Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Ten zestaw standaryzowanych protokołów może być wykorzystany do zaoferowania nowego wglądu w górną bruzdę oczną lub SOS, niedawno odkrytą strukturę rozwijającego się oka. Protokoły te pozwolą każdemu eksperymentatorowi na całym świecie wyraźnie zwizualizować SOS podczas rozwoju oka danio pręgowanego. Zacznij od umieszczenia heterozygotycznego czynnika różnicowania wzrostu sześć A samca i samicy danio pręgowanego po oddzielnych stronach przegrody w zbiorniku z odchlorowaną wodą wieczorem przed ich parowaniem.

Następnego ranka usuń przegrodę i pozwól rybom rozmnażać się nie dłużej niż 30 minut. Pod koniec okresu rozrodczego zebrać zarodki na szalki Petriego zawierające pożywkę E3 w celu ich inkubacji w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia. Po 20 godzinach od zapłodnienia zastąp supernatant pożywką E3 uzupełnioną 0,004%1-fenylo-2-tiomocznikiem, aby zapobiec produkcji pigmentu i zbadaj zarodki za pomocą mikroskopii świetlnej, aby potwierdzić, że wszystkie są na odpowiednim etapie rozwoju.

Umieść próbki pod mikroskopem preparacyjnym. Wyrzuć wszelkie niedojrzałe rozwojowo zarodki i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie rozdzielić kosmówkę. Wizualizuj SOS, który może pojawić się jako wgłębienie lub linia na grzbietowym brzegu oka.

Następnie posortuj zarodki, które wykazują opóźnienie zamknięcia SOS od tych, które tego nie robią. Aby sfotografować te zarodki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, przygotuj szalkę Petriego zawierającą 1% agarozy w pożywce E3 i delikatnie nakłuj środek agarozy, aby utworzyć płytki otwór, w którym można umieścić żółtko zarodka. Następnie umieść znieczulony zarodek bocznie na agarozie.

Aby zobrazować zarodki za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego, przenieś zarodek na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą mały bolus niezżelowanej agarozy o niskiej temperaturze topnienia 1% do podłoża E3 i użyj cienkiej żyłki, aby szybko ustawić zarodek w pozycji bocznej. Gdy agaroza ostygnie, wlej do naczynia tyle podłoża E3, aby pokryć agarozę i użyj soczewki obiektywowej 20x zanurzonej w wodzie, aby zobrazować SOS. Po zobrazowaniu delikatnie wyciągnij agarozę z zarodka i utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie lub pozwól danio pręgowanemu kontynuować swój rozwój.

Aby zobrazować SOS poprzez fluorescencyjną ekspresję mRNA, użyj aparatu do mikroiniekcji, aby wstrzyknąć 300 pikogramów wzmocnionego mRNA GFP-CAX do zarodków na etapie jednokomórkowym. Następnie użyj fluorescencyjnego stereoskopu do badań przesiewowych w poszukiwaniu zarodków z jasną, zwiększoną ekspresją GFP i uzyskaj obrazy zarodków za pomocą jednej z metod obrazowania, jak pokazano. W celu barwienia immunofluorescencyjnego całego zarodka lamininy danio pręgowanego, należy zdechorionować zarodki, jak pokazano, i umieścić zarodki w probówce do mikrowirówki w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie przez dwie godziny na wytrząsarce o temperaturze pokojowej.

Pod koniec utrwalania przemyj zarodki cztery razy w PBS plus Tween lub PBST przez pięć minut na przemycie, a następnie permeabilizację w 10 mikrogramach na mililitr lub Proteinazę K w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umyj przepuszczalne zarodki czterokrotnie w PBST, jak wykazano, i zablokuj zarodki w 5% surowicy koziej i dwóch miligramach na mililitr albuminy surowicy bydlęcej w PBST przez jedną do dwóch godzin na wytrząsarce o temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej inkubować zarodki w pierwotnym przeciwciałie anty-lamininowym będącym przedmiotem zainteresowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na shakerze.

Następnego ranka umyj zarodki pięć razy w PBST przez 15 minut na jedno przemycie i oznacz tkanki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze chronionym przed światłem. Następnego ranka umyj zarodki cztery razy w PBST przez 15 minut na jedno mycie i umieść zarodki na małej szalce Petriego zawierającej świeży PBST. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie rozerwij żółtka i usuń komórki żółtka poprzez łagodne zeskrobanie woreczków żółtkowych.

Przenieś otoczkowe zarodki do świeżo przygotowanego 30% glicerolu w PBS, upewniając się, że umieściłeś zarodki na wierzchu roztworu i przenieś jak najmniej poprzedniego roztworu i poczekaj, aż zarodki opadną na dno probówki. Gdy zarodki osiągną dno pojemnika, przenieś je do sekwencyjnego 50% i 70% glicerolu w roztworach PBS, jak właśnie pokazano. Po tym, jak zarodki opadną na dno pojemnika z 70% glicerolem, przenieś próbki do małego plastikowego naczynia w celu rozbioru i odetnij zarodki z tyłu tyłomózgowia.

Za pomocą drobnych narzędzi do preparowania przesuń jedną głowę do szkiełka podstawowego z jak najmniejszą ilością glicerolu i delikatnie włóż cienką szpilkę do komory przodomózgowia od wewnątrz, naciskając w dół, aby oddzielić od siebie prawą i lewą połowę głowy. Gdy głowa zostanie całkowicie wyfiletowana wzdłuż linii środkowej, zamontuj każdą stronę głowy pośrodku linii w dół, okiem do góry. SOS można zaobserwować za pomocą mikroskopu preparacyjnego w ciągu 20 do 23 godzin po zapłodnieniu oraz poprzez obrazowanie z kontrastem różnicowym jako cienką linię w oku grzbietowym, która oddziela nosową i skroniową połowę rozwijającej się siatkówki.

Ponadto w grzbietowej granicy oka może być widoczne subtelne wgłębienie. Po immunofluorescencyjnym barwieniu lamininy można potwierdzić, że cienka linia jest błoną podstawną. Gdy zamknięcie SOS jest opóźnione, jego przedłużoną obecność można zaobserwować jako wyraźną szczelinę w grzbietowej stronie oka pod mikroskopem preparacyjnym.

Podczas obserwacji pod mikroskopem złożonym przy użyciu różnicowego obrazowania interferencyjnego z kontrastem, cecha ta jest jeszcze bardziej widoczna, gdy nosowa i skroniowa strona oka są oddzielone SOS, co jest wyraźnie widoczne jako linia w oku grzbietowym. Po 28 godzinach od zapłodnienia u danio pręgowanego typu dzikiego, barwienie lamininą wyraźnie pokazuje, że SOS jest całkowicie zamknięty, co czyni go idealnym etapem do monitorowania opóźnień w zamykaniu szczeliny. Wstrzyknięcie wzmocnionego mRNA GFP-CAX umożliwia wizualizację błon komórkowych żywego lub utrwalonego zarodka w celu śledzenia zmian w morfologii komórek, które prowadzą do zamknięcia SOS.

Wizualizacja SOS może być trudna, ponieważ jest wąska i przejściowa. Konieczne jest jednak zachowanie spójnej metody oceniania podczas oceniania opóźnień zamknięcia w późniejszych punktach czasowych. Techniki te można łączyć z eksperymentalnymi manipulacjami w celu identyfikacji czynników genetycznych lub czynników farmakologicznych, które wpływają na prawidłowe tworzenie i zamykanie SOS.