Name: Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj trójwymiarową mikroskopię dwufotonową do badania odpowiedzi naczyniowych w kapilarach mózgowych po lokalnym wyrzucie ATP. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary zmian średnicy naczyń w trzech wymiarach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Fundację Lundbeck, Fundację NOVO-Nordisk, Duńską Radę Niezależnych Badań | Nauk Medycznych oraz grant Fundacji NORDEA dla Centrum Zdrowego Starzenia się.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Duński Krajowy Komitet Etyki zgodnie z wytycznymi zawartymi w Konwencji Rady Europejskiej o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych i były zgodne z wytycznymi ARRIVE. Jest to procedura terminalna, w której myszy są poddawane eutanazji przed odzyskaniem znieczulenia.
1. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Oczyść stół operacyjny i całe otoczenie 70% etanolem. Przed zabiegiem dokładnie oczyść i osusz narzędzia chirurgiczne.</li>
	<li>Znieczulić mysz NG2DsRed (Tg(Cspg4-DsRed.T1)1Akik/J; obie płcie; w wieku 4-8 miesięcy) przez wstrzyknięcie otrzewnowe ketaminy + ksylazyny (60 mg / kg + 10 mg / kg) rozpuszczonych w sterylizowanej wodzie, pH 7,4. Podawać dodatkowe dawki ketaminy (30 mg/kg) co 25 minut aż do zakończenia zabiegu chirurgicznego. Regularnie sprawdzaj odruchy szczypania ogona i palców u stóp, aby zweryfikować głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknij sól fizjologiczną podskórnie w cztery różne miejsca na grzbiecie myszy o łącznej objętości 1 ml, aby zapobiec odwodnieniu podczas eksperymentu. Aby chronić oczy przed wysuszeniem, nałóż lubrykant do oczu. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą sondy temperatury doodbytniczej i koca grzewczego.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Tracheotomii 
	<ol>
		<li>Umieść mysz na plecach. Wstrzyknąć 0,04 ml 0,5% lidokainy podskórnie pod planowane nacięcie i odczekać 2 min. Wykonaj nacięcie o długości 10 mm nad kością piersiową (manubrium). Oddziel gruczoły podżuchwowe i mięśnie mostkowo-tarczowe, a następnie odsłoń tchawicę.</li>
		<li>Wykonaj nożyczkami tracheostomię między dwoma pierścieniami tchawicy. Włóż do tchawicy małą metalową rurkę o długości 16,2 mm i średnicy 1 mm. Podłącz rurkę do respiratora mechanicznego i kapnografu, aby monitorować CO2 pod koniec wydechu (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzenie cewnika
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 0,5% lidokainy (0,04 ml) podskórnie pod planowane nacięcie i odczekać 2 min.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie oddziel tętnicę od żyły. Zatrzymaj przepływ krwi w górę za pomocą zacisku mikronaczyniowego. Zwęź przepływ krwi w dół za pomocą nylonowego szwu 10-0 podwiązującego oba naczynia krwionośne.</li>
		<li>Użyj nożyczek do mikropreparowania, aby wykonać małe nacięcie zarówno w tętnicy, jak i żyle. Włóż plastikowe cewniki do obu naczyń krwionośnych. Zabezpiecz cewniki, zaciskając szwy (szwy nylonowe 8-0 lub 10-0 w zależności od wielkości naczynia) bez uszczerbku dla światła cewnika. Zdejmij zacisk mikronaczyniowy i zamknij skórę.</li>
		<li>Monitoruj ciśnienie krwi za pomocą cewnika tętniczego. Zmierz poziom gazometrii krwi w próbkach krwi tętniczej (50 μl) przed i po każdym eksperymencie (normalne wartości: pO2, 90-120 mmHg; pCO2, 35-40 mmHg; pH, 7,25-7,45) za pomocą analizatora gazometrii krwi. Użyj cewnika dożylnego do infuzji fluoresceiny i znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kraniotomia
	<ol>
		<li>Zgol futro z głowy myszy między uszami. Wstrzyknąć 0,04 ml 0,5% lidokainy podskórnie pod planowane nacięcie i odczekać 2 min.</li>
		<li>Przetrzyj czaszkę za pomocą 10% roztworu chlorku żelaza, aby usunąć okostną. Dokładnie opłucz czaszkę solą fizjologiczną. Przyklej metalową głowicę do czaszki za pomocą kleju cyjanoakrylowego i aktywatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Metalowa belka głowicy ma 75 mm długości i 13,5 mm szerokości, z okrągłym otworem o średnicy 5 mm pośrodku.</li>
		<li>Wywierć kraniotomię o średnicy 4 mm, wyśrodkowaną na 0,5 mm z tyłu i 3 mm na prawo od bregmy nad prawą korą czuciową. Usuń oponę twardą za pomocą rozszerzacza naczyń z cienką końcówką.</li>
		<li>Przykryj odsłoniętą korę 0,75% żelem agarozowym, rozpuszczonym w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF; pH = 7,4) i schłodzonym do 35 °C. Przykryj 80-90% kraniotomii szklanym szkiełkiem nakrywkowym pod kątem 10-15° do metalowej belki głowicy (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B), która umożliwia wprowadzenie i umieszczenie szklanej mikropipety.</li>
		<li>Aby zminimalizować pulsację mózgu, przyklej dwa rogi szklanego szkiełka nakrywkowego do metalowego pręta głowicy za pomocą kleju cyjanoakrylowego i aktywatora. Aktywator należy stosować ostrożnie, aby zapobiec dostaniu się do odsłoniętego mózgu. Następnie dokładnie spłucz przyklejone szklane szkiełko nakrywkowe solą fizjologiczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj włożenie sondy stymulacyjnej podkładki wąsów. Wprowadź zestaw specjalnie wykonanych elektrod bipolarnych (o długości 8 mm i grubości 0,25 mm) przezskórnie po lewej stronie twarzy, aby stymulować ramus infraorbitalis nerwu trójdzielnego przeciwlegle do kraniotomii. Umieść katodę blisko rozworu podoczodołowego i włóż anodę do mięśni żucia7. Stymulację należy wykonywać stymulatorem elektrycznym o natężeniu 1,5 mA przez 1 ms w pociągach trwających 20 s przy 2 Hz.</li>
	<li>Po zakończeniu operacji należy podać bolus 0,05 ml izotiocyjanianu fluoresceiny (dekstran FITC, 4% w/v, masa cząsteczkowa [MW] 50 000) do żyły udowej w celu oznaczenia osocza krwi. Przerwać stosowanie ketaminy i przełączyć znieczulenie na ciągły wlew dożylny α-chloralozy (17% w/v, stężenie końcowe) zmieszanej z dekstranem FITC (2% w/v, stężenie końcowe) w dawce 0,02 ml/10 g/h. Odczekać około pół godziny na ustabilizowanie się nowego stanu znieczulenia. 
	UWAGA: Zarówno FITC-dekstran, jak i α-chloraloza rozpuszcza się w 0,9% soli fizjologicznej.</li>
</ol>
3. Pierwsza sesja obrazowania dwufotonowego
<ol>
	<li>Przenieś mysz do etapu komercyjnego mikroskopu dwufotonowego (tabela materiałów). Zarówno w trybie oświetlenia epifluorescencyjnego czerwonego białka (RFP, <silna klasa="xfig">Rysunek 1C), jak i zielonego białka fluorescencyjnego (GFP, <silna klasa="xfig">Rysunek 1C), zrób zdjęcie odsłoniętej kory za pomocą obiektywu 5x. Użyj zdjęcia z zapytania ofertowego jako "mapy" do włożenia szklanej mikropipety podczas następnej sesji. 
	UWAGA: "Mapa" GFP służy do odróżniania żył/żyłek od tętnic/tętniczek.</li>
	<li>Obrazowanie dwufotonowe można wykonać za pomocą mikroskopu dwufotonowego i obiektywu zanurzeniowego z aperturą numeryczną (NA) o powiększeniu 25x 1,0 z silnikiem piezoelektrycznym. Ustaw długość fali wzbudzenia na 900 nm. Przeszukaj korę mózgową i podążaj za każdą penetrującą tętniczką i znajdź jej poziome gałęzie (naczynia włosowate 1. rzędu).</li>
	<li>Obraz przenikający tętniczki i ich naczynia włosowate 1. rzędu w spoczynku i podczas stymulacji opuszki wąsów. Szczegółowe parametry obrazowania znajdują się w punkcie 5.</li>
	Zaznacz lokalizacje naczyń włosowatych 1. rzędu z >5% rozszerzeniem naczyń krwionośnych podczas stymulacji poduszek wąsów na "mapie" RFP (<silna klasa = "xfig">Rysunek> 1 C).<li> Lokalizacje z <5% rozszerzeniem naczyń krwionośnych są uważane za znajdujące się poza regionem kory beczki wąsów. 
	UWAGA: Jeśli w eksperymencie użyjesz myszy typu dzikiego zamiast myszy NG2DsRed, obraz GFP jest używany jako "mapa".</li>
</ol>
4. Wprowadzenie szklanej mikropipety
<ol>
	<li>Przygotować szklane mikropipety do zaciągania za pomocą ściągacza do pipet (tabela materiałów). Szklane mikropipety mają rezystancję 3-3,5 MΩ i długość stożka 4,5-5 mm. Załaduj do pipety mieszaninę 1 mM ATP i 10 μM Alexa 594 w celu wizualizacji końcówki pipety pod lampą epifluorescencyjną i mikroskopem dwufotonowym.</li>
	<li>Zamontuj szklaną mikropipetę na uchwycie zacisku krosowego i podłącz ją do pompy powietrza. Ustaw ciśnienie docisku pompy na 0 psi.</li>
	<li>Korzystając z czerwonego oświetlenia epifluorescencyjnego, ustaw ostrość na końcówce pipety za pomocą obiektywu 5x. Umieścić szklaną mikropipetę w płynie CSF nad agarozą. Dostosuj ciśnienie dotrzymywania pompy powietrza na 0.2 psi. Można zaobserwować małą czerwoną chmurę wyrzucaną z końcówki pipety w aCSF. Ma to na celu zapobieżenie zatykaniu się podczas wkładania pipety.</li>
	<li>Wybierz jedną z zaznaczonych lokalizacji na "mapie" zapytania ofertowego jako miejsce docelowe. Przesunąć końcówkę pipety do płaszczyzny poziomej krawędzi szkła nakrywkowego w odległości 30 μm, z grubsza wskazując miejsce docelowe w płaszczyźnie x-y.</li>
	<li>Ostrożnie opuść końcówkę pipety w osi z pod szkiełko nakrywkowe. Następnie zacznij przesuwać szklaną pipetę w kierunku miejsca docelowego, aż znajdzie się ~500 μm nad powierzchnią mózgu. Często przełączaj ostrość między krawędzią szkła nakrywkowego, końcówką pipety i powierzchnią mózgu, upewniając się, że jest wystarczająco dużo wolnego miejsca na przesuwanie pipety.</li>
	<li>Przełącz obiektyw na 25x. Wyśrodkuj końcówkę pipety i przesuń końcówkę pipety dalej w kierunku miejsca docelowego na "mapie" zapytania ofertowego. Trzymaj końcówkę pipety w warstwie agarozy.</li>
	<li>Gdy końcówka pipety znajduje się ~100 μm nad powierzchnią mózgu, przełącz tryb obrazowania na mikroskopię dwufotonową. Skoncentruj się na docelowym miejscu, w którym chcesz się zaciągnąć. Zapisz jego współrzędne x, y (x0, y0) i jego głębokość pod powierzchnią (z0). Oblicz współrzędne punktu wstawienia na powierzchni mózgu (xi, yi) w następujący sposób: 
	xi = x0 + z0 / tan θ 
	yi = y0 
	gdzie θ jest kątem między uchwytem na pipety a płaszczyzną poziomą.</li>
	<li>Ustawić końcówkę pipety we współrzędnych (xi, yi) na powierzchni mózgu. Delikatnie i powoli wkładaj pipetę, aż osiągnie (x0, y0, z0). Jeśli naczynie znajduje się na drodze do wprowadzenia pipety, wyjmij pipetę i ponownie oblicz inne współrzędne i ścieżkę wprowadzania; lub lekko obrócić płytkę stage (jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Ustaw ciśnienie dotrzymania pompy na 0 psi, a ciśnienie wyrzutowe na 10-15 psi. Puff ATP przez 200-400 ms w miejscu docelowym podczas obrazowania dwufotonowego. Dostosuj ciśnienie i czas zaciągania dla każdej pipety i w czasie, jak wyjaśniono w sekcji dyskusji.</li>
</ol>
5. Obrazowanie dwufotonowe Hyperstack 
<ol>
	<li>Wykonuj eksperymenty przy użyciu mikroskopu dwufotonowego i obiektywu zanurzeniowego w wodzie 25 x 1,0 NA z silnikiem piezoelektrycznym. Ustaw długość fali wzbudzenia na 900 nm. Przefiltruj emitowane światło, aby zebrać czerwone światło z DsRed (perycyty)/tetrametylorodaminy izotiocyjanian-dekstran (TRITC-dektran) barwiące osocze krwi i zielone światło z FITC-dekstranu (osocze krwi)/GCaMP6 (GFP, wapń astrocytowy).</li>
	<li>Wytwórz stos z o wysokiej rozdzielczości w miejscu zainteresowania zawierającym tętniczkę penetrującą, kapilarnę 1.rzędu, kapilarnę 2. rzędu i ewentualnie sąsiednie komórki fluorescencyjne (np. perycyty, astrocyty). Określ objętość x*y*z obrazowania hyperstack, uwzględniając strukturę 3D naczyń krwionośnych w jak największym stopniu. Całkowita wysokość każdego stosu może wahać się od 30-50 μm, podczas gdy płaszczyzna x-y obejmuje w przybliżeniu obszar 60 μm x 40 μm.</li>
	<li>Ustaw stos obrazów w oprogramowaniu do obrazowania tak, aby składał się z 8-10 płaszczyzn z odległością między płaszczyznami 4-5 μm. Obiektyw piezomotoryczny zatrzymuje się na każdym poziomie na osi z, aby uzyskać obraz każdej płaszczyzny. Częstotliwość próbkowania wynosi 1 s na stos, a rozdzielczość pikseli w płaszczyźnie x-y wynosi 0,2-0,3 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Jedno nagranie zwykle zawiera 10 stosów obrazów przed zaciągnięciem i 150 stosów obrazów po zaciągnięciu.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Przetwarzaj dane za pomocą dedykowanego oprogramowania analitycznego. Spłaszcz każdy stos obrazów w jeden obraz za pomocą projekcji o maksymalnej intensywności (Rysunek 2B). Narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) o szerokości 3 μm prostopadle w poprzek interesującego Cię naczynia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Aby zminimalizować zakłócenia spowodowane cieniami czerwonych krwinek i niewielkimi drganiami kory mózgowej, uśrednij prostokątny ROI, rzutując go na jedną linię, która następnie reprezentuje średni profil segmentu naczynia. Zrób to dla każdego obrazu o maksymalnej intensywności.</li>
	<li>Wykreśl linie profilu jako obraz 2D z osią x reprezentującą obrazy o maksymalnej intensywności w porządku chronologicznym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D, górny panel). Użyj aktywnego algorytmu konturu (segmentacja Chan-Vese), aby znaleźć krawędzie naczynia8,9 (oznaczone czerwonymi krzywymi; <silna klasa="xfig">Rysunek 2D, górny panel).</li>
	<li>Oblicz przebieg czasowy zmian średnicy jako różnicę między krawędziami naczynia krwionośnego (pionowa odległość między górną i dolną czerwoną krzywą w <silna klasa="xfig">Rysunek 2D, dolny panel). Normalizowanie zmian średnicy do linii bazowej średnicy przed zaciąganiem i wykreślanie krzywych zmian średnicy w czasie. Zrób to dla każdego ROI (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Amplituda odpowiedzi naczynia jest definiowana jako najwyższa/najniższa amplituda piku po zaciągnięciu. Opóźnienie odpowiedzi definiuje się jako opóźnienie o połowie maksymalnej amplitudy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G). Ręcznie prześledź szkieletową strukturę naczyniową, umieszczając węzły wzdłuż naczyń (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F) i mierząc odległość geograficzną między każdym ROI a tętniczką penetrującą. Oblicz prędkość CVR, dzieląc odległości przez różnice opóźnień.</li>
</ol>
7. Wstrzyknięcie wektora wirusowego
<ol>
	<li>W celu jednoczesnego zbadania astrocytarnych odpowiedzi wapniowych, wstrzyknąć objętość 0,6 μl wektora wirusowego (pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f, Addgene) do kory somatosensorycznej myszy NG2DsRed, postępując zgodnie ze standardową procedurą wstrzykiwania stereotaktycznego wektora wirusowego10.</li>
	<li>Po trzech tygodniach astrocyty w korze somatosensorycznej myszy wykazują ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, GCaMP6f. Postępuj zgodnie z wyżej wymienioną procedurą chirurgiczną i obrazowaniem dwufotonowym dla myszy. Aby odróżnić astrocyty od luminy naczynia, do barwienia światła naczynia na czerwono stosuje się dekstran TRITC zamiast dekstranu FITC.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li>
<li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li>
<li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li>
<li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Communication+and+Image+Representation%22%5BJournal%5D)">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787(2014).</li>
<li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2%2B+Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li>
<li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726(2018).</li>
<li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+%28Scape%29+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z wyzwań związanych z badaniami naczyniowymi jest precyzyjny pomiar średnic naczyń. Metoda, którą tutaj opisujemy, wykorzystywała zmotoryzowany obiektyw piezoelektryczny do szybkiego i powtarzalnego obrazowania hiperstosu za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Po pierwsze, metoda ta pozwala na wielokrotne badanie tętniczki penetrującej, naczyń włosowatych 1. i 2. rzędu bez utraty ostrości i doprowadziła do odkrycia wolno prowadzonych odpowiedzi naczyniowych w naczyniach włosowatych in vivo. Po d...

Mózg ma wysoki wskaźnik zużycia energii. Około 20% tlenu i 25% glukozy zużywanych przez ludzkie ciało jest przeznaczone do funkcjonowania mózgu, podczas gdy mózg zajmuje tylko 2% całkowitej masy ciała. Utrzymanie prawidłowego funkcjonowania mózgu wymaga wystarczającego i wydajnego zaopatrzenia w tlen i składniki odżywcze poprzez przepływ krwi w złożonej sieci naczyń. Lokalna aktywność mózgu i mózgowy przepływ krwi (CBF) są silnie sprzężone, w zależności od właściwości funkcjonalnych neuronów, astrocytów, perycytów, komórek mięśni gładkich (SMC) i komórek śródbłonka (EC)1. Ostatnio kilka pierwszych rzędów naczyń włosowatych rozgałęziających się od przenikających tętniczek pojawiło się jako "gorący punkt" 2, wykazując aktywną regulację przepływu krwi w naczyniach włosowatych. Powolna przewodzona odpowiedź naczyniowa (CVR) została odkryta w tym "gorącym punkcie" w korze somatosensorycznej myszy zarówno podczas stymulacji wąsów, jak i miejscowego wyrzucania (zaciągania się) ATP za pomocą szklanej mikropipety3.
Chociaż obrazowanie in vivo za pomocą dwufotonowej mikroskopii fluorescencyjnej było szeroko stosowane do badania reakcji nerwowo-naczyniowych w korze mózgowej, większość badań mierzyła średnice naczyń krwionośnych i badała ich regulację w dwuwymiarowej (2D) płaszczyźnie x-y. Wyzwania są następujące: Po pierwsze, mózgowe naczynia krwionośne i obejmujące je astrocyty, perycyty i SMC budują gałęzie w trzech wymiarach (3D). Dlatego tak ważne jest badanie ich interakcji w 3D. Po drugie, nawet niewielki dryf ostrości wpłynie na precyzyjny pomiar zarówno średnic naczyń, jak i komórkowych sygnałów fluorescencyjnych. Wreszcie, CVR-y są szybkie i dalekosiężne w trzech wymiarach. Skanowanie objętościowe 3D jest optymalne do wykrywania CVR i ujawniania ich mechanizmów. Wdrożyliśmy obiektyw piezoelektryczny w mikroskopie dwufotonowym do badania kory somatosensorycznej myszy in vivo, umożliwiając precyzyjne pomiary średnicy poprzez projekcje maksymalnej intensywności uzyskanych obrazów.
Szklane mikropipety były często używane do badań in vivo mózgu, np. do masowego ładowania barwników organicznych4, zapisu EEG5 oraz do zaciskania kropek6. Niemniej jednak ograniczenia pozostają. Zazwyczaj końcówka szklanej mikropipety jest umieszczona nieprecyzyjnie lub mikropipeta nie jest używana do interwencji miejscowych. W tym miejscu zoptymalizowaliśmy procedurę wprowadzania mikropipet i miejscowego wyrzucania.
Ponadto, połączenie dwufotonowej mikroskopii 3D i genetycznie kodowanych wskaźników fluorescencyjnych oferuje bezprecedensową możliwość zbadania sprzężenia nerwowo-naczyniowego w zakresie 3D. W tym badaniu wykorzystaliśmy to i wstrzyknęliśmy wektory wirusowe przenoszące genetycznie kodowane wskaźniki wapnia specyficzne dla astrocytów do kory somatosensorycznej myszy. Astrocyty oraz średnice naczyń zostały zobrazowane jednocześnie, łącząc różne markery fluorescencyjne.
Ogólnie rzecz biorąc, prezentujemy zoptymalizowaną metodę lokalnego wyrzucania (zaciągania się) za pomocą szklanej mikropipety oraz szybkie dwufotonowe obrazowanie hiperstosu, które pozwala na precyzyjny pomiar zmian średnicy kapilarnej. Ponadto nasza metoda zapewnia nowatorskie narzędzie do jednoczesnego badania profili 3D odpowiedziCa2+ w astrocytach i odpowiedzi średnicy naczyń krwionośnych.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>A6138</td><td>Nakładaj na odsłoniętą korę w celu ochrony</td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-10438</td><td>Barwnik do czerwonego koloru fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Środek rozszerzający naczynia krwionośne i zwężający naczynia krwionośne, środek do zaciągania</td></tr> się <tr><td>Klej i aktywator cyjanoakrylanu</td><td>Kleje Loctite</td><td>i SF7452</td><td>Klej do elementu metalowego i szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>Oko lubrykant</td><td>Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Dania</td><td></td><td>Utrzymuj nawilżenie oczu myszy</td></tr><tr><td>FITC-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD500S</td><td>Barwnik surowicy krwi, zielony kolor fluorescencyjny</td></tr><tr><td>NG2DsCzerwone myszy Jackson</td><td>Laboratory</td><td>8241</td><td>Te transgeniczne myszy wyrażają wariant białka czerwonej fluorescencji (DsRed) pod kontrolą mysiego promotora NG2 (Cspg4)</td></tr><tr><td>pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td><td>Addgene</td><td>52924-AAV5</td><td>Wektory wirusowe specyficzne dla astrocytów przenoszące genetycznie kodowane wskaźniki wapnia</td></tr><tr><td>TRITC-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52194</td><td>Barwnik surowicy krwi, czerwony kolor fluorescencyjny</td></tr> <tr><td>< silny>Lista urządzeń< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td>Daj ciśnienie powietrza do zaciągania pipety</td></tr><tr><td>Analizator gazometrii Radiometr</td><td></td><td>ABL 700</td><td>Pomiar parametrów gazometrycznych krwi&nbsp;</td></tr><tr><td>Ciśnieniomierz</td><td>World Precision Instruments</td><td>BP-1</td><td>Monitor ciśnienia krwi pod</td></tr> ciśnieniem <tr><td>Regulator temperatury ciała</td><td>CWE</td><td>Model TC-1000</td><td>Utrzymuj temperaturę ciała myszy w zakresie fizjologicznym</td></tr><tr><td>Capnograph</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Typ 340</td><td>Monitoruj końcowo-wydechowy CO2 od myszy</td></tr><tr><td>Stymulator elektryczny</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISO-flex</td><td>Zastosuj stymulację poduszki wąsów</td></tr><tr><td>Wentylator mechaniczny</td><td>Aparat Harvard</td><td>D-79232</td><td>Mechanicznie wentylować mysz w zakresie fizjologicznym</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Femtonics Ltd</td><td>Femto3D-RC</td><td></td></tr><tr><td>Lista narzędzi chirurgicznych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta anatomiczna&nbsp;</td><td>Lawton</td><td>09-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta kątowa i zrównoważona</td><td>S& T AG</td><td>00595 FRAS-18 RM-8</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysa</td><td>Lawton</td><td>05-1450</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk mikronaczyniowy</td><td>S& T AG</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Mysie cewniki naczyniowe</td><td>Verutech</td><td>100828</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut atp za pomocą szklanej mikropipety

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Utrzymanie prawidłowego funkcjonowania mózgu wymaga wystarczającego i wydajnego dostarczania tlenu i składników odżywczych przez złożoną sieć naczyń. Jednak regulacja przepływu krwi w mózgu (CBF) nie jest w pełni zrozumiała, zwłaszcza na poziomie naczyń włosowatych. Mikroskopia dwufotonowa jest potężnym narzędziem szeroko stosowanym do badania CBF i jego regulacji. Obecnie pole to jest ograniczone przez brak badań in vivo z użyciem mikroskopii dwufotonowej badających (1) odpowiedzi CBF w trzech wymiarach, (2) przeprowadzone odpowiedzi naczyniowe oraz (3) interwencje miejscowe w sieci naczyniowej. W tym miejscu opisujemy metodę 3D in vivo wykorzystującą mikroskopię dwufotonową do badania przeprowadzonych odpowiedzi naczyniowych wywołanych przez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety. Nasza metoda wykorzystuje szybkie i powtarzalne obrazowanie dwufotonowe hyperstack, zapewniając precyzyjne pomiary średnicy poprzez projekcję maksymalnej intensywności uzyskanych obrazów. Ponadto pokazujemy, że ta metoda może być również wykorzystana do badania 3D astrocytarnych odpowiedzi wapniowych. Omówiono również zalety i ograniczenia wprowadzania szklanych mikropipet i obrazowania dwufotonowego hiperstosu.

Po zakończeniu zabiegu myszy przetransportowano do mikroskopu dwufotonowego (Rycina 1A). Szklaną mikropipetę zawierającą 1 mM ATP wprowadzono w pobliże docelnego naczynia krwionośnego w wyznaczonym miejscu (Rycina 1B).
Wykonaliśmy obrazowanie w trybie hyperstack podczas podawania impulsu 1 mM ATP (Rycyna 2A, Wideo uzupełniające 1). Każdy ...

Prezentujemy zoptymalizowaną procedurę miejscowego wyrzucania za pomocą szklanej mikropipety i szybkiej metody obrazowania dwufotonowego hiperstosu, która pozwala na precyzyjny pomiar zmian średnicy kapilary i badanie jej regulacji w trzech wymiarach.

Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Protokół ten ma na celu badanie powolnych reakcji naczyniowych w naczyniach włosowatych mózgu wywołanych przez miejscowy wyrzut ATP. Zaletą tej techniki jest symulowanie lokalnych aktywności synaptycznych poprzez miejscowy wyrzut pipety i utrzymywanie ostrości na skąpym naczyniu za pomocą mikroskopii dwufotonowej 3D. Metoda ta może być również stosowana do badania nerwiaka mózgowego i aktywności glejowej w spoczynku i po stymulacji w trzech wymiarach. Procedurę zademonstruje Michael L

in-vivo-three-dimensional-two-photon-microscopy-to-study-conducted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Mikrojontoforeza polega na przemieszczaniu jonów z mikropipety w odpowiedzi na różnicę potencjałów elektrycznych między wnętrzem a zewnętrzem mikropipety. Dzięki temu cząsteczki biologicznie czynne są dostarczane proporcjonalnie do natężenia prądu elektrycznego. Przedstawiamy mikrojontoforezę acetylocholiny w połączeniu z mikromanipulacją w celu zbadania rozszerzenia naczyń zależnego od śródbłonka w mikrokrążeniu.

Mikrojontoforeza i mikromanipulacja w obrazowaniu fluorescencyjnym mikrokrążenia in vivo

W tym artykule przedstawiamy metodę analizy mikronaczyń guza in vivo za pomocą dynamicznej wideomikroskopii fluorescencyjnej wzmocnionej kontrastem. Uzyskano dwa parametry ilościowe: funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych odzwierciedlającą unaczynienie guza oraz nieszczelność wskaźnika odzwierciedlającą nieszczelność ściany śródbłonka.

In vivo (in vivo) Obrazowanie angiogenezy guza za pomocą fluorescencyjnej wideomikroskopii konfokalnej

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj trójwymiarową mikroskopię dwufotonową do badania odpowiedzi naczyniowych w kapilarach mózgowych po lokalnym wyrzucie ATP. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary zmian średnicy naczyń w trzech wymiarach.

Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety

Przeglądaj więcej filmów