Obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych

Protokół ten określa proste przygotowanie do obrazowania AFM pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w postaci uwodnionej i wysuszonej, ich unieruchomienie elektrostatyczne, skanowanie powierzchni, identyfikację pęcherzową oraz analizę i interpretację danych. Główną zaletą tej techniki jest wygodne elektrostatyczne utrwalenie pęcherzyków na powierzchni skóry oraz analiza po obrazowaniu w celu uwzględnienia zniekształceń kształtu spowodowanych unieruchomieniem. Uzyskane wyniki wymiarowania pęcherzyków są zgodne ze złotym standardem obrazowania CryoTEM, które pozostaje kosztowną i wymagającą techniką.

Jeśli jesteś nowym użytkownikiem AFM, zacznij od scharakteryzowania suchych próbek, zanim przejdziesz do próbek uwodnionych. Ponieważ istnieje wiele dodatkowych czynników, które mogą wpływać na pobieranie uwodnionej próbki. Na początek wyizoluj pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z biopłynu, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.

Następnie mocno przymocuj krążek miki do magnetycznego dysku z próbką ze stali nierdzewnej. Rozetnij krążek miki za pomocą ostrej brzytwy, aby odsłonić nową warstwę materiału. W temperaturze pokojowej potraktuj górną powierzchnię miki przez dziesięć sekund stu mikrolitrami dziesięciomilimolowego roztworu chlorku niklu II.

To modyfikuje ładunek powierzchni z ujemnego na dodatni. Zetrzyj roztwór chlorku niklu II niestrzępiącą się chusteczką lub bibułą. Następnie trzykrotnie umyj powierzchnię miki wodą dejonizowaną i osusz ją strumieniem suchego azotu.

Umieść krążek z próbką AFM z dołączoną miką zmodyfikowaną powierzchniowo na szalce Petriego. Następnie rozcieńczyć egzosomy PBS, aby uzyskać stężenie od czterech do czterdziestu miliardów cząstek na mililitr roztworu. Zwaliduj stężenie rozcieńczonych cząstek za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.

Uformuj siedzącą kroplę na powierzchni miki, opróżniając sto mikrolitrów rozcieńczonego roztworu egzosomu z pipety. Następnie umieść pokrywkę na szalce Petriego i uszczelnij ją folią parafenową, aby zmniejszyć parowanie próbki. Inkubować w lodówce przez dwanaście godzin.

Po inkubacji należy ostrożnie zassać od 80 do 90 procent próbki, nie naruszając powierzchni. W tym momencie egzosomy zostaną elektrostatycznie unieruchomione na podłożu miki. Podczas obrazowania uwodnionych próbek należy trzykrotnie spłukać powierzchnię PBS.

Należy zadbać o to, aby próbka była nawodniona przez cały proces płukania. Po umyciu powierzchni miki PBS usuń od 80 do 90 procent płynu i odpipetuj czterdzieści mikrolitrów świeżego PBS, aby przykryć próbkę. Uwodniona próbka jest gotowa do obrazowania.

Podczas obrazowania wysuszonych EV należy usunąć sole z powierzchni, trzykrotnie spłukując podłoże wodą dejonizowaną. Po zaessaniu jak największej ilości cieczy, bez dotykania powierzchni, resztę wysusz strumieniem suchego azotu. Aby zobrazować wysuszone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, wybierz wspornik przeznaczony do skanowania w powietrzu w trybach opukiwania i obrazowania bezkontaktowego i zamontuj go na uchwycie sondy.

Umieścić próbkę na stoliku AFM. Magnetyczny dysk próbki ze stali nierdzewnej unieruchomi próbkę na stoliku. Umieść uchwyt sondy w AFM.

Poczekaj, aż przygotowanie i etap zrównoważą się termicznie. Użyj trybu stukania, aby zeskanować obszar o wymiarach 5x5 mikronów zrastrowany w 512 liniach z częstotliwością skanowania jednej herca. Uzyskaj zarówno obrazy wysokości, jak i fazy, ponieważ dostarczają one uzupełniających informacji na temat topografii i właściwości powierzchni próbki.

Czas skanowania będzie się wydłużał wraz z obrazowanym obszarem i liczbą linii wybranych do utworzenia obrazu, ale będzie się zmniejszał wraz z szybkością skanowania. Ponieważ szybkie skanowanie może mieć wpływ na jakość obrazu, szybkość rastrowania powinna być równowagą między czasem akwizycji a jakością obrazu. Aby zobrazować uwodnione pęcherzyki, wybierz wspornik, który jest odpowiedni do skanowania miękkich, uwodnionych próbek i zamontuj wspornik na uchwycie sondy przeznaczonym do skanowania w cieczach.

Zwilż końcówkę wspornika PBS, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia pęcherzyków powietrza do cieczy podczas skanowania. Następnie unieruchomić próbkę na stoliku AFM. Gdy próbka osiągnie równowagę termiczną, zobrazuj uwodnioną powierzchnię miki w trybie stukania.

Uzyskaj zarówno obrazy wysokości, jak i fazy. Aby przeanalizować wykonane obrazy, najpierw przejdź do Proces danych"wybierz tryby SPM, a następnie Wskazówka" i wybierz Wskazówka dotycząca modelu"Wybierz geometrię i wymiary końcówki użytej do zeskanowania próbki i kliknij OK'Popraw artefakty erozji końcówki, wykonując rekonstrukcję powierzchni. Otwórz obraz.

Z menu wybierz Proces danych'następnie wybierz Tryby SPM'a następnie Wskazówka'następnie wybierz Rekonstrukcja powierzchni'i kliknij OK'Następnie wybierz Proces danych, a następnie Poziom'i wybierz Poziom płaszczyzny', aby wyrównać płaszczyznę obrazowania i dopasować laboratoryjną płaszczyznę XY, usuwając nachylenie podłoża z danych skanowania. Wyrównaj wiersze na obrazie, wybierając Proces danych"a następnie Popraw dane"a następnie wybierz Wyrównaj wiersze"Dostępnych jest kilka opcji wyrównania, w tym mediana, która jest algorytmem, który znajduje średnią wysokość każdej linii skanowania i odejmuje ją od danych. Następnie przejdź do procesu danych"a następnie Popraw dane"i wybierz Usuń blizny"Spowoduje to usunięcie typowych błędów skanowania znanych jako blizny"Aby wyrównać powierzchnię miki na zerowej wysokości, przejdź do procesu danych"menu i wybierz Spłaszcz podstawę"w Poziomie"rozwijane menu.

Zidentyfikuj dodatkowe pęcherzyki komórkowe na zeskanowanej powierzchni, przechodząc do menu Ziarna i używając opcji Oznacz według progu"Ten algorytm identyfikuje egzosomy unieruchomione powierzchniowo jako cząstki wystające z podłoża o powierzchnię zerową na wysokość powyżej progu wybranego przez użytkownika. Wybierz próg z zakresu od jednego do trzech nanometrów. Pozwoli to wyeliminować większość zakłóceń w tle.

Na koniec należy przeprowadzić geometryczną i wymiarową charakterystykę zidentyfikowanych pęcherzyków przy użyciu dostępnych algorytmów rozkładów dostępnych w menu Grains. Eksportuj dane AFM z Gwyddion do specjalistycznej analizy za pomocą innych narzędzi obliczeniowych i niestandardowych programów komputerowych. Modyfikacja powierzchni chlorku niklu powoduje unieruchomienie pęcherzyków pozakomórkowych, które jest zależne od czasu.

Stężenie powierzchniowe unieruchomionych pęcherzyków jest nadmiernie gęste po 24 godzinach inkubacji, podczas gdy 12-godzinna inkubacja prowadzi do mniejszej liczby egzosomów i danych skanowania, które są łatwiejsze do dokładnej analizy. Ten obraz AFM pokazuje uwodnione egzosomy MCF7 elektrostatycznie unieruchomione na zmodyfikowanej powierzchni miki. Odpowiedni obraz fazowy AFM potwierdza, że ziarna na obrazie wysokości są miękkimi nanocząstkami, czego należy się spodziewać w przypadku pęcherzyków błonowych.

Dane dotyczące wysokości dla trzech pęcherzyków wzdłuż tej samej linii są pokazane tutaj. Profile te ilustrują spłaszczony kształt spowodowany elektrostatycznym przyciąganiem egzosomów do dodatnio naładowanej powierzchni zmodyfikowanej miki. Zniekształcenie kształtu jest widoczne w powiększonym widoku unieruchomionego pęcherzyka i jego przekroju poprzecznego.

Aby oszacować rozmiar kuli egzosomów w roztworze, on może dopasować objętości zamknięte w unieruchomionych powierzchniowo i sferycznych otoczkach błonowych. Rozkład wielkości pęcherzyków kulistych w roztworze określono na podstawie danych AFM z 561 unieruchomionych pęcherzyków. Rozmiary pęcherzyków na obrazach CryoTEM są zgodne z wynikami AFM.

Przed obrazowaniem egzosomów należy pamiętać o dokładnym spłukaniu powierzchni PBS. Spowoduje to usunięcie przychodzących egzosomów i zapobiegnie ich przyczepianiu się do końcówki AFM. Podczas obrazowania wysuszonych egzosomów należy użyć wody demineralizowanej do podniesienia podłoża.

Mycie DI zapobiegnie tworzeniu się kryształków soli na powierzchni podczas wysychania podłoża. Jeśli są obecne, kryształy soli sprawią, że przetwarzanie obrazu będzie trudnym zadaniem.