Sekwencjonowanie półprzewodników do preimplantacyjnych badań genetycznych w kierunku aneuploidii

Protokół, który tutaj prezentujemy, to szybka i tania półprzewodnikowa, oparta na sekwencjonowaniu metoda badań przesiewowych aneuploidii u zarodków. Udoskonalony protokół do wykonywania amplifikacji szablonów oraz układ biblioteki sekwencjonowania sprawiają, że detekcja PGTA jest powtarzalna, wysoka przepustowość, opłacalna i oszczędza czas. Czas pracy tego sekwencera półprzewodnikowego wynosi tylko dwie do czterech godzin.

Skrócenie czasu od otrzymania próbek do wydania raportów do pięciu dni. Ta metoda zapewnia sekwencjonowanie genomu w celu badania przesiewowego aneuploidii, zmienności liczby kopii i wywołań polimorfizmu pojedynczego nukleotydu. Ze względu na różną chemię sekwencjonowania, biblioteka przygotowana przez ten protokół nie może być sekwencjonowana bezpośrednio w innych systemach sekwencjonowania.

Ale ten sam sekwencer, ale inne przygotowanie biblioteki, jest w stanie przeprowadzić nieinwazyjne badania prenatalne. Procedurę zademonstruje Xiangchun Guo, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć sekwencjonowanie, należy zawirować każdą rozcieńczoną bibliotekę i krótko obrócić cztery razy na mini wirówce przez trzy sekundy za każdym razem.

Następnie weź pięć mikrolitrów z każdej biblioteki, aby zebrać je w wolnej od jądra, jednopunktowej pięciomililitrowej probówce. Wiruj wymieszaną bibliotekę i krótko obracaj na mini wirówce przez trzy sekundy. Dodać 150 mikrolitrów roztworu do łamania do dwóch nowych probówek regeneracyjnych.

Zainstaluj nowe rurki regeneracyjne, router do odzyskiwania i płytkę wzmacniającą. Wymieszaj, trzykrotnie odwracając butelkę z olejem. Upewnij się, że zarówno olej, jak i roztwór do odzyskiwania są wypełnione w co najmniej dwóch trzecich.

Wirować bufor PCR master mix przez 30 sekund i krótko wirować na mini wirówce przez trzy sekundy. Wiruj cząstki kuli i wymieszaną bibliotekę przez jedną minutę i krótko obracaj na mini wirówce przez trzy sekundy. Następnie przygotuj mieszaninę ligacyjną o pojemności 2400 mikrolitrów, dodając 172 mikrolitry wody bez nukleaz, osiem mikrolitrów biblioteki mieszanej, 120 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej i 100 mikrolitrów cząstek kuli do probówki zawierającej 2000 mikrolitrów buforu PCR z mieszanką główną.

Ustawić pipetę na 800 mikrolitrów i załadować mieszaninę ligacyjną do filtra reakcyjnego przez port próbki. Odwróć butelkę z olejem trzy razy i za pomocą pipety P1000 dodaj 200 mikrolitrów oleju reakcyjnego do filtra reakcyjnego. Wybierz program Proton, a następnie wybierz przycisk wspomagany, aby upewnić się, że urządzenie zostało poprawnie skonfigurowane, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na monitorze.

Następnie kliknij przycisk Dalej, aby uruchomić program. Załaduj 100 mikrolitrów próbki produktu emulsyjnego PCR, 130 mikrolitrów przemytych kulek, 300 mikrolitrów roztworu płuczącego ES i 300 mikrolitrów roztworu topniejącego do paska z ośmioma probówkami. Umieść ośmiorurowy pasek na systemie wzbogacania.

Zainstaluj końcówkę do pipety i nową rurkę o pojemności dwóch mililitrów w punkcie zerowym i uruchom program. Odwirować dwumililitrową probówkę w punkcie zerowym o temperaturze 15 500 razy G przez pięć minut. Odrzucić sklarowany osad i zachować dziesięć mikrolitrów produktu wzbogacającego.

Dodaj 200 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do probówki i wymieszaj przez wirowanie. Ponownie odwirować dwumililitrową probówkę w punkcie zerowym. Odrzucić sklarowany osad i zachować 10 mikrolitrów produktu wzbogacającego.

Dodaj 90 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do probówki i wymieszaj przez wirowanie. Aby przygotować szablon, odwiruj kontrolę pozytywną i krótko zakręć. Dodać pięć mikrolitrów kontroli pozytywnej do 100 mikrolitrów produktu wzbogacającego.

Wirować i odwirowywać przy 15 500 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i zachować 10 mikrolitrów matrycy. Następnie dodaj 20 mikrolitrów startera sekwencjonującego i 15 mikrolitrów buforu do wyżarzania do probówki z matrycą.

Zwiruj probówkę i krótko obracaj na mini wirówce przez trzy sekundy. Inkubować probówkę w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką. Następnie dodaj 10 mikrolitrów bufora ładującego do probówki.

Mieszać, pipetując w górę i w dół. Wymieszaj 55 mikrolitrów próbki, pipetując w górę iw dół, a następnie załaduj próbkę do dołka załadowczego chipa. Zachowaj zużytą końcówkę pipety i dwumililitrową probówkę do PCR w punkcie zerowym.

Umieść chip na mini wirówce do chipów, gdy jakaś próbka dostanie się do chipa. Sprawdź pozycję i odwiruj chip przez 10 minut. Przygotuj 50% bufor do wyżarzania, dodając 500 mikrolitrów buforu do wyżarzania i 500 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki.

Przygotuj roztwór do płukania, dodając 500 mikrolitrów buforu do wyżarzania i 500 mikrolitrów 100%2-propanolu do jednopunktowej pięciomililitrowej probówki. Następnie przygotuj mieszaninę pieniącą, dodając 49 mikrolitrów 50% buforu do wyżarzania i jeden mikrolitr roztworu pianotwórczego do dwóch nowych jednopunktowych pięciomililitrowych probówek. Odpipetować powietrze do jednej z mieszanin pieniących i załadować 120 mikrolitrów pęcherzyków do studzienki załadowczej.

Przenieś nadmiar wyrzuconej cieczy ze studzienki wyjściowej do studzienki załadowczej i odwiruj wiór przez 30 sekund na mini wirówce do wiórów. Powtórz proces dla drugiej mieszaniny pieniącej. Dodaj 55 mikrolitrów 50% buforu do dwumililitrowej probówki utrzymywanej w punkcie zerowym.

Użyj zachowanej końcówki pipety, aby pipetować w górę i w dół. Załaduj wszystkie 55 mikrolitrów bufora do wyżarzania do studzienki załadowczej. Odwiruj wiór przez 30 sekund na wyznaczonej mini wirówce do chipów.

Załaduj 100 mikrolitrów roztworu płuczącego do studzienki ładującej wióry i wyrzuć wyrzuconą ciecz ze studzienki wyjściowej. Powtórz ten krok ładowania raz. Załaduj 100 mikrolitrów 50% bufora wyżarzającego do studni ładującej wióry.

Powtórz ten krok ładowania w sumie trzy razy. Dodaj 60 mikrolitrów 50% buforu do wyżarzania i sześć mikrolitrów enzymu sekwencjonującego do nowej jednopunktowej pięciomililitrowej probówki. Mieszać, pipetując w górę i w dół.

Powoli pipetować 65 mikrolitrów tego zmieszanego roztworu do studni ładującej wióry, unikając pęcherzyków. Trzymaj chip z dala od światła i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Na koniec, po inkubacji, natychmiast załaduj chip do sekwencera i kliknij Start The Sequencing Run na ekranie, aby rozpocząć sekwencjonowanie.

Retrospektywna analiza statystyczna 186 zarodków w stadium rozszczepienia i 1135 zarodków w stadium blastocysty wykazała ponad 95% skuteczność WGA w obu typach próbek. Wskaźniki niepowodzeń kontroli jakości sekwencjonowania wynosiły 3,4% w grupie w stadium rozszczepienia i tylko 1,9% w grupie w stadium blastocysty. Oprócz aneuploidii, dane sekwencjonowania mogą być wykorzystane do innych analiz.

Na przykład skopiuj wariacje liczbowe o rozmiarze mniejszym niż pięć megazasad lub analizę DNA mięśniowego, w zależności od głębokości i jakości sekwencjonowania. Dzięki poprawie w wywoływaniu numerów kopii, naukowcy mogą dalej badać przyszłość mozaicyzmu chromosomowego w ludzkich zarodkach we wczesnym stadium rozwoju.