Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Protokół ten zapewnia długoterminową, funkcjonalną metodę in vitro do oceny chimerycznego receptora antygenowego lub komórek CAR T, poprzez powtarzającą się prowokację komórkami nowotworowymi. Technika ta jest mniej czasochłonna i mniej pracochłonna niż ocena funkcji limfocytów CAR T in vivo, a jednocześnie pozwala uzyskać dokładne odwzorowanie prawdziwej skuteczności przeciwnowotworowej. Ta technika in vitro umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe i różnicowanie siły przeciwnowotworowej komórek CAR T.

Ma to potencjalne zastosowanie w ocenie skuteczności klinicznej produktów z komórek CAR T. Zacznij od oddzielenia guzów glejaka od kultury guza glejaka. Z jednym mililitrem zimnej akutazy i 30 do 60 sekund pipetowania.

Gdy guzy zostaną przerwane, zatrzymaj reakcję za pomocą pięciu mililitrów ciepłej pożywki do kohodowli. I granulować zawiesiny komórek nowotworowych przez wirowanie. Ponownie zawiesić komórki glejaka na 1,6 razy 10 do piątej komórki nowotworowej na mililitr świeżego stężenia pożywki kokultury i rozcieńczyć limfocyty T zebrane z hodowli komórek CAR T do odpowiedniego procentu limfocytów T CAR dodatnich na mililitr stężenia pożywki do kohodowli.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek nowotworowych do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem. I 100 mikrolitrów limfocytów CAR T do każdej studzienki komórek nowotworowych przy delikatnym mieszaniu. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W drugim, czwartym i szóstym dniu hodowli ostrożnie usuń 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki komórki nowotworowej, płytki do kohodowli komórek T przeznaczonych do ponownego użycia zgodnie z tabelą. Następnie dodaj 50 mikrolitrów świeżej zawiesiny komórek glejaka, przygotowanej tak, jak właśnie pokazano, ale z dwukrotnie większą liczbą komórek niż początkowa kohodowla do każdego dołka z delikatnym mieszaniem. I włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

W pierwszym, trzecim, piątym i siódmym dniu wspólnej hodowli przenieś supernatant z każdej studzienki, która ma być zebrana, na nową 96-dołkową okrągłą płytkę denną zgodnie z tabelą i dodaj 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanej 0,5% trypsyny EDTA do każdej pożywki zubożonej studzienki. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza potwierdź, że komórki oderwały się od dna każdej studzienki za pomocą mikroskopii świetlnej i delikatnie odpipetuj roztwór enzymu wokół dna każdej studzienki, aby ponownie zawiesić komórki. Przed przeniesieniem oderwanej zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków nowej płytki 96 dołków.

Osadzać komórki przez wirowanie i myć komórki 200 mikrolitrami aktywnego fluorescencyjnie roztworu do sortowania komórek lub FFS na studzienkę z drugim wirowaniem. Ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach interesującego nas koktajlu przeciwciał w 100 mikrolitrach SSS na studzienkę na 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. A pod koniec inkubacji usuń wszelkie niezwiązane przeciwciała przez sekwencyjne płukanie FSS o pojemności 100 i 200 mikrolitrów i ponownie zawiesij komórki w 100 do 200 mikrolitrach barwnika jądrowego DAPI i FSS.

Następnie przeanalizuj komórki zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. W celu analizy funkcjonalnej i fenotypowej limfocytów CAR T po kohodowli komórek nowotworowych pobierz pliki danych z cytometru przepływowego i bramuj wszystkie żywe komórki ujemne DAPI. Aby określić ilościowo komórki nowotworowe, należy zaszczepić populację CD45 ujemną.

Aby określić ilościowo limfocyty CAR T, należy zaszczepić populację CD45 dodatnią CAR. Następnie wykreśl liczbę komórek guza i CAR T w czasie trwania eksperymentu, identyfikując aktywację limfocytów T przez koekspresję 41BB i CD69. Wyczerpanie limfocytów T przez ekspresję PD1, LAG3 i TIM3 oraz stan pamięci komórek T LAG3 i TIM3 oraz stan pamięci limfocytów T przez CD45RO i ekspresję liganda CD62.

przez CD45RO i ekspresję liganda CD62. Zarówno CD4-dodatnie, jak i CD8-dodatnie limfocyty CAR T stają się w równym stopniu aktywowane przeciwko komórkom glejaka, które wyrażają docelowy antygen, na co wskazuje ich CD107a i wewnątrzkomórkowa ekspresja cytokin. Jednak, jak ocenia się na podstawie powtarzającego się prowokacji nowotworem SA, CD4 dodatniego, ale nie CD8-dodatniego, limfocyty CAR T są zdolne do wielokrotnego zabijania rund.

Limfocyty T CD4-dodatnie CAR osiągają również bardziej solidną ekspansję. Gdy limfocyty CAR T CD4 dodatnie i CD8 dodatnie są mieszane w stosunku jeden do jednego, ta kombinacja komórek wykonuje CD8 dodatnie, ale nie CD4-dodatnie komórki CAR T pod względem długoterminowej cytotoksyczności. Ponadto ekspansja limfocytów T CD8 dodatnich jest indukowana przez dodanie limfocytów T CD4-dodatnich.

Podczas gdy ekspansja limfocytów T CD4-dodatnich CAR jest hamowana w obecności komórek CDa-dodatnich. 24 godziny po początkowej kohodowli zarówno CD4-dodatnie, jak i CD8-dodatnie komórki CAR T są podobnie aktywowane. Podczas powtarzającego się wyzwania nowotworowego zarówno CD4-dodatnie, jak i CD8-dodatnie limfocyty CAR T wykazują przejście od fenotypu pamięci centralnej CD45RO dodatniego, CD62 liganowo-dodatniego, do fenotypu CD45RO dodatniego liganu CD62 z ujemnym efektorem pamięciowym.

Limfocyty T CAR CD8 są również bardziej podatne na wyczerpanie w porównaniu z limfocytami T CD4 dodatnimi, co ocenia się na podstawie ich ekspresji PD1, LAG3 i TIM3 po trzech dniach kohodowli. Ponadto nie zaobserwowano różnic w wyczerpaniu limfocytów T CDa-dodatnich w obecności lub braku limfocytów T CD4-dodatnich, co wskazuje, że indukowana przez CD4 ekspansja komórek T CAR CD8 nie jest związana z lepszą funkcją efektorową. Ten esej można również połączyć z sortowaniem limfocytów T z kokultury w celu przeprowadzenia dalszej analizy transkryptomów, proteomiki i określonych genów będących przedmiotem zainteresowania.

To powtarzalne wyzwanie nowotworowe może być również wykorzystane jako platforma do badania zdarzeń biologicznych po rozpoznaniu guza przez limfocyty CAR T.