29%3A+Endorsed+by%3A+Association+for+European+Paediatric+and+Congenital+Cardiology+%28AEPC%29%2C+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation+%28ISHLT%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT).</a> European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).</li>
<li>Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+pulmonary+arterial+hypertension%3A+the+hope+for+etiological+discovery+and+pharmacological+cure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cell+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure.</a> American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).</li>
<li>Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review%3A+the+evolution+of+animal+models+in+pulmonary+hypertension+research%3B+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet.</a> Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).</li>
<li>Gomez-Arroyo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+overview+of+mouse+models+of+pulmonary+arterial+hypertension%3A+problems+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cell+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects.</a> American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).</li>
<li>Ciuclan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+murine+model+of+severe+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).</li>
<li>Taraseviciene-Stewart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+VEGF+receptor+2+combined+with+chronic+hypoxia+causes+cell+death-dependent+pulmonary+endothelial+cell+proliferation+and+severe+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension.</a> FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).</li>
<li>Vitali, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sugen+5416%2Fhypoxia+mouse+model+of+pulmonary+hypertension+revisited%3A+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up.</a> Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).</li>
<li>Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+magnetic+resonance+imaging+for+in+vivo+quantification+of+pulmonary+hypertension+in+the+Sugen+5416%2Fhypoxia+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse.</a> Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).</li>
<li>Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+right+ventricular+functional+and+structural+changes+in+a+mouse+model+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension.</a> Physiological Reports. 1 (7), 00184(2013).</li>
<li>Momcilovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+18F-FDG+PET%2FCT+Imaging+and+Quantitative+Histology+to+Measure+Dynamic+Changes+in+the+Glucose+Metabolism+in+Mouse+Models+of+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer.</a> Journal of Visualized Experiment. (137), 57167(2018).</li>
<li>Guma, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+therapy+and+aerosol+interleukin-2+for+the+treatment+of+osteosarcoma+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis.</a> Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).</li>
<li>Lattouf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picrosirius+red+staining%3A+a+useful+tool+to+appraise+collagen+networks+in+normal+and+pathological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).</li>
<li>Penumatsa, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+2+in+pulmonary+and+cardiac+tissue+remodeling+in+experimental+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cell+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension.</a> American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-level+right+ventricular+dysfunction+with+preserved+Frank-Starling+mechanism+in+a+mouse+model+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension.</a> Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).</li>
<li>van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle+and+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">The right ventricle and pulmonary hypertension.</a> Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).</li>
<li>Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheat+germ+agglutinin+staining+as+a+suitable+method+for+detection+and+quantification+of+fibrosis+in+cardiac+tissue+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448(2014).</li>
<li>Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+histochemistry+of+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lectin histochemistry of human skeletal muscle.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).</li>
<li>Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sugen+5416%2FHypoxia+Mouse+Model+of+Pulmonary+Arterial+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension.</a> Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).</li>
<li>Colvin, K. L., Yeager, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Pulmonary+Hypertension%3A+Matching+Disease+Mechanisms+to+Etiology+of+the+Human+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pulmonary+and+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease.</a> Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).</li>
<li>Benza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+survival+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+insights+from+the+Registry+to+Evaluate+Early+and+Long-Term+Pulmonary+Arterial+Hypertension+Disease+Management+%28REVEAL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL).</a> Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).</li>
<li>Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicology+of+dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO).</a> Headache. 6 (3), 127-136 (1966).</li>
<li>Jacob, S. W., Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+sulfoxide+%28DMSO%29.+Toxicology%2C+pharmacology%2C+and+clinical+experience%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience.</a> American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).</li>
<li>Abraham, D., Mao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Pressure-Volume+Loop+Analysis+Using+Conductance+Catheters+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (103), 52942(2015).</li>
<li>Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamic+Characterization+of+Rodent+Models+of+Pulmonary+Arterial+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiment. (110), 53335(2016).</li>
<li>Townsend, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Pressure+Volume+Loops+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse.</a> Journal of Visualized Experiment. (111), 53810(2016).</li>
<li>Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrossTalk+proposal%3A+The+mouse+SuHx+model+is+a+good+model+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension.</a> Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Protokół ten opisuje, jak modelować PH u myszy, łącząc dwa patologiczne bodźce: przewlekłe niedotlenienie i wstrzyknięcie SU5416 (Hipoksja/SU5416)18. Próbując skorelować ten mysi model z ludzkim stanem PH, nieuchronnie należy spojrzeć na obecną klasyfikację PH, pokazaną w Tabeli 1. PH w prawie wszystkich postaciach charakteryzuje się zwężeniem naczyń płucnych i nieprawidłową proliferacją komórek śródbłonka i mięśni gładkich. Prowadzi to do podwyższonego ciśnienia w tętnicach płucn...

Nadciśnienie płucne (PH) to stan patofizjologiczny, definiowany jako średnie ciśnienie w tętnicy płucnej (PA) przekraczające 25 mm Hg w spoczynku, oceniane za pomocą cewnikowania prawej komory serca1,2. Istnieje wiele chorób, które mogą prowadzić do rozwoju PH. W celu uporządkowania stanów związanych z nadciśnieniem płucnym opracowano kilka systemów klasyfikacji. Obecna klasyfikacja kliniczna dzieli liczne schorzenia związane z PH na 5 różnych grup1. Rozróżnienie to jest istotne, ponieważ poszczególne grupy pacjentów cierpią na choroby różniące się obrazem klinicznym, patologią, rokowaniem oraz odpowiedzią na leczenie2. Tabela 1 podsumowuje obecną klasyfikację, uzupełnioną o podstawowe cechy histopatologiczne każdej z chorób.
<img alt="Tabela nadciśnienia płucnego; cechy histopatologiczne, modele zwierzęce, typy chorób płuc." src="/files/ftp_upload/59252/59252tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Przegląd klasyfikacji klinicznej PH wraz z głównymi cechami histopatologicznymi w poszczególnych grupach. Przydatność protokołu Hypoxia/SU5416 do modelowania PH. Tabela została zmodyfikowana na podstawie 19. PH: nadciśnienie płucne, PAH: nadciśnienie tętnicze płuc
Mimo znaczącego postępu w leczeniu chorób związanych z nadciśnieniem płucnym (PH), PH nadal pozostaje chorobą nieuleczalną, a wskaźnik śmiertelności w ciągu 3 lat wynosi od 20% do 80%3. Wskazuje to na konieczność zrozumienia mechanizmów leżących u podłoża PH, a następnie opracowania nowych terapii w celu zapobiegania, spowolnienia postępu i wyleczenia tej choroby. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie w tym zakresie. Obecnie istnieje wiele modeli służących do badania PH. Zainteresowany czytelnik może zapoznać się z doskonałymi przeglądami literatury na ten temat2,3,4. Mając na uwadze różnorodność chorób prowadzących do PH, oczywiste jest, że zróżnicowane postacie ludzkiego PH nie mogą zostać w pełni odtworzone w jednym modelu zwierzęcym. Dostępne modele zwierzęce można podzielić na modele: i) jednoczynnikowe (single-hit), ii) dwuczynnikowe (two-hit), iii) knockout oraz iv) nadekspresyjne3. W modelach jednoczynnikowych PH jest indukowane przez pojedynczy bodziec patologiczny, natomiast modele dwuczynnikowe łączą dwa bodźce patologiczne w celu wywołania cięższego PH, co pozwala na dokładniejsze odwzorowanie złożonego obrazu choroby u ludzi. Poza różnicami etiologicznymi, poszczególne bodźce prowadzą do różnic w modelowaniu PH, które zależą również od gatunku i tła genetycznego zwierząt4.
Jednym z najczęściej stosowanych klasycznych modeli PH u gryzoni jest model przewlekłej hipoksji2. Wiadomo, że hipoksja indukuje PH zarówno u ludzi, jak i u wielu gatunków zwierząt. Przewagą hipoksji jest to, że stanowi ona fizjologiczny bodziec dla PH (Tabela 1). Jednakże, mimo że stopień hipoksji stosowany do indukowania PH u gryzoni jest znacznie silniejszy niż u ludzi, pojedynczy czynnik (hipoksja) prowadzi jedynie do łagodnej formy przebudowy naczyniowej. Nie odwzorowuje to nasilenia choroby u ludzi. Dodanie drugiego czynnika, dodatkowego bodźca indukującego PH, przyniosło obiecujące wyniki: wstrzyknięcie związku SU5416 gryzoniom w połączeniu z bodźcem hipoksycznym indukuje cięższy fenotyp PH2,5,6. SU5416 jest inhibitorem receptora-2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Blokuje on receptory VEGF i prowadzi do apoptozy komórek śródbłonka. W warunkach hipoksji stymuluje to proliferację podgrupy opornych na apoptozę komórek śródbłonka. Ponadto SU5416 prowadzi do proliferacji komórek mięśni gładkich. Połączenie tych efektów skutkuje patologiczną przebudową naczyniową krążenia płucnego i prowadzi do podwyższonego ciśnienia w PA oraz przebudowy prawej komory2,5,7. Model ten został opisany po raz pierwszy u szczurów6, a później zastosowany u myszy4,5,7. Model mysi wykazuje mniej nasiloną przebudowę naczyniową w porównaniu do szczurów. Co więcej, po powrocie do normoksji PH nadal postępuje u szczurów, podczas gdy u myszy jest ona częściowo odwracalna.
Poniższy protokół opisuje wszystkie etapy modelowania nadciśnienia płucnego (PH) u myszy z wykorzystaniem metody hipoksji/SU5416 (planowanie, harmonogram, wykonanie). Ponadto w protokole opisano charakterystykę modelu: funkcjonalną (poprzez inwazyjny pomiar ciśnienia w prawej komorze (RV) z wykorzystaniem techniki otwartej klatki piersiowej), morfometryczną (poprzez wycięcie i zważenie prawej oraz lewej komory) oraz histologiczną (poprzez ocenę przebudowy naczyń płucnych, hipertrofii kardiomiocytów prawej komory oraz włóknienia).
Wszystkie kroki i metody opisane w niniejszym protokole mogą zostać z łatwością wdrożone przez badaczy o dowolnym poziomie doświadczenia. Choć pomiary czynnościowe RV z wykorzystaniem techniki otwartej klatki piersiowej (opisanej w tym dokumencie) nie stanowią złotego standardu w tej dziedzinie, mają one tę zaletę, że można je szybko opanować i precyzyjnie powtórzyć nawet przez mniej doświadczonego eksperymentatora.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Roth</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>Aceton, klasa histologiczna</td><td>The Lab Depot</td><td>VT110D</td><td></td></tr><tr><td>ADVantage System ciśnieniowo-objętościowy</td><td>Transonic</td><td>ADV500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Bouina</td><td>Sigma</td><td>Ht10132</td><td></td></tr><tr><td>System kauteryzacji</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Rurki połączeniowe i zawory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Covidien</td><td>8884541300</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 24 x50 mm</td><td>Roth</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja i analiza danych</td><td>Emka</td><td>iox2</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień bezpośrednia 80</td><td>Sigma</td><td>365548-5G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetylosulfotlenek)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 7 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-6032</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Wodny</td><td>roztwór Sigma</td><td>HT110216</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, laboratoryjny Grade</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>861285</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Kozie serum</td><td>invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza&nbsp;</td><td>Gaymar&nbsp;</td><td>T/Pump</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin 2</td><td>Thermo Scientific</td><td>7231</td><td></td></tr><tr><td>Komora hipoksyjna</td><td>Biospherix</td><td>A30274P</td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcyjna</td><td>DRE Veterinary</td><td>12570</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik do intubacji (cewnik dożylny SurFlash (20 G x 1") )</td><td>Terumo&nbsp;</td><td>SR*FF2025</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>NDC-10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>DRE Veterinary</td><td>12432</td><td></td></tr><tr><td>Myszy (C57BL/6)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needles 25 G x 5/8"</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td></td><td>OCT Tissue Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kwas pirynowy - roztwór nasycony 1,3</td>% <td>Sigma</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik ciśnieniowy</td> objętościowy <td>Transonic</td><td>FTH-1212B-4018</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Statyczny kontroler tlenu ProOx 360</td><td>Biospherix</td><td>P360</td><td></td></tr><tr><td>SU 5416</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8442</td><td></td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny, pleciony jedwab, 5.0</td><td>Surgical Specialties Corp.&nbsp;</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>303134</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki z igłą 1 ml</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Zielona plama kwasowa nukleinowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tenotomii</td><td>Pricon</td><td>60-521</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Roth</td><td>9558.3</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator&nbsp;</td><td>CWE</td><td>SAR-830/P</td><td></td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/su5416

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

Nadciśnienie płucne (PH) jest stanem patofizjologicznym, definiowanym przez średnie ciśnienie w tętnicy płucnej przekraczające 25 mm Hg w spoczynku, oceniane za pomocą cewnikowania prawego serca. Do PH może prowadzić szerokie spektrum chorób, różniących się etiologią, histopatologią, obrazem klinicznym, rokowaniem i odpowiedzią na leczenie. Pomimo znacznego postępu w ostatnich latach, PH pozostaje nieuleczoną chorobą. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska może utorować drogę do opracowania nowych terapii. Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami badawczymi do osiągnięcia tego celu. Obecnie dostępnych jest kilka modeli do rekapitulacji PH. Ten protokół opisuje model PH myszy z dwoma trafieniami. Bodźcami do rozwoju pH są niedotlenienie i wstrzyknięcie SU5416, antagonisty receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). Trzy tygodnie po rozpoczęciu hipoksji/SU5416 u zwierząt rozwija się przebudowa naczyń płucnych imitująca zmiany histopatologiczne obserwowane w pH człowieka (głównie Grupa 1). Przebudowa naczyń krwionośnych w krążeniu płucnym powoduje przebudowę prawej komory (RV). Szczegółowo opisano procedury pomiaru ciśnienia RV (metodą otwartej klatki piersiowej), analizy morfometryczne RV (poprzez preparowanie i ważenie obu komór serca) oraz oceny histologiczne przebudowy (zarówno płucnej poprzez ocenę przebudowy naczyń krwionośnych, jak i sercowej poprzez ocenę przerostu i zwłóknienia kardiomiocytów RV). Zaletami tego protokołu są możliwość zastosowania zarówno u myszy dzikich, jak i modyfikowanych genetycznie, stosunkowo łatwe i tanie wdrożenie oraz szybki rozwój choroby będącej przedmiotem zainteresowania (3 tygodnie). Ograniczenia tej metody polegają na tym, że myszy nie rozwijają ciężkiego fenotypu, a PH jest odwracalne po powrocie do normoksji. Zarówno badania prewencyjne, jak i terapeutyczne mogą być łatwo realizowane w tym modelu, bez konieczności posiadania zaawansowanych umiejętności (w przeciwieństwie do chirurgicznych modeli gryzoni).

W niniejszym protokole szczegółowo opisujemy tworzenie modelu Hipoksja/SU5416 służącego do indukowania nadciśnienia płucnego (PH) u myszy. Ponadto szczegółowo przedstawiamy wszystkie niezbędne kroki w celu przeprowadzenia oceny naczyniowej płuc i funkcji serca po zakończeniu okresu obserwacji.
Przegląd schematu eksperymentalnego dla tego modelu przedstawiono na Rysunku 1A13,14. Myszy podda...

Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.

Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by ...

Protokół ten może być stosowany do indukcji nadciśnienia płucnego i wykonywania pomiarów funkcjonalnych prawej komory. Model hipoksji Sugena jest łatwy do wdrożenia i może podsumować niektóre cechy charakterystyczne nadciśnienia płucnego w ciągu dwóch do trzech tygodni od indukcji. Korzystając z tego modelu, możemy zidentyfikować nowe szlaki zaangażowane w rozwój choroby.Możemy identyfikować nowe cele i testować ich potencjał terapeutyczny. Przed rozpoczęciem procedury indukcji należy zabezpieczyć zbiorniki z azotem w pobliżu komory hipoksyjnej i ustawić regulator tlenu w punkcie 10% tlenu. Następnie załaduj świeżo przygotowany roztwór SU5416 do jednej mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 i ręcznie przytrzymuj pierwsze zwierzę, które ma zostać wstrzyknięte.Chwyć skórę, aby utworzyć namiot równolegle do kręgosłupa, upewniając się, że mocno chwytasz tył głowy, aby uniknąć potencjalnego ugryzienia przez mysz. Wprowadzić igłę podskórnie przez bok w luźnym fałdzie skórnym równolegle do skóry i dostarczyć 100 mikrolitrów zawartości strzykawki. Po 10 sekundach wyjmij igłę i umieść zwierzę z powrotem w klatce.Po wstrzyknięciu wszystkim zwierzętom umieść myszy w wentylowanej komorze do hipoksji. W przypadku ekspozycji na hipoksję należy upewnić się, że komory są wyposażone w czujnik tlenu do pomiaru poziomu tlenu i otwierać komory na nie więcej niż 20 minut co trzy dni w celu oczyszczenia i dodania pokarmu i wody. Należy codziennie sprawdzać zwierzęta pod kątem oznak stresu i powtarzać wstrzyknięcie SU5416 co tydzień przez trzy kolejne tygodnie.Przed rozpoczęciem procedury pomiaru ciśnienia należy przygotować łącznik rurki Y i użyć trybu ręcznego, aby sprawdzić działanie wentylatora. Ustaw ciśnienie wdechowe na mniej niż jeden centymetr wody, aby uniknąć barotraumy i ustaw częstość oddechów na 110 oddechów na minutę. Wytnij cewnik wewnątrznaczyniowy o rozmiarze 20, aby utworzyć rurkę dotchawiczą i włącz jednostkę kontroli objętości ciśnienia.Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i umieść cewnik objętościowy pod ciśnieniem w 15-mililitrowej probówce wirówkowej PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie skalibruj cewnik zgodnie z protokołem producenta. Umieść mysz na poduszce grzewczej i umieść sondę doodbytniczą do monitorowania temperatury ciała.Następnie potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u znieczulonej myszy i ogol okolice szyi i klatki piersiowej. Zabezpiecz kończyny myszy taśmą chirurgiczną i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w przyśrodkowej skórze szyjki macicy. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką tępo oddziel śliniankę przyuszną i podżuchwową, aby odsłonić mięśnie leżące pod tchawicą.Ostrożnie przeciąć mięśnie, aby całkowicie odsłonić tchawicę i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie między chrząstkami tchawicy. Włóż przygotowaną rurkę dotchawiczą i wyjmij metalową prowadnicę cewnika wewnątrznaczyniowego. Następnie podłącz cewnik do respiratora i sprawdź położenie rurki dotchawiczej, ręcznie delikatnie napompowując płuca.Zabezpiecz pozycję taśmą. W celu pomiaru ciśnienia w prawej komorze wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry nad wyrostkiem mieczykowatym i górną częścią brzucha i zaczynając od środkowej linii dystalnie do mieczykowatej i ostrożnie przesuwając się na boki po obu stronach, oddziel skórę nad klatką piersiową i ścianą brzucha. Otwierając jamę brzuszną, ostrożnie przetnij przeponę, uważając, aby nie uszkodzić bijącego serca lub płuc.I użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie usunąć osierdzie. Zbliż cewnik ciśnieniowy do myszy i za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką wyposażonego w igłę wykonaj ranę kłutą w nietypowej dystalnej części prawej komory. Ostrożnie zastąp igłę cewnikiem ciśnieniowym, wprowadzając cewnik ciśnieniowy równolegle do kierunku prawej komory z końcówką skierowaną w stronę tętnicy płucnej.Obserwuj śledzenie fali ciśnienia, aby zapewnić prawidłowe ustawienie cewnika. Gdy sygnał ciśnienia się ustabilizuje, przerwij oddychanie i wykonaj co najmniej trzy pomiary. Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów ostrożnie umieścić cewnik z powrotem w probówce wirówkowej wypełnionej PBS w łaźni wodnej.W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne krzywe ciśnienia oraz analizę ilościową ciśnienia w prawej komorze pod koniec okresu obserwacji. Analiza histologiczna przebudowanych tętnic płucnych po niedotlenieniu w połączeniu z leczeniem SU5416 ujawnia wzrost grubości ściany przyśrodkowej w porównaniu ze zwierzętami normoksycznymi. Barwienie aglutyniną z kiełków pszenicy w celu oceny przerostu kardiomiocytów wskazuje, że niedotlenienie w połączeniu z ekspozycją na SU5416 powoduje wyraźny wzrost wielkości kardiomiocytów i przerost prawej komory.Ponadto morfometryczna ocena przerostu prawej komory za pomocą pomiaru wskaźnika Fultona potwierdza wzrost przerostu prawej komory u zwierząt niedotlenionych. Wykonanie pomiarów funkcjonalnych jest ważne, aby uniknąć krwawienia, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na wyniki badania. Protokół ten może być również stosowany do wywoływania nadciśnienia płucnego u szczurów z niewielkimi modyfikacjami.Warto zauważyć, że tylko jedno wstrzyknięcie leku Sugen u szczurów wystarcza do wywołania nadciśnienia płucnego.

induction-characterization-pulmonary-hypertension-mice-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Specyficzny i szybki protokół do jednoczesnego badania funkcji prawego serca, zapalenia płuc i odpowiedzi immunologicznej jest opisany jako narzędzie do nauki.  Filmy i rysunki opisują fizjologię i techniki mikrodysekcji w zorganizowanym podejściu zespołowym, które można dostosować do stosowania w małych i dużych badaniach.

Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

Ten artykuł zawiera protokół do echokardiograficznej oceny wielkości prawej komory i nadciśnienia płucnego u myszy.  Zastosowania obejmują określanie fenotypu i seryjną ocenę w transgenicznych i indukowanych toksynami mysich modelach kardiomiopatii i chorób naczyń płucnych.

Echokardiograficzna ocena prawego serca u myszy

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) to choroba tętniczek płucnych, która prowadzi do ich zatarcia i rozwoju niewydolności prawej komory. Modele WWA u gryzoni mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii WWA. Tutaj pokazujemy charakterystykę hemodynamiczną, z cewnikowaniem prawego serca i echokardiografią, u myszy i szczura.

Charakterystyka hemodynamiczna modeli tętniczego nadciśnienia płucnego u gryzoni

Ten protokół opisuje procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie modelu tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem (PAH) u szczurów oraz procedury analizy głównych hemodynamicznych i histologicznych punktów końcowych w tym modelu.

Chirurgia zastawkowa, cewnikowanie prawego serca i morfometria naczyniowa w modelu szczurzym dla tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego przepływem

Lewa pneumonektomia gryzoni jest cenną techniką w badaniach nad nadciśnieniem płucnym. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący procedurę pneumonektomii u szczurów i opiekę pooperacyjną w celu zapewnienia minimalnej zachorowalności i śmiertelności.

Lewa pneumonektomia w połączeniu z monokrotaliną lub Sugenem jako model nadciśnienia płucnego u szczurów

Tutaj oferujemy użyteczne podejście do badania mechanizmu niewydolności prawej komory. Wygodniejsze i skuteczniejsze podejście do zwężenia tętnicy płucnej ustala się za pomocą narzędzi chirurgicznych wykonanych we własnym zakresie. Ponadto przedstawiono metody oceny jakości tego podejścia za pomocą echokardiografii i cewnikowania.

Indukcja niewydolności prawej komory przez zwężenie tętnicy płucnej i ocena funkcji prawej komory u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia inwazyjnej oceny hemodynamicznej prawej komory i tętnicy płucnej u myszy przy użyciu metody chirurgicznej na otwartej klatce piersiowej.

Inwazyjna ocena hemodynamiczna układu prawej komory i tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego niedotlenieniem u myszy

Ten protokół krok po kroku przeprowadza wielokrotne dożylne podawanie dawki bolusa i inwazyjne monitorowanie hemodynamiczne u myszy. Badacze mogą wykorzystać ten protokół do przyszłych badań przesiewowych związków terapeutycznych w kierunku nadciśnienia tętniczego płucnego.

Wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa i inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu nadciśnienia tętniczego płucnej myszy wywołanego niedotlenieniem

Opisujemy mysi model przeciążenia ciśnienia w prawej komorze wywołanego przez opaski na pniu płucnym. Szczegółowe protokoły intubacji, chirurgii i fenotypowania za pomocą echokardiografii znajdują się w artykule. Do intubacji i chirurgii wykorzystywane są instrumenty wykonane na zamówienie, co pozwala na szybkie i niedrogie odtworzenie modelu.

Mysi model przerostu prawej komory serca wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym i niewydolności przez opaski pnia płucnego

Tutaj przedstawiono metodę wywoływania tętniczego nadciśnienia płucnego związanego ze zwłóknieniem płuc (PF-PH) model szczurzy poprzez wstrzykiwanie bleomycyny do dróg oddechowych. Zapewniamy również podejście krok po kroku do walidacji tego modelu zwierzęcego.

Ustalenie i walidacja szczurzego modelu tętniczego nadciśnienia płucnego związanego ze zwłóknieniem płuc

Prezentacja szczegółowych metod oceny funkcji prawej komory poprawi jakość i wiarygodność badań nad nadciśnieniem płucnym, oferując solidne ramy dla przyszłych badań i zwiększając odtwarzalność w różnych laboratoriach.

Ocena funkcji prawej komory w eksperymentalnych modelach tętniczego nadciśnienia płucnego

Poznaj metodę indukcji nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416. Protokół obejmuje pomiary funkcjonalne prawej komory serca i charakterystykę morfometryczną zmian w ciągu trzech tygodni.

Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416

Przeglądaj więcej filmów