Podłużne obrazowanie przyżyciowe zachowania komórek guza mózgu w odpowiedzi na inwazyjną biopsję chirurgiczną

Protokół ten umożliwia użytkownikowi badanie wpływu inwazyjnych procedur chirurgicznych stosowanych w klinice na zachowania komórek nowotworowych, takie jak migracja, inwazja i proliferacja. Metoda ta w unikalny sposób pozwala na wizualizację tego samego guza przed i po inwazyjnym zabiegu, zapewniając wgląd, który mógłby zostać pominięty w podejściu niepodłużnym. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palców u znieczulonej myszy dorosłej, zamontuj mysz na ramie stereotaktycznej i zabezpiecz głowę za pomocą zacisku na nos i dwóch pasków dousznych.

Użyj lampy grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Za pomocą ostrych nożyczek ogol futro na czaszce od oczu do podstawy czaszki i użyj 70% etanolu do sterylizacji odsłoniętej skóry. Przetnij skórę w okrężny sposób i za pomocą bawełnianego wacika zeskrob odsłoniętą okostną.

Potraktuj obszar chirurgiczny kroplą 1% lidokainy i stężeniem epinefryny 1:100 000 przez pięć minut, a następnie usuń nadmiar roztworu za pomocą bawełnianego wacika. Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przykleić krawędzie skóry do czaszki i umieść ramę stereotaktyczną pod mikroskopem stereoskopowym o 4-krotnym powiększeniu. Następnie ostrożnie wywierć powierzchowny, okrągły rowek o średnicy pięciu milimetrów nad prawą kością ciemieniową.

I nałóż kroplę bufora kory na rowek. Użyj cienkich kleszczy, aby podnieść płat kostny, aby uwidocznić powierzchnię mózgu, i użyj zakrzywionych, zwężających się, bardzo cienkich kleszczyków, aby usunąć oponę twardą. Jeśli wystąpi krwawienie, użyj wchłanialnej gąbki żelatynowej, aby uzyskać hemostazę.

W celu wstrzyknięcia komórek nowotworowych załaduj około trzech mikrolitrów komórek do gazoszczelnej strzykawki o pojemności pięciu mikrolitrów wyposażonej w dwie igły punktowe. Zamocuj igłę na ramieniu manipulatora stereotaktycznego i usuń bufor kory z odsłoniętej tkanki. Umieść końcówkę strzykawki w środku kraniotomii i wprowadź igłę na głębokość 0,5 milimetra od powierzchni czaszki.

Następnie dodaj kroplę buforu kory mózgowej do kraniotomii i użyj iniektora z pompką mikrostrzykawkową, aby dostarczyć komórki z szybkością od 250 do 400 nanolitrów na minutę. Aby przygotować okno obrazowania czaszki, zastąp bufor kory kroplą oleju silikonowego w miejscu kraniotomii, aby uniknąć pęcherzyków powietrza pod okienkiem. Uszczelnij odsłonięty mózg sześciomilimetrowym szkiełkiem nakrywkowym i nałóż klej cyjanoakrylowy między szkiełko nakrywkowe a czaszkę.

Następnie za pomocą cienkiej pęsety delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do czaszki. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym umieść mysz ekranem do góry w pudełku do obrazowania i ustaw obiektyw wodny 25x w najniższej pozycji z. Dodaj dużą kroplę wody do obiektywu i przenieś pudełko do obrazowania do ciemnej komory klimatycznej mikroskopu o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przyłóż obiektyw do szkiełka nakrywkowego z okienkiem obrazowania czaszki, aż kropla wody dotknie szkiełka nakrywkowego. Korzystając z trybu epifluorescencji, obserwuj guz przez okular, aby ustawić ostrość komórek. Dostrój laser do odpowiedniej długości fali i wybierz tryb na żywo.

Po wybraniu kilku interesujących pozycji do obrazowania, zapisz ich współrzędne w oprogramowaniu. Zdefiniuj stos z dla każdej pozycji, aby uzyskać maksymalną objętość komórek nowotworowych bez uszczerbku dla rozdzielczości komórek nowotworowych, z rozmiarem kroku między obrazami ustawionym na trzy mikrometry. Następnie wykonuj obrazy objętości guza w różnych pozycjach co 20 minut przez dwie godziny, dodając wodę do obiektywu przed każdym akwizycją obrazu.

Po uzyskaniu ostatniego obrazu przenieś mysz na poduszkę grzewczą z monitorowaniem aż do pełnego odzyskania. Dzień po pierwszej sesji obrazowania zabezpiecz znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej, jak pokazano, i użyj bawełnianego wacika nasączonego acetonem, aby wytrzeć krawędzie szkiełka nakrywkowego, aż klej zmięknie. Wsuń igłę o rozmiarze 25 G pod szkiełko nakrywkowe i użyj cienkich kleszczyków, aby ją podnieść, a następnie nawodnij kraniotomię świeżym buforem kory

Nakłuj guz na głębokość jednego milimetra za pomocą igły o rozmiarze 25, zatrzymując krwawienie sterylną gąbką żelatynową i uszczelnij powierzchnię mózgu świeżym olejem silikonowym. Następnie przyklej nowy sześciomilimetrowy szkiełko nakrywkowe na ranę. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz plik poklatkowy LIF w oprogramowaniu mikroskopowym i wybierz zakładkę Proces, Narzędzia procesu i Scalanie.

Wybierz pierwszy obraz sekwencji czasowej i kliknij jako pierwszy. Wybierz drugi obraz sekwencji czasowej i kliknij drugi. W polu Scal wymiary wybierz t dla czasu, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Zostanie wygenerowany nowy plik z dwoma punktami czasowymi. Po odtworzeniu każdej serii poklatkowej dla trzech kolejnych stosów poklatkowych osobno, przeciągnij folder zawierający obrazy poklatkowe do ImageJ. Wybierz zakładkę Wtyczki, Śledzenie i MtrackJ.

Aby śledzić każdą pojedynczą komórkę, wybierz pozycję Dodaj i kliknij każdą komórkę w każdym punkcie czasu. Następnie kliknij pomiar i zapisz plik, aby wyodrębnić miarę ścieżek. Migrację poszczególnych komórek nowotworowych można określić, śledząc ścieżkę migracji w czasie w różnych płaszczyznach xy stosu z i wykreślić jako procent komórek migrujących przed i po biopsji.

Szybkość proliferacji komórek nowotworowych można określić ilościowo na podstawie kondensacji Dendra2 znakowanej H2B po mitozie i wykreślić jako procent dzielących się komórek przed i po biopsji. Porównanie rozkładu prędkości migracji przed i po biopsji w tym samym guzie ujawnia, że liczba komórek migrujących wzrasta po interwencji, z towarzyszącym spadkiem liczby komórek wolno migrujących i niemigrujących. Średnio na guz obserwuje się 1,75-krotny wzrost odsetka komórek migrujących, gdy wykonuje się uraz podobny do biopsji, w porównaniu z kontrolnymi myszami bez biopsji.

Chociaż odsetek migrujących komórek nowotworowych ostatecznie zmniejsza się zarówno u myszy kontrolnych, jak i poddanych biopsji, myszy poddane biopsji nadal wykazują wyższą zdolność migracji niż myszy kontrolne ogółem. Zachowanie proliferacyjne komórek nowotworowych wykazuje również 1,52-krotny wzrost liczby zdarzeń mitotycznych po biopsji w czasie, w porównaniu z myszami kontrolnymi bez biopsji. Warto zauważyć, że nie obserwuje się indukcji migracji lub proliferacji komórek nowotworowych po wymianie okna obrazowania czaszki bez biopsji, co wskazuje, że wzrost szybkości proliferacji i migracji komórek nowotworowych jest specjalnie wywoływany przez uraz podobny do biopsji.

Ważne jest, aby pracować z dużą precyzją i umiejętnościami chirurgicznymi podczas etapów obrazowania czaszki, implantacji i wymiany. Konieczna może być rozległa praktyka.