Name: Obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę obrazowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Protokół obejmuje elektrostatyczną imobilizację, skanowanie powierzchni i analizę danych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od National Science Foundation (numer nagrody IGERT-0903715), University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant and the Graduate Research Fellowship Award) oraz Skolkovo Institute of Science and Technology (Skoltech Fellowship).

1. Izolacja EV od biopłynu 
<ol>
	<li>Wyizoluj EV za pomocą jednej z uznanych metod, takich jak ultrawirowanie różnicowe8, wytrącanie lub chromatografia wykluczania wielkości9.</li>
	<li>Potwierdzić obecność oczekiwanych biomarkerów powierzchniowych i świetlnych oraz brak biomarkerów wskazujących na zanieczyszczenie krzyżowe preparatu. Potwierdź morfologię dwuwarstwowej warstwy lipidowej izolowanych cząstek za pomocą mikroskopii elektronowej. 
	UWAGA: Podczas izolowania egzosomów hydrodynamiczny rozkład wielkości mierzony za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) lub dynamicznego rozpraszania światła powinien mieścić się w oczekiwanym zakresie. Szczegóły izolacji EV i egzosomów wykraczają poza zakres tego protokołu. Wybrana metoda będzie zależała od pytań eksperymentalnych i celu badania10. Poniższe kroki stanowią konkretną ilustrację procedury wzbogacania egzosomów poprzez wytrącanie z pożywki wzrostowej komórek raka piersi MCF-7 przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do wytrącania (tabela materiałów).</li>
	<li>Przed ekspansją hodowli komórkowej przechowuj komórki raka piersi MCF-7 w ciekłym azocie. Rozmrozić komórki do subkultury.</li>
	<li>Postępując zgodnie z praktykami aseptycznymi, należy wykonać posiew komórek na płytkach o średnicy 150 mm. Użyj pożywki wzrostowej składającej się z minimalnej niezbędnej pożywki Eagle, 0,01 mg/ml ludzkiej rekombinowanej insuliny i 10% wolnej od egzosomów płodowej surowicy bydlęcej.</li>
	<li>Napowietrzać kulturę za pomocą 95% powietrza i 5% CO2 i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po osadzeniu się komórek (około 24 godziny po posiewaniu) należy zmienić podłoże. Podzielić płytkę w stosunku 1:10 i wyhodować dziesięć płytek, z których każda zawiera 20 ml pożywki.</li>
	<li>Zbierz i połącz pożywkę z 9 z tych płytek (180 ml) przy ~70−80% zbiegu, gdy komórki są jeszcze w fazie wzrostu.</li>
	<li>Podzielić pożywkę na 60 ml i 120 ml, dalej podzielić na 30 ml / probówkę i odwirować przy 3 000 x g przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieś supernatant z każdej probówki do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml i wykonaj izolację egzosomu.</li>
	<li>Wyizoluj egzosomy przez wytrącanie zgodnie z opublikowanymi protokołami (patrz na przykład reference11) lub postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli używany jest komercyjny zestaw izolacyjny (tabela materiałów). W pierwszym kroku w tym drugim przypadku należy odwirować pożywkę komórkową o stężeniu 3 000 x g przez 15 minut. Usunąć supernatant i wyrzucić komórki i resztki komórek.</li>
	<li>Dodaj roztwór strącający (stosunek objętościowy 1:5) do supernatantu, wymieszaj i wstaw do lodówki na noc.</li>
	<li>Wirować przy 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.</li>
	<li>Obracaj pozostałą osadkę egzosomu przez kolejne 5 minut w temperaturze 1,500 x g. Nie naruszając osadu, usuń pozostały roztwór opadowy przez aspirację.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100-500 μl 1x buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i podzielić na wiele podwielokrotności w razie potrzeby do dalszej analizy.</li>
	<li>Natychmiast przystąp do powierzchniowego unieruchomienia wyizolowanych egzosomów w celu obrazowania AFM. W razie potrzeby zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, zaznając środków ostrożności w celu uniknięcia uszkodzenia próbki podczas cyklu zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Powierzchniowe utrwalenie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
<ol>
	<li>Użyj mocnej taśmy dwustronnej, żywicy epoksydowej lub alternatywnego kleju, aby mocno przymocować krążek miki do magnetycznego dysku próbki ze stali nierdzewnej AFM/skaningowego mikroskopu tunelowego (STM).</li>
	<li>Rozłup krążek miki za pomocą ostrej brzytwy lub noża uniwersalnego lub przyklejając taśmę samoprzylepną do górnej powierzchni, a następnie odklejając ją w celu usunięcia warstwy materiału. 
	UWAGA: Każda metoda powinna odsłonić pierwotną powierzchnię poprzez usunięcie cienkiej warstwy miki uprzednio wystawionej na działanie środowiska. Po zabiegu przymocowanie miki do metalowego krążka próbki AFM/STM musi pozostać mocne.</li>
	<li>W temperaturze pokojowej należy traktować górną powierzchnię miki przez 10 s 100 μl 10 mM roztworu NiCl2, który modyfikuje ładunek powierzchniowy z ujemnego na dodatni.</li>
	<li>Osusz roztwór NiCl2 niestrzępiącą się chusteczką lub bibułą. Umyj powierzchnię miki 3x wodą dejonizowaną (DI) i osusz strumieniem suchego azotu. 
	UWAGA: Dobrą praktyką jest skanowanie zmodyfikowanej powierzchni za pomocą AFM w celu potwierdzenia, że jest wolna od zanieczyszczeń.</li>
	<li>Umieść krążek próbki AFM z dołączoną miką modyfikowaną powierzchniowo na szalce Petriego.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę egzosomu z kroku 1.14 1x PBS, aby uzyskać stężenie między 4,0 x 109 i 4,0 x 1010 cząstek na ml roztworu. Zatwierdzić stężenie rozcieńczonych cząstek za pomocą NTA.</li>
	<li>Utworzyć siedzącą kroplę na powierzchni miki, opróżniając 100 μl rozcieńczonego roztworu egzosomu z pipety.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na szalce Petriego i uszczelnij ją folią parafinową, aby zmniejszyć parowanie próbki. Inkubować próbkę przez 12−18 h w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Gęstość powierzchniowa unieruchomionych egzosomów będzie rosła wraz z czasem inkubacji i stężeniem EV w cieczy. Dłuższy czas inkubacji może być konieczny, jeśli egzosomy są obecne w próbce w niższych stężeniach.</li>
	<li>Po inkubacji odessać 80−90% próbki bez naruszania powierzchni. W tym momencie egzosomy zostaną elektrostatycznie unieruchomione na podłożu miki.</li>
	<li>Przed obrazowaniem uwodnionych EV spłucz powierzchnię 1x PBS. Powtórz 3 razy. Należy zadbać o to, aby próbka była nawodniona przez cały proces płukania.</li>
	<li>Po umyciu powierzchni miki 1x PBS, usuń 80%-90% płynu i odpipetuj ~40 μL świeżego 1x PBS, aby przykryć próbkę.</li>
	<li>Podczas obrazowania wysuszonych EV należy spłukać podłoże wodą DI. Powtórz 3x. 
	UWAGA: Płukanie wodą DI zapobiegnie tworzeniu się kryształków soli i osadzaniu się substancji rozpuszczonych na powierzchni podczas wysychania podłoża.</li>
	<li>Przed obrazowaniem wysuszonych pojazdów elektrycznych należy zassać jak najwięcej płynu bez dotykania powierzchni, a resztę wysuszyć strumieniem suchego azotu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie AFM 
<ol>
	<li>Aby zobrazować wysuszone pojazdy elektryczne, należy wybrać wspornik przeznaczony do skanowania w powietrzu w trybie gwintowania i obrazowania bezdotykowego i zamontować go na uchwycie sondy. 
	UWAGA: Charakterystyka przykładowego wspornika wymienionego w Tabeli materiałów (długość 123 μm, szerokość 40 μm, promień końcówki 7 nm i stała sprężystości 37 N/m) może być wykorzystana jako wskazówka przy wyborze sondy kompatybilnej z dostępnym oprzyrządowaniem AFM.
	<ol>
		<li>Umieścić preparat z kroku 2.13 na etapie AFM. Magnetyczny dysk próbki ze stali nierdzewnej unieruchomi próbkę na stoliku. Poczekaj, aż przygotowanie i etap zrównoważą się termicznie.</li>
		<li>Użyj trybu stukania, aby zeskanować wystarczająco duży obszar powierzchni miki. Na przykład wybierz obszar o wymiarach 5 x 5 μm, zrastrowany w 512 liniach z częstotliwością skanowania ~1 Hz. Uzyskaj zarówno obrazy wysokości, jak i fazy, ponieważ dostarczają one uzupełniających się informacji na temat topografii i właściwości powierzchni próbki. 
		UWAGA: Czas skanowania będzie się wydłużał wraz z obrazowanym obszarem i liczbą linii wybranych do utworzenia obrazu, ale będzie się zmniejszał wraz z szybkością skanowania zdefiniowaną jako liczba linii skanowanych na sekundę. Szybkość skanowania może mieć wpływ na jakość obrazu. W związku z tym szybkość rastrowania powinna rozsądnie równoważyć kompromis między czasem akwizycji a jakością obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zobrazować uwodnione pęcherzyki, należy wybrać wspornik odpowiedni do skanowania miękkich, uwodnionych próbek i zamontować wspornik na uchwycie sondy przeznaczonym do skanowania w cieczach. 
	UWAGA: Przy wyborze sondy kompatybilnej z dostępnym oprzyrządowaniem AFM, jako wskazówkę można posłużyć się specyfikacją sondy wymienioną w Tabeli materiałów (trójkątny wspornik o długości nominalnej 175 μm, szerokości 22 μm, promieniu końcówki 20 nm, stałej sprężystości 0,07 N/m i zoptymalizowany do obrazowania z częstotliwością sterowania w zakresie od 4 do 8 kHz).
	<ol>
		<li>Zwilż końcówkę wspornika 1x PBS, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia pęcherzyków powietrza do cieczy podczas skanowania.</li>
		<li>Umieść preparat z kroku 2.11 na etapie AFM. Magnetyczny dysk próbki ze stali nierdzewnej unieruchomi dołączoną mikę zawierającą unieruchomione EV na swojej powierzchni.</li>
		<li>Daj czas na przygotowanie i etap AFM na zrównoważenie termiczne.</li>
		<li>Zobrazuj uwodnioną powierzchnię miki w trybie stukania. Zbierz obrazy zarówno wysokości, jak i fazy. 
		UWAGA: Na jakość obrazowania ma wpływ oprzyrządowanie, wybrana sonda i parametry skanowania. Optymalizując warunki skanowania, jako punkt wyjścia można wykorzystać następujące opcje: obszar 5 x 5 μm skanowany w 512 liniach z częstotliwością skanowania ~0,8-1,0 Hz i częstotliwością sterowania od 4 do 8 kHz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza obrazu
UWAGA: Następujące kroki przetwarzania i analizy danych są stosowane do uzyskanych obrazów wysokości. Podobną procedurę można zastosować do analizy danych fazowych. Poniższy opis jest specyficzny dla Gwyddion12, wolnego i otwartego oprogramowania dostępnego na licencji GNU General Public License. Podobne możliwości są dostępne w alternatywnych narzędziach programowych.
<ol>
	<li>Przejdź do Data Process, SPM modes, Tip i wybierz Model Tip (Rysunek 2). Wybierz geometrię i wymiary końcówki użytej do zeskanowania próbki, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Skoryguj artefakty erozji końcówki, wykonując rekonstrukcję powierzchni. Otwórz obraz. Z menu wybierz Data Process, SPM modes, Tip, a następnie wybierz Surface Reconstruction i kliknij OK (Rysunek 3).</li>
	<li>Wyrównaj płaszczyznę obrazowania tak, aby pasowała do laboratoryjnej płaszczyzny XY, usuwając nachylenie podłoża z danych skanowania. Aby wykonać to zadanie, wybierz Data Process, Level i wybierz Plane Level (Poziom płaszczyzny) (Rysunek 4).</li>
	<li>Wyrównaj wiersze obrazu, wybierając opcję Przetwarzanie danych, Popraw dane, a następnie wybierz pozycję Wyrównaj wiersze. Dostępnych jest kilka opcji wyrównania (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Na przykład Mediana to algorytm, który znajduje średnią wysokość każdej linii skanowania i odejmuje ją od danych.</li>
	<li>Przejdź do sekcji Przetwarzanie danych, popraw dane i wybierz opcję Usuń blizny (Rysunek 6), która usuwa typowe błędy skanowania znane jako blizny.</li>
	<li>Wyrównaj powierzchnię miki na zerowej wysokości, Z = 0, wybierając opcję Spłaszcz podstawę w menu rozwijanym Poziom dostępnym z poziomu procesu danych (Rysunek 7).</li>
	<li>Zidentyfikuj EV na zeskanowanej powierzchni za pomocą menu rozwijanego Oznacz według progu w ziarnach (<silna klasa="xfig">Rysunek 8A). Algorytm ten identyfikuje egzosomy unieruchomione powierzchniowo jako cząstki wystające z podłoża o zerowej powierzchni na wysokości powyżej wybranego przez użytkownika progu. Wybierz próg w zakresie od 1 do 3 nm, który wyeliminuje większość zakłóceń tła. Mniejsze progi są używane z czystszym tłem. 
	UWAGA: Próg w <silnej klasie="xfig">Rysunek 8A wynosi 1,767 nm. Wynik identyfikacji egzosomu MCF-7 z tym progiem pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 8B. Gwyddion oferuje kilka alternatyw dla progowania jako algorytmu do automatycznej identyfikacji pęcherzyków na obrazie, w tym automatyczne progowanie (metoda Otsu), wykrywanie krawędzi i algorytm zlewni. 
	UWAGA: Aglomeraty cząstek, jeśli są obecne na obrazie AFM, mogą być maskowane i wyłączane z analizy.</li>
	<li>Wykonaj geometryczną i wymiarową charakterystykę zidentyfikowanych EV za pomocą dostępnych algorytmów rozkładów dostępnych w menu Ziarna. 
	UWAGA: Gwyddion dostarcza narzędzia do oceny rozkładu właściwości skalarnych, powierzchniowych, wolumetrycznych i innych właściwości unieruchomionych EV w stanie uwodnionym lub wysuszonym. Przykład właściwości wartości skalarnych jest pokazany w Rysunek 9, który przedstawia rozkład maksymalnych wysokości w obrębie śladu każdego zidentyfikowanego egzosomu.</li>
	<li>Eksportuj dane AFM z Gwyddion do specjalistycznej analizy za pomocą innych narzędzi obliczeniowych i niestandardowych programów komputerowych.</li>
</ol>

<ol><li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li>
<li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li>
<li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li>
<li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li>
<li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001(2018).</li>
<li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).</li>
<li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li>
<li>Nečas, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gwyddion%3A+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Physics%22%5BJournal%5D)">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li>
<li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li>
<li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).</li>
<li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li>
<li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603(2015).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva%2C+using+correlative+AFM%2C+FESEM%2C+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li>
<li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+amniocytes+express+hTERT%2C+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li>
<li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Circulating+Biomarkers%22%5BJournal%5D)">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li>
<li>Pastré, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions%3A+A+Theoretical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li>
<li>van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification%2C+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Unieruchomienie EV z płynu biologicznego, skanowanie powierzchni i analiza obrazu są podstawowymi etapami opracowanego protokołu charakterystyki EV w cieczy za pomocą AFM. Liczba pęcherzyków podatnych na obrazowanie AFM skaluje się wraz z obrazowaną powierzchnią i stężeniem powierzchniowym pęcherzyków unieruchomionych na podłożu. Biorąc pod uwagę ujemny potencjał zeta EV i egzosomów18, zalecamy elektrostatyczne utrwalanie EV z próbek cieczy do podłoża AFM. Unieruchomienie jest skuteczne, gdy powie...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są obecne we wszystkich płynach ustrojowych, w tym we krwi, moczu, ślinie, mleku i płynie owodniowym. Egzosomy tworzą klasę okręgową EV różniącą się od innych EV biogenezą endosomalną, markerami szlaku endosomalnego i najmniejszym rozmiarem spośród wszystkich EV. Wielkość egzosomów jest często podawana ze znaczną zmiennością między badaniami. Stwierdzono, że wyniki wymiarowania są zależne od metody, co odzwierciedla różnicę w zasadach fizycznych stosowanych przez różne techniki analityczne do szacowania rozmiarów EVs1,2. Na przykład analiza śledzenia nanocząstek (NTA) ― najpowszechniej stosowana technika charakteryzowania wielkości ― szacuje rozmiar EV jako ich średnice hydrodynamiczne, które charakteryzują odporność na ruchliwość Browna EV w roztworze. Większa średnica hydrodynamiczna pęcherzyka oznacza jego mniejszą ruchliwość w cieczy. Warstwa koronalna wokół pęcherzyków, składająca się z białek powierzchniowych i innych cząsteczek zakotwiczonych lub zaadsorbowanych na powierzchni błony, znacznie utrudnia mobilność i zwiększa rozmiar hydrodynamiczny EV. W ujęciu względnym wzrost ten jest szczególnie duży w przypadku egzosomów3, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. 
Obrazowanie kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM) jest ostateczną techniką w charakterystyce rozmiarów i morfologii pęcherzyków w ich stanie uwodnionym. Jednak wysoki koszt oprzyrządowania i specjalistyczna wiedza potrzebna do jego prawidłowego wykorzystania motywują do poszukiwania alternatywnych technik, które mogą obrazować uwodnione pojazdy elektryczne. Kolejną godną uwagi wadą tej techniki jest stosunkowo niewielka liczba EV zaobserwowanych lub scharakteryzowanych w uzyskanych obrazach krio-TEM.
Mikroskopia sił atomowych (AFM) wizualizuje trójwymiarową topografię uwodnionych lub wysuszonych EVs4,5,6 poprzez skanowanie sondy przez podłoże w celu rasterowania obrazu cząstek na powierzchni. W niniejszym badaniu przedstawiono podstawowe etapy protokołu charakteryzujące pojazdy elektryczne za pomocą AFM. Przed zobrazowaniem pęcherzyków w cieczy, muszą one zostać unieruchomione na podłożu poprzez przywiązanie do funkcjonalizowanej powierzchni, uwięzienie w filtrze lub przez przyciąganie elektrostatyczne7. Elektrostatyczne utrwalanie na dodatnio naładowanym podłożu jest szczególnie wygodną opcją do unieruchamiania egzosomów, o których wiadomo, że mają ujemny potencjał zeta. Jednak te same siły elektrostatyczne, które unieruchamiają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe na powierzchni, zniekształcają również ich kształt, co sprawia, że analiza danych po obrazowaniu jest niezbędna. Rozwijamy ten punkt, opisując algorytm, który szacuje wielkość pęcherzyków kulistych w roztworze na podstawie danych AFM dotyczących zniekształconego kształtu egzosomów unieruchomionych na powierzchni.
W opracowanym protokole, przedstawiono procedurę solidnego elektrostatycznego unieruchomienia pęcherzyków, a następnie kroki potrzebne do wykonania obrazowania siły atomowej w stanie uwodnionym lub wysuszonym. Zidentyfikowano czynniki, które wpływają na stężenie powierzchniowe unieruchomionych pęcherzyków. Podano wytyczne dotyczące sposobu przeprowadzania immobilizacji elektrostatycznej dla próbek o różnych stężeniach EV w roztworze. Omówiono dobór warunków doświadczalnych pozwalających na oszacowanie empirycznych rozkładów prawdopodobieństwa różnych właściwości biofizycznych w oparciu o odpowiednio dużą liczbę unieruchomionych pęcherzyków. Podano przykłady analizy danych AFM po obrazowaniu. W szczególności opisano algorytm określania wielkości pęcherzyków w roztworze w oparciu o charakterystykę AFM unieruchomionych EV. Reprezentatywne wyniki wskazują na spójność wymiarowania pęcherzyków metodą AFM z wynikami obrazowania cryo-TEM.

<table><tbody><tr><td>Kontroler AFM/STM&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Multimode Nanoscope V</td><td>Ten kontroler AFM obsługuje obrazowanie próbek biologicznych w cieczy i powietrzu.&nbsp;</td></tr><tr><td>Metalowe krążki na próbki AFM/STM (10 mm)</td><td>TedPella</td><td>16207</td><td>Metalowa tarcza na próbki, do której przymocowany jest krążek miki za pomocą taśmy dwustronnej lub w inny sposób.</td></tr><tr><td>Krążki AFM/STM Mica (10 mm)</td><td>TedPella</td><td>50</td><td>Najwyższej jakości mika V1 o grubości 0,21mm (0,0085"). Z przeplotem, w opakowaniach po 10 sztuk. Może być montowany na tarczach AFM/STM. Dostępne w czterech średnicach:</td></tr><tr><td>Sonda AFM do obrazowania w powietrzu</td><td>Bruker</td><td>TESP-V2</td><td>Wysokiej jakości wytrawione sondy krzemowe do trybu stukania i trybu bezdotykowego do skanowania w powietrzu.</td></tr><tr><td>Sonda AFM do obrazowania miękkich próbek w cieczy</td><td>Bruker</td><td>MLCT</td><td>Wsporniki z miękkiego azotku krzemu z końcówkami z azotku krzemu, które dobrze nadają się do pracy w cieczy.&nbsp; Zakres stałych siły umożliwia użytkownikom obrazowanie wyjątkowo miękkich próbek w trybie kontaktowym, a także spektroskopii o wysokim obciążeniu w stosunku do odległości.</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Spectrum</td><td>360-77705</td><td>Służy do mocowania krążka miki na metalowym dysku próbki.</td></tr><tr><td>ExoQuick-TC</td><td>System Biosciences</td><td>EXOTC50A-1</td><td>ExoQuick-TC to opatentowany zestaw na bazie polimerów przeznaczony do izolacji egzosomów z pożywek do hodowli tkankowych.</td></tr><tr><td>Szklany uchwyt sondy AFM do obrazowania w cieczach</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; MTFML-V2</td><td>Ten szklany uchwyt sondy jest przeznaczony do skanowania w płynie za pomocą MultiMode AFM.&nbsp; Uchwyt może być używany w trybie gwintowania z siłą szczytową, trybie kontaktowym, trybie gwintowania i modulacji siły.&nbsp; Sonda jest sterowana akustycznie przez oddzielny oscylator piezoelektryczny dla większej modulacji amplitudy. Uchwyt jest dostarczany z dwoma portami, wymaganymi złączkami i zestawem akcesoriów do dodawania i usuwania płynów.</td></tr><tr><td>Czeski Instytut Metrologiczny</td> <td>Gwyddion</td>.<td>Wersja 2.52</td><td>Oprogramowanie Open Source do wizualizacji i analizy pól danych uzyskanych technikami mikroskopii skaningowej.</td></tr><tr><td>Niestrzępiąca się bibuła</td><td>GE Healthcare Whatman&nbsp;</td><td>Klasa GB003 Bibuła</td><td>Użyj tej bibuły do usunięcia NiCl2 po modyfikacji podłoża miki.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Niestrzępiące się chusteczki do pomieszczeń czystych</td><td>Texwipe</td><td>AlphaWipe TX1004</td><td>Używaj tych chusteczek poliestrowych do czyszczenia powierzchni.&nbsp;</td></tr><tr><td>Chlorek niklu(II) (NiCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td>Proszek używany do wytwarzania 10 mM NiCl2 w wodzie DI</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Egzosomy i inne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to kompleksy molekularne składające się z pęcherzyka błony lipidowej, dekoracji jego powierzchni przez białka błonowe i inne cząsteczki oraz różnorodnej zawartości światła odziedziczonej po komórce rodzicielskiej, która obejmuje RNA, białka i DNA. Charakterystyka rozmiarów hydrodynamicznych EV, które zależą od wielkości pęcherzyka i jego warstwy koronalnej utworzonej przez dekoracje powierzchniowe, stała się rutyną. W przypadku egzosomów, najmniejszych EV, względna różnica między rozmiarem hydrodynamicznym a rozmiarem pęcherzyków jest znacząca. Charakterystyka rozmiarów pęcherzyków za pomocą obrazowania w kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM), techniki będącej złotym standardem, pozostaje wyzwaniem ze względu na koszt urządzenia, wiedzę specjalistyczną wymaganą do przygotowania próbki, obrazowania i analizy danych oraz niewielką liczbę cząstek często obserwowanych na obrazach. Szeroko dostępną alternatywą jest mikroskopia sił atomowych (AFM), która może dostarczyć wszechstronnych danych na temat trójwymiarowej geometrii, rozmiaru i innych właściwości biofizycznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Opracowany protokół prowadzi użytkowników przez korzystanie z tego narzędzia analitycznego i nakreśla przepływ pracy w zakresie analizy EV przez AFM, który obejmuje przygotowanie próbki do obrazowania EV w postaci uwodnionej lub wysuszonej, elektrostatyczne unieruchomienie pęcherzyków na podłożu, pozyskiwanie danych, ich analizę i interpretację. Reprezentatywne wyniki pokazują, że utrwalenie EV na zmodyfikowanej powierzchni miki jest przewidywalne, konfigurowalne i pozwala użytkownikowi uzyskać wyniki wymiarowania dla dużej liczby pęcherzyków. Stwierdzono, że rozmiar pęcherzyków na podstawie danych AFM jest zgodny z obrazowaniem cryo-TEM.

Fiksacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) na powierzchni jest krytycznym etapem sekwencji obrazowania. Elektrostatyczna immobilizacja egzosomów na powierzchni, które znane są z posiadania ujemnego potencjału zeta, zachodzi skutecznie po zmodyfikowaniu podłoża z miki w celu nadania mu dodatniego ładunku powierzchniowego. Stwierdzono, że bez zastosowania NiCl2 w celu nadania dodatnich ładunków powierzchniowych, immobilizacja EVs na podłożu jest nieskuteczna. Obraz wysokości na Rysunku 1...

Opisano krok po kroku procedurę bezznacznikowego unieruchamiania egzosomów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek płynnych oraz ich obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Obrazy AFM służą do oszacowania wielkości pęcherzyków w roztworze i scharakteryzowania innych właściwości biofizycznych.

Obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Protokół ten określa proste przygotowanie do obrazowania AFM pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w postaci uwodnionej i wysuszonej, ich unieruchomienie elektrostatyczne, skanowanie powierzchni, identyfikację pęcherzową oraz analizę i interpretację danych. Główną zaletą tej techniki jest wygodne elektrostatyczne utrwalenie pęcherzyków na powierzchni skóry oraz analiza po obrazowaniu w celu uwzględnienia zniekształceń kształtu spowodowanych unieruchomieniem. Uzyskane wyniki wymiarowania pęcherzyków są zgodne ze złotym standardem obrazowania CryoTEM, które pozostaje kosztowną i wymagającą techniką.Jeśli jesteś nowym użytkownikiem AFM, zacznij od scharakteryzowania suchych próbek, zanim przejdziesz do próbek uwodnionych. Ponieważ istnieje wiele dodatkowych czynników, które mogą wpływać na pobieranie uwodnionej próbki. Na początek wyizoluj pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z biopłynu, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym.Następnie mocno przymocuj krążek miki do magnetycznego dysku z próbką ze stali nierdzewnej. Rozetnij krążek miki za pomocą ostrej brzytwy, aby odsłonić nową warstwę materiału. W temperaturze pokojowej potraktuj górną powierzchnię miki przez dziesięć sekund stu mikrolitrami dziesięciomilimolowego roztworu chlorku niklu II.To modyfikuje ładunek powierzchni z ujemnego na dodatni. Zetrzyj roztwór chlorku niklu II niestrzępiącą się chusteczką lub bibułą. Następnie trzykrotnie umyj powierzchnię miki wodą dejonizowaną i osusz ją strumieniem suchego azotu.Umieść krążek z próbką AFM z dołączoną miką zmodyfikowaną powierzchniowo na szalce Petriego. Następnie rozcieńczyć egzosomy PBS, aby uzyskać stężenie od czterech do czterdziestu miliardów cząstek na mililitr roztworu. Zwaliduj stężenie rozcieńczonych cząstek za pomocą analizy śledzenia nanocząstek.Uformuj siedzącą kroplę na powierzchni miki, opróżniając sto mikrolitrów rozcieńczonego roztworu egzosomu z pipety. Następnie umieść pokrywkę na szalce Petriego i uszczelnij ją folią parafenową, aby zmniejszyć parowanie próbki. Inkubować w lodówce przez dwanaście godzin.Po inkubacji należy ostrożnie zassać od 80 do 90 procent próbki, nie naruszając powierzchni. W tym momencie egzosomy zostaną elektrostatycznie unieruchomione na podłożu miki. Podczas obrazowania uwodnionych próbek należy trzykrotnie spłukać powierzchnię PBS.Należy zadbać o to, aby próbka była nawodniona przez cały proces płukania. Po umyciu powierzchni miki PBS usuń od 80 do 90 procent płynu i odpipetuj czterdzieści mikrolitrów świeżego PBS, aby przykryć próbkę. Uwodniona próbka jest gotowa do obrazowania.Podczas obrazowania wysuszonych EV należy usunąć sole z powierzchni, trzykrotnie spłukując podłoże wodą dejonizowaną. Po zaessaniu jak największej ilości cieczy, bez dotykania powierzchni, resztę wysusz strumieniem suchego azotu. Aby zobrazować wysuszone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, wybierz wspornik przeznaczony do skanowania w powietrzu w trybach opukiwania i obrazowania bezkontaktowego i zamontuj go na uchwycie sondy.Umieścić próbkę na stoliku AFM. Magnetyczny dysk próbki ze stali nierdzewnej unieruchomi próbkę na stoliku. Umieść uchwyt sondy w AFM.Poczekaj, aż przygotowanie i etap zrównoważą się termicznie. Użyj trybu stukania, aby zeskanować obszar o wymiarach 5x5 mikronów zrastrowany w 512 liniach z częstotliwością skanowania jednej herca. Uzyskaj zarówno obrazy wysokości, jak i fazy, ponieważ dostarczają one uzupełniających informacji na temat topografii i właściwości powierzchni próbki.Czas skanowania będzie się wydłużał wraz z obrazowanym obszarem i liczbą linii wybranych do utworzenia obrazu, ale będzie się zmniejszał wraz z szybkością skanowania. Ponieważ szybkie skanowanie może mieć wpływ na jakość obrazu, szybkość rastrowania powinna być równowagą między czasem akwizycji a jakością obrazu. Aby zobrazować uwodnione pęcherzyki, wybierz wspornik, który jest odpowiedni do skanowania miękkich, uwodnionych próbek i zamontuj wspornik na uchwycie sondy przeznaczonym do skanowania w cieczach.Zwilż końcówkę wspornika PBS, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wprowadzenia pęcherzyków powietrza do cieczy podczas skanowania. Następnie unieruchomić próbkę na stoliku AFM. Gdy próbka osiągnie równowagę termiczną, zobrazuj uwodnioną powierzchnię miki w trybie stukania.Uzyskaj zarówno obrazy wysokości, jak i fazy. Aby przeanalizować wykonane obrazy, najpierw przejdź do Proces danych"wybierz tryby SPM, a następnie Wskazówka" i wybierz Wskazówka dotycząca modelu"Wybierz geometrię i wymiary końcówki użytej do zeskanowania próbki i kliknij OK'Popraw artefakty erozji końcówki, wykonując rekonstrukcję powierzchni. Otwórz obraz.Z menu wybierz Proces danych'następnie wybierz Tryby SPM'a następnie Wskazówka'następnie wybierz Rekonstrukcja powierzchni'i kliknij OK'Następnie wybierz Proces danych, a następnie Poziom'i wybierz Poziom płaszczyzny', aby wyrównać płaszczyznę obrazowania i dopasować laboratoryjną płaszczyznę XY, usuwając nachylenie podłoża z danych skanowania. Wyrównaj wiersze na obrazie, wybierając Proces danych"a następnie Popraw dane"a następnie wybierz Wyrównaj wiersze"Dostępnych jest kilka opcji wyrównania, w tym mediana, która jest algorytmem, który znajduje średnią wysokość każdej linii skanowania i odejmuje ją od danych. Następnie przejdź do procesu danych"a następnie Popraw dane"i wybierz Usuń blizny"Spowoduje to usunięcie typowych błędów skanowania znanych jako blizny"Aby wyrównać powierzchnię miki na zerowej wysokości, przejdź do procesu danych"menu i wybierz Spłaszcz podstawę"w Poziomie"rozwijane menu.Zidentyfikuj dodatkowe pęcherzyki komórkowe na zeskanowanej powierzchni, przechodząc do menu Ziarna i używając opcji Oznacz według progu"Ten algorytm identyfikuje egzosomy unieruchomione powierzchniowo jako cząstki wystające z podłoża o powierzchnię zerową na wysokość powyżej progu wybranego przez użytkownika. Wybierz próg z zakresu od jednego do trzech nanometrów. Pozwoli to wyeliminować większość zakłóceń w tle.Na koniec należy przeprowadzić geometryczną i wymiarową charakterystykę zidentyfikowanych pęcherzyków przy użyciu dostępnych algorytmów rozkładów dostępnych w menu Grains. Eksportuj dane AFM z Gwyddion do specjalistycznej analizy za pomocą innych narzędzi obliczeniowych i niestandardowych programów komputerowych. Modyfikacja powierzchni chlorku niklu powoduje unieruchomienie pęcherzyków pozakomórkowych, które jest zależne od czasu.Stężenie powierzchniowe unieruchomionych pęcherzyków jest nadmiernie gęste po 24 godzinach inkubacji, podczas gdy 12-godzinna inkubacja prowadzi do mniejszej liczby egzosomów i danych skanowania, które są łatwiejsze do dokładnej analizy. Ten obraz AFM pokazuje uwodnione egzosomy MCF7 elektrostatycznie unieruchomione na zmodyfikowanej powierzchni miki. Odpowiedni obraz fazowy AFM potwierdza, że ziarna na obrazie wysokości są miękkimi nanocząstkami, czego należy się spodziewać w przypadku pęcherzyków błonowych.Dane dotyczące wysokości dla trzech pęcherzyków wzdłuż tej samej linii są pokazane tutaj. Profile te ilustrują spłaszczony kształt spowodowany elektrostatycznym przyciąganiem egzosomów do dodatnio naładowanej powierzchni zmodyfikowanej miki. Zniekształcenie kształtu jest widoczne w powiększonym widoku unieruchomionego pęcherzyka i jego przekroju poprzecznego.Aby oszacować rozmiar kuli egzosomów w roztworze, on może dopasować objętości zamknięte w unieruchomionych powierzchniowo i sferycznych otoczkach błonowych. Rozkład wielkości pęcherzyków kulistych w roztworze określono na podstawie danych AFM z 561 unieruchomionych pęcherzyków. Rozmiary pęcherzyków na obrazach CryoTEM są zgodne z wynikami AFM.Przed obrazowaniem egzosomów należy pamiętać o dokładnym spłukaniu powierzchni PBS. Spowoduje to usunięcie przychodzących egzosomów i zapobiegnie ich przyczepianiu się do końcówki AFM. Podczas obrazowania wysuszonych egzosomów należy użyć wody demineralizowanej do podniesienia podłoża.Mycie DI zapobiegnie tworzeniu się kryształków soli na powierzchni podczas wysychania podłoża. Jeśli są obecne, kryształy soli sprawią, że przetwarzanie obrazu będzie trudnym zadaniem.

imaging-of-extracellular-vesicles-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Źródło: Biller, S. J., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic do transmisyjnej mikroskopii elektronowej za pomocą barwienia ujemnego, umożliwiając wizualizację morfologii, wielkości i czystości pęcherzyków w wysokiej rozdzielczości do analiz strukturalnych i porównawczych.

Wizualizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

W tym filmie demonstrujemy test do wizualizacji i ilościowego określenia poboru komórkowego przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV. Test ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego i pozwala na odróżnienie zinternalizowanych EV od tych przyklejonych do powierzchni komórki.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: metoda wizualizacji i ilościowego określania wychwytu komórkowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D

Ten film demonstruje immunologiczne wychwytywanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą znakowanych fluorescencyjnie koniugatów przeciwciało-magnetyczne nanocząstki wychwytywane. Proces obejmuje tworzenie kompleksów, barwienie fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami wykrywającymi, separację magnetyczną i analizę cytometryczną przepływową w celu charakterystyki antygenowej.

Wychwytywanie immunologiczne i cytometria przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu charakterystyki antygenowej

Źródło: Lunelli, L., et. al. Przyglądanie się polisomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych. J. Vis. exp.(2016). Ten film przedstawia obrazowanie polisomów przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Arkusz miki pokryty jonami niklu zakotwicza RNA z dołączonymi rybosomami. Próbka jest myta, suszona i umieszczana na stoliku mikroskopowym. Końcówka wspornikowa skanuje powierzchnię próbki, rejestrując ugięcia lasera w celu odwzorowania topologii. Oprogramowanie służy do korekcji zniekształceń i...

 Obrazowanie polisomów wyizolowanych z mózgu myszy za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ten protokół opisuje różne techniki niezbędne do transmisyjnej mikroskopii elektronowej, w tym barwienie ujemne, ultracienkie sekcje dla szczegółowej struktury i znakowanie immuno-złote w celu określenia pozycji określonych białek w egzosomach.

Przygotowanie próbek i obrazowanie egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) służy do ominięcia typowego limitu dyfrakcji mikroskopii świetlnej i do oglądania egzosomów w skali nanometrów. Może być stosowany zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach do charakteryzowania egzosomów.

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Przedstawiamy protokół izolacji i zamrażania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z nowotworowych komórek urotelialnych. Technika zamrażania i pękania ujawniła średnicę i kształt pojazdów elektrycznych oraz – jako unikalną cechę – wewnętrzną organizację membran pojazdów elektrycznych. Mają one ogromne znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób pojazdy elektryczne oddziałują z błonami biorczymi.

Mikroskopia elektronowa zamrażalno-pękająca do analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę obrazowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych AFM. Protokół obejmuje elektrostatyczną imobilizację, skanowanie powierzchni i analizę danych.

Obrazowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów