Analiza fukozylowanych trisacharydów mleka ludzkiego w kontekście biotechnologicznym z wykorzystaniem genetycznie kodowanych biosensorów

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kilka kluczowych pytań związanych z produkcją oligosacharydów mleka ludzkiego. Po pierwsze, ile produktu posiadam? A po drugie, jakie jest specyficzne wiązanie węglowodanowe?

Celem jest uproszczenie i przyspieszenie procesu ilościowego określania i charakteryzowania tych oligosacharydów mleka ludzkiego. Metoda ta ma dwie zalety w porównaniu z obecnym stanem techniki. Po pierwsze, jest podatny na badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Możesz więc wyobrazić sobie testowanie tysięcy różnych warunków, a może nawet biblioteki enzymów syntezy w ciągu jednego dnia przy użyciu tej techniki. Wykorzystuje również unikalną specyficzność substratu, którą natura wyewoluowała w enzymach, aby dostarczyć nam informacji o wiązaniach węglowodanowych tych oligosacharydów. Wierzymy, że ta metoda może poprawić produkcję oligosacharydów mleka kobiecego, co z kolei może prowadzić do lepszej jakości mleka modyfikowanego dla niemowląt, które bardziej naśladuje mleko matki i pomaga wypełnić lukę między dziećmi karmionymi piersią a mlekiem modyfikowanym.

Zaleca się zachowanie dyskrecji użytkownika przy podejmowaniu decyzji o tym, jaką metodę usunąć laktozę w oparciu o koszty, przepustowość i dostępność sprzętu. Należy zadbać o optymalne usuwanie laktozy. Dzień przed eksperymentem wysiewaj 5 mililitrów pożywki LB uzupełnionej kanamycyną i karbenicyliną ze świeżej kolonii bakteryjnej przy użyciu sterylnych technik.

Inkubuj wszystkie kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem. Następnego dnia przenieś 50 mikrolitrów nocnej kultury do pięciu mililitrów świeżej pożywki LB M9 z kanamycyną i karbenicyliną. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem, aż kultura osiągnie OD600 między punktem zerowym piątym a punktem zerowym siódmym.

Najpierw przenieś nocne kultury do jednopunktowych pięciomililitrowych probówek i odwiruj przy 12 500 gach przez jedną minutę. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach 1x PBS, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę jednokomórkową do tub faksowych.

Użyj cytometru przepływowego, aby wzbudzić GFP i zebrać poziomy fluorescencji FITC, jak opisano w protokole tekstowym. Aby wykonać krzywą kalibracyjną, wykonaj od ośmiu do 10 rozcieńczeń standardowego 2'FL w zakresie od zera do 2500 miligramów na litr. Hodować komórki biosensoryczne 2'FL i indukować je standardowymi rozcieńczeniami, jak opisano w protokole tekstowym.

Rozpocznij hodowlę szczepu produkującego 2'FL w pięciu mililitrach pożywki LB i hoduj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia subkulturuj w 1% w 250 mililitrach przygotowanej minimalnej pożywki i dodaj glicerol do końcowego stężenia 10 gramów na litr. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kultura osiągnie poziom OD600 między punktem zerowym piątym a punktem zerowym siódmym.

Następnie dodać IPTG do końcowego stężenia wynoszącego pięć milimoli i laktozę do końcowego stężenia dwóch gramów na litr. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym wstrząsaniem przez 24 godziny. Następnego dnia przenieś nocną kulturę do sterylnych 50-mililitrowych probówek i odwiruj przy 900 razy g przez 15 minut.

Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad w wodzie dejonizowanej. Powtórz to pranie trzy razy, aby usunąć resztki laktozy. Następnie ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach wody dejonizowanej.

Umieść komórki na lodzie i użyj sonikatora o mocy 30% w 30-sekundowych impulsach, aby zlizować zawiesinę komórkową. Odwirować zlizane komórki z prędkością 2 000 g przez 25 minut. Usunąć supernatant i przepuścić go przez sterylny filtr.

Przefiltrowany supernatant należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu, gdy będzie on gotowy do analizy. Następnie zaszczepić kulturę komórek biosensorycznych 2'FL. W środkowej fazie logarytmicznej indukować komórki lizatem komórkowym w stężeniach równoważnych stężeniom 2'FL użytym do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej.

Wykonaj kalibrację zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie uruchom próbki na cytometrze przepływowym. Wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź, wykreślając wynik fluorescencji w stosunku do stężenia oligosacharydów i porównaj odpowiedź wzorców na lizat komórkowy.

Najpierw rozpuść alfalizowaną beta galaktozydazę FL do 1 000 jednostek na mililitr w jednym milimolowym chlorku magnezu. Aby określić optymalne stężenie potrzebnego enzymu, hoduj inokulum komórek biosensorycznych 2'FL i w środkowej fazie logarytmicznej indukuj laktozą i 2'FL. Do 100 mikrolitrowych kultur dodaj zmienne ilości beta galaktozydazy do 12 jednostek.

Pozwól kulturom rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle potrząsając. Zmierz fluorescencję zgodnie z opisem w protokole tekstowym i oblicz optymalne jednostki enzymu potrzebne do określenia minimalnego stężenia enzymu, aby osiągnąć pożądane tłumienie sygnału. Do komórek wytwarzających 2'FL hodowanych przez 24 godziny dodaj optymalne jednostki beta galaktozydazy i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, oznacz miano 2'FL, jak opisano wcześniej.

Najpierw rozpocznij 25-mililitrową hodowlę szczepu wytwarzającego 2'FL. Po indukcji szczepu w środkowej fazie logarytmicznej inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie zaszczepić kulturę E.coli BL21 w pożywce LB.

Wyhoduj go do połowy fazy logarytmicznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie dodaj 15 mililitrów tej kultury do 24-godzinnej kultury 2'FL. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie określ miano 2'FL zgodnie z wcześniejszym opisem.

Na początek rozpocznij 25-mililitrową hodowlę szczepu produkującego 2'FL. Gdy szczep zostanie indukowany w środkowej fazie logarytmicznej, inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Dodaj dwie objętości 100% etanolu do kultury i dobrze wstrząśnij.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie odwirować zawiesinę o stężeniu 900 razy g przez 15 minut. Zebrać supernatant i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić laktozę.

Przepuścić roztwór przez bibułę filtracyjną, aby usunąć wytrąconą laktozę. Zebrać filtrat zawierający lizat komórkowy i oznaczyć miano 2'FL zgodnie z poprzednio opisanym opisem. W tym badaniu zastosowano strategię wysokoprzepustową do wykrywania fukozylowanych oligosacharydów mleka ludzkiego specyficznych dla sprzężeń.

Osiąga się to poprzez budowę bioczujników całych komórek za pomocą inżynierii genetycznej E. Coli, które po indukcji specyficznymi glikanami reagują sygnałem fluorescencyjnym. Sygnał fluorescencyjny w różnych warunkach indukcji, analizowany na cytometrze przepływowym, wykazuje ponad 100-krotny wzrost fluorescencji za pomocą biosensora 2'FL w porównaniu ze sterowaniem wektorowym lub bioczujnikiem dla 3'FL. Świadczy to o wysokiej specyficzności połączenia bioczujnika.

Czułość testu można określić, generując krzywą dawka-odpowiedź z różnymi poziomami węglowodanów. Dynamiczny zakres liniowy wykrywania 2'FL wynosi od 40 do 400 miligramów na litr, a granica wykrywalności wynosi cztery miligramy na litr. Test ten można przeprowadzić w ciągu dnia roboczego, co widać w pomiarach dynamiki ekspresji reportera za pomocą strzałów błyskawicznych.

Komórki biodetekcyjne mogą być wykorzystywane do wykrywania i ilościowego oznaczania 2'FL ze zmodyfikowanego szczepu produkcyjnego 2'FL przy użyciu szeregu strategii redukcji sygnału z egzogennej laktozy, tak aby odczytany sygnał bezpośrednio odpowiadał stężeniu 2'FL. Jedną ze strategii jest enzymatyczna degradacja laktozy przy użyciu beta galaktozydazy, która nie działa na zmodyfikowaną laktozę. Inna strategia wykorzystywała etanol, który nie tylko selektywnie wytrąca laktozę, ale także powoduje lizę komórek produkcyjnych, ponieważ liza komórek jest niezbędnym krokiem w dół.

Wreszcie, najbardziej skuteczną, ale czasochłonną metodą jest granulowanie i mycie komórek przed lizą komórek w celu uwolnienia wewnątrzkomórkowego 2'FL. Po ustaleniu tej metody byliśmy w stanie poszerzyć repertuar celów oligosacharydowych przy użyciu różnych enzymów. Obecnie jesteśmy w stanie wykryć dziewięć różnych oligosacharydów i pracujemy nad kolejnymi.

Optymalizując ten test, zauważyliśmy, że solidność naszych enzymów pozwoliła nam opracować technikę, która daje odczyt specyficzny dla wiązania w ciągu około pięciu minut. Chociaż żaden z użytych tutaj odczynników nie jest szczególnie niebezpieczny, osoby stosujące tę metodę powinny przestrzegać standardowych procedur zagrożenia biologicznego i biobezpieczeństwa, w tym nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.