Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416
June 3rd, 2020
Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.
Protokół ten może być stosowany do indukcji nadciśnienia płucnego i wykonywania pomiarów funkcjonalnych prawej komory. Model hipoksji Sugena jest łatwy do wdrożenia i może podsumować niektóre cechy charakterystyczne nadciśnienia płucnego w ciągu dwóch do trzech tygodni od indukcji. Korzystając z tego modelu, możemy zidentyfikować nowe szlaki zaangażowane w rozwój choroby.
Możemy identyfikować nowe cele i testować ich potencjał terapeutyczny. Przed rozpoczęciem procedury indukcji należy zabezpieczyć zbiorniki z azotem w pobliżu komory hipoksyjnej i ustawić regulator tlenu w punkcie 10% tlenu. Następnie załaduj świeżo przygotowany roztwór SU5416 do jednej mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 i ręcznie przytrzymuj pierwsze zwierzę, które ma zostać wstrzyknięte.
Chwyć skórę, aby utworzyć namiot równolegle do kręgosłupa, upewniając się, że mocno chwytasz tył głowy, aby uniknąć potencjalnego ugryzienia przez mysz. Wprowadzić igłę podskórnie przez bok w luźnym fałdzie skórnym równolegle do skóry i dostarczyć 100 mikrolitrów zawartości strzykawki. Po 10 sekundach wyjmij igłę i umieść zwierzę z powrotem w klatce.
Po wstrzyknięciu wszystkim zwierzętom umieść myszy w wentylowanej komorze do hipoksji. W przypadku ekspozycji na hipoksję należy upewnić się, że komory są wyposażone w czujnik tlenu do pomiaru poziomu tlenu i otwierać komory na nie więcej niż 20 minut co trzy dni w celu oczyszczenia i dodania pokarmu i wody. Należy codziennie sprawdzać zwierzęta pod kątem oznak stresu i powtarzać wstrzyknięcie SU5416 co tydzień przez trzy kolejne tygodnie.
Przed rozpoczęciem procedury pomiaru ciśnienia należy przygotować łącznik rurki Y i użyć trybu ręcznego, aby sprawdzić działanie wentylatora. Ustaw ciśnienie wdechowe na mniej niż jeden centymetr wody, aby uniknąć barotraumy i ustaw częstość oddechów na 110 oddechów na minutę. Wytnij cewnik wewnątrznaczyniowy o rozmiarze 20, aby utworzyć rurkę dotchawiczą i włącz jednostkę kontroli objętości ciśnienia.
Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych i umieść cewnik objętościowy pod ciśnieniem w 15-mililitrowej probówce wirówkowej PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie skalibruj cewnik zgodnie z protokołem producenta. Umieść mysz na poduszce grzewczej i umieść sondę doodbytniczą do monitorowania temperatury ciała.
Następnie potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u znieczulonej myszy i ogol okolice szyi i klatki piersiowej. Zabezpiecz kończyny myszy taśmą chirurgiczną i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w przyśrodkowej skórze szyjki macicy. Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką tępo oddziel śliniankę przyuszną i podżuchwową, aby odsłonić mięśnie leżące pod tchawicą.
Ostrożnie przeciąć mięśnie, aby całkowicie odsłonić tchawicę i użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie między chrząstkami tchawicy. Włóż przygotowaną rurkę dotchawiczą i wyjmij metalową prowadnicę cewnika wewnątrznaczyniowego. Następnie podłącz cewnik do respiratora i sprawdź położenie rurki dotchawiczej, ręcznie delikatnie napompowując płuca.
Zabezpiecz pozycję taśmą. W celu pomiaru ciśnienia w prawej komorze wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry nad wyrostkiem mieczykowatym i górną częścią brzucha i zaczynając od środkowej linii dystalnie do mieczykowatej i ostrożnie przesuwając się na boki po obu stronach, oddziel skórę nad klatką piersiową i ścianą brzucha. Otwierając jamę brzuszną, ostrożnie przetnij przeponę, uważając, aby nie uszkodzić bijącego serca lub płuc.
I użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie usunąć osierdzie. Zbliż cewnik ciśnieniowy do myszy i za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką wyposażonego w igłę wykonaj ranę kłutą w nietypowej dystalnej części prawej komory. Ostrożnie zastąp igłę cewnikiem ciśnieniowym, wprowadzając cewnik ciśnieniowy równolegle do kierunku prawej komory z końcówką skierowaną w stronę tętnicy płucnej.
Obserwuj śledzenie fali ciśnienia, aby zapewnić prawidłowe ustawienie cewnika. Gdy sygnał ciśnienia się ustabilizuje, przerwij oddychanie i wykonaj co najmniej trzy pomiary. Po zarejestrowaniu wszystkich pomiarów ostrożnie umieścić cewnik z powrotem w probówce wirówkowej wypełnionej PBS w łaźni wodnej.
W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne krzywe ciśnienia oraz analizę ilościową ciśnienia w prawej komorze pod koniec okresu obserwacji. Analiza histologiczna przebudowanych tętnic płucnych po niedotlenieniu w połączeniu z leczeniem SU5416 ujawnia wzrost grubości ściany przyśrodkowej w porównaniu ze zwierzętami normoksycznymi. Barwienie aglutyniną z kiełków pszenicy w celu oceny przerostu kardiomiocytów wskazuje, że niedotlenienie w połączeniu z ekspozycją na SU5416 powoduje wyraźny wzrost wielkości kardiomiocytów i przerost prawej komory.
Ponadto morfometryczna ocena przerostu prawej komory za pomocą pomiaru wskaźnika Fultona potwierdza wzrost przerostu prawej komory u zwierząt niedotlenionych. Wykonanie pomiarów funkcjonalnych jest ważne, aby uniknąć krwawienia, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na wyniki badania. Protokół ten może być również stosowany do wywoływania nadciśnienia płucnego u szczurów z niewielkimi modyfikacjami.
Warto zauważyć, że tylko jedno wstrzyknięcie leku Sugen u szczurów wystarcza do wywołania nadciśnienia płucnego.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy poprzez ekspozycję na niedotlenienie i wstrzyknięcie antagonistów receptora VEGF. Model ten pozwala na funkcjonalną i morfometryczną charakteryzację PH oraz przerostu prawej komory serca w ciągu trzech tygodni.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauka
- Biologia układu krążenia
- Fizjopatologologia
Tło
- Nadciśnienie płucne jest poważnym stanem o wpływie na układ krążenia.
- Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw PH może prowadzić do nowych docelowych terapii.
- Model hipoksji Sugen jest szeroko stosowaną metodą badania PH u myszy.
- Antagonisty receptora VEGF odgrywają rolę w rozwoju PH.
Cel badania
- Indukowanie nadciśnienia płucnego w kontrolowanym modelu myszym.
- Przeprowadzenie pomiarów funkcjonalnych prawej komory.
- Identyfikacja nowych ścieżek i docelowych terapii dla PH.
Stosowane metody
- Indukcja niedotlenienia poprzez ustawienie stężenia tlenu na 10%.
- Wstrzyknięcie SU5416 w celu zablokowania receptorów VEGF.
- Monitorowanie funkcji i morfologii prawej komory.
- Charakteryzacja modelu w ciągu trzech tygodni.
Główne wyniki
- Rozwijanie nadciśnienia płucnego i przerostu prawej komory.
- Pomiar funkcjonalny wskazuje na istotne zmiany w działaniu prawej komory.
- Obserwowane zmiany morfologiczne zgodne z nadciśnieniem płucnym.
- Identyfikacja potencjalnych nowych docelowych terapii leczenia.
Wnioski
- Model hipoksji Sugen skutecznie naśladuje nadciśnienie płucne.
- Ten model może być wykorzystany do badania nowych ścieżek zaangażowanych w PH.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do testowania terapeutycznego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The hypoxia/SU5416 mouse model provides a rapid, cost-effective system for interrogating vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary hypertension, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with wild-type and genetically modified mice supports pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing within a three-week timeframe. This model bridges discovery biology and preclinical evaluation by delivering quantifiable hemodynamic and histological readouts that inform portfolio triage and risk-adjusted decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF signaling pathways and identification of novel therapeutic targets involved in pulmonary vascular remodeling.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of genetic or pharmacological interventions using standardized induction and measurement procedures.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by modeling key histopathological hallmarks of human Group 1 pulmonary hypertension, including medial wall thickening and right ventricular hypertrophy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable outputs such as right ventricular pressure via catheterization and Fulton index for hypertrophy assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible, low-variance measurements when combined with standardized hypoxia exposure and weekly SU5416 dosing.
- Scalability: Enables platform reuse across wild-type and knockout models without requiring surgical expertise, supporting high-throughput target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system that mimics human pulmonary hypertension pathophysiology, allowing evaluation of target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Supports prevention and therapy studies through reversible phenotype upon normoxia return, enabling washout and rechallenge designs.
- Translational Continuity: Connects early discovery to preclinical validation by delivering functional (RV pressure) and structural (vascular remodeling, cardiomyocyte hypertrophy) endpoints aligned with clinical biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target identification, assay validation, and mechanistic de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of VEGF-dependent and independent pathways in pulmonary hypertension through inducible, reversible vascular injury.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized induction (10% oxygen, weekly SU5416) and quantifiable outputs (RV pressure, Fulton index, histological thickening).
- Analytics: Provides functional hemodynamics and morphometric readouts that allow cross-group comparison and effect size estimation for target prioritization.
- Translational Research: Offers mechanistic insight into right ventricular adaptation and pulmonary artery remodeling, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable phenotypic platform for iterative testing of targets across multiple chemogenetic or pharmacological modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by modeling human-relevant vascular and cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hypoxia control, injection schedule, and pressure/volume catheterization techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of targets based on functional and structural disease modification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering multiparametric data (pressure, hypertrophy, fibrosis) for objective target ranking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic chamber management, SU5416 handling, and right ventricular catheterization techniques.
- Dependent on precise oxygen control (10%) and access to nitrogen tanks for chamber maintenance.
- Necessitates standardized animal handling and weekly dosing to ensure model consistency across cohorts.
- Limited to mild-to-moderate phenotype severity, which may restrict modeling of advanced disease stages.
- Reversibility upon normoxia return requires careful experimental design for chronic therapy studies.
