Trójwymiarowa mikroskopia dwufotonowa in vivo do badania przeprowadziła odpowiedzi naczyniowe poprzez miejscowy wyrzut ATP za pomocą szklanej mikropipety

Znaczenie dla przemysłu

Metoda ta umożliwia precyzyjny pomiar trójwymiarowy zmian średnicy naczyń włosowatych w odpowiedzi na lokalną emisję ATP, zapewniając fizjologicznie istotny model do badania mechanizmów sprzężenia naczyniowo-nerwowego. Poprzez symulowanie lokalnej aktywności synapycznej i rejestrowanie przewodzonych odpowiedzi naczyniowych w kapilarach mózgowych, wspiera ona walidację celów w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na OUN, gdzie regulacja naczyniowa wpływa na dostarczanie i skuteczność leków. Podejście to minimalizuje ryzyko związane z hipotezami mechanistycznymi dotyczącymi regulacji przepływu krwi w modelach przedklinicznych, oferując ilościowe i powtarzalne wyniki funkcji naczyniowych.

Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym

Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu

• Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących sprzężenia naczyniowo-nerwowego oraz szlaków sygnalizacyjnych zależnych od ATP w kapilarach mózgowych.
• Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację receptorów naczyniowych i kanałów jonowych poprzez lokalne podawanie agonistów oraz pomiar średnicy naczyń w czasie rzeczywistym.
• Wartość prognostyczna: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z odpowiedziami naczyniowymi w trójwymiarowym systemie istotnym dla przebiegu choroby.

Przesiewanie i opracowywanie testów

• Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszego przesiewu związków poprzez ustalenie podstawowej reaktywności naczyniowej na ATP.
• Wyniki ilościowe: Zapewnia precyzyjne i powtarzalne pomiary średnicy naczyń włosowatych za pomocą maksymalnej projekcji intensywności obrazowania dwufotonowego w formie hyperstack.
• Skalowalność i ponowne wykorzystanie: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w badaniach nad aktywnością gleju, funkcją synaptyczną i regulacją naczyniową przy minimalnej adaptacji protokołu.

Badania translacyjne i przedkliniczne

• Znaczenie chorobowe: Modeluje przewodzone odpowiedzi naczyniowe na poziomie kapilarnym, które są kluczowe dla zrozumienia hipoperfuzji w stanach neurodegeneracyjnych i niedokrwiennych.
• Ciągłość translacyjna: Łączy mechanistyczne spostrzeżenia z fazy odkryć z przedkliniczną walidacją celów naczyniowych wpływających na funkcję bariery krew-mózg.
• Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie efektów zaangażowania celu w dynamikę naczyniową w fizjologicznie nienaruszonych sieciach.

Integracja potoku i przepływu pracy

Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po optymalizację związku wiodącego, szczególnie w przypadku terapeutyków celowanych w OUN, gdzie odpowiedź naczyniowa pozwala przewidzieć ekspozycję tkankową oraz skuteczność.

• Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących receptorów GPCR i kanałów jonowych zaangażowanych w sygnalizację naczyniowo-nerwową poprzez analizę lokalnego wyrzutu ATP oraz zmian średnicy naczyń.
• Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów służących do oceny wpływu związków na dynamikę naczyń włosowatych w trzech wymiarach.
• Analityka: Dostarcza ilościowych wskaźników odpowiedzi naczyniowej, które pozwalają na porównywanie różnych warunków i efektów działania związków.
• Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane na poziomie naczyń włosowatych z modelami przedklinicznymi regulacji mózgowego przepływu krwi oraz oddziaływań glia-naczynia.
• Wykorzystanie w organizacji: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i mikroiniekcji do długofalowych badań nad mechanizmami naczyniowo-nerwowymi w ramach wielu projektów.

Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy

• Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności w powiązaniach mechanistycznych między aktywnością neuronalną a odpowiedzią naczyniową.
• Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki obrazowaniu typu hyperstack oraz precyzyjnemu dozowaniu za pomocą mikropipety, co minimalizuje zmienność zależną od operatora.
• Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka związanego z celami naczyniowymi, redukując niepowodzenia w późnych etapach wynikające z niewystarczającej ekspozycji w mózgu.
• Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane efekty dotyczące przewodnictwa naczyń włosowatych i regulacji przepływu krwi.

Wskazówki dotyczące wdrożenia

• Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii dwufotonowej, mikromanipulacji oraz obrazowania naczyniowego in vivo.
• Zależy od dostępu do skaningowych mikroskopów laserowych z możliwością strojenia, zdolnych do akwizycji hiperstosów oraz szybkiego śledzenia w osi z.
• Konieczna jest standaryzacja parametrów wyrzutu ATP oraz kryteriów wyboru naczyń pomiędzy operatorami i ośrodkami.
• Wymaga rozważenia adaptacji dla różnych modeli zwierzęcych, łożysk naczyniowych i strategii znakowania fluorescencyjnego.
• Ograniczone przez wyzwania techniczne związane z utrzymaniem ostrości naczynia podczas wprowadzania mikropipety oraz konieczność zapewnienia czasu na rekonwalescencję pooperacyjną.

Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji