Name: Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj metody wizualizacji bruzdy ocznej górnej (SOS) w larwach Danio rerio podczas embriogenezy. Standardowe protokoły umożliwiają badanie czynników wpływających na rozwój struktury oka u kręgowców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC), Alberta Innovates Technology Futures oraz Women and Children's Health Research Institute (WCHRI).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alberty.
1. Protokół 1: Wizualizacja SOS za pomocą stereomikroskopii i obrazowania z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC)
<ol>
	<li>Pobieranie zarodków
	<ol>
		<li>W zbiorniku z odchlorowaną wodą przygotuj wieczorem krzyżówki danio pręgowanego gdf6a+/-, łącząc samca danio pręgowanego z samicą danio pręgowanego. Pamiętaj, aby oddzielić mężczyznę od samicy za pomocą przegrody, aby upewnić się, że zarodki urodziły się w krótkim czasie.</li>
		<li>Następnego ranka pociągnij za przegrodę i pozwól danio pręgowanemu rozmnażać się nie dłużej niż 30 minut. Zbierz zarodki na szalkach Petriego z pożywką E3, opisaną w The Zebrafish Book12, i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.</li>
		<li>Usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub martwe zarodki, które będą białe i nieprzezroczyste.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i obrazowanie w czasie rzeczywistym zarodków danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Przy 20 hpf zastąp pożywkę E3 pożywką E3 zawierającą 0,004% 1-fenylo 2-tiomocznika (PTU), aby zapobiec produkcji pigmentu. 
		UWAGA: Dodanie PTU w nieco późniejszym punkcie czasowym, takim jak 22-24 hpf, jest mało prawdopodobne, aby zakłóciło eksperyment ze względu na wczesny wiek zarodków w momencie obrazowania. Zaleca się jednak wczesne leczenie zarodków, aby całkowicie zapobiec pigmentacji, ponieważ w oku grzbietowym pojawia się pasmo pigmentacji, które może zakłócać obrazowanie SOS.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie zarodki znajdują się we właściwych stadiach rozwoju w różnych momentach prowadzących do czasu obserwacji. Zaleca się, aby robić to na etapach, na których liczba somitów jest wyraźnie widoczna, jak opisano w Kimmel et al.13. Usuń te, które są niedojrzałe rozwojowo.</li>
		<li>Umieść zarodki pod mikroskopem preparacyjnym i usuń zarodki, delikatnie rozsuwając kosmówkę za pomocą cienkich kleszczy. Wizualizuj SOS w oku grzbietowym. SOS może pojawić się jako wgłębienie na grzbietowym brzegu oka, a linia powinna być widoczna w poprzek oka grzbietowego. Aby uzyskać normalne zamknięcie SOS, obserwuj zarodki w temperaturze około 20-23 hpf. W celu zbadania fenotypów opóźnionego zamknięcia SOS obserwuj zarodki w temperaturze 28 hpf lub późniejszej.</li>
		<li>Oddziel zarodki, które wykazują opóźnienie zamknięcia SOS od tych, które go nie wykazują.</li>
		<li>Aby sfotografować te zarodki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, przygotuj szalkę Petriego zawierającą 1% agarozy w E3. Lekko nakłuj środek agarozy, aby utworzyć płytki otwór, w którym żółtko zarodka może siedzieć, gdy zarodek zostanie umieszczony na agarozie. Zapewni to, że zarodek nie będzie znajdował się pod kątem podczas fotografowania.</li>
		<li>Znieczulić zarodki 0,003% trikainą w E3 i umieścić bocznie na agarozie.</li>
		<li>Aby zobrazować zarodki za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego, przenieś zarodek na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą mały bolus nieżelowej 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w E3 (w/v). Szybko ustaw zarodek na boki za pomocą cienkiej żyłki lub rzęsy i poczekaj, aż agaroza ostygnie. Gdy agaroza będzie twarda, wlej do naczynia tyle E3, aby przykryła agarozę. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz Distel i Köster14. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z odwróconego mikroskopu, zarodek można umieścić na szkle naczynia ze szklanym dnem szkiełka nakrywkowego i zobrazować za pomocą standardowej soczewki obiektywowej 20X.</li>
		<li>Użyj soczewki obiektywowej 20x zanurzonej w wodzie, aby zobrazować SOS za pomocą mikroskopu złożonego. Po wizualizacji delikatnie wyciągnij agarozę z zarodków i utrwal w 4% paraformaldehydzie (PFA) lub pozwól im kontynuować rozwój.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół 2: Barwienie immunofluorescencyjne lamininy w całości
<ol>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne lamininy w całości: Dzień 1
	<ol>
		<li>Dekorionate zarodki zgodnie z opisem w kroku 1.2.3, jeśli nie zostało to jeszcze wykonane. Utrwalić zarodki w probówce do mikrowirówki w żądanym punkcie czasowym w świeżo przygotowanym 4% PFA przez 2 godziny na wytrząsarce o temperaturze pokojowej (22-25 °C). Prać w 1x PBST przez 5 minut, cztery razy. 
		UWAGA: Po gastrulacji zarodki mogą lepiej się utrwalać po dechorionacji.</li>
		<li>Przepuszczalność zarodków w 10 μg/ml proteinazy K w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Czas inkubacji będzie zależał od etapu rozwoju, na którym zarodki są utrwalone (patrz Thisse i Thisse15).</li>
		<li>Prać w 1x PBST przez 5 minut, cztery razy.</li>
		<li>Zablokować zarodki w roztworze 5% surowicy koziej i 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1xPBST przez 1-2 godziny na wytrząsarce o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając królicze przeciwciało anty-lamininowe w roztworze blokowym w rozcieńczeniu 1:200.</li>
		<li>Inkubować zarodki w pierwszorzędowym przeciwciałie anty-lamininy przez noc na wytrząsarce o temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne lamininy w całości: Dzień 2
	<ol>
		<li>Prać w 1x PBST przez 15 min, pięć razy.</li>
		<li>Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488 w 1x PBST do rozcieńczenia 1:1000, 
		UWAGA: Możliwe jest dostosowanie tego kroku do zasobów dostępnych dla eksperymentatora poprzez użycie innego przeciwciała drugorzędowego.</li>
		<li>Inkubować zarodki w przeciwciałach drugorzędowych przez noc na wytrząsarce o temperaturze 4 °C. Począwszy od tego kroku, osłaniaj się przed światłem tak bardzo, jak to możliwe.</li>
		<li>Prać w 1x PBST przez 15 minut, cztery razy. W razie potrzeby zarodki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowanie i montaż oczu embrionalnych
	<ol>
		<li>W razie potrzeby umieść zarodki na małej szalce Petriego i ogol je w 1x PBST. Zrób to, delikatnie rozbijając żółtko drobnymi kleszkami i usuwając komórki żółtka poprzez łagodne zeskrobanie woreczka żółtkowego.</li>
		<li>Przygotować następujące stężenia roztworów z serii PBS-glicerol w probówkach do mikrowirówek: 30%, 50% i 70% glicerolu w PBS. Przenieś zarodki do 30% glicerolu/PBS, upewniając się, że umieściłeś zarodki na wierzchu roztworu i przenosząc jak najmniej poprzedniego roztworu. Poczekaj, aż zarodki opadną na dno probówki.</li>
		<li>Gdy zarodki opadną na dno, przenieś je do 50% glicerolu/PBS. Powtórz i przenieś do 70% glicerolu/PBS.</li>
		<li>Gdy zarodki zanurzą się w 70% glicerolu/PBS, przenieś je do małego plastikowego naczynia do sekcji.</li>
		<li>Odetnij zarodek z tyłu tyłomózgowia i w razie potrzeby użyj tylnej tkanki do genotypowania.</li>
		<li>Przenieś głowę na szklane szkiełko, przenosząc jak najmniej glicerolu. Użyj kleszczy lub innych drobnych narzędzi do preparowania, aby przytrzymać tylny koniec, aby utrzymać głowę nieruchomo. Użyj cienkiej szpilki do drobnego smarowania lub innych drobnych narzędzi do preparowania, aby delikatnie włożyć do komory przodomózgowia od przodu i popchnąć w dół, aby oddzielić od siebie prawą i lewą połowę głowy. Powtórz to, przesuwając się do tyłu przez śródmózgowie i do komory tylnego mózgu, zasadniczo piłując głowę w dół linii środkowej. Minimalizuje to ręczną manipulację oka i otaczających tkanek, pozostawiając w ten sposób SOS nieuszkodzony</li>.
		<li>Zamontuj każdą stronę głowy linią środkową w dół, okiem do góry. Umieścić cztery wkładki smaru próżniowego w rogach (w odpowiedniej odległości od siebie dla używanego szkiełka nakrywkowego) i przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym, dociskając kolejno każdy wkład, aż szkiełko nakrywkowe zetknie się z próbkami. Odpipetować 70% glicerolu na krawędzi szkiełka nakrywkowego, tak aby glicerol został wciągnięty pod spód, wypełniając przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.</li>
		<li>Próbki należy pobrać w ciągu jednego dnia lub uszczelnić wokół szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i próbkami obrazu dopiero po wyschnięciu lakieru do paznokci. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Protokół 3: Wizualizacja SOS za pomocą mRNA eGFP-CAAX
<ol>
	<li>Synteza mRNA eGFP-CAAX
	<ol>
		<li>Linearyzować 1 μg plazmidu pCS2-eGFP-CAAX 16 z NotI w objętości reakcji 40 μL przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Aby zatrzymać reakcję trawienia restrykcyjnego, dodaj 10 μl wody wolnej od RNaz, 2,5 μl 10% SDS i 2,0 μl 10 mg/ml proteinazy K.</li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.</li>
		<li>Dodać do reakcji (całkowita objętość 200 μl) i przejść do następnego etapu: 50 μl wody wolnej od RNaz, 20 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 75,5 μl wody wolnej od RNazy 
		UWAGA: Woda wolna od RNaz jest dodawana przy dwóch oddzielnych okazjach, aby zapobiec nadmiernemu rozcieńczeniu octanu sodu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego i wirować przez 20 s. Oddzielić fazę wodną i organiczną przez odwirowanie przy 18 000 x g przez 5 min.</li>
		<li>Przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby uniknąć przeniesienia dolnej warstwy organicznej. Dodać równą objętość chloroformu do nowej probówki. 
		UWAGA: Dodanie chloroformu jest opcjonalne, ale zaleca się zapewnienie całkowitego usunięcia fenolu z próbki.</li>
		<li>Wirować przez 20 s. Oddzielić fazę wodną i organiczną poprzez odwirowanie przy 18 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Tak jak poprzednio, przenieś górną warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki, uważając, aby uniknąć przeniesienia dolnej warstwy organicznej.</li>
		<li>Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2.</li>
		<li>Wytrącić DNA, dodając 3 objętości etanolu w 100% wolnego od RNaz i schłodzić w temperaturze -20 °C przez 15 minut. Wirować przy 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Granulka powinna być widoczna. Zdekantować supernatant.</li>
		<li>Umyj granulat 100 μl zimnej wody bez etanolu 70% i RNaz. Po delikatnym wymieszaniu w celu rozbicia osadu, odwirować przy 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Granulka powinna być widoczna. Zdekantować supernatant.</li>
		<li>Suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut i ponownie zawiesić DNA w 7 μl wody. 
		UWAGA: Pelet może wymagać suszenia przez okres dłuższy niż 5 minut, w zależności od dostępnego przepływu powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transkrypcja i oczyszczanie mRNA eGFP-CAAX
	<ol>
		<li>W sposób wolny od RNaz przygotować reakcję transkrypcji in vitro z dostępnym w handlu zestawem polimerazy RNA Sp6, używając około 1 μg oczyszczonego linearyzowanego plazmidowego DNA uzyskanego w kroku 3.2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Polimeraza RNA Sp6 musi być używana do produkcji mRNA z czapeczką.</li>
		<li>Dodać 1 μl DNazy (2 U/μL; Nie zawiera RNaz) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Oczyść mRNA za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania RNA. Podwielokrotnić mRNA, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja i wizualizacja
	<ol>
		<li>Pozyskać zarodki zgodnie z Protokołem 1.1.</li>
		<li>Za pomocą aparatu do mikroiniekcji wstrzyknij 300 pg mRNA eGFP-CAAX na etapie 1 komórki.</li>
		<li>Badania przesiewowe w kierunku zarodków z jasną ekspresją eGFP w oczach przy użyciu stereoskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Zobrazuj zarodki zgodnie z opisem w Protokole 1.2.</li>
		<li>Alternatywnie, dekorionacja i utrwalenie zarodków w pożądanym punkcie czasowym w 4% PFA przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C. Myj zarodki w 1x PBST przez 5 minut, cztery razy i dechorionat, jeśli nie zostało to wcześniej zrobione. Przeciąć oczy i zamontować je na szkiełkach, jak opisano w Protokole 2.3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chow, R. L., Lang, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+development+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early eye development in vertebrates.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).</li>
<li>Slavotinek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development+genes+and+known+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Eye development genes and known syndromes.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).</li>
<li>Gregory-Evans, C. Y., Williams, M. J., Halford, S., Gregory-Evans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+coloboma%3A+a+reassessment+in+the+age+of+molecular+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Ocular coloboma: a reassessment in the age of molecular neuroscience.</a> Journal of Medical Genetics. 41 (12), (2004).</li>
<li>Onwochei, B. C., Simon, J. W., Bateman, J. B., Couture, K. C., Mir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+colobomata%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmolgy%22%5BJournal%5D)">Ocular colobomata.</a> Survey of Ophthalmolgy. 45, 175-194 (2000).</li>
<li>Williamson, K. A., FitzPatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+microphthalmia%2C+anophthalmia+and+coloboma%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of microphthalmia, anophthalmia and coloboma.</a> European Journal of Medical Genetics. 57, 369-380 (2014).</li>
<li>Chang, L., Blain, D., Bertuzzi, S., Brooks, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uveal+coloboma%3A+clinical+and+basic+science+update%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Uveal coloboma: clinical and basic science update.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 17, 447-470 (2006).</li>
<li>Kaufman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+origins+of+Zebrafish+ocular+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and origins of Zebrafish ocular vasculature.</a> BMC Developmental Biology. 15 (18), (2015).</li>
<li>Hocking, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+defects+underlie+Superior+Coloboma%2C+a+newly+identified+closure+disorder+of+the+dorsal+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic defects underlie Superior Coloboma, a newly identified closure disorder of the dorsal eye.</a> PLOS Genetics. 14 (3), (2018).</li>
<li>Lawson, N. D., Wolfe, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+for+the+analysis+of+vertebrate+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish.</a> Developmental Cell. 21 (1), (2011).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3B+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 5th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Distel, M., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Kwan, K. M., Otsuna, H., Kidokoro, H., Carney, K. R., Saijoh, Y., Chien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+choreography+of+cell+movements+shapes+the+vertebrate+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye.</a> Development. 139, 359-372 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Craniofacial+Development+in+the+sox10%3A+kaede+Transgenic+Zebrafish+Line+Using+Time-lapse+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (79), e50525(2013).</li>
<li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania sprzecznych interesów.

W tym miejscu przedstawiamy ustandaryzowaną serię protokołów obserwacji SOS w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Aby określić fenotypy opóźnienia zamknięcia, nasze protokoły skupiły się na zdolności do rozróżnienia separacji dwóch dyskretnych płatów grzbietowo-nosowej i grzbietowo-skroniowej strony oka, podobnie jak w technikach stosowanych do wizualizacji fenotypów opóźnienia zamknięcia szczeliny naczyniówki w oku brzusznym.
Te techniki wizualizacji mogą być używane w połączeniu z ró...

Formowanie oka kręgowców to wysoce konserwatywny proces, w którym starannie zaaranżowane międzykomórkowe szlaki sygnałowe ustalają typy tkanek i określają tożsamość regionalną1. Zaburzenia wczesnej morfogenezy oka skutkują głębokimi defektami w architekturze oka i często są oślepiające2. Jedna z takich chorób wynika z niemożności zamknięcia szczeliny naczyniówkowej oka po brzusznej stronie miseczki nerwu wzrokowego3. Szacuje się, że to zaburzenie, znane jako coloboma oczne, występuje u 1 na 4-5000 żywych urodzeń i powoduje 3-11% ślepoty u dzieci, zwykle objawiając się jako struktura przypominająca dziurkę od klucza, która wystaje niżej ze źrenicy w środku oka4,5,6. Funkcją szczeliny naczyniówki jest zapewnienie punktu wejścia dla wczesnego układu naczynieniowego wrażliwego w miseczkę wzrokową, po czym boki szczeliny zrośnią się, aby zamknąć naczynia 7.
Chociaż coloboma oczna jest znana od czasów starożytnych, niedawno zidentyfikowaliśmy nową podgrupę pacjentów z coloboma z utratą tkanki wpływającą na górny/grzbietowy aspekt oka. Ostatnie prace w naszym laboratorium doprowadziły do odkrycia struktury oka w oku grzbietowym danio pręgowanego, którą nazywamy górną bruzdą oczną (SOS) lub górną szczeliną8. Ważne jest, aby pamiętać, że struktura ma cechy zarówno bruzdy, jak i szczeliny. Podobnie jak bruzda, jest to ciągła warstwa tkanki, która rozciąga się od nosa do skroniowej siatkówki. Ponadto zamknięcie struktury nie jest pośredniczone przez fuzję dwóch przeciwległych błon podstawnych i wydaje się, że wymaga procesu morfogenetycznego, w którym struktura jest zasiedlona przez komórki. Jednak, podobnie jak szczelina, tworzy strukturę, która oddziela nosową i skroniową stronę oka grzbietowego z błoną podstawną. Dla spójności w tym tekście będziemy odnosić się do niego jako SOS.
SOS jest ewolucyjnie zachowany u kręgowców, będąc widocznym podczas morfogenezy oka u ryb, piskląt, traszek i myszy8. W przeciwieństwie do szczeliny naczyniówki, która jest obecna od 20 do 60 godzin po zapłodnieniu (hpf) u danio pręgowanego, SOS jest wysoce przejściowy, jest łatwo widoczny od 20-23 hpf i nieobecny przez 26 hpf8. Ostatnie badania w naszym laboratorium wykazały, że podobnie jak szczelina naczyniówki, SOS odgrywa rolę w prowadzeniu naczyń krwionośnych podczas morfogenezy oka8. Chociaż czynniki kontrolujące powstawanie i zamykanie SOS nie są jeszcze w pełni poznane, nasze dane podkreśliły rolę genów wzorcujących wzorzec oka grzbietowo-brzusznego8.
Danio pręgowany jest doskonałym organizmem modelowym do badania SOS. Jako system modelowy zapewnia szereg korzyści w badaniu rozwoju oka: jest modelem kręgowców; każde pokolenie wykazuje wysoką płodność (~200 zarodków); jego genom został w pełni zsekwencjonowany, co ułatwia manipulacje genetyczne; Około 70% ludzkich genów ma co najmniej jeden ortolog danio pręgowanego, co czyni go idealnym, opartym na genetyce modelem choroby człowieka9,10. Co najważniejsze, jego rozwój odbywa się na zewnątrz matki, a jego larwy są przezroczyste, co pozwala na wizualizację rozwijającego się oka ze względną łatwością11.
W tym zestawie protokołów opisujemy techniki, za pomocą których SOS może być wizualizowany u larw danio pręgowanego. Różnorodność technik wizualizacji zastosowanych w tym raporcie pozwoli na wyraźną obserwację SOS podczas normalnego rozwoju oka, a także możliwość wykrycia wad zamknięcia SOS. Nasze przykładowe protokoły będą zawierały badania Gdf6, BMP zlokalizowanego w oku grzbietowym i znanego regulatora zamknięcia SOS. Co więcej, techniki te można łączyć z eksperymentalnymi manipulacjami w celu identyfikacji czynników genetycznych lub czynników farmakologicznych, które wpływają na prawidłowe tworzenie i zamykanie SOS. Ponadto dołączyliśmy protokół, dzięki któremu możliwe jest obrazowanie fluorescencyjne wszystkich błon komórkowych, co pozwala eksperymentatorowi zaobserwować zmiany morfologiczne w komórkach otaczających SOS. Naszym celem jest ustanowienie zestawu ustandaryzowanych protokołów, które mogą być wykorzystywane w całej społeczności naukowej, aby zaoferować nowy wgląd w tę nową strukturę rozwijającego się oka.

<table><tbody><tr><td>1-fenylo 2-tiomocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>AGA001.1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop DIC/fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager Z1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do mikroskopu preparacyjnego</td><td>Qimaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Smar wysokopróżniowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królik Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przechwytywania obrazu</td><td>Inkubator Zeiss</td><td>ZEN</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>Model 1545</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nasadkowe mikroskopu (22 mm x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Pinek Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Zestaw do transkrypcji mMachine Sp6</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd ( PFA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Chloroform: alkohol izoamylowy pH 6,7 +/- 0,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1752-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-lamininowe królika</td><td>Millipore Sigma</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnaza (2 U/&micro; L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysty dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Invitrogen</td><td>15525017</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy danio rerio

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Wrodzony coloboma oka to zaburzenie genetyczne, które zazwyczaj obserwuje się jako rozszczep w dolnej części oka, wynikający z niepełnego zamknięcia szczeliny naczyniówkowej. Ostatnio identyfikacja osób z coloboma w górnym aspekcie tęczówki, siatkówki i soczewki doprowadziła do odkrycia nowej struktury, określanej jako górna szczelina lub górna bruzda oczna (SOS), która jest przejściowo obecna na grzbietowej stronie muszli wzrokowej podczas rozwoju oka kręgowców. Chociaż ta struktura jest zachowana u myszy, piskląt, ryb i traszki, nasza obecna wiedza na temat SOS jest ograniczona. Aby wyjaśnić czynniki, które przyczyniają się do jego powstawania i zamykania, niezbędna jest umiejętność jego obserwacji i identyfikacji nieprawidłowości, takich jak opóźnienie w zamknięciu SOS. W tym miejscu postanowiliśmy stworzyć ustandaryzowaną serię protokołów, które można wykorzystać do efektywnej wizualizacji SOS poprzez połączenie powszechnie dostępnych technik mikroskopowych z powszechnymi technikami biologii molekularnej, takimi jak barwienie immunofluorescencyjne i nadekspresja mRNA. Chociaż ten zestaw protokołów koncentruje się na możliwości obserwacji opóźnienia zamknięcia SOS, można go dostosować do potrzeb eksperymentatora i można go łatwo modyfikować. Ogólnie rzecz biorąc, mamy nadzieję, że uda nam się stworzyć przystępną metodę, dzięki której nasze zrozumienie SOS może zostać pogłębione w celu poszerzenia obecnej wiedzy na temat rozwoju oka kręgowców.

SOS u danio pręgowanego pojawia się w 20 hpf w obrębie domniemanej grzbietowej części siatkówki8. Do 23 hpf SOS przechodzi z początkowej wąskiej architektury w szerokie wcięcie, a do 26 hpf przestaje być widoczny8. Aby zatem zbadać SOS podczas prawidłowego rozwoju oka danio pręgowanego, embriony należy obserwować między 20 a 23 hpf. W tym okresie SOS jest widoczny pod mikroskopem stereoskopowym oraz w obrazowaniu DIC jako cienka linia w grzb...

Tutaj prezentujemy ustandaryzowaną serię protokołów do obserwacji górnej bruzdy ocznej, niedawno zidentyfikowanej, ewolucyjnie zachowanej struktury w oku kręgowców. Wykorzystując larwy danio pręgowanego, demonstrujemy techniki niezbędne do identyfikacji czynników, które przyczyniają się do powstawania i zamykania górnej bruzdy ocznej.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Ten zestaw standaryzowanych protokołów może być wykorzystany do zaoferowania nowego wglądu w górną bruzdę oczną lub SOS, niedawno odkrytą strukturę rozwijającego się oka. Protokoły te pozwolą każdemu eksperymentatorowi na całym świecie wyraźnie zwizualizować SOS podczas rozwoju oka danio pręgowanego. Zacznij od umieszczenia heterozygotycznego czynnika różnicowania wzrostu sześć A samca i samicy danio pręgowanego po oddzielnych stronach przegrody w zbiorniku z odchlorowaną wodą wieczorem przed ich parowaniem.Następnego ranka usuń przegrodę i pozwól rybom rozmnażać się nie dłużej niż 30 minut. Pod koniec okresu rozrodczego zebrać zarodki na szalki Petriego zawierające pożywkę E3 w celu ich inkubacji w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia. Po 20 godzinach od zapłodnienia zastąp supernatant pożywką E3 uzupełnioną 0,004%1-fenylo-2-tiomocznikiem, aby zapobiec produkcji pigmentu i zbadaj zarodki za pomocą mikroskopii świetlnej, aby potwierdzić, że wszystkie są na odpowiednim etapie rozwoju.Umieść próbki pod mikroskopem preparacyjnym. Wyrzuć wszelkie niedojrzałe rozwojowo zarodki i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie rozdzielić kosmówkę. Wizualizuj SOS, który może pojawić się jako wgłębienie lub linia na grzbietowym brzegu oka.Następnie posortuj zarodki, które wykazują opóźnienie zamknięcia SOS od tych, które tego nie robią. Aby sfotografować te zarodki za pomocą mikroskopu preparacyjnego, przygotuj szalkę Petriego zawierającą 1% agarozy w pożywce E3 i delikatnie nakłuj środek agarozy, aby utworzyć płytki otwór, w którym można umieścić żółtko zarodka. Następnie umieść znieczulony zarodek bocznie na agarozie.Aby zobrazować zarodki za pomocą mikroskopu złożonego lub konfokalnego, przenieś zarodek na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą mały bolus niezżelowanej agarozy o niskiej temperaturze topnienia 1% do podłoża E3 i użyj cienkiej żyłki, aby szybko ustawić zarodek w pozycji bocznej. Gdy agaroza ostygnie, wlej do naczynia tyle podłoża E3, aby pokryć agarozę i użyj soczewki obiektywowej 20x zanurzonej w wodzie, aby zobrazować SOS. Po zobrazowaniu delikatnie wyciągnij agarozę z zarodka i utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie lub pozwól danio pręgowanemu kontynuować swój rozwój.Aby zobrazować SOS poprzez fluorescencyjną ekspresję mRNA, użyj aparatu do mikroiniekcji, aby wstrzyknąć 300 pikogramów wzmocnionego mRNA GFP-CAX do zarodków na etapie jednokomórkowym. Następnie użyj fluorescencyjnego stereoskopu do badań przesiewowych w poszukiwaniu zarodków z jasną, zwiększoną ekspresją GFP i uzyskaj obrazy zarodków za pomocą jednej z metod obrazowania, jak pokazano. W celu barwienia immunofluorescencyjnego całego zarodka lamininy danio pręgowanego, należy zdechorionować zarodki, jak pokazano, i umieścić zarodki w probówce do mikrowirówki w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie przez dwie godziny na wytrząsarce o temperaturze pokojowej.Pod koniec utrwalania przemyj zarodki cztery razy w PBS plus Tween lub PBST przez pięć minut na przemycie, a następnie permeabilizację w 10 mikrogramach na mililitr lub Proteinazę K w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umyj przepuszczalne zarodki czterokrotnie w PBST, jak wykazano, i zablokuj zarodki w 5% surowicy koziej i dwóch miligramach na mililitr albuminy surowicy bydlęcej w PBST przez jedną do dwóch godzin na wytrząsarce o temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej inkubować zarodki w pierwotnym przeciwciałie anty-lamininowym będącym przedmiotem zainteresowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na shakerze.Następnego ranka umyj zarodki pięć razy w PBST przez 15 minut na jedno przemycie i oznacz tkanki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze chronionym przed światłem. Następnego ranka umyj zarodki cztery razy w PBST przez 15 minut na jedno mycie i umieść zarodki na małej szalce Petriego zawierającej świeży PBST. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie rozerwij żółtka i usuń komórki żółtka poprzez łagodne zeskrobanie woreczków żółtkowych.Przenieś otoczkowe zarodki do świeżo przygotowanego 30% glicerolu w PBS, upewniając się, że umieściłeś zarodki na wierzchu roztworu i przenieś jak najmniej poprzedniego roztworu i poczekaj, aż zarodki opadną na dno probówki. Gdy zarodki osiągną dno pojemnika, przenieś je do sekwencyjnego 50% i 70% glicerolu w roztworach PBS, jak właśnie pokazano. Po tym, jak zarodki opadną na dno pojemnika z 70% glicerolem, przenieś próbki do małego plastikowego naczynia w celu rozbioru i odetnij zarodki z tyłu tyłomózgowia.Za pomocą drobnych narzędzi do preparowania przesuń jedną głowę do szkiełka podstawowego z jak najmniejszą ilością glicerolu i delikatnie włóż cienką szpilkę do komory przodomózgowia od wewnątrz, naciskając w dół, aby oddzielić od siebie prawą i lewą połowę głowy. Gdy głowa zostanie całkowicie wyfiletowana wzdłuż linii środkowej, zamontuj każdą stronę głowy pośrodku linii w dół, okiem do góry. SOS można zaobserwować za pomocą mikroskopu preparacyjnego w ciągu 20 do 23 godzin po zapłodnieniu oraz poprzez obrazowanie z kontrastem różnicowym jako cienką linię w oku grzbietowym, która oddziela nosową i skroniową połowę rozwijającej się siatkówki.Ponadto w grzbietowej granicy oka może być widoczne subtelne wgłębienie. Po immunofluorescencyjnym barwieniu lamininy można potwierdzić, że cienka linia jest błoną podstawną. Gdy zamknięcie SOS jest opóźnione, jego przedłużoną obecność można zaobserwować jako wyraźną szczelinę w grzbietowej stronie oka pod mikroskopem preparacyjnym.Podczas obserwacji pod mikroskopem złożonym przy użyciu różnicowego obrazowania interferencyjnego z kontrastem, cecha ta jest jeszcze bardziej widoczna, gdy nosowa i skroniowa strona oka są oddzielone SOS, co jest wyraźnie widoczne jako linia w oku grzbietowym. Po 28 godzinach od zapłodnienia u danio pręgowanego typu dzikiego, barwienie lamininą wyraźnie pokazuje, że SOS jest całkowicie zamknięty, co czyni go idealnym etapem do monitorowania opóźnień w zamykaniu szczeliny. Wstrzyknięcie wzmocnionego mRNA GFP-CAX umożliwia wizualizację błon komórkowych żywego lub utrwalonego zarodka w celu śledzenia zmian w morfologii komórek, które prowadzą do zamknięcia SOS.Wizualizacja SOS może być trudna, ponieważ jest wąska i przejściowa. Konieczne jest jednak zachowanie spójnej metody oceniania podczas oceniania opóźnień zamknięcia w późniejszych punktach czasowych. Techniki te można łączyć z eksperymentalnymi manipulacjami w celu identyfikacji czynników genetycznych lub czynników farmakologicznych, które wpływają na prawidłowe tworzenie i zamykanie SOS.

visualization-superior-ocular-sulcus-during-danio-rerio

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Poznaj metody wizualizacji bruzdy ocznej górnej (SOS) w larwach Danio rerio podczas embriogenezy. Standardowe protokoły umożliwiają badanie czynników wpływających na rozwój struktury oka u kręgowców.

Wizualizacja bruzdy ocznej górnej podczas embriogenezy Danio rerio

Przeglądaj więcej filmów