Name: Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj hybrydową elektroforezę przezroczystą/niebieską natywną do separacji superkompleksów mitochondrialnych. Ta metoda minimalizuje ekspozycję na detergenty i Coomassie Blue, zachowując aktywność enzymów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jennie Rossi za pomoc techniczną, a także dr Mireille Khacho, dr Davidowi Pattenowi i dr Ujvalowi Anilowi Kumarowi za pomocną dyskusję podczas opracowywania tej metody. Prace te zostały sfinansowane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) oraz Narodową Radę Nauk i Inżynierii Kanady (NSERC). AC jest laureatem Nagrody Doktorskiej - Frederick Banting i Charles Best Canada Graduate Scholarships (CIHR).

1. Ekstrakcja SC
<ol>
	<li>Przygotować 100 ml buforu ekstrakcyjnego (patrz Tabela 2) rozpuszczając EDTA w wodzie. Zwiększ pH za pomocą KOH aż do całkowitego rozpuszczenia, a następnie dostosuj pH do 7,5 za pomocą HCl. Dodaj pozostałe składniki do roztworu, uzupełnij do końcowej objętości wodą i trzymaj na lodzie. W probówce rozpuść digitoninę w buforze ekstrakcyjnym, aby uzyskać 10% roztwór podstawowy, dokładnie zmieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia i trzymaj na lodzie. 
	UWAGA: Bufor ekstrakcyjny można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 miesiące. Jeśli na dnie żelu zaczną pojawiać się faliste pasma, oznacza to, że bufor ekstrakcyjny jest zbyt stary. Przygotowując 10% roztwór digitoniny, należy przygotować objętość wywaru liczącą 500 μl na próbkę, jeśli używasz mitochondriów wątroby myszy. Rozpuszczalność digitoniny różni się w zależności od pochodzenia i partii produktu (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Mitochondria wyizolowane z tkanek zwierzęcych (mysie serce, mięśnie, wątroba; serce szczura) lub komórek (ludzkie fibroblasty) przy użyciu standardowych protokołów23,24,25 mogą być używane do ekstrakcji SCs. Po uzyskaniu mitochondriów należy określić ilościowo zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego zgodnie z zaleceniami producenta. W razie potrzeby uzupełnij izolowane mitochondria w proteazy i inhibitory fosfataz na tym etapie. 
	UWAGA: SC mogą być ekstrahowane zarówno na świeżych, jak i rozmrożonych mitochondriach. Zaleca się ekstrakcję SC ze wszystkich próbek w tym samym czasie, aby upewnić się, że są one traktowane tymi samymi partiami roztworów i w tych samych warunkach.</li>
	<li>Na podstawie uzyskanego stężenia białka mitochondrialnego i pożądanego ostatecznego stosunku digitoniny do białka, należy obliczyć wymaganą objętość podstawowego roztworu digitoniny i buforu ekstrakcyjnego zgodnie z tabelą 1. W przypadku ekstrakcji SC dodać 1 μl buforu ekstrakcyjnego (Tabela 2) zawierającego digitoninę na każde 10 μg białka mitochondrialnego. Stosunek digitoniny do białka może wahać się od 2 do 8 g/g. Miareczkowanie digitoniny powinno być zawsze wykonywane dla każdego nowego rodzaju użytej próbki (patrz <silna klasa = "xfig" > rysunek 2 dla przykładu).</li>
	<li>Mitochondria osadu w probówce o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić mitochondrialny osad w obliczonej objętości lodowatego buforu ekstrakcyjnego zawierającego digitoninę. Umieścić probówki na mini rotatorze probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy średniej prędkości obrotowej. Upewnij się, że próbki są odpowiednio wymieszane.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 20 400 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych fragmentów.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki na lód i określić ilościowo białka. Frakcja ta reprezentuje ekstrakt z superkompleksów oddechowych. Jeżeli elektroforeza nie zostanie przeprowadzona tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: 1) Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania ekstraktu, ponieważ zakłóca to wyższe układy molekularne SC. W razie potrzeby podwielokrotną próbkę należy wykonać przed pierwszym cyklem zamrażania/rozmrażania. 2) Aby przeprowadzić standardowy eksperyment BN-PAGE, na tym etapie należy dodać CB do ekstraktu SCs. CB należy dodawać w proporcji 1g/8g w stosunku do ilości użytego detergentu.</li>
</ol>
2. Gradientowe odlewanie żelowe i elektroforeza
<ol>
	<li>Przygotować 3 razy bufor gradientowy i zapasy akryloamidu do przygotowania żelu gradientowego, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C (patrz Tabela 3).</li>
	<li>Przygotować anodowe i katodowe i utrzymywać je w temperaturze 4 °C (patrz tabela 5).</li>
	<li>Otwórz komorę odlewu i umieść w niej zewnętrzną szklaną płytkę (20 cm x 22 cm). Ustaw jeden zestaw przekładek (1.5 mm) za pomocą karty wyrównowania, aby upewnić się, że są mocno osadzone z boku i rogów komory. Umieść wewnętrzną szklaną płytkę (20 cm x 20 cm) na podkładkach dystansowych (tworzy to kanapkę z żelem) i połóż plastikowy arkusz rozdzielający na szklanej płycie.</li>
	<li>Powtarzaj krok 2.3, aż do osiągnięcia żądanej liczby żeli do odlania. W tym protokole odlewane są 4 żele. Stosowany przez nas system komór odlewniczych (patrz Tabela Materiałów) pozwala na odlewanie jednorazowo maksymalnie 10 żeli. Zajmij pozostałą przestrzeń w komorze, dodając najpierw tyle bloków akrylowych, ile potrzeba, a następnie szklane płytki, jeśli to konieczne. 
	UWAGA: Montaż musi być szczelnie zamknięty; Pomiędzy kanapkami z żelem w komorze nie powinno być żadnej przestrzeni.</li>
	<li>Umieść pasek parafilmu w rowku przed mocnym osadzeniem uszczelki w wycięciu uszczelki. Umieść płytkę uszczelniającą na komorze i dokręć wszystkie 6. Postaw komorę odlewniczą.</li>
	<li>Umieścić gradient formujący na płycie mieszającej z mieszadłem magnetycznym w "lekkiej" komorze mieszania. Podłącz rurkę komory odlewniczej do formownika gradientowego, zabezpiecz rurkę w kasecie pompy perystaltycznej i upewnij się, że zawór odcinający formy gradientowej jest zamknięty.</li>
	<li>Aby odlać 4 żele, należy przygotować 60 ml 4% i 60 ml 12% roztworów żelu (patrz Tabela 4) w kolbie Erlenmeyera i dokładnie zamieszać do wymieszania. Wlać 60 ml 4% roztworu żelu do "lekkiej" komory mieszania i 60 ml 12% do "ciężkiej" komory zbiornika gradientu. Ustaw prędkość mieszania płytki mieszającej na 350 obr./min. Otwórz kran i włącz pompę przy 35 obr./min.</li>
	<li>Gdy frakcja lekka jest niższa niż frakcja ciężka, zatrzymaj pompę i otwórz trzpień zaworu między zbiornikami "lekkimi" i "ciężkimi", pozwól, aby objętość frakcji się zrównoważyła i uruchom ponownie pompę. 
	UWAGA: Ważne jest, aby żadne pęcherzyki nie dostały się do systemu i nie zostały uwięzione między szklanymi płytkami. Jeśli tak się stanie, cofnij montaż, umyj i ponów nawóz.</li>
	<li>Gdy żel gradientowy zostanie całkowicie wylany, zatrzymaj pompę i nalej wodę (około 1 ml) na każdą kanapkę z żelem, aby zapobiec wysuszeniu żelu. Pozostaw do polimeryzacji na 2 godziny.</li>
	<li>Przygotować 25 ml żelu do układania w stos w Erlenmeyer i zamieszać do dokładnego wymieszania. Usuń wodę i włóż 15 grzebieni do każdej kanapki z żelem. Wlać żel do układania w stos i pozostawić do polimeryzacji przez 2 godziny 
	UWAGA: Żele można odlewać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.</li>
	<li>Włóż żel do zacisków kanapkowych i wyjmij grzebień. Trzymając krótką szklaną płytkę skierowaną w dół, włóż kanapkę z żelem do rdzenia chłodzącego. Powtórz po drugiej stronie i umieść rdzeń w zbiorniku do elektroforezy.</li>
	<li>Wlej 300 ml buforu z niebieską katodą do wewnętrznej komory zbiornika do elektroforezy. Wlej 2 litry buforu anodowego do zewnętrznej komory zbiornika do elektroforezy. 
	UWAGA: Elektroda musi być zanurzona w buforze katody, co wymaga około 300 ml.</li>
	<li>Załaduj od 75 μg do 175 μg białka na studzienkę. Uruchomić żel pod napięciem 150 V przez 1,5 godziny (lub do momentu, gdy wszystkie próbki dostaną się do żelu gradientowego) w chłodni (4 °C). 
	UWAGA 1: 1) Minimum 75 μg na studzienkę jest wymagane dla dobrej rozdzielczości pasm aktywności w żelu. Obciążenie ponad 175 μg białka doprowadzi do utraty czystych prążków z powodu nadmiernej aktywności enzymów. 2) Powtórzenia próbki należy załadować do oddzielnych studzienek, aby umożliwić równoległe oznaczanie aktywności w żelu i analizę immunoblot kompleksów OXPHOS. Równoległe oznaczanie IGA dla CI, CII, CIV i CV wymaga minimum 300 μg. Równoległa analiza immunoblot CI, CII, CII, CIV i CV wymaga minimum 375 μg.</li>
	<li>Usuń bufor z niebieską katodą za pomocą pipety lub próżni, zastąp 300 ml buforem katodowym Coomassie Blue-free i uruchom żel pod napięciem 200 V przez noc (16–20 h) w chłodni (4 °C). Przejdź do kroku 3 lub 4, aby zmierzyć aktywność w żelu lub immunoblotting.</li>
</ol>
3. Aktywność w żelu dla kompleksów I, II, IV i CV
<ol>
	<li>Przed zakończeniem elektroforezy należy przygotować aktywności w żelu zgodnie z tabelą 6 i przechowywać w ciemności w temperaturze RT. 20 ml buforu aktywności w żelu wystarcza na 3 pasy próbki. 
	UWAGA: Ten test aktywności CV w żelu opiera się na odwrotnej aktywności syntazy ATP (tj. hydrolizie ATP) i wykorzystuje wapń jako kofaktor, który wytrąca się w żelu. Wapń jest mniej szkodliwy niż ołów stosowany w innych protokołach. Ponadto korzystanie z tego protokołu nie wymaga wstępnej aktywacji/kondycjonowania gel23.</li>
	<li>Przerwij elektroforezę i odzyskaj żel. W razie potrzeby przetnij pasy i przenieś pasy żelu w plastikowych torbach (przecięte z 3 stron i plastikowa torba otwarta jak książka). Uszczelnij 2 z 3 stron za pomocą zgrzewarki. 
	UWAGA: Aby porównać skład prążków SC między grupami eksperymentalnymi, zaleca się przeprowadzenie tych samych próbek w powtórzeniach na tym samym żelu. Przeciąć pasy, aby inkubować każdą kontrpróbę w różnych aktywności w żelu (CI, II, IV, V). Aby potwierdzić specyficzność testów, można przygotować dodatkowe kontrpróby, które będą działać w żelu w obecności określonych inhibitorów łańcucha oddechowego.</li>
	<li>W przypadku 3 próbek eksperymentalnych (tj. 3 studzienek) dodaj 20 ml buforu aktywności w żelu, usuń pęcherzyki i zamknij4-tą stronę plastikowej torby. 
	UWAGA: Dodać inhibitory w eksperymentach kontroli ujemnej, jeśli są wykonywane: CI: Rotenon 1 μM; CII: Malonian sodu 10 mM; CIII: Antymycyna-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomycyna 0,5 μM.</li>
	<li>Inkubować paski żelu w temperaturze 37 °C w ciemności i sprawdzać co 15 minut. Czas inkubacji różni się w zależności od ilości białka i kompleksów. CI zareaguje szybciej niż CIV lub CV. Optymalne barwienie następuje zwykle po 2 godzinach dla CI, 4 h dla CIV i 6 h dla CII i CV.</li>
	<li>Spłucz pasy żelu w wodzie, aby zatrzymać reakcję, i obraz na białym tle dla CI, CII, CIV lub czarnym tle dla CV. 
	UWAGA: Żele można przechowywać w plastikowych torebkach w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
4. Immunoblotting
<ol>
	<li>Przygotować bufor transferowy zgodnie z tabelą 7 i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować TBST i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść cały żel lub wybrane tory w pojemniku i dodaj bufor transferowy uzupełniony SDS (0,25% ostatecznie w buforze transferowym). Umieść pojemnik na bujaku i inkubuj przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przeciąć membranę PVDF (wielkość odpowiadającą wielkości żelu) i aktywować w 20 ml metanolu pod wpływem mieszania przez 2 minuty. Zastąp 20 ml buforu transferowego i poddaj mieszaniu na 2 minuty.</li>
	<li>Przygotuj kanapkę transferową, od dołu do góry, upewniając się, że nie ma pęcherzyków między żelem a aktywowaną membraną PVDF: przezroczysta strona kasety / gąbka / bibuła / membrana / żel / bibuła / gąbka / strona kasety. Zamknij i zablokuj kasetę.</li>
	<li>Umieść kanapkę transferową w zbiorniku transferowym, przezroczystą stroną kanapki skierowaną w stronę czerwonej strony elektrody i wlej bufor transferowy, aby zanurzyć żel. Podłączyć układ chłodzenia do zbiornika transferowego i ustawić na 4 °C. Podłączyć do zasilania, ustawić na 40 mA i pracować przez 24 godziny.</li>
	<li>Pobrać błony, blokować przez 1 godzinę w 5% BSA w TBST i inkubować w roztworze przeciwciał pierwotnych przygotowanym w 5% BSA w TBST przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Patrz Tabela 8 dla zastosowanych przeciwciał.</li>
	<li>Płukać membrany w TBST 3x przez 10 min każda.</li>
	<li>Inkubować błony w drugorzędowych roztworach przeciwciał przygotowanych w 5% BSA w TBST przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płukać membrany w TBST 3x przez 10 min każda.</li>
	<li>Dodaj roztwór chemiluminescencyjny do membran i obrazu.</li>
</ol>
5. Analiza
<ol>
	<li>Do analizy SC można wykorzystać obrazy testowe aktywności w żelu lub immunobloty. Aby przeanalizować skład prążków, wyrównaj replikaty i sprawdź, który kompleks zareagował pozytywnie dla każdego danego pasma.</li>
	<li>Aby przeanalizować rozkład kompleksów w różnych złożeniach supramolekularnych, otwórz obrazy w ImageJ i użyj narzędzia do analizy Gel (patrz Rysunek 5 dla przykładu).
	<ol>
		<li>Wybierz pasy ruchu za pomocą narzędzia Prostokąt i wykreśl pasy.</li>
		<li>Narysuj linie, aby zamknąć obszar pod krzywą każdego interesującego pasma i kliknij każdy obszar za pomocą narzędzia różdżki, aby wygenerować tabelę zawierającą wartości obszaru pod krzywą.</li>
		<li>Aby obliczyć rozkład kompleksu, należy podać wartości dla każdego pasma w stosunku do monomeru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Chain+Supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Respiratory Chain Supercomplexes.</a> IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Respiratory+Chain+Supercomplex+Formation+in+Response+to+Exercise+in+Human+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle.</a> Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enigma+of+the+Respiratory+Chain+Supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes%3A+structure%2C+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly.</a> Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+Assembly+Determines+Electron+Flux+in+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nuclear+DNA-encoded+subunits+into+mitochondrial+complex+IV%2C+and+their+preferential+integration+into+supercomplex+forms+in+patient+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria.</a> The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).</li>
<li>Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Type-Specific+Modulation+of+Respiratory+Chain+Supercomplex+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).</li>
<li>D'Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+chain+supercomplexes+set+the+threshold+for+respiration+defects+in+human+mtDNA+mutant+cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids.</a> Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).</li>
<li>Antoun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+and+supercomplex+assembly+in+rectus+abdominis+muscle+of+diabetic+obese+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals.</a> Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).</li>
<li>Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+Fibrillation+Is+Associated+With+Impaired+Atrial+Mitochondrial+Energetics+and+Supercomplex+Formation+in+Adults+With+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes.</a> Canadian Journal of Diabetes. , (2018).</li>
<li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Are+Destabilized+in+Barth+Syndrome+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients.</a> Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Jang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+Supercomplexes+in+the+Heart+During+Ischemia-Reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).</li>
<li>Krause, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions+in+organellar+and+prokaryotic+proteomes+by+native+gel+electrophoresis%3A+%28Membrane%29+protein+complexes+and+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes.</a> Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes.</a> Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Jang, S., Javadov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Challenges+in+Elucidating+Respiratory+Supercomplexes+in+Mitochondria%3A+Methodological+Obstacles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles.</a> Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).</li>
<li>Cuillerier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+hepatic+LRPPRC+alters+mitochondrial+bioenergetics%2C+regulation+of+permeability+transition+and+trans-membrane+ROS+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion.</a> Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPallotti%2C+F+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 80, Academic Press. 3-44 (2007).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nature Protocols. 4, 1582(2009).</li>
<li>Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28BN-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Beutner, G., Porter, G. A. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Supercomplexes+of+the+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+with+Native+Electrophoresis%2C+In-gel+Assays%2C+and+Electroelution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55738(2017).</li>
<li>Von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVon+Hagen%2C+J+%22Proteomics+Sample+Preperation%22">Proteomics Sample Preperation</a>. , Wiley InterScience. 485(2008).</li>
<li>Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+dimeric+F1F0-ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of dimeric F1F0-ATP synthase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).</li>
<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+mitochondrial+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Structural organization of mitochondrial ATP synthase.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+Stated+of+America%22%5BJournal%5D)">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887(2013).</li>
</ol>

Superkompleksy mitochondrialne są aktywnie badane w celu wyjaśnienia ich fizjologicznej roli i znaczenia w patogenezie wielu chorób człowieka, niezależnie od tego, czy są to nabyte, czy genetyczne choroby mitochondrialne 3,7,9,10,11,12,13,14 . Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Protokół ten został przetestowany z mitochondriami wątroby myszy, mitochondriami mięśni szkieletowych myszy (wyniki nie pokazane), mitochondriami serca szczura i mitochondriami ludzkich fibroblastów (wyniki nie pokazane), ale z pewnością można go dostosować do innych źródeł izolowanych mitochondriów. Metoda optymalnie łączy różne aspekty protokołów BN i CN-PAGE, co pozwala na ograniczenie narażenia na detergenty i związki anionowe do minimum w porównaniu z opublikowanymi protokołami 20,27,28.
Przygotowanie próbki
Przygotowanie próbki stanowi kluczowy krok do pomyślnego oddzielenia SC. Skład buforu powinien być starannie dobrany, aby osiągnąć właściwą rozpuszczalność białek i zespołów białek, przy jednoczesnym zachowaniu w jak największym stopniu ich integralności funkcjonalnej i strukturalnej. Siła jonowa i pH buforu ekstrakcyjnego to dwa ważne czynniki, które należy wziąć pod uwagę. Zbyt niskie stężenia soli (< 50 mM K-octanu lub NaCl) spowodują słabą rozpuszczalność białek w obecności niejonowych detergentów, podczas gdy stężenia soli powyżej 500 mM będą sprzyjać układaniu / agregacji białek oraz wytrącaniu CB i białek29. W związku z tym SC powinny być ekstrahowane przy użyciu o sile jonowej zbliżonej do fizjologicznej. Jeśli chodzi o pH, zaleca się stosowanie pH zbliżonego do fizjologicznego.
Rodzaj detergentu i stosunek detergentu do białka mają również kluczowe znaczenie dla optymalnej ekstrakcji SC. W celu maksymalnego zachowania rodzimych SC preferowana jest digitonina26. Jak wykazano w niniejszym protokole i innych opublikowanych metodach 23,30,31,32, ten łagodny detergent zachowuje supramolekularny skład wielu zespołów SC oraz dimeryczną i oligomeryczną strukturę ATPsyntazy (Rysunek 3 i Rysunek 4). Miareczkowanie badanych próbek różnymi ilościami digitoniny ma kluczowe znaczenie dla określenia warunków, które umożliwiają optymalną rozpuszczalność, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności enzymów i fizjologicznych interakcji białek. Miareczkowanie powinno być wykonywane w proporcjach od 2 do 8 g/g26. Optymalne wyniki dla mitochondriów wątroby, mięśni szkieletowych i serca uzyskuje się odpowiednio przy 4, 5 i 6 g digitoniny/g białka. Należy zauważyć, że digitonina może być zastąpiona przez Triton X-100, który w optymalnych warunkach skutkuje podobną migracją i składem SC jak te obserwowane w przypadku digitoniny2. Detergent ten należy jednak stosować ostrożnie, ponieważ stosunkowo niewielki wzrost stosunku detergentu do białka (np. z 1 do 1,5 g/g) może spowodować całkowitą dysocjację zespołów SC2, co może skutkować niespójnościami eksperymentalnymi. Po ekstrakcji próbki są tradycyjnie uzupełniane Coomassie Blue w celu nadania białkom ładunku po nałożeniu na żel, z wyjątkiem tradycyjnego CN-PAGE20,26. W celu zminimalizowania narażenia na białko Coomassie blue i potencjalnej dysocjacji labilnych białek, próbki nie są uzupełniane błękitem Coomassie w tym protokole.
Elektroforezy
Zarówno CN-PAGE, jak i BN-PAGE zostały wykorzystane do badania mitochondrialnych kompleksów OXPHOS, z których każdy ma odrębne zalety i ograniczenia. Łagodniejsze warunki stosowane w CN-PAGE (głównie brak CB, który ma działanie podobne do detergentu), pozwalają na lepsze zachowanie aktywności syntazy ATP w żelu i ograniczają dysocjację labilnych białek w zespołach SC i syntazy ATP o dużej masie cząsteczkowej26. Jednak brak anionowego barwnika CB w ekstrakcie białkowym i do elektroforezy powoduje migrację białek w oparciu o ich ładunek wewnętrzny i punkt izoelektryczny, co zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną białek w żelu26. Ponadto, przy braku CB, białka o niewystarczającym ładunku ujemnym mają tendencję do agregacji, zmniejszając w ten sposób rozdzielczość kompleksów białkowych w żelu20,26. Aby obejść te ograniczenia, tak zwana CN-PAGE o wysokiej rozdzielczości została opracowana przez Wittiga i Schraggera20. W tym protokole deoksycholan sodu (DOC) i różne łagodne detergenty niejonowe (DDM, Triton X100) są dodawane do bufora katodowego, aby utrzymać rozpuszczalność białek błonowych i nałożyć ujemne przesunięcie ładunku na białka, co skutkuje znaczną poprawą rozdzielczości20.
Charakterystyczną cechą obecnego hybrydowego protokołu CN/BN jest to, że porównywalną rozdzielczość można osiągnąć bez tych detergentów. Chwilowe dodanie CB do bufora katodowego na początku elektroforezy jest wystarczające, aby ograniczyć agregację białek i zwiększyć ruchliwość w żelu (Rysunek 3 i Rysunek 4). W rezultacie, ta hybrydowa technika umożliwia doskonałą rozdzielczość różnych zespołów SC i bardzo niskie lub zerowe narażenie na detergenty. Obecność niewielkich ilości CB pozwala również na lepsze zachowanie aktywności CV, lepsze zachowanie dimerycznych i oligomerycznych zespołów CV (Rysunek 3 oraz Wittig i Schägger2005 26) oraz redukcję niebieskiego szumu tła, który może utrudniać ilościowe określenie aktywności żelu, szczególnie w przypadku CII i CIV (Rysunek 2). Co więcej, brak CB w ekstrakcie białkowym ogranicza zakłócenie labilnych interakcji białkowych w obrębie SC. Na przykład fizyczne powiązanie syntazy ATP z ANT w celu utworzenia syntasomu 33 lub z cyklofiliną-D w celu regulacji otwarcia PTP 34 jest lepiej widoczne przy braku CB. Chwilowa ekspozycja na CB tylko podczas elektroforezy może być zatem przydatna do ujawnienia nowych interakcji białkowych w SC. Ogólnie rzecz biorąc, ten hybrydowy protokół CN/BN-PAGE pozwala zatem na połączenie precyzyjnych i szybkich pomiarów aktywności żelu z technikami analitycznymi obejmującymi elektroforezę 2D, immunodetekcję i/lub proteomikę w celu zaawansowanej analizy SC. Należy zauważyć, że wraz z rosnącym zainteresowaniem SC, coraz więcej badań wykorzystuje małe żele 10 x 10 cm do natywnej PAGE. Chociaż takie podejście może być wystarczające do zidentyfikowania poważnych zmian w obfitych zespołach SC, niższa zdolność separacji małych żeli jest prawdopodobnie ograniczona do rozwiązywania subtelnych przegrupowań lub wycinania wyraźnych prążków do analizy proteomicznej. Co więcej, kilka badań z użyciem mniejszych żeli wykazało, że respiresom migruje w tym samym rozmiarze co dimer ATPsynthazy, co utrudnia ich dysocjację22. Dlatego należy faworyzować stosowanie dużych żeli.

Mitochondria wytwarzają energię poprzez fosforylację oksydacyjną, gdzie kompleksy oddechowe I-II-III-IV utleniają substraty i przenoszą elektrony do tlenu, generując gradient, który umożliwia fosforylację ADP przez syntazę ATP (CV). W ostatnich latach szeroko zakrojone badania wykazały, że kompleksy łańcuchów oddechowych są nie tylko włączone w sposób liniowy do wewnętrznej błony mitochondrialnej, ale są również zorganizowane w układy superkompleksów (SCs)1,2. W mitochondriach ssaków SC występują w różnych stechiometriach: CI/CIII2/CIV1-4 (który jest nazywany respirasomem i który jest zdolny do oksydoredukcji NADH:O2 in vitro)2, CI/CIII2 i CIII2/CIV1-2 3,4. Ponadto kompleksy oddechowe są rozmieszczone w różnych proporcjach między ich formą wolną a układem SC. Dlatego szacuje się, że 85%–100% CI, 55%–65% CIII i 15%–25% CIV znajduje się w SCs4. Uważa się, że te supramolekularne struktury zmniejszają produkcję ROS, stabilizują lub pomagają w składaniu poszczególnych kompleksów, regulują aktywność łańcucha oddechowego i zapobiegają agregacji białek w bogatej w białko wewnętrznej błonie mitochondrialnej5,6,7,8. Ich zdolność do przebudowy w zależności od zmian zapotrzebowania na energię oraz ich znaczenie w patogenezie chorób są badane w kilku laboratoriach3,7,9,10,11,12,13,14. Badania wykazały, że patologiczne zmiany w składaniu SCs są obecne w różnych zaburzeniach, w tym między innymi w genetycznym defektywstwie syntezy kardiolipiny15, niewydolność serca16, niedokrwienie-reperfuzja17, diabetes12 i aging18.
Natywna elektroforeza i immunodetekcja są szeroko stosowane w badaniach SCs w celu rozwiązania czwartorzędowych układów kompleksów OXPHOS2,19,20,21. Natywna elektroforeza może być dodatkowo połączona ze specyficznymi testami aktywności żelu lub 2D-SDS PAGE, aby umożliwić precyzyjne określenie molekularne różnych zespołów SCs1,19. Możliwość badania SC jest krytycznie zależna od warunków ekstrakcji, w tym rodzaju i stężenia użytego detergentu, siły jonowej i pH, a także od warunków migracji elektroforetycznej, które obejmują skład buforu, obecność CB, wielkość żelu i procentową zawartość akryloamidu2.
Protokoły i rozdzielczość pasm SC różnią się znacznie między artykułami, co utrudnia porównywanie badań i adaptację metod utrudnia22. W związku z tym w niniejszym artykule zaproponowano solidny i optymalny protokół ekstrakcji SC z izolowanych mitochondriów z różnych źródeł za pomocą niejonowego detergentu digitoniny oraz rozdzielczości pasm SC o dużej masie cząsteczkowej. Zoptymalizowane stężenie detergentu, skład buforu ekstrakcyjnego i brak Coomassie Blue w przygotowaniu próbki minimalizują zakłócenia kompleksów białkowych. Protokół ten (patrz Rysunek 1 dla przeglądu) łączy CN-PAGE i BN-PAGE w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości zespołów SCs na dużym żelu i jest kompatybilny z testami aktywności w żelu, co pozwala na lepszą wizualizację pasm reaktywnych, wraz z zastosowaniem immunodetekcji do szczegółowej analizy układów i składu SC.

<table><tbody><tr><td>Hydrat tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 6-amino-kapronowy</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan soli disodowej hydrat</td><td>sigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ATPB [3D5] - Marker mitochondrialny</td><td>Abcam</td><td>ab14730</td><td>Numer partii GR3174539-12, RRID AB_301438</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SDHA [2E3GC12FB2AE2]</td><td>Abcam</td><td>ab14715</td><td>Numer partii GR3235943-1, RRID AB_301433</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-UQCRC2 [13G12AF12BB11]</td><td>Abcam</td><td>ab14745</td><td>Numer partii GR304308-3, RRID AB_2213640</td></tr><tr><td>Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide</td><td>Biorad</td><td>1610201</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue G</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne COX4 (1D6E1A8)</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td>Numer partii TI2637158, RRID AB_2532240</td></tr><tr><td>Cytochrom c z serca konia</td><td>sigma</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand FH100M Wielokanałowe pompy perystaltyczne</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-310-660</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>Wewnętrzne szklane płytki. Opakowanie 2 sztuk 20 x 20 cm, płytki szklane do komórek elektroforetycznych PROTEAN II xi i PROTEAN II XL o długości 20 cm, stosować z płytą zewnętrzną</td><td>Biorad</td><td>1651823</td><td></td></tr><tr><td>Model 485 Gradient Former. 40-175 ml akrylowy preparat do formowania gradientowego, zawiera trzpień zaworu i zestaw rurek, do stosowania z systemami wielokomorowych odlewów Mini-PROTEAN</td><td></td><td></td> Przeciwciało monoklonalne 1654120 <td></td></tr><tr><td>NDUFA9 (20C11B11B11)</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td>Numer partii TD2536591, RRID AB_2532223</td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium Blue chloride</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Zewnętrzne płytki szklane. Opakowanie 2, 22,3 x 20 cm, szklane płytki do 20 cm komórek do elektroforezy PROTEAN II xi i PROTEAN II XL, do stosowania z płytką wewnętrzną</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td></td></tr><tr><td>Floride fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Powerpack 1000</td><td>Biorad</td><td>Numer seryjny 286BR 07171</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski kanapkowe PROTEAN II. Opakowanie 2 szt., zaciski do żeli do biegania, do 20 cm ogniwa do elektroforezy PROTEAN II xi, 1 lewe i 1 prawe</td><td>Biorad</td><td>1651902</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II xi Cell. Wielkoformatowa pionowa cela do elektroforezy, żel 16 x 20 cm, pojemność 4 żeli, przekładki i grzebienie</td><td>Biorad</td><td>1651811</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II xi Comb. Opakowanie 1, 15-dołkowe, 1,5 mm, grzebień do komory elektroforetycznej PROTEAN II xi</td><td>Biorad</td><td>1651873</td><td></td></tr><tr><td>Komory Odlewniczej PROTEAN II xi Multi-Gel. Wielożelowa komora odlewnicza, żel o wymiarach 20 x 20 cm, do dziesięciu żeli o grubości 1,5 mm, zawiera płytkę uszczelniającą, uszczelkę, arkusze separacyjne, bloki akrylowe, karty wyrównujące PROTEAN II XL Biorad</td><td></td><td>1652025</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II xi Dystanse. Opakowanie 4, 1,5 mm, przekładki do 20 cm Komórka do elektroforezy PROTEAN II xi</td><td>Biorad</td><td>1651849</td><td></td></tr><tr><td>SCIENCEWARE Worki użytkowe (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, pudełko 100 grubych</td> bibuł <td>VWR</td><td>11215-388</td><td></td></tr><tr><td>. Opakowanie 25 arkuszy, 15 x 20 cm, chłonna bibuła filtracyjna, do stosowania z kasetą Trans-Blot</td><td>Biorad</td><td>1703956</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwo Trans-Blot z elektrodami płytkowymi i cewką Super Cooling. Komórka transferowa i cewka chłodząca (#170-3912), zawiera 2 kasety z uchwytami na żel, zbiornik buforowy, pokrywę z, podkładki z włókna, 1 opakowanie bibuły</td><td>Biorad</td><td>1703939</td><td></td></tr></tbody></table>

hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Kompleksy maszynerii fosforylacji oksydacyjnej tworzą supramolekularne układy białkowe zwane superkompleksami (SC), które, jak się uważa, nadają mitochondriom strukturalne i funkcjonalne korzyści. SC zostały zidentyfikowane u wielu gatunków, od drożdży po ssaki, a coraz więcej badań donosi o zakłóceniu ich organizacji w chorobach genetycznych i nabytych u ludzi. W związku z tym coraz więcej laboratoriów jest zainteresowanych analizą SC, co może być wyzwaniem metodologicznym. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół, który łączy zalety metod PAGE Blue- i Clear-Native w celu rozwiązywania i analizowania SC w sposób efektywny czasowo. Dzięki tej hybrydowej metodzie CN/BN-PAGE mitochondrialne SC ekstrahowane optymalnymi ilościami łagodnego detergentu digitoniny są na krótko wystawiane na działanie anionowego barwnika Coomassie Blue (CB) na początku elektroforezy, bez narażenia na działanie innych detergentów. Ta krótka ekspozycja na CB pozwala na separację i rozwiązanie SC tak skutecznie, jak w przypadku tradycyjnych metod BN-PAGE, przy jednoczesnym uniknięciu negatywnego wpływu wysokich poziomów CB na testy aktywności w żelu i labilnych interakcji białko-białko w SC. Dzięki temu protokołowi możliwe jest połączenie precyzyjnych i szybkich pomiarów aktywności żelu z technikami analitycznymi obejmującymi elektroforezę 2D, detekcję immunologiczną i/lub proteomikę w celu zaawansowanej analizy SC.

Rysunek 2 przedstawia wyniki eksperymentu z miareczkowaniem digitoniną, mającego na celu ustalenie odpowiedniej ilości digitoniny wymaganej do ekstrakcji SC. Ilość ta będzie się różnić w zależności od rodzaju tkanki/komórek oraz tego, czy próbka była mrożona. W tym eksperymencie przeprowadzono analizę aktywności CIV w żelu w celu wizualizacji SC wyizolowanych ze świeżych mitochondriów wątroby mysiej. Przetestowano stosunki od 2/1 do 10/1 g digitoniny/g białka. Optymalna ilość digitoniny dla tej próbki wynosi 4 g/g, ponieważ zapewnia dobrą rozdzielczość monomerów CIV oraz wysokocząsteczkowych SC. Przy niższym stosunku prążki nie są wyraźne i rozmywają się podczas elektroforezy, natomiast zastosowanie wyższego stosunku digitoniny prowadzi do rozpadu wysokocząsteczkowych SC.
Rysunek 3 i Rysunek 4 przedstawiają wyniki pełnego eksperymentu przeprowadzonego na preparacie mitochondriów wątroby myszy ekstrahowanych przy użyciu 4 g digitonin /g białka. Białka rozdzielono za pomocą hybrydowej elektroforezy BN/CN-PAGE, standardowej elektroforezy BN-PAGE lub CN-PAGE. Wszystkie trzy żele odlewano jednocześnie, a do studzienek naniesiono powtórzenia tej samej próbki. Po elektroforezie poszczególne ścieżki wycięto i poddano pomiarowi aktywności w żelu (CI, CII, CIV i CV na Rysunku 3) oraz analizie immunoblottingowej (CI, CII, CIII, CIV, CV na Rysunku 4).
Dodanie CB albo chwilowo w buforze katodowym (tj. hybrydowa metoda CN/BN-PAGE), albo do próbek i buforu katodowego przez cały czas trwania elektroforezy (tj. BN-PAGE), znacznie poprawia mobilność i rozdzielczość prążków SC oraz poszczególnych kompleksów oddechowych w porównaniu z CN-PAGE (Rycina 3). Prążki są łatwo rozróżnialne przy zastosowaniu techniki hybrydowej lub BN-PAGE po przeprowadzeniu testu aktywności in-gel dla CIV, podczas gdy w tej samej próbce rozdzielonej metodą CN-PAGE nie można zidentyfikować reaktywnych prążków SC i monomerycznego CIV.
Rycina 3 i Rysunek 4 wykazano, że rozdzielczość i wzór prążkowania monomerów OXPHOS oraz kompleksów supramolekularnych są jakościowo porównywalne w przypadku hybrydowej elektroforezy CN/BN-PAGE i BN-PAGE. Istnieją jednak zauważalne różencje. Po pierwsze, ruchliwość elektroforetyczna kompleksów OXPHOS jest nieznacznie zmniejszona, gdy białka są rozdzielane w warunkach hybrydowych CN/BN-PAGE kontra standardowa elektroforeza w układzie BN-PAGE, ze względu na zmniejszoną ilość CB. To przesunięcie ruchliwości jest większe dla monomerów kompleksu IV, następnie dla monomerów kompleksu V oraz kompleksu I (Rycina 3 i Rycina 4). Po drugie, niebieskie tło jest słabsze w hybrydowej elektroforezie CN/BN-PAGE w porównaniu z BN-PAGE (Rycina 3, lewe pasma). W rezultacie wysoki poziom tła po BN-PAGE całkowicie maskuje barwienie aktywności w żelu dla CII oraz zwiększa szum tła związany z aktywnością dimerów CIV (Rysunek 3). Po trzecie, aktywność CV jest wyższa, gdy próbki są rozdzielane w warunkach hybrydowych CN/BN-PAGE w porównaniu do BN-PAGE (Rycina 3), ze względu na zmniejszoną ilość CB, o której wiadomo, że wpływa ona na aktywność katalityczną CV.26 CN/BN-PAGE pozwala również na lepsze zachowanie nadcząsteczkowych kompleksów CV, o czym świadczy większy udział całkowitej aktywności CV związany z dimerami CV (Rycina 3). Co więcej, oligomery CV są widoczne w elektroforezie CN/BN-PAGE, podczas gdy w warunkach BN-PAGE ulegają one całkowitej dysocjacji. Co ciekawe, w przypadku analizy próbek metodą CN/BN-PAGE, pomiędzy monomerami a dimerami CV obserwuje się również wyraźne prążki wykazujące aktywność CV (Rysunek 2).
Rysunek 5 przedstawia reprezentatywną analizę rozkładu kompleksów OXPHOS w zgromadzeniach supramolekularnych. Obraz ukazuje aktywność CI w żelu dla próbek uzyskanych z 4 różnych preparatów mitochondriów wątroby zdrowej myszy. Analiza densytometryczna pozwala na pomiar pola pod krzywą dla prążków reaktywnych z CI oraz przedstawienie względnego rozkładu aktywności C1 w formach monomerycznych (I1) i supramolekularnych (I1III2, I1III2IV1, I1III2IVn). Podobną analizę można przeprowadzić po wykonaniu immunoblottingu.
<img alt="Proces oczyszczania białka; schemat wirowania i PAGE; CN/BN-PAGE, analiza elektroforetyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat analizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy; wpływ stosunku digitoniny na kompleksy białkowe; analiza pręg żelowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Miareczkowanie digitoniną w celu ekstrakcji superkompleksów z mitochondriów świeżej wątróby mysiej. Niniejszy przykład przedstawia alikwoty mitochondriów wątroby mysiej, wyizolowanych od jednego zwierzęcia, które poddano działaniu zwiększających się ilości digitoniny w celu ekstrakcji superkompleksów oddechowych. Próbki rozdzielono następnie za pomocą hybrydowej elektroforezy CN/BN PAGE i określono aktywność CIV w żelu. CIV1: monomery kompleksu IV; CIV2: dimery kompleksu IV; SC: superkompleksy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Hybrydowa elektroforeza żelowa CN/BN-PAGE i BN-PAGE do analizy kompleksów białkowych oraz aktywności enzymatycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Aktywność w żelu kompleksów OXPHOS po hybrydowym CN/BN-PAGE, BN-PAGE lub CN-PAGE. Mitochondria wątrobowe izolowane od jednej myszy poddano działaniu digitonininy (stosunek 4 g/g digitoniny do białka) w celu ekstrakcji superkompleksów oddechowych. Alikwoty tej próbki nałożono następnie na wiele studni w trzech oddzielnych żelach i poddano analizie CN/BN-PAGE, BN-PAGE lub CN-PAGE. Każda powtórzona ścieżka w każdym żelu została następnie wycięta i niezwłocznie wykorzystana do testów aktywności w żelu (oznaczonych jako CI, CII, CIV i CV). Jedną ścieżkę wykorzystano jako kontrolę w celu wykazania tła (oznaczonego jako BG) przy barwieniu błękitem Coomassie. Kompleksy OXPHOS i zgrupowania nadcząsteczkowe zidentyfikowano zgodnie ze standardową nomenklaturą, gdzie liczby w indeksach wskazują stechiometrię molekularną każdego kompleksu OXPHOS. Należy zauważyć, że pozycja zgrupowań nadcząsteczkowych zawierających CIII opiera się na immunodetekcji, ponieważ w tym konkretnym eksperymencie nie przeprowadzono oznaczania aktywności w żelu dla CIII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunoblot hybrydowy CN/BN-PAGE pokazujący rozdział kompleksów białkowych; analiza wyników elektroforezy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza immunoblottingowa kompleksów OXPHOS po hybrydowym CN/BN-PAGE lub BN-PAGE. Repliki z eksperymentów opisanych w legendzie do Rysunku 3 zostały przeniesione elektroforetycznie na jedną membranę. Po transferze poszczególne ścieżki wycięto i inkubowano ze swoistymi przeciwciałami rozpoznającymi CI, CII, CIII, CIV i CV. Kompleksy OXPHOS oraz zgrupowania supramolekularne zidentyfikowano zgodnie ze standardową nomenklaturą, gdzie liczby w indeksach wskazują stechiometrię molekularną każdego kompleksu OXPHOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy; analiza prążków białkowych, histogram rozkładu aktywności; schemat naukowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59294/59294fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ilościowe oznaczenie rozkładu CI w kompleksach monomerycznych i supramolekularnych. (A) Aktywność CI w żelu określona po hybrydowej elektroforezie CN/BN-PAGE ekstraktów SC z mitochondriów wątrobowych uzyskanych od 4 myszy. (B) Densitogramy uzyskane za pomocą narzędzia Gel Analysis w programie ImageJ, wykazujące wyraźne piki odpowiadające monomerom CI (I1) oraz różnym supramolekularnym kompleksom zawierającym CI (I1III2, I1III2IV1 oraz I1III2IVn). (C) Ilościowe oznaczenie względnego rozkładu aktywności C1. Dane przedstawiają średnią i SEM dla 4 myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59294/59294fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stosunek digitonininy do białka (g/g)</td>
			<td>2 g/g</td>
			<td>4 g/g</td>
			<td>6 g/g</td>
			<td>8 g/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość buforu do ekstrakcji (µL)</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>200</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość 10% roztworu zapasowego digitoniny (µL)</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>300</td>
			<td>400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość buforu do ekstrakcji (µL)</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Objętości wymagane do ekstrakcji SC z 5 mg białek mitochondrialnych przy zastosowaniu różnych stosunków digitoniny do białka.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Związek</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >EDTA, pH 7.5</td>
			<td >1 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >30 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Octan potasu</td>
			<td >150 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Glicerol</td>
			<td >12%</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Kwas 6-aminokapronowy</td>
			<td >2 mM</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Bufor do ekstrakcji SC (stężenia końcowe). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 miesiące.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do żelu 3X:  Podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazol/HCl pH 7,0</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas 6-aminokapronowy</td>
			<td>1,5 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor akrylamidowy:  Podzielić na alykwoaty i przechowywać w temperaturze -20 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akrylamid</td>
			<td>99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-akrylamid</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Buforowe roztwory stokowe do żeli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dla 2 żeli:</td>
			<td>4% (60 ml)</td>
			<td>12% (60 ml)</td>
			<td>Koncentrujący (4%) (25 ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do żelu 3X</td>
			<td>19,8 ml</td>
			<td>19,8 ml</td>
			<td>8,25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor akrylamidowy</td>
			<td>4,8 ml</td>
			<td>14,4 ml</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td>35 ml</td>
			<td>13,1 ml</td>
			<td>14,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>-</td>
			<td>12 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS 10%</td>
			<td>360 μL</td>
			<td>60 μL</td>
			<td>150 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>24 μL</td>
			<td>12 μL</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Żel gradientowy 4%–12%.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor anodowy: Przechowywać w 4 °C, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazol</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor katodowy: Przechowywać w temperaturze 4 °C, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricyna</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazol</td>
			<td>7,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z dodatkiem lub bez dodatku błękitu Coomassie (G250)</td>
			<td>0.022%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Bufory do elektroforezy.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do pomiaru aktywności kompleksu I: przygotować na świeżo w 5 mM TRIS-HCl pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niebieski nitrotetrazolium</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>14 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do pomiaru aktywności kompleksu II: przygotować na świeżo w 5 mM TRIS-HCl pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bursztynian</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitronezonian błękitny</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do pomiaru aktywności kompleksu IV: przygotować świeżo w 50 mM fosforanie sodu o pH 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrom c</td>
			<td>0,05 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzydyna</td>
			<td>2,3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do pomiaru aktywności syntazy ATP: przygotować na świeżo w wodzie, dostosować pH do 8 za pomocą KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicyna</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl22</td>
			<td>30 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Bufory do testu aktywności w żelu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Związek</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bufor do transferu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (zasada)</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicyna</td>
			<td>192 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karta Charakterystyki Substancji Chemicznej (SDS)</td>
			<td>4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metanol</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (zasada)</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>137 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 </td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 7: Bufory do immunoblottingu.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kompleks</td>
			<td>Podjednostka</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I</td>
			<td>NDUFA9</td>
			<td>20C11B11B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>II</td>
			<td>SDHA</td>
			<td>2E3GC12FB2AE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>III</td>
			<td>UQCRC2</td>
			<td>13G12AF12BB11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IV</td>
			<td>COX4</td>
			<td>1D6E1A8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V</td>
			<td>ATPB</td>
			<td>3D5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 8: Przeciwciała użyte do immunoblottingu w celu wykrycia SC łańcucha oddechowego. Patrz Tabela materiałów w celu sprawdzenia firm i numerów partii.

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

Superkompleksy to supramolekularne zespoły utworzone przez kompleksy łańcuchów oddechowych w błonie wewnętrznej mitochondriów. Uważa się, że tworzenie tych superkompleksów daje kilka korzyści strukturalnych i funkcjonalnych, do których należą zmniejszona produkcja reaktywnych form tlenu, stabilizacja i bardziej efektywne składanie poszczególnych kompleksów łańcuchów oddechowych, regulacja aktywności łańcucha oddechowego i zapobieganie agregacji białek w bogatym w białka środowisku błony wewnętrznej. Zmiany w budowie i składzie superkompleksów są dynamiczne i coraz częściej wykazano, że leżą u podstaw zmian w funkcji mitochondriów obserwowanych podczas adaptacji fizjologicznej, a także różnych chorób genetycznych i nabytych.Ten film przedstawia hybrydowy protokół PAGE clear/blue native do rozwiązywania i analizowania superkompleksów w precyzyjny i efektywny czasowo sposób. Główną zaletą tej hybrydowej metody PAGE clear / blue native jest to, że optymalnie łączy różne aspekty tradycyjnych protokołów PAGE blue i clear native, co pozwala zmniejszyć narażenie na detergenty i związki anionowe do minimum w porównaniu z opublikowanymi protokołami. Optymalna separacja i analiza superkompleksów uzyskuje się na żelach o dużym gradientze.Zabieg ten składa się z kilku delikatnych kroków, wymagających zdolności manualnych i starannego wykonania. Wizualne wsparcie do pisemnego protokołu zawiera ważne wskazówki, które ułatwiają wdrożenie techniki. Procedurę demonstruje Alexandria, doktorantka z mojego laboratorium.Na początek odwiruj mitochondria wyizolowane z tkanki zwierzęcej w 1,5-mililitrowej probówce o temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i dodać obliczoną objętość lodowatego buforu ekstrakcyjnego zawierającego digitoninę do probówki w celu ponownego zawieszenia osadu mitochondrialnego. Umieść probówki na mini rotatorze probówek i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy średniej prędkości obrotowej.Odwirować próbki w temperaturze 20, 400 razy G przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia nierozpuszczalnych fragmentów. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Jeśli elektroforeza nie zostanie wykonana tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Otwórz komorę odlewniczą. Umieść w komorze zewnętrzną szklaną płytkę o wymiarach 20 centymetrów razy 22 centymetry. Umieść jeden zestaw przekładek o pojemności 1.5 mililitra za pomocą karty wyrównowania, aby upewnić się, że są mocno osadzone z boku i rogów komory.Umieść wewnętrzną szklaną płytkę na przekładkach, aby uformować żelową kanapkę, i połóż plastikowy arkusz rozdzielający na szklanej płycie. Ułóż trzy kolejne żelowe kanapki. W razie potrzeby dodaj więcej bloków akrylowych lub szklanych płytek, aby zająć pozostałą przestrzeń w komorze.Umieść pasek parafilmu w rowku przed mocnym osadzeniem uszczelki w wycięciu uszczelki. Umieść płytę sufitową na komorze i dokręć wszystkie sześć. Postaw komorę odlewniczą.Umieścić formę gradientu na płycie mieszającej z mieszadłem magnetycznym w komorze mieszania światła. Podłącz rurkę komory odlewniczej do kształtownika gradientu i zabezpiecz rurkę w kasecie pompy perystaltycznej. Upewnij się, że zawór odcinający kształtera gradientu jest zamknięty.Aby odlać cztery żele, przygotuj 60 mililitrów 4% i 60 mililitrów 12% roztworów żelu w dwóch kolbach Erlenmeyera i dokładnie zamieszaj, aby wymieszać. Wlej 4% roztwór żelu do lekkiej komory mieszania, a 12% do ciężkiej komory zbiornika formy gradientowej. Ustaw prędkość mieszania płytki mieszającej na 350 obr./min.Następnie otwórz kran i włącz pompę przy 35 obr./min. Gdy poziom roztworu frakcji lekkiej jest niższy niż frakcji ciężkiej, zatrzymaj pompę i otwórz trzpień zaworu między zbiornikami lekkimi i ciężkimi. Poczekaj, aż objętość frakcji zrównoważy się i uruchom ponownie pompę.Upewnij się, że żadne bąbelki nie dostały się do systemu i nie zostały uwięzione między szklanymi płytkami. Po całkowitym wylaniu żelu gradientowego zatrzymaj pompę i nałóż jeden mililitr wody na każdą kanapkę z żelem, aby zapobiec wysuszeniu żelu. Pozwól mu polimeryzować przez dwie godziny.Przygotować 25 mililitrów żelu do układania w kolbie Erlenmeyera i zamieszać, aby dokładnie wymieszać. Delikatnie odwróć montaż, aby usunąć wodę i włóż 15-dołkowe grzebienie do każdej kanapki z żelem. Wlej żel do układania w stos i pozwól mu polimeryzować przez dwie godziny.Następnie włóż zaciski żelowe i kanapkowe i wyjmij grzebień. Trzymając krótką szklaną płytkę skierowaną w dół, włóż kanapkę z żelem do rdzenia chłodzącego. Powtórz po drugiej stronie i umieść rdzeń w zbiorniku do elektroforezy.Wlej 300 mililitrów niebieskiego buforu katodowego do wewnętrznej komory zbiornika do elektroforezy. Za pomocą pipety i końcówek ładujących załaduj od 75 do 175 mikrogramów białka na studzienkę. W chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza podłącz elektrody do źródła zasilania i włącz je na 150 woltów, a następnie uruchom żel przez półtorej godziny lub do momentu, gdy wszystkie próbki dostaną się do gradientowego żelu.Załaduj powtórzone próbki do oddzielnych studzienek, aby umożliwić równoległe oznaczanie aktywności w żelu i analizę immunoblot kompleksów OXPHOS. Usunąć niebieski bufor katodowy za pomocą pipety. Zastąp 300 mililitrami niebieskiego bufora katodowego Coomassie i uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez noc w chłodni.Przed zakończeniem elektroforezy należy przygotować aktywności w żelu zgodnie z manuskryptem i przechowywać je w ciemności w temperaturze pokojowej. Przerwij elektroforezę i odzyskaj żel. Wytnij plastikową torbę, aby można ją było otworzyć jak książkę.Przetnij pasy i przenieś pasy żelu do plastikowych worków. Użyj zgrzewarki, aby uszczelnić dwie z trzech stron. Jeżeli przeprowadza się eksperymenty kontroli ujemnej, należy dodać inhibitory do testowych.W przypadku trzech próbek eksperymentalnych dodać 20 mililitrów buforu aktywności w żelu. Usuń bąbelki i zamknij czwartą stronę plastikowej torby. Inkubuj pasy żelowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności i sprawdzaj co 15 minut.Czas inkubacji różni się w zależności od ilości białka i kompleksów. Po inkubacji spłucz pasy żelu w wodzie, aby zatrzymać reakcję, i obraz na białym tle dla kompleksu I, kompleksu II, kompleksu IV lub czarnego tła dla kompleksu V. W tym przykładzie przeprowadzono złożoną dożylną aktywność w żelu w celu wizualizacji superkompleksów wyizolowanych ze świeżych mitochondriów wątroby myszy. Optymalna ilość digityniny dla tej próbki wynosi cztery gramy na gram, ponieważ zapewnia dobrą rozdzielczość kompleksu monomerycznego IV i superkompleksów o dużej masie cząsteczkowej.Przy niższym stosunku prążki nie są przezroczyste i podczas elektroforezy zamieniają się w rozmaz, podczas gdy zastosowanie wyższego stosunku digitoniny prowadzi do rozerwania superkompleksów o dużej masie cząsteczkowej. Mitochondria wątroby wyizolowane od jednej myszy potraktowano optymalną ilością digitoniny w celu ekstrakcji superkompleksów oddechowych. Ruchliwość elektroforetyczna kompleksów OXPHOS jest nieznacznie zmniejszona, gdy białka są rozdzielane przy użyciu hybrydowych przezroczystych/niebieskich natywnych warunków PAGE, w porównaniu ze standardowym natywnym PAGE, ze względu na zmniejszoną ilość błękitu Coomassie.Ta zmiana ruchliwości jest większa w przypadku złożonych monomerów dożylnych, a następnie złożonych monomerów V i kompleksu I. Niebieskie tło jest niższe w hybrydowej przezroczystej natywnej/niebieskiej natywnej PAGE w porównaniu z niebieską natywną PAGE. Wysokie poziomy tła następujące po niebieskiej natywnej PAGE całkowicie maskują barwienie aktywności w żelu dla kompleksu II i wzmacniają szum tła związany z aktywnością dimerów kompleksu IV. W przypadku tego protokołu miareczkowanie próbek będących przedmiotem zainteresowania różnymi ilościami digitoniny ma kluczowe znaczenie w celu zidentyfikowania warunków, które umożliwiają optymalną rozpuszczalność, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności enzymów i fizjologicznych interakcji białek.Wszystkie kroki związane z odlewaniem żelu powinny być wykonywane skrupulatnie, aby uzyskać optymalny gradient dla prawidłowej separacji próbek. Należy również zachować szczególną ostrożność przy manipulowaniu tymi dużymi i delikatnymi żelami. Zawsze trzymaj je kilkoma palcami, używając wysokoprocentowej końcówki żelu.Dzięki tej hybrydowej metodzie PAGE bezbarwnej/niebieskiej próbki są poddawane działaniu anionowego barwnika Coomassie blue tylko przez krótki czas na początku elektroforezy, bez narażenia na działanie jakichkolwiek innych detergentów. Pozwala to na rozdzielanie i rozdzielanie superkompleksów tak skutecznie, jak w przypadku tradycyjnych metod niebieskiego natywnego PAGE, przy jednoczesnym unikaniu negatywnego wpływu wysokich poziomów błękitu Coomassie na testy aktywności w żelu i labilne interakcje białko-białko w superkompleksach. Dzięki temu protokołowi możliwe jest zatem połączenie precyzyjnych i szybkich pomiarów aktywności w żelu z technikami analitycznymi obejmującymi elektroforezę 2D, immunodetekcję i/lub analizę odnoszącą się do proteomiki superkompleksów.

hybrid-clearblue-native-electrophoresis-for-separation-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

W tym filmie demonstrujemy technikę elektroforetyczną, zwaną niebieską natywną STRONĄ, do analizy mitochondrialnych kompleksów białkowych układu oddechowego w ich natywnie złożonym i funkcjonalnie aktywnym stanie. Anionowy niebieski barwnik Coomassie powoduje, że kompleksy białkowe stają się naładowane ujemnie, co umożliwia separację na podstawie wielkości i struktury.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół elektroforezy strefy kapilarnej do oceny wewnętrznej fizykochemicznej heterogeniczności przeciwciał monoklonalnych jako atrybutu jakości.

Elektroforeza kapilarna Separacja izoform przeciwciał monoklonalnych za pomocą neutralnej kapilary

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Ten protokół łączy charakterystykę próbki białka za pomocą elektroforezy żelu kapilarnego oraz szybkie wiązanie przesiewu dla naładowanych ligandów za pomocą elektroforezy kapilarnej o powinowactwie. Jest zalecany w przypadku białek o elastycznej strukturze, takich jak białka wewnętrznie nieuporządkowane, w celu określenia wszelkich różnic w wiązaniu dla różnych konformerów.

Analiza wewnętrznego zaburzenia AtHIRD11 i wiązania się z jonami metali za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej i powinowactwa do elektroforezy kapilarnej

Poznaj hybrydową elektroforezę przezroczystą/niebieską natywną do separacji superkompleksów mitochondrialnych. Ta metoda minimalizuje ekspozycję na detergenty i Coomassie Blue, zachowując aktywność enzymów.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych (Wideo) | JoVE Journal

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Przeglądaj więcej filmów