Name: Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę współkultury in vitro do oceny funkcjonalnej komórek CAR-T poprzez powtarzane wyzwania komórek glejaka. Ta technika umożliwia badanie aktywacji i wyczerpania limfocytów T w immunoterapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) grant TR3-05641 i granty NIH P30 CA33572 (rdzenie). D.W. jest wspierany przez stypendium NCI 1F99CA234923-01.

Nasz IRB nie wymaga przeglądu tego protokołu. Z Wydziału Patologii Miasta Nadziei otrzymujemy wyrzucone świeże próbki guza glejaka, które są zakodowane, a nasze laboratorium nie może uzyskać dostępu do klucza. Otrzymujemy próbki z danymi dotyczącymi jedynie wcześniejszego leczenia i stanu choroby w momencie biopsji/resekcji, bez danych identyfikujących.
1. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę z nerwowych komórek macierzystych do hodowli pierwotnych linii komórkowych GBM: DEM:F12, 1:50 B27, 5 μg/ml heparyny i 2 mmol/L L-glutaminy; uzupełnione 20 ng/ml naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF) i 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) dwa razy w tygodniu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotować pożywkę z limfocytów T: X-VIVO 15 zawierającą 10% płodową surowicę cielęcą (FCS); uzupełnioną 70 j.m./ml rhIL-2 i 0,5 ng/ml rhIL-15 co 48 godzin (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj pożywki do wspólnej hodowli: weź pożywkę z neuronalnych komórek macierzystych bez suplementu EGF i FGF i dodaj 10% FCS.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący FACS (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 ml).</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek nowotworowych GBM
<ol>
	<li>Zebrać kulki nowotworowe GBM o niskim pasażu (TS) przez odwirowanie przy 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant. 
	nuta: Kule nowotworowe GBM (TS) są generowane z wyciętych guzów, jak opisano wcześniej22,23,24 i utrzymywane w pożywkach z neuronalnymi komórkami macierzystymi, w inkubatorach z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wstępnie ogrzać pożywki do kohodowli w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml zimnej akutazy do GBM TS, zdysocjować TS przez pipetowanie przez 30-60 s i zatrzymać dysocjację przez dodanie 5 ml ciepłej pożywki do współhodowli. 
	nuta: GBM TS nie powinny być utrzymywane w akutazie dłużej niż 5 minut.</li>
	<li>Zebrać komórki GBM przez odwirowanie przy 300 x g przez 4 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki do kohodowli.</li>
	<li>Określ stężenie komórek za pomocą licznika żywotności komórek. 
	nuta: Żywotność komórek musi wynosić >70%.</li>
</ol>
3. Przygotowanie limfocytów CAR T
<ol>
	<li>Mniej niż 24 godziny przed testem pobrać 100 μl hodowanych limfocytów CAR T do probówki do cytometrii przepływowej i dodać 2 ml FSS. 
	nuta: Limfocyty CAR T zostały wygenerowane zgodnie z wcześniejszym opisem11,21 i hodowane w pożywce z komórek T.</li>
	<li>Odwirowywać przy 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 2 ml FSS do przemycia komórek, odwirować przy 300 x g przez 4 minuty i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Wybarwić komórki odpowiednim przeciwciałem, aby wskazać ekspresję CAR w temperaturze 4 °C przez 30 min. 
	nuta: Na przykład, jeśli używany jest CAR ukierunkowany na IL13Rα2 opisany wcześniej25, należy wybarwić przeciwciałem anty-IL13.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 2 ml FSS i przeanalizować CAR exn za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Określ CAR% na limfocytach T, korzystając ze strategii bramkowania pokazanej w Rysunek 1B.</li>
	<li>W dniu kohodowli zebrać wszystkie limfocyty CAR T przez odwirowanie przy 300 x g przez 4 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki do kohodowli.</li>
	<li>Określ stężenie komórek za pomocą licznika żywotności komórek. 
	nuta: Żywotność komórek musi wynosić >70%.</li>
</ol>
4. Konfiguracja guza — kohodowla limfocytów T
<ol>
	<li>Rozcieńczyć komórki nowotworowe do stężenia 0,16 miliona/ml za pomocą pożywki do kohodowli.</li>
	<li>Na podstawie CAR%, rozcieńczyć limfocyty CAR T do stężenia 0,04 miliona komórek CAR+/ml z pożywkami do kohodowli. 
	nuta: Na przykład, jeśli CAR wynosi 50%, a stężenie limfocytów T wynosi 0,4 miliona/ml, wykonaj rozcieńczenie 1:5, aby uzyskać końcowe stężenie 0,04 miliona komórek CAR+/ml.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl rozcieńczonych komórek nowotworowych do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl rozcieńczonych limfocytów T CAR do każdej studzienki zawierającej komórki nowotworowe i dobrze wymieszać. 
	nuta: Każda kohodowla komórek nowotworowych T będzie analizowana w 4 punktach czasowych. Na podstawie różnych analiz może być wymagane 4-6 powtórzeń w każdym punkcie czasowym, ale <3 powtórzenia na punkt czasowy nie są zalecane; zob. tabela 1 w celu zapoznania się z reprezentatywną mapą tablic.</li>
	<li>Przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Ponowne wyzwanie dla komórek nowotworowych
UWAGA: Ponowne wyzwanie odbywa się po 2, 4 i 6 dniach od początkowej konfiguracji wspólnej kultury (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).
<ol>
	<li>Zbierz i oddziel GBM TS zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.1-2.6).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki GBM w stężeniu 0,64 miliona/ml.</li>
	<li>Określić studzienki do kohodowli, które wymagają ponownego wyzwania (patrz Tabela 1) i ostrożnie usunąć 50 μl pożywki z górnej części każdego dołka.</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórek GBM do każdej studzienki i dobrze wymieszać, a następnie umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Pobieranie próbek i analiza cytometryczna przepływowa
UWAGA: Próbki zostaną pobrane po 1, 3, 5 i 7 dniach od początkowej konfiguracji wspólnej hodowli, z odpowiednio 1, 2, 3 i 4 rundami prowokacji nowotworowej.
<ol>
	<li>Wstępnie podgrzać 0,05% roztwór trypsyny-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Określ studzienki, które wymagają zbioru i przenieś pożywkę do nowej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.</li>
	<li>Pobrać pipetą 50 μl trypsyny-EDTA do studzienek, aby trawić pozostałe komórki nowotworowe w temperaturze 37 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Pod mikroskopem upewnij się, że komórki oderwały się od dna.</li>
	<li>Pipetować wokół dna studzienki w celu ponownego zawieszenia oderwanych komórek, a następnie przenieść odłączone komórki zawierające trypsynę-EDTA do odpowiednich dołków 96-dołkowej płytki okrągłodennej.</li>
	<li>Odwirować okrągłodenną 96-dołkową płytkę w temperaturze 300 x g, w temperaturze 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl/basenik FSS do przemycia komórek, odwirować w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl/baseniku FSS zawierającym przeciwciała (patrz tabela materiałów) i wybarwić komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 100 μl/basenik FSS do komórek, odwirować przy 300 x g, 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 μl/basenik FSS do przemycia komórek, odwirować w temperaturze 300 x g, 4 °C przez 4 minuty, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki z 100-200 μl / studzienkę FSS z 500 ng / ml DAPI, a następnie przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
7. Analiza funkcjonalna i fenotypowa limfocytów CAR T
<ol>
	<li>Pobierz pliki danych z cytometru przepływowego i bramuj wszystkie żywe komórki (DAPI-) (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C).</li>
	<li>Określ ilościowo komórki nowotworowe przez bramkowanie populacji CD45- i limfocytów CAR T przez bramkowanie populacji CD45 +, CAR+ (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
	nuta: Jeśli komórki nowotworowe wyrażają CD45 (np. Komórki chłoniaka Rajiego), barwienie anty-CD3 można zastosować do różnicowania limfocytów T od komórek nowotworowych.</li>
	<li>Wykreśl liczbę komórek nowotworowych i komórek CAR T w czasie trwania filmu.</li>
	<li>Zidentyfikuj aktywację limfocytów T przez koekspresję 4-1BB i CD69. 
	nuta: Te markery powierzchniowe można wykorzystać do analizy aktywacji limfocytów T 6-24 godziny po początkowej kohodowli.</li>
	<li>Zidentyfikuj wyczerpanie limfocytów T przez ekspresję PD-1, LAG-3 i TIM-3.</li>
	<li>Zidentyfikuj stan pamięci limfocytów T na podstawie ekspresji CD45RO i CD62L.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults%3A+a+phase+1+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li>
<li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Therapeutic+T+Cells%3A+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li>
<li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li>
<li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li>
<li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA%2B+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-targeted+CD4%2B+CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li>
<li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
<li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li>
<li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li>
</ol>

Konstrukcja CAR opisana w tej pracy została licencjonowana przez Mustang Bio., Inc., za co S.J.F. i C.E.B. otrzymują opłaty licencyjne. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak potencjalnego konfliktu interesów.

Ten powtarzalny test prowokacyjny komórek nowotworowych stanowi wygodne podejście do oceny siły działania komórek CAR T, przy użyciu konfiguracji in vitro, która podsumowuje wysokie obciążenie guza związane z modelami nowotworów in vivo. Podczas tego 7-dniowego testu limfocyty CAR T przechodzą cztery rundy prowokacji guza (początkowa kohodowla i 3-krotna reprowokacja), tworząc środowisko, w którym wyczerpane limfocyty T mogą stracić zdolność do reagowania na prowokację guza pomimo silnej początkowej odpowiedzi. Eliminacja komórek nowotworowych i ekspansja limfocytów CAR T stanowią dwa podstawowe odczyty, które można uzyskać z tego testu, podczas gdy fenotypy komórek CAR T można łatwo przeanalizować, barwiąc markery powierzchniowe lub wewnątrzkomórkowe, które wskazują na aktywację, wyczerpanie i / lub pamięć limfocytów T. Test ten jest również wygodny do połączenia z bezstronną analizą transkryptomu komórek CAR T, proteomu lub proteomu fosforu21,26 oraz polifunkcjonalności limfocytów T, która została przyjęta do przewidywania odpowiedzi klinicznych27. Co więcej, komórki nowotworowe mogą być również testowane pod kątem ich odpowiedzi adaptacyjnej przeciwko odporności limfocytów T, takiej jak wydzielanie cytokin28. Ponieważ próbki są pobierane w wielu punktach czasowych, test ten pozwala nie tylko na statyczną, ale także dynamiczną analizę zachowania komórek CAR T podczas reagowania na nadmierną liczbę komórek nowotworowych.
Test ten jest szczególnie skuteczny w porównywaniu siły efektorowej limfocytów CAR T ukierunkowanych na ten sam antygen, ale o różnych konstrukcjach i/lub procesach produkcyjnych. Użyliśmy tego testu, aby zidentyfikować, że limfocyty T CD4 + CAR były w stanie pośredniczyć w lepszej długoterminowej funkcji efektorowej niż komórki CD8 + 21. Wykazano również, że skuteczność CAR in vivo była skorelowana z cytotoksycznością w późniejszych punktach czasowych (D5-D7) podczas tego testu, co dodatkowo podkreśla konieczność stosowania powtarzalnego prowokacji guza do oceny in vitro limfocytów T CAR. Chociaż komórki GBM zostały tutaj użyte jako przykład komórek docelowych, test ten można łatwo zaadaptować do innej kombinacji limfocytów T i guza. Warto zauważyć, że zachowanie limfocytów CAR T może się również różnić w zależności od gęstości antygenu, a inżynieria komórek rakowych w celu ekspresji różnych poziomów docelowych antygenów zapewniła narzędzie do badania sekwencyjnych zdarzeń molekularnych po rozpoznaniu CAR29. Dlatego test ten można również wykorzystać do zbadania wzorca aktywacji niektórych limfocytów CAR T przeciwko różnym celom.
Ponieważ żywotność komórek docelowych i ekspansja limfocytów CAR T to dwa wstępne odczyty tego testu, bardzo ważne jest, aby wszystkie kokultury rozpoczynały się od żywotnych (>70%) komórek nowotworowych i limfocytów T. Podczas wykonywania procesów ponownego naruszania działanie pożywki aspirującej (krok 5.3) nie powinno zakłócać komórek nowotworowych i limfocytów T na dnie studzienek, aby nie wprowadzać niepotrzebnych zmian w liczbie komórek. Podczas wykonywania tego testu na docelowych liniach komórkowych zawiesiny zaleca się zebranie pozostałych komórek przez odwirowanie przed ponownym wyzwaniem komórek nowotworowych.
Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że parametry konfiguracji (stosunek E:T początkowej kohodowli i ponownego wyzwania) muszą być dostosowane w oparciu o różne kombinacje CAR-guza. Na przykład, jeśli komórki nowotworowe wyrażają znaczny poziom cząsteczek hamujących działanie układu odpornościowego (np. PD-L1), zaleca się wyższy stosunek E:T, biorąc pod uwagę, że ogólna skuteczność zabijania jest upośledzona w porównaniu z komórkami nowotworowymi o niskim poziomie PD-L1. Przed zastosowaniem testu do nowych kombinacji CAR-guz zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego w celu określenia optymalnych warunków, które zwykle pozwalają najsilniejszym limfocytom CAR T testowanym w teście wyeliminować >80% komórek nowotworowych w punkcie końcowym. Ponieważ do zabijania za pośrednictwem limfocytów CAR T potrzebny jest bezpośredni kontakt komórka-komórka, jeśli komórki nowotworowe były znakowane fluorescencyjnie, wówczas panel analizy cytometrii przepływowej musi być odpowiednio dostosowany (np. jeśli komórki nowotworowe były znakowane GFP, nie należy stosować żadnych przeciwciał sprzężonych z FITC).
Aktywność kliniczna limfocytów CAR T przeciwko nowotworom złośliwym komórek B doprowadziła do powstania dwóch leków zatwierdzonych przez FDA. Jednak odpowiedź wykazała znaczne różnice u różnych pacjentów 27,30,31, co zostało wyjaśnione w celu skorelowania z właściwościami fenotypowymi produktów CAR 30. Ten test in vitro repetitive tum challenge zapewnia ponadto podejście do funkcjonalnego testowania siły działania efektora CAR oprócz charakterystyki fenotypowej i produkcji cytokin wielofunkcyjnych, a także pozwala na bardziej przepustowe badania przesiewowe produktów klinicznych w porównaniu z modelami nowotworów in vivo, przy jednoczesnym zachowaniu wierności predykcyjnej. Ogólnie rzecz biorąc, test ten może być stosowany do testów funkcjonalnych limfocytów T w celu projektowania limfocytów CAR T, rozwoju przedklinicznego i klinicznego.

Immunoterapia z wykorzystaniem limfocytów T zmodyfikowanych przez chimeryczny receptor antygenowy (CAR) przyniosła obiecujące wyniki w walce z nowotworami złośliwymi komórek B1,2,3,4, podczas gdy potencjał celowania w inne nowotwory jest nadal przedmiotem rygorystycznych badań5,6,7. Poczyniono znaczne postępy w zakresie optymalizacji konstrukcji CAR, procesu produkcyjnego i schematów wstępnego podawania pacjentom6,7,8, a nowe podejścia do biologii syntetycznej mają zwiększyć ich trwałość, bezpieczeństwo i swoistość dla nowotworów9,10. Jednak właściwa ocena potencjału terapeutycznego limfocytów CAR T w celu dokonania najlepszego wyboru do translacji klinicznej była trudna i pracochłonna. Najbardziej znanym do tej pory modelem oceny funkcji limfocytów CAR T jest model u myszy z niedoborem odporności z ludzkimi ksenoprzeszczepami nowotworowymi, przy czym limfocyty CAR T są badane pod kątem skuteczności przeciwnowotworowej i porównywane przy miareczkowanych dawkach komórek11,12,13,14,15. Te mysie badania in vivo są pracochłonne i czasochłonne, zwłaszcza w przypadku badań przesiewowych dużej liczby parametrów. Co więcej, badania in vivo mogą być ograniczone ze względu na dostępność szczepów myszy, ośrodków opieki nad zwierzętami i technik obchodzenia się ze zwierzętami. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania wygodniejszych testów in vitro, pozwalających na szybkie odczyty aktywności efektorowej, które również wiernie odzwierciedlają funkcję przeciwnowotworową tych limfocytów T in vivo.
Konwencjonalne metody określania cytotoksyczności limfocytów T in vitro skupiały się na wykrywaniu degranulacji, produkcji cytokin i zdolności do lizy komórek docelowych znakowanych radioizotopami (tj. testy uwalniania chromu). Chociaż testy te są pouczające w określaniu swoistości limfocytów CAR T i rozpoznawaniu przekierowanego celu, często nie odzwierciedlają one potencjału przeciwnowotworowego in vivo zmodyfikowanych limfocytów T12,13,16. W niektórych przypadkach zabijanie in vitro w krótkoterminowych testach wykazało odwrotną korelację z funkcją przeciwnowotworową in vivo16. Taka niespójność jest prawdopodobnie wynikiem wysokich proporcji efektor-cel (E:T) stosowanych w tych testach in vitro, a tym samym niemożności różnicowania produktów z komórek CAR T, które są podatne na wyczerpanie17. W przeciwieństwie do tego, podczas eradykacji guza in vivo limfocyty T zwykle reagują na duże obciążenia guza, co wymaga wielu rund zabijania, a następnie prowadzi do różnicowania i wyczerpania limfocytów T18,19,20, co jest jedną z głównych barier dla skutecznego usuwania guza przez limfocyty CAR T12,13. Tymczasem większość krótkoterminowych testów zabijania in vitro również nie odczytuje różnic w proliferacji limfocytów T, podczas gdy u pacjentów leczonych limfocytami CAR T zdolność do ekspansji limfocytów CAR T jest silnie skorelowana z odpowiedziami klinicznymi4. W związku z tym odpowiedni test in vitro musiałby podsumować warunki dużego obciążenia guza, indukcji wyczerpania limfocytów T i umożliwić odczyt ekspansji limfocytów T.
Tutaj opisujemy strategię oceny komórek CAR T pod kątem powtarzalnego potencjału zabijania nowotworów, za pomocą prostego testu in vitro na wspólnej hodowli. Jednocześnie można badać różne parametry aktywności efektorowej limfocytów T, w tym zabijanie komórek docelowych, ekspansję limfocytów T CAR oraz fenotypy związane z pamięcią lub wyczerpaniem. Wyniki uzyskane w tym teście dobrze korelują z działaniem przeciwnowotworowym komórek CAR T in vivo i mogą być wykorzystane do oceny siły działania produktów z komórek CAR T. Chociaż opisujemy test do oceny komórek CAR T ukierunkowanych na IL13Ra2 w stosunku do pierwotnych linii GBM21, można go łatwo dostosować do dowolnej platformy komórek CAR T.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna/0,53 mM EDTA w HBSS bez wapnia i magnezu</td><td>Corning</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI) - FluoroPure grade</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innowacyjne technologie komórkowe</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td><td>Novartis Oncology</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD137, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>Anty-CD19, PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>Anty-CD3, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>Anty-CD4, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>Anti-CD45, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>Anti-CD45RO, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>Anti-CD62L, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>Anti-CD69, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>Anti-CD8, APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti-PD-1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 Suplement bez serum (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Clear Płaskie dno polistyrenu poddane działaniu TC, pakowane pojedynczo, z pokrywką, sterylne (produkt #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Zdefiniowana płodowa surowica bydlęca, HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) bez glutaminy</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc bez L-Glu, na 1 l</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham's F12 50:50 Mieszanina z L-glutaminą i 15 mM HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie</td><td>hyklon</td> FCS <td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa (1,000 U / ml)</td><td>American Farmaceutyczny</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x W/CA & MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS z 1 mM EDTA (bez Ca2+ lub Mg2+)</td> <td>VWR Scientific Products</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 Rozcieńczenie robocze (10 ng/&mikro; L)</td><td>CellGenix, US Operations</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML&nbsp;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Maska zabiegowa Tecnol</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek t receptora antygenu chimerycznego

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Dziedzina terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) szybko się rozwija dzięki ulepszeniom w projektowaniu CAR, metodach inżynierii genetycznej i optymalizacjach produkcji. Jednym z wyzwań dla tych wysiłków rozwojowych było jednak opracowanie testów in vitro, które mogą dostarczyć solidnych informacji na temat wyboru optymalnych produktów z komórek CAR T w celu osiągnięcia sukcesu terapeutycznego in vivo. Standardowe testy lizy guza in vitro często nie odzwierciedlają prawdziwego potencjału przeciwnowotworowego limfocytów CAR T ze względu na stosunkowo krótki czas kohodowli i wysoki stosunek limfocytów T do guza. W tym miejscu opisujemy metodę kohodowli in vitro w celu oceny potencjału rekurencyjnego zabijania komórek CAR T przy wysokim obciążeniu komórkami nowotworowymi. W tym teście długoterminowa funkcja cytotoksyczna i zdolność proliferacyjna komórek CAR T jest badana in vitro przez 7 dni z dodatkowymi celami nowotworowymi podawanymi do kokultury co drugi dzień. Test ten można połączyć z profilowaniem aktywacji limfocytów T, wyczerpania i fenotypów pamięci. Za pomocą tego testu z powodzeniem wyodrębniliśmy funkcjonalne i fenotypowe różnice między limfocytami T CD4 + i CD8 + CAR a komórkami glejaka (GBM), odzwierciedlając ich zróżnicowaną aktywność przeciwnowotworową in vivo w ortotopowych modelach ksenoprzeszczepów. Metoda ta zapewnia łatwe podejście do oceny siły działania limfocytów CAR T i wyjaśnienia różnic funkcjonalnych między różnymi produktami z komórek CAR T.

Wykorzystując opisany powyżej test, wykazaliśmy różnice w sile efektorowej oraz dynamice zabijania pośredniczonej przez komórki CAR T CD4+ i CD8+. Przedstawione tutaj wyniki ilustrują różnice między komórkami CAR T CD4+ i CD8+, wygenerowanymi od zdrowego dawcy, niezależnie od naszej poprzedniej publikacji21.
Dzięki standardowemu testowi degranulacji mogliśmy zaobserwować, że komórki CAR T CD4+ i CD8+ uległy w równym stopniu aktywacji przeciwko komórkom GBM wykazującym ekspresję docelowego antygenu, co wskazywała ekspresja CD107a oraz cytokin wewnątrzkomórkowych (Rycina 2A). Jednakże, stosując test powtarzalnej stymulacji guzem, stwierdziliśmy, że komórki CAR T CD4+, a nie CD8+, wykazują zdolność do wielokrotnego zabijania w wielu rundach (Rycina 2B). W trakcie tego testu komórki CAR T CD4+ osiągnęły również lepszą ekspansję w porównaniu do komórek CD8+ (Rycina 2C). Różnice w ekspansji między subpopulacjami komórek CAR T zaobserwowano dopiero w D3 po dwóch rundach stymulacji guzem (1:12 E:T), natomiast różnice w cytotoksyczności wystąpiły począwszy od D5 po trzech rundach stymulacji guzem (1:20 E:T), co wskazuje, że krótkoterminowe testy nie pozwoliły na wyjaśnienie różnic w potencjale poszczególnych produktów CAR T. Gdy w teście zastosowano mieszaninę komórek CAR T CD4+ i CD8+ w stosunku 1:1, okazało się, że wykazują one wyższą długoterminową cytotoksyczność niż komórki CAR T CD8+, ale nie niż komórki CAR T CD4+ (Rycina 2B). Ekspansja komórek CAR T CD8+ była indukowana przez współpodane komórki CD4+, podczas gdy ekspansja komórek CAR T CD4+ była hamowana w obecności komórek CD8+ (Rycina 2C).
Aby wyjaśnić mechanizm różnicujący aktywność efektorową komórek CAR T CD4+ i CD8+, najpierw potwierdziliśmy, że 24 h po początkowej kokulturze obie populacje komórek CAR T CD4+ i CD8+ zostały aktywowane w podobnym stopniu (Rysunek 3A). Jednocześnie, jak wskazuje ekspresja CD45RO i CD62L, zarówno komórki CAR T CD4+, jak i CD8+ wykazały przejście z fenotypu pamięci centralnej (CD45RO+, CD62L+) do fenotypu pamięci efektorowej (CD45RO+, CD62L-) podczas powtarzającej się stymulacji nowotworem (Rysunek 3B). Następnie scharakteryzowaliśmy komórki w 3. dniu tego testu, czyli przed momentem, w którym podgrupy komórek CAR T zaczęły wykazywać różnice funkcjonalne. Wyczerpanie limfocytów T oznaczono koekspresją receptorów hamujących PD-1, LAG-3 i TIM-315,21, co wykazało, że komórki CAR T CD8+ były bardziej podatne na wyczerpanie w porównaniu z komórkami CAR T CD4+ (Rysunek 3C). Co więcej, nie zauważono różnic w wyczerpaniu komórek CAR T CD8+ w obecności lub przy braku współpodanych komórek CD4+ (Rysunek 3C), co wskazuje, że indukowana przez CD4 ekspansja komórek CAR T CD8+ nie wiąże się z lepszą funkcją efektorową.
Wraz z wynikami z tego testu zidentyfikowano, że komórki CAR T CD4+ wykazały wyższą skuteczność niż komórki CD8+ konkretnie w zakresie długoterminowej cytotoksyczności. Pomimo podobnej cytotoksyczności krótkoterminowej (1–3 dni po ponownej ekspozycji), komórki CAR T CD4+ zachowały funkcję efektorową przy wielokrotnej stymulacji komórkami nowotworowymi, podczas gdy komórki CD8+ uległy wyczerpaniu i nie zdołały kontrolować wzrostu komórek nowotworowych. Po zmieszaniu obu subpopulacji, komórki CAR T CD4+ wspomagały ekspansję komórek CAR T CD8+, jednak stan wyczerpania komórek CD8+ nie został złagodzony, co skutkowało brakiem efektu synergicznego między obiema grupami. Podobną różnicę między komórkami CAR T CD4+ a CD8+ zaobserwowano w modelu in vivo, jak opisano wcześniej21. Rzeczywiście, komórki CAR T CD8+ były w stanie doprowadzić do krótkoterminowego oczyszczenia z nowotworu, po czym nastąpiła nawrotowość antygen-dodatnia; w przeciwieństwie do tego, leczenie komórkami CAR T CD4+ doprowadziło do długoterminowej eradykacji nowotworu21, co przypomina ich potencjał do wielokrotnego zabijania zaobserwowany w teście ponownej ekspozycji in vitro.
<img alt="Oś czasu kokultury i analizy komórek CAR T, wykresy cytometrii przepływowej, wykres żywotności komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat i strategia analizy testu powtarzalnego wyzwania. (A) Schemat i oś czasu testu powtarzalnego wyzwania nowotworowego. W każdym dołku komórki CAR T były najpierw kokultywowane z komórkami GBM PBT030-2 (4000 komórek CAR+, 16 000 komórek nowotworowych), a następnie poddawane ponownemu wyzwaniu przy użyciu 32 000 komórek nowotworowych co drugi dzień (D2, D4 i D6). Analiza liczby komórek nowotworowych i komórek CAR T, a także fenotypu komórek CAR T, jest przeprowadzana w dniach D1, D3, D5 i D7. (B) Strategia bramkowania w celu określenia CAR% w komórkach T przed ustanowieniem kokultury. (C) Strategia bramkowania żywych komórek, komórek nowotworowych i komórek CAR T z testu powtarzalnego wyzwania. (D) Liczba komórek nowotworowych w różnych punktach czasowych testu ponownego wyzwania, kokultywowanych z nietransdukowanymi komórkami T. Słupki błędów = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej, aktywność komórek CD4+ i CD8+, CD107a, IFN-γ, wyniki krotności ekspansji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2Test wielokrotnego wyzwania ujawnia różnice w potencjale zabijania i proliferacji między komórkami CD4+ oraz CD8+ Komórki CAR-T. (A) Degranulacja i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin dla CD4+ oraz CD8+ Komórki CAR-T po 5 h kokultury z komórkami GBM (E:T=1:1). (B) CD4+, CD8+ lub zmieszane (CD4:CD8=1:1) komórki CAR-T zastosowano w teście wielokrotnej stymulacji, a następnie oznaczono liczbę żywych komórek nowotworowych. *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0,001 w porównaniu z CD4+z wykorzystaniem jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testami wielokrotnych porównań Bonferroniego. (C) CD4+ oraz CD8+ Ekspansja komórek CAR-T podczas testu wielokrotnego wyzwania nowotworowego. Porównanie (od lewej do prawej) CD4+ kontra CD8+, pojedyncza podgrupa; CD4+ kontra CD8+, w grupie „mieszanej”; CD4+, pojedyncze vs mieszane; CD8+pojedyncze kontra mieszane.p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0,001 przy użyciu nieparowanego testu t Studenta t test. Słupki błędów = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizy komórek CAR-T; cytometria przepływowa, receptory hamujące, CD4+, CD8+, PD1, LAG3, TIM3." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza fenotypu limfocytów T podczas powtarzalnego testu stymulacji. (A) Barwienie 4-1BB i CD69 na komórkach CAR-T w dniu D1 testu. (B) Barwienie CD45RO i CD62L komórek CAR-T przed zastosowaniem w teście stymulacji (input) oraz w dniach D3 i D7 testu. (C) Koekspresja PD-1, LAG-3 i TIM-3 na komórkach CAR-T w dniu D3 testu. (Góra) Strategie bramkowania w celu identyfikacji limfocytów T wykazujących ekspresję 1, 2 lub 3 receptorów hamujących. (Dół) Porównanie: komórek CD4+ (pojedyncza subpopulacja), komórek CD8+ (pojedyncza subpopulacja) oraz komórek CD8+ (w ramach grupy „mieszanej”). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej analizy CAR CD4+/CD8+; metoda badawcza." src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Reprezentatywny schemat rozmieszczenia próbek na płytce w układzie ponownej stymulacji.

Tutaj opisujemy metodę wspólnej hodowli in vitro do rekurencyjnego wyzwania limfocytów T ukierunkowanych na nowotwór, co pozwala na fenotypową i funkcjonalną analizę aktywności przeciwnowotworowych limfocytów T.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Protokół ten zapewnia długoterminową, funkcjonalną metodę in vitro do oceny chimerycznego receptora antygenowego lub komórek CAR T, poprzez powtarzającą się prowokację komórkami nowotworowymi. Technika ta jest mniej czasochłonna i mniej pracochłonna niż ocena funkcji limfocytów CAR T in vivo, a jednocześnie pozwala uzyskać dokładne odwzorowanie prawdziwej skuteczności przeciwnowotworowej. Ta technika in vitro umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe i różnicowanie siły przeciwnowotworowej komórek CAR T.Ma to potencjalne zastosowanie w ocenie skuteczności klinicznej produktów z komórek CAR T. Zacznij od oddzielenia guzów glejaka od kultury guza glejaka. Z jednym mililitrem zimnej akutazy i 30 do 60 sekund pipetowania.Gdy guzy zostaną przerwane, zatrzymaj reakcję za pomocą pięciu mililitrów ciepłej pożywki do kohodowli. I granulować zawiesiny komórek nowotworowych przez wirowanie. Ponownie zawiesić komórki glejaka na 1,6 razy 10 do piątej komórki nowotworowej na mililitr świeżego stężenia pożywki kokultury i rozcieńczyć limfocyty T zebrane z hodowli komórek CAR T do odpowiedniego procentu limfocytów T CAR dodatnich na mililitr stężenia pożywki do kohodowli.Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonych komórek nowotworowych do każdego dołka 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z płaskim dnem. I 100 mikrolitrów limfocytów CAR T do każdej studzienki komórek nowotworowych przy delikatnym mieszaniu. Następnie umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.W drugim, czwartym i szóstym dniu hodowli ostrożnie usuń 50 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki komórki nowotworowej, płytki do kohodowli komórek T przeznaczonych do ponownego użycia zgodnie z tabelą. Następnie dodaj 50 mikrolitrów świeżej zawiesiny komórek glejaka, przygotowanej tak, jak właśnie pokazano, ale z dwukrotnie większą liczbą komórek niż początkowa kohodowla do każdego dołka z delikatnym mieszaniem. I włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.W pierwszym, trzecim, piątym i siódmym dniu wspólnej hodowli przenieś supernatant z każdej studzienki, która ma być zebrana, na nową 96-dołkową okrągłą płytkę denną zgodnie z tabelą i dodaj 50 mikrolitrów wstępnie podgrzanej 0,5% trypsyny EDTA do każdej pożywki zubożonej studzienki. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza potwierdź, że komórki oderwały się od dna każdej studzienki za pomocą mikroskopii świetlnej i delikatnie odpipetuj roztwór enzymu wokół dna każdej studzienki, aby ponownie zawiesić komórki. Przed przeniesieniem oderwanej zawiesiny komórkowej do odpowiednich dołków nowej płytki 96 dołków.Osadzać komórki przez wirowanie i myć komórki 200 mikrolitrami aktywnego fluorescencyjnie roztworu do sortowania komórek lub FFS na studzienkę z drugim wirowaniem. Ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach interesującego nas koktajlu przeciwciał w 100 mikrolitrach SSS na studzienkę na 30-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza. A pod koniec inkubacji usuń wszelkie niezwiązane przeciwciała przez sekwencyjne płukanie FSS o pojemności 100 i 200 mikrolitrów i ponownie zawiesij komórki w 100 do 200 mikrolitrach barwnika jądrowego DAPI i FSS.Następnie przeanalizuj komórki zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. W celu analizy funkcjonalnej i fenotypowej limfocytów CAR T po kohodowli komórek nowotworowych pobierz pliki danych z cytometru przepływowego i bramuj wszystkie żywe komórki ujemne DAPI. Aby określić ilościowo komórki nowotworowe, należy zaszczepić populację CD45 ujemną.Aby określić ilościowo limfocyty CAR T, należy zaszczepić populację CD45 dodatnią CAR. Następnie wykreśl liczbę komórek guza i CAR T w czasie trwania eksperymentu, identyfikując aktywację limfocytów T przez koekspresję 41BB i CD69. Wyczerpanie limfocytów T przez ekspresję PD1, LAG3 i TIM3 oraz stan pamięci komórek T LAG3 i TIM3 oraz stan pamięci limfocytów T przez CD45RO i ekspresję liganda CD62.przez CD45RO i ekspresję liganda CD62. Zarówno CD4-dodatnie, jak i CD8-dodatnie limfocyty CAR T stają się w równym stopniu aktywowane przeciwko komórkom glejaka, które wyrażają docelowy antygen, na co wskazuje ich CD107a i wewnątrzkomórkowa ekspresja cytokin. Jednak, jak ocenia się na podstawie powtarzającego się prowokacji nowotworem SA, CD4 dodatniego, ale nie CD8-dodatniego, limfocyty CAR T są zdolne do wielokrotnego zabijania rund.Limfocyty T CD4-dodatnie CAR osiągają również bardziej solidną ekspansję. Gdy limfocyty CAR T CD4 dodatnie i CD8 dodatnie są mieszane w stosunku jeden do jednego, ta kombinacja komórek wykonuje CD8 dodatnie, ale nie CD4-dodatnie komórki CAR T pod względem długoterminowej cytotoksyczności. Ponadto ekspansja limfocytów T CD8 dodatnich jest indukowana przez dodanie limfocytów T CD4-dodatnich.Podczas gdy ekspansja limfocytów T CD4-dodatnich CAR jest hamowana w obecności komórek CDa-dodatnich. 24 godziny po początkowej kohodowli zarówno CD4-dodatnie, jak i CD8-dodatnie komórki CAR T są podobnie aktywowane. Podczas powtarzającego się wyzwania nowotworowego zarówno CD4-dodatnie, jak i CD8-dodatnie limfocyty CAR T wykazują przejście od fenotypu pamięci centralnej CD45RO dodatniego, CD62 liganowo-dodatniego, do fenotypu CD45RO dodatniego liganu CD62 z ujemnym efektorem pamięciowym.Limfocyty T CAR CD8 są również bardziej podatne na wyczerpanie w porównaniu z limfocytami T CD4 dodatnimi, co ocenia się na podstawie ich ekspresji PD1, LAG3 i TIM3 po trzech dniach kohodowli. Ponadto nie zaobserwowano różnic w wyczerpaniu limfocytów T CDa-dodatnich w obecności lub braku limfocytów T CD4-dodatnich, co wskazuje, że indukowana przez CD4 ekspansja komórek T CAR CD8 nie jest związana z lepszą funkcją efektorową. Ten esej można również połączyć z sortowaniem limfocytów T z kokultury w celu przeprowadzenia dalszej analizy transkryptomów, proteomiki i określonych genów będących przedmiotem zainteresowania.To powtarzalne wyzwanie nowotworowe może być również wykorzystane jako platforma do badania zdarzeń biologicznych po rozpoznaniu guza przez limfocyty CAR T.

in-vitro-tumor-cell-rechallenge-for-predictive-evaluation-chimeric

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie demonstrujemy test powtarzalnego wyzwania nowotworowego, aby ocenić potencjał powtarzalnych komórek T CAR podczas dużego obciążenia komórek nowotworowych. Ponadto limfocyty CAR T można analizować za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia różnych subpopulacji komórek CAR T w próbce.

Powtarzalny test prowokacyjny nowotworu: Test hodowli in vitro w celu oceny limfocytów T chimerycznego receptora antygenowego (CAR) pod kątem powtarzalnego potencjału zabijania guza

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Ten film demonstruje technikę generowania ex vivo limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) specyficznym dla antygenu nowotworowego. Wektory retrowirusowe przenoszące transgeniczne RNA są mieszane z komórkami śledziony w pożywce uzupełnionej interleukiną-2 w celu promowania przeżycia i proliferacji komórek T. Mieszanina jest następnie przenoszona na płytkę pokrytą rekombinowanymi fragmentami ludzkiej fibronektyny i odwirowywana, aby ułatwić fuzję wirusa z komórką, umożliwiając...

Technika ex vivo do generowania specyficznych dla nowotworu chimerycznych komórek T receptora antygenowego

Ten film demonstruje test in vitro w celu sprawdzenia aktywności limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR). Komórki chłoniaka z komórek B eksprymujące antygen CD19 i lucyferazy cytoplazmatycznej są hodowane wspólnie z komórkami CAR T specyficznymi dla CD19. Wiązanie CAR z CD19 na guzie indukuje limfocyty CAR T do uwalniania cytokin i toksyn, które powodują cytotoksyczność komórek nowotworowych. Aktywność limfocytów CAR T ocenia się poprzez ilościowe określenie uwolnionej cytokiny...

Test in vitro w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej komórek CAR T specyficznych dla nowotworu

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Protokół do oceny ilościowego zabijania komórek nowotworowych przez komórki Jurkata wyrażające chimeryczny receptor antygenowy (CAR) ukierunkowany na pojedynczy antygen nowotworowy. Protokół ten może być wykorzystany jako platforma przesiewowa do szybkiej optymalizacji konstrukcji zawiasów CAR przed potwierdzeniem w limfocytach T pochodzących z krwi obwodowej.

Szybka ocena cytotoksyczności in vitro receptora antygenu chimerycznego z ekspresją Jurkata przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Poznaj metodę współkultury in vitro do oceny funkcjonalnej komórek CAR-T poprzez powtarzane wyzwania komórek glejaka. Ta technika umożliwia badanie aktywacji i wyczerpania limfocytów T w immunoterapii przeciwnowotworowej.

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego (Wideo) | JoVE Journal

Ponowne badanie komórek nowotworowych in vitro w celu predykcyjnej oceny funkcji przeciwnowotworowej komórek T receptora antygenu chimerycznego

Przeglądaj więcej filmów