Name: Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Poznaj metodę kolorymetryczną do pomiaru aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus przy użyciu płytek 96-dołkowych. Ta technika umożliwia badanie roli ALP w formowaniu biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy William Rainey Harper College i University of Illinois w Chicago za możliwość przeprowadzenia tych eksperymentów. Dziękujemy również Fundacji McGraw Hill za hojne wsparcie.

1. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Przygotuj 1 l bulionu sojowego tryptycznego (TSB): Do 1 l wody destylowanej dodaj 15 g kazeiny trawionej przez trzustkę, 5 g papaicznego trawienia śruty sojowej, 3 g chlorku sodu, 2,5 g dekstrozy i 2,5 g fosforanu dipotasowego. Sterylizuj przed użyciem.</li>
	<li>W przypadku agaru sojowego tryptycznego (TSA) dodaj 15 g agaru do 1 litra TSB, autoklawu. Następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie wlać w proporcji 20 ml na szalkę Petriego (100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Pożywka do hodowli biofilmu: Dodać 10 g glukozy do 1 l autoklawizowanego TSB. Sterylizować przez filtrację przy użyciu filtra 0,2 μm.</li>
</ol>
2. Tworzenie biofilmu S. aureus w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej
UWAGA: Biofilm S. aureus jest hodowany zgodnie z wcześniejszym opisem6,21.
<ol>
	<li>Zaszczepić jedną pojedynczą kolonię S. aureus z TSA w 10 ml TSB i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć nocną hodowlę w 10 ml TSB/glukozy (10 g/l) w stosunku 1:100 (v/v). Delikatnie wymieszaj, aby uzyskać stałe stężenie.</li>
	<li>Przenieś 200 μl rozcieńczonej kultury do łącznie 18 dołków (więcej dla grup eksperymentalnych, taka kontrola bez biofilmu, aby zasugerować związek z aktywnością ALP6) z jednej płytki 96-dołkowej. Użyj trojaczków dla każdego punktu czasowego: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min i 75 min. Patrz krok 3.2.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu wytworzenia biofilmu6,21.</li>
	<li>Zdekantować supernatant przez aspirację.</li>
	<li>Przemyć każdą studzienkę 1x roztworem buforowym fosforanu (PBS, pH 7,4), odwirować przez 5 minut przy 15 000 x g i zdekantować supernatant przez aspirację.</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności ALP w biofilmie S. aureus
UWAGA: Aktywność ALP została zmierzona zgodnie z opisem6,18.
<ol>
	<li>Dodać 75 μl buforowanego substratu ALP składającego się z dostępnego w handlu pNPP do każdej studzienki z kroku 2.6 i rozpocząć rejestrację czasu. Zapisz każdy punkt czasowy w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Po inkubacji przez zróżnicowany czas: 0 min (kontrola), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min i 75 min odpowiednio, dodać 75 μl 5 M NaOH, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Odwirować płytkę przez 5 minut przy 15 000 x g.</li>
	<li>Przenieść 100 μl supernatantu do nowej płytki 96-dołkowej w celu pomiaru kolorymetrycznego.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 405 nm za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Użyj studzienek punktu czasowego 0 min, aby kontrolować szum tła 405 nm.</li>
	<li>Powtórz cały eksperyment na trzech pojedynczych płytkach 96-dołkowych.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszym teście użyliśmy pNPP jako substratu ALP. Jest to roztwór roboczy przeznaczony do testu ELISA i nie jest wymagane rozcieńczanie. Po hydrolizie przez ALP powstaje żółty produkt, który można zmierzyć przy 405 nm. Pod koniec reakcji enzymatycznej na krótko odwirowaliśmy 96-dołkową płytkę i przenieśliśmy supernatant na świeżą 96-dołkową płytkę w celu zmierzenia absorbancji za pomocą czytnika płytek. Odkryliśmy, że ten dodatkowy etap wirowania ma kluczowe znaczenie, ponieważ zwiększa spójność absorbancji przy 405 nm, ...

Fosfataza alkaliczna (ALP) jest powszechnie wyrażana zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych1. Może katalizować hydrolizę monofosforanu z różnych cząsteczek, takich jak nukleotydy, białka, alkaloidy, estry fosforanowe i bezwodniki kwasu fosforowego. U ludzi eukariotyczny ALP jest obecny w wielu tkankach, w tym w wątrobie, kościach, jelitach i łożysku2. Odgrywa ważną rolę w fosforylacji białek, wzroście komórek, apoptozie, procesach komórek macierzystych, a także w prawidłowej mineralizacji szkieletu. Eukariotyczny ALP jest również kluczowym wskaźnikiem w surowicy pod kątem obecności chorób w kościach, wątrobie i innych tkankach/narządach na podwyższonym poziomie3,4.
Prokariotyczny ALP został wykryty w różnych komórkach bakteryjnych, w tym E. coli5, S. aureus6,7 i niektórych powszechnych bakteriach żwacza w glebach8. Bakteryjna aktywność ALP została wykorzystana jako bioczujnik w wykrywaniu pestycydów, metali ciężkich9 i zanieczyszczenia bakteryjnego10. Wyrażenie konstytutywne ALP zostało użyte do identyfikacji Staphylococci11 oraz do odróżnienia Serratia od Enterobacter12. Ponadto sugeruje się, że konstytutywna produkcja ALP jest skorelowana z chorobotwórczością u gronkowców13. Chociaż ALP był badany w różnych warunkach3,4, niewiele jest doniesień na temat jego aktywności i funkcji w kulturach biofilmów.
Udokumentowano, że biofilm ma inaczej funkcjonujące życie bakteryjne w porównaniu z jego wolno żyjącym odpowiednikiem w komórkach bakteryjnych14. U S. aureus tworzenie się biofilmu zostało zidentyfikowane w różnych stanach klinicznych i odpowiada za oporność na antybiotyki i przewlekły stan zapalny15,16. Doniesiono, że w matrycy biofilmu znajduje się wiele cząsteczek, takich jak polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe i lipidy, ale mechanizm tworzenia biofilmu nie jest w pełni zrozumiały14. Aby zrozumieć rolę ALP w tworzeniu biofilmu, przeprowadziliśmy hodowlę biofilmów S. aureus na 96 dołkowych płytkach do hodowli tkankowych i zmierzyliśmy aktywność ALP za pomocą para-nitrofenylofosforanu (pNPP).
Cząsteczka pNPP jest gotowym do użycia substratem dla ALP i jest szeroko stosowana do pomiaru aktywności ALP6,17,18. Ten test kolorymetryczny opiera się na konwersji fosforanu para-nitrofenylu (pNPP) do para-nitrofenolu, w wyniku czego uzyskuje się kolorowy produkt o długości fali 405 nm. W porównaniu z innymi konwencjonalnymi testami ALP, takimi jak elektroforeza w żelu agarozowym19, wytrącanie aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) i WGA-HPLC20, ten test jest wysoce specyficzny, czuły, łatwy do odtworzenia, a co najważniejsze, pozwala na wysoką przepustowość.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Granulki NaOH</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrofenylofosforan (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>Typowe stężenia płynnych substratów pNPP, często stosowanych w testach immunoenzymatycznych (ELISA), wahają się od 10 do 50 mM. Podobnie jak w przypadku większości gotowych do użycia płynnych substratów pNPP, takich jak ten zastosowany tutaj, dokładne stężenie pNPP nie jest ujawniane ze względu na jego zastrzeżony charakter.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Agar sojowy tryptyczny&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 g/l TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; g/L Trawienie kazeiny przez trzustkę............ 15.0 Papaic Digest z mączki sojowej......... 5.00 Chlorek sodu.............................. 3.00 Dekstroza........................................ &nbsp; 2,50 Fosforan dipotasowy.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>Dno w kształcie litery U</td></tr></tbody></table>

analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie s. aureus

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Fosfataza alkaliczna (ALP) jest powszechnym enzymem wyrażanym zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Katalizuje hydrolizę monoestrów fosforanowych z wielu cząsteczek o zasadowym pH i odgrywa nieodzowną rolę w metabolizmie fosforanów. U ludzi eukariotyczny ALP jest jednym z najczęściej wykorzystywanych sygnałów enzymatycznych w diagnozowaniu różnych chorób, takich jak cholestaza i krzywica. U S. aureus ALP jest wykrywany wyłącznie na błonie komórkowej; Jest również wyrażany jako forma wydzielnicza. Jednak niewiele wiadomo na temat jego funkcji w tworzeniu biofilmu.
Celem tego manuskryptu jest opracowanie szybkiego i wiarygodnego testu do pomiaru aktywności ALP w biofilmie S. aureus, który nie wymaga izolacji białka. Używając fosforanu p-nitrofenylu (pNPP) jako substratu, zmierzyliśmy aktywność ALP w biofilmie S. aureus utworzonym na 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Aktywność opierała się na tworzeniu rozpuszczalnego produktu reakcji mierzonego absorbancją 405 nm. Wysoka przepustowość metody 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zapewnia czułą i powtarzalną metodę oznaczania aktywności ALP. Ten sam zestaw eksperymentalny można również rozszerzyć w celu pomiaru innych zewnątrzkomórkowych markerów molekularnych związanych z tworzeniem biofilmu.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny wynik aktywności ALP w kulturach biofilmu S. aureus w 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej. Do każdego dołka dodano 75 μL dostępnego komercyjnie roztworu pNPP i inkubowano w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przez różne odstępy czasu (odpowiednio 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min i 75 min) dodano 75 μL 5 M NaOH, aby zatrzymać reakcję. Następnie zmierzono ilość produktu w czytniku płytek 96-dołkowych ...

W tym manuskrypcie ustaliliśmy metodę wysokoprzepustową do ilościowego oznaczania aktywności fosfatazy alkalicznej w hodowli biofilmu S. aureus z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej

Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Protokół ten przedstawił łatwą i wiarygodną metodę pomiaru aktywności alkalizowanej fosfatazy w hodowli biofilmu S.aureus. Pomoże nam to zrozumieć funkcję ALP w tworzeniu biofilmu. Główną zaletą tej techniki jest wysoka przepustowość.Jest bardzo czuły i łatwy do wykonania. Procedurę zademonstruje Kevin Danikowski, były student z Harper College. Aby przygotować TSB, dodaj do wody destylowanej trawienie kazeiny przez trzustkę, trawienie papaiczne śruty sojowej, chlorek sodu, dekstrozę i fosforan dipotasowy.Przykryj kolbę folią aluminiową i umieść ją w autoklawie w celu sterylizacji przed użyciem. Aby przygotować TSA, dodaj agar do TSB i umieść go w autoklawie w celu sterylizacji. Następnie pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej.Następnie wlej go na szalkę Petriego w proporcji 20 mililitrów na naczynie. Aby przygotować pożywkę do hodowli biofilmu, dodaj glukozę do autoklawizowanego TSB, aby osiągnąć stężenie 10 gramów na litr. Za pomocą zestawu do filtracji próżniowej przefiltruj roztwór za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 mikrometra.Aby zaszczepić, użyj wysterylizowanej pętli inokulacyjnej, aby wybrać jedną pojedynczą kolonię Staph aureus z szalki Petriego i umieścić ją w probówce hodowlanej wypełnionej 10 mililitrami TSB. Umieść probówkę w inkubatorze, aby rosła przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety pobrać 100 mikrolitrów kultury przez noc i przenieść ją do probówki hodowlanej wypełnionej 10 mililitrami TSB z glukozą w celu rozcieńczenia w stosunku objętościowym 1:100.Delikatnie wymieszaj, aby uzyskać stałe stężenie. Za pomocą mikropipety przenieś 200 mikrolitrów rozcieńczonej kultury do łącznie 18 dołków z jednej płytki 96-dołkowej. Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny w celu wytworzenia biofilmu.Aby uzyskać najlepsze tworzenie biofilmu S.aureus, lepiej jest wybrać płaską lub okrągłą płytkę 96-dołkową. Następnie lekko przechyl płytkę, aby zdekantować supernatant przez aspirację od krawędzi każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę 1X PBS.Umieścić płytkę w wirówce, aby wirowała przez pięć minut z prędkością 8 000 obrotów na minutę i zdekantować supernatant przez aspirację. Dodać 75 mikrolitrów buforowanego substratu ALP składającego się z dostępnego w handlu PNPP do każdej studzienki i użyć timera, aby zapisać każdy punkt czasowy w trzech egzemplarzach. Po każdym punkcie czasowym inkubacji dodaj 75 mikrolitrów pięciu molowych wodorotlenków sodu do każdej z trzech studzienek, aby zatrzymać reakcję.Wirować płytkę przez pięć minut z prędkością 800 obrotów na minutę. Za pomocą pipety przenieś 100 mikrolitrów supernatantu do nowej 96-dołkowej płytki w celu pomiaru kalorymetrycznego. Użyj 96-dołkowego czytnika płytek, aby zmierzyć absorbancję każdego dołka przy 405 nanometrach.Użyj 30-minutowych studzienek punktów czasowych, aby kontrolować hałas w tle. Powtórz cały eksperyment na trzech 96-dołkowych płytkach. Protokół ten opracowuje szybki i wiarygodny test do pomiaru aktywności ALP w biofilmie S.aureus, który nie wymaga izolacji białka.Reprezentatywny wynik aktywności ALP pokazuje tendencję wzrostową do 75 minut. Po 75 minutach nie zaobserwowano wzrostu aktywności ALP. Bardzo ważne jest, aby stworzyć dobrą kulturę biofilmu, a opanowanie jej może zająć sporo prób.Możesz potwierdzić tworzenie się biofilmu, wykonując test fioletu krystalicznego, jak wcześniej informowaliśmy przez nas i innych, lub możesz wstępnie potraktować płytkę ludzkim osoczem, aby ułatwić tworzenie biofilmu. Po jego rozwinięciu można przeprowadzić badania przesiewowe potencjalnych inhibitorów ALP, które mogą zakłócać tworzenie biofilmu. Uzyskane wyniki dostarczą ważnych informacji na temat zarządzania biofilmem w medycynie.Pięciomolowy wodorotlenek sodu może być niebezpieczny w przypadku kontaktu. Podczas obsługi należy nosić środki ochrony osobistej.

colorimetric-analysis-alkaline-phosphatase-activity-s-aureus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biofilmy tworzące się na powierzchniach zębów są wysoce złożone i narażone na stałe wrodzone oraz egzogenne wyzwania środowiskowe, które modulują ich architekturę, fizjologię oraz transkryptom. Opracowaliśmy zestaw narzędzi do badania składu, organizacji strukturalnej i ekspresji genów w biofilmach jamy ustnej, które można zaadaptować do innych obszarów badań nad biofilmami.

Analityczny zestaw narzędzi do kompleksowej oceny biochemicznej, strukturalnej i transkrypcyjnej biofilmów jamy ustnej indukowanych przez paciorkowce z grupy mutans

Źródło: Vidilaseris, K., et al. Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów pirofosfatazy związanych z błoną Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia test kolorymetryczny do badania przesiewowego inhibitorów pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną (mPPazy) poprzez ilościowe określenie uwalniania ortofosforanu. Metoda umożliwia identyfikację związków hamujących mPPazę z Thermotoga maritima, potencjalnego celu dla leków przeciwdrobnoustrojowych.

Przesiewowe inhibitory pirofosfatazy związanej z błoną bakteryjną za pomocą testu kolorymetrycznego 

Źródło: Tay, S. B. i in. Antywirusowe zaburzenie biofilmów patogennych przy użyciu inżynierowanych laktonan gaśniczych kworum.  J. Vis. Exp. (2016)Film demonstruje metodę ilościowego określenia biomasy biofilmu w patogennej bakterii, porównując nieleczone grupy kontrolne z próbkami objętymi enzymem gaszczącym kworum. Enzym zakłóca sygnalizację bakteryjną podczas wczesnej inkubacji, zmniejszając przyczepność komórek. Po płukaniu i dalszej inkubacji studnie kontrolne tworzą gęste biofilmy,...

Ilościowe tłumienie biofilmu indukowanego enzymami u bakterii patogennych

Ten film demonstruje test in vitro do badania interakcji neutrofil-biofilm. Bakterie chorobotwórcze osadzone w biofilmie i wyizolowanych neutrofilach oznaczono za pomocą znaczników fluorescencyjnych, a odpowiedź immunologiczną neutrofili i unikanie odpowiedzi immunologicznej przez bakterie oceniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Test in vitro do badania interakcji między neutrofilami a biofilmem

W przeciwieństwie do tego, co obserwuje się u eukariontów, istnieje niedostatek badań, które szczegółowo opisują depolaryzację błony i zmiany stężenia jonów u bakterii, przede wszystkim dlatego, że ich mały rozmiar utrudnia konwencjonalne metody pomiaru. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokoły monitorowania takich zdarzeń w znaczącym patogenie Gram-dodatnim Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem technik fluorescencyjnych.

Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokoły do szybkiego badania i charakteryzowania enzymów pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Test dyfuzji mikroszkiełkowej i test uwalniania barwnika wykorzystują docelowe substraty bakteryjne do jakościowej i ilościowej oceny aktywności enzymatycznej.

Testy jakościowe i ilościowe do wykrywania i charakterystyki białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych

Większość infekcji bakteryjnych wytwarza biofilm. Ze względu na środowisko, w którym działają, bakterie związane z biofilmem są często fenotypowo odporne na leki. Nowe cząsteczki przeciwbakteryjne, które zabijają bakterie w biofilmach, mają zatem wysoki priorytet. Opracowujemy test do szybkiego badania przesiewowego pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych, które są skuteczne w zwalczaniu biofilmów.

Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Ten manuskrypt opisuje protokół do badania przeciwbakteryjnego wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolewulinowego (ALA-PDT) na biofilm Staphylococcus aureus. Protokół ten może zostać wykorzystany do opracowania modelu in vitro w celu zbadania leczenia biofilmów bakteryjnych za pomocą PDT w przyszłości.

Model in vitro do badania wpływu terapii fotodynamicznej za pośrednictwem kwasu 5-aminolulinowego na biofilm Staphylococcus aureus

Protokół opisuje hodowlę międzykrólestwowych biofilmów składających się z Candida albicans i Streptococcus mutans oraz przedstawia metodę opartą na mikroskopii konfokalnej do monitorowania pH zewnątrzkomórkowego wewnątrz tych biofilmów.

Monitorowanie pH zewnątrzkomórkowego w biofilmach międzyludzkich za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

Obecny protokół opisuje badanie interakcji neutrofil-biofilm. Biofilmy Staphylococcus aureus tworzy się in vitro i inkubuje z neutrofilami ludzkimi pochodzącymi z krwi obwodowej. Odpowiedź oksydacyjna neutrofili jest określana ilościowo, a lokalizacja neutrofili w biofilmie jest określana za pomocą mikroskopii.

Standaryzowane testy in vitro do wizualizacji i ilościowego określenia interakcji między ludzkimi neutrofilami a biofilmami Staphylococcus aureus

Poznaj metodę kolorymetryczną do pomiaru aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus przy użyciu płytek 96-dołkowych. Ta technika umożliwia badanie roli ALP w formowaniu biofilmu.

Analiza kolorymetryczna aktywności fosfatazy alkalicznej w biofilmie S. aureus

Przeglądaj więcej filmów