Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus
12 kwietnia 2019
W tym manuskrypcie ustaliliśmy metodę wysokoprzepustową do ilościowego oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej w hodowli biofilmu S. aureus z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej
Protokół ten przedstawił łatwą i wiarygodną metodę pomiaru aktywności alkalizowanej fosfatazy w hodowli biofilmu S.aureus. Pomoże nam to zrozumieć funkcję ALP w tworzeniu biofilmu. Główną zaletą tej techniki jest wysoka przepustowość.
Jest bardzo czuły i łatwy do wykonania. Procedurę zademonstruje Kevin Danikowski, były student z Harper College. Aby przygotować TSB, dodaj do wody destylowanej trawienie kazeiny przez trzustkę, trawienie papaiczne śruty sojowej, chlorek sodu, dekstrozę i fosforan dipotasowy.
Przykryj kolbę folią aluminiową i umieść ją w autoklawie w celu sterylizacji przed użyciem. Aby przygotować TSA, dodaj agar do TSB i umieść go w autoklawie w celu sterylizacji. Następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.
Następnie wlej go na szalkę Petriego w proporcji 20 mililitrów na naczynie. Aby przygotować pożywkę do hodowli biofilmu, dodaj glukozę do autoklawizowanego TSB, aby osiągnąć stężenie 10 gramów na litr. Za pomocą zestawu do filtracji próżniowej przefiltruj roztwór za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 mikrometra.
Aby zaszczepić, użyj wysterylizowanej pętli inokulacyjnej, aby wybrać jedną pojedynczą kolonię Staph aureus z szalki Petriego i umieścić ją w probówce hodowlanej wypełnionej 10 mililitrami TSB. Umieść probówkę w inkubatorze, aby rosła przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety pobrać 100 mikrolitrów kultury przez noc i przenieść ją do probówki hodowlanej wypełnionej 10 mililitrami TSB z glukozą w celu rozcieńczenia w stosunku objętościowym 1:100.
Delikatnie wymieszaj, aby uzyskać stałe stężenie. Za pomocą mikropipety przenieś 200 mikrolitrów rozcieńczonej kultury do łącznie 18 dołków z jednej płytki 96-dołkowej. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w celu wytworzenia biofilmu.
Aby uzyskać najlepsze tworzenie biofilmu S.aureus, lepiej jest wybrać płaską lub okrągłą płytkę 96-dołkową. Następnie lekko przechyl płytkę, aby zdekantować supernatant przez aspirację od krawędzi każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę 1X PBS.
Umieścić płytkę w wirówce, aby wirowała przez pięć minut z prędkością 8 000 obrotów na minutę i zdekantować supernatant przez aspirację. Dodać 75 mikrolitrów buforowanego substratu ALP składającego się z dostępnego w handlu PNPP do każdej studzienki i użyć timera, aby zapisać każdy punkt czasowy w trzech egzemplarzach. Po każdym punkcie czasowym inkubacji dodaj 75 mikrolitrów pięciu molowych wodorotlenków sodu do każdej z trzech studzienek, aby zatrzymać reakcję.
Wirować płytkę przez pięć minut z prędkością 800 obrotów na minutę. Za pomocą pipety przenieś 100 mikrolitrów supernatantu do nowej 96-dołkowej płytki w celu pomiaru kalorymetrycznego. Użyj 96-dołkowego czytnika płytek, aby zmierzyć absorbancję każdego dołka przy 405 nanometrach.
Użyj 30-minutowych studzienek punktów czasowych, aby kontrolować hałas w tle. Powtórz cały eksperyment na trzech 96-dołkowych płytkach. Protokół ten opracowuje szybki i wiarygodny test do pomiaru aktywności ALP w biofilmie S.aureus, który nie wymaga izolacji białka.
Reprezentatywny wynik aktywności ALP pokazuje tendencję wzrostową do 75 minut. Po 75 minutach nie zaobserwowano wzrostu aktywności ALP. Bardzo ważne jest, aby stworzyć dobrą kulturę biofilmu, a opanowanie jej może zająć sporo prób.
Możesz potwierdzić tworzenie się biofilmu, wykonując test fioletu krystalicznego, jak wcześniej informowaliśmy przez nas i innych, lub możesz wstępnie potraktować płytkę ludzkim osoczem, aby ułatwić tworzenie biofilmu. Po jego rozwinięciu można przeprowadzić badania przesiewowe potencjalnych inhibitorów ALP, które mogą zakłócać tworzenie biofilmu. Uzyskane wyniki dostarczą ważnych informacji na temat zarządzania biofilmem w medycynie.
Pięciomolowy wodorotlenek sodu może być niebezpieczny w przypadku kontaktu. Podczas obsługi należy nosić środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt przedstawia wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej w kulturach biofilmu S. aureus z wykorzystaniem 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek. Metoda ta została opracowana tak, aby była czuła i łatwa w wykonaniu, co ułatwia badania nad rolą fosfatazy alkalicznej w tworzeniu biofilmu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Badania nad biofilmem
- Enzymologia
Wstęp
- Fosfataza alkaliczna (ALP) jest enzymem uczestniczącym w różnych procesach biologicznych.
- Zrozumienie roli ALP w tworzeniu biofilmu jest kluczowe dla badań mikrobiologicznych.
- Metody wysokoprzepustowe są niezbędne do efektywnego gromadzenia danych w badaniach.
- Biofilmy to złożone społeczności mikroorganizmów, które mogą wpływać na zdrowie oraz przemysł.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody pomiaru aktywności ALP w biofilmach.
- Pogłębienie wiedzy na temat funkcji ALP w procesie tworzenia biofilmu.
- Dostarczenie protokołu, który może zostać łatwo wdrożony przez badaczy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki TSB z wykorzystaniem pancreaticznego hydrolizatu kazeiny, papainowego hydrolizatu mączki sojowej, chlorku sodu, dekstrozy oraz fosforanu dipotasowego.
- Wykorzystanie 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowych w celu przeprowadzenia analizy wysokoprzepustowej.
- Pomiar aktywności fosfatazy alkalicznej w kulturach biofilmu S. aureus.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez Kevina Danikowskiego, byłego studenta Harper College.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na skuteczne oznaczanie aktywności ALP w kulturach biofilmu.
- Wysoka czułość techniki umożliwia przeprowadzenie dokładnych pomiarów.
- Protokół jest prosty i może zostać łatwo wdrożony w różnych laboratoriach.
- Wnioski z niniejszego badania mogą być pomocne w przyszłych badaniach nad biofilmem.
Wnioski
- Ustanowiona metoda jest skuteczna w badaniu ALP w biofilmach.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia dynamiki biofilmu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole, aby zgłębić inne aspekty biologii biofilmu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia szybką, wysokoprzepustową kwantyfikację aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus bez konieczności izolacji białek, co wspiera wczesną walidację celów w badaniach nad nowymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Dzięki zapewnieniu czułego i powtarzalnego odczytu aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych, metoda ułatwia weryfikację mechanistyczną hipotez terapeutycznych związanych z biofilmem. Kompatybilność testu z formatem płytek 96-dołkowych pozwala na płynną integrację z kaskadami przesiewowymi w celu identyfikacji związków wiodących oraz budowania pewności predykcyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną, według której fosfataza alkaliczna przyczynia się do tworzenia i utrzymywania się biofilmu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowy pomiar aktywności enzymu w nienaruszonych systemach biofilmu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu poprzez powiązanie modulacji ALP z fenotypami hamowania biofilmu.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje ustandaryzowany format wysokoprzepustowy do oceny wpływu związków na zewnątrzkomórkowe markery enzymatyczne.
- Wynik ilościowy: Generuje pomiary absorbancji przy 405 nm, które umożliwiają analizę zależności dawka-odpowiedź oraz potwierdzenie trafień.
- Skalowalność: Wykorzystuje format płytki 96-dołkowej, aby wspierać średnioprzepustowy screening bibliotek inhibitorów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Łączy aktywność ALP z biofilmem S. aureus, który jest kluczowym czynnikiem wirulencji w zakażeniach chronicznych i związanych z urządzeniami medycznymi.
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia odczyt zgodny z biomarkerami, który stanowi pomost między etapem odkrycia a przedklinicznymi badaniami skuteczności.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Dostarcza informacji dla kryteriów go/no-go w oparciu o zaangażowanie celu oraz wpływ fenotypowy w modelach biofilmu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, umożliwiając walidację celu w celu wsparcia identyfikacji związku wiodącego oraz oceny przedklinicznej strategii przeciwbiofilmowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar ALP jako funkcjonalnego produktu metabolizmu biofilmu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty odpowiednie do przesiewania bibliotek związków w płytkach mikrotitracyjnych.
- Analityka: Dostarcza pomiarów kinetycznych i końcowych, które umożliwiają statystyczne porównanie warunków traktowanych z kontrolnymi.
- Badania translacyjne: Wspiera rozwój biomarkerów poprzez powiązanie aktywności enzymatycznej z tworzeniem biofilmu i potencjalną interwencją terapeutyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania enzymów zewnątrzkomórkowych w biofilmach mikrobiologicznych w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dotyczącej roli ALP w biofilmie.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, czułość i powtarzalność dzięki prostemu odczytowi kolorymetrycznemu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając szybki screening modulatorów ALP z wyraźnymi powiązaniami fenotypowymi z biofilmem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o kontynuacji prac w oparciu o ocenę ryzyka poprzez powiązanie modulacji celu ze skutecznością przeciwbiofilmową.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu mikrobiologii w celu sterylnej hodowli biofilmu i pracy z S. aureus.
- Zależy od dostępu do czytnika płytek 96-dołkowych zdolnego do pomiaru absorbancji przy 405 nm.
- Wymaga standaryzacji warunków tworzenia biofilmu we wszystkich dołkach i płytkach w celu uzyskania wiarygodnych porównań.
- Wiąże się z koniecznością optymalizacji przy rozszerzaniu metody na inne gatunki bakterii lub markery zewnątrzkomórkowe.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność kontroli absorbancji tła oraz zapewnienia prawidłowego zatrzymania reakcji za pomocą NaOH.
