Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Superkompleksy to supramolekularne zespoły utworzone przez kompleksy łańcuchów oddechowych w błonie wewnętrznej mitochondriów. Uważa się, że tworzenie tych superkompleksów daje kilka korzyści strukturalnych i funkcjonalnych, do których należą zmniejszona produkcja reaktywnych form tlenu, stabilizacja i bardziej efektywne składanie poszczególnych kompleksów łańcuchów oddechowych, regulacja aktywności łańcucha oddechowego i zapobieganie agregacji białek w bogatym w białka środowisku błony wewnętrznej. Zmiany w budowie i składzie superkompleksów są dynamiczne i coraz częściej wykazano, że leżą u podstaw zmian w funkcji mitochondriów obserwowanych podczas adaptacji fizjologicznej, a także różnych chorób genetycznych i nabytych.

Ten film przedstawia hybrydowy protokół PAGE clear/blue native do rozwiązywania i analizowania superkompleksów w precyzyjny i efektywny czasowo sposób. Główną zaletą tej hybrydowej metody PAGE clear / blue native jest to, że optymalnie łączy różne aspekty tradycyjnych protokołów PAGE blue i clear native, co pozwala zmniejszyć narażenie na detergenty i związki anionowe do minimum w porównaniu z opublikowanymi protokołami. Optymalna separacja i analiza superkompleksów uzyskuje się na żelach o dużym gradientze.

Zabieg ten składa się z kilku delikatnych kroków, wymagających zdolności manualnych i starannego wykonania. Wizualne wsparcie do pisemnego protokołu zawiera ważne wskazówki, które ułatwiają wdrożenie techniki. Procedurę demonstruje Alexandria, doktorantka z mojego laboratorium.

Na początek odwiruj mitochondria wyizolowane z tkanki zwierzęcej w 1,5-mililitrowej probówce o temperaturze 16 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i dodać obliczoną objętość lodowatego buforu ekstrakcyjnego zawierającego digitoninę do probówki w celu ponownego zawieszenia osadu mitochondrialnego. Umieść probówki na mini rotatorze probówek i inkubuj przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy średniej prędkości obrotowej.

Odwirować próbki w temperaturze 20, 400 razy G przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia nierozpuszczalnych fragmentów. Przenieść supernatant do nowej probówki na lodzie. Jeśli elektroforeza nie zostanie wykonana tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Otwórz komorę odlewniczą. Umieść w komorze zewnętrzną szklaną płytkę o wymiarach 20 centymetrów razy 22 centymetry. Umieść jeden zestaw przekładek o pojemności 1.5 mililitra za pomocą karty wyrównowania, aby upewnić się, że są mocno osadzone z boku i rogów komory.

Umieść wewnętrzną szklaną płytkę na przekładkach, aby uformować żelową kanapkę, i połóż plastikowy arkusz rozdzielający na szklanej płycie. Ułóż trzy kolejne żelowe kanapki. W razie potrzeby dodaj więcej bloków akrylowych lub szklanych płytek, aby zająć pozostałą przestrzeń w komorze.

Umieść pasek parafilmu w rowku przed mocnym osadzeniem uszczelki w wycięciu uszczelki. Umieść płytę sufitową na komorze i dokręć wszystkie sześć. Postaw komorę odlewniczą.

Umieścić formę gradientu na płycie mieszającej z mieszadłem magnetycznym w komorze mieszania światła. Podłącz rurkę komory odlewniczej do kształtownika gradientu i zabezpiecz rurkę w kasecie pompy perystaltycznej. Upewnij się, że zawór odcinający kształtera gradientu jest zamknięty.

Aby odlać cztery żele, przygotuj 60 mililitrów 4% i 60 mililitrów 12% roztworów żelu w dwóch kolbach Erlenmeyera i dokładnie zamieszaj, aby wymieszać. Wlej 4% roztwór żelu do lekkiej komory mieszania, a 12% do ciężkiej komory zbiornika formy gradientowej. Ustaw prędkość mieszania płytki mieszającej na 350 obr./min.

Następnie otwórz kran i włącz pompę przy 35 obr./min. Gdy poziom roztworu frakcji lekkiej jest niższy niż frakcji ciężkiej, zatrzymaj pompę i otwórz trzpień zaworu między zbiornikami lekkimi i ciężkimi. Poczekaj, aż objętość frakcji zrównoważy się i uruchom ponownie pompę.

Upewnij się, że żadne bąbelki nie dostały się do systemu i nie zostały uwięzione między szklanymi płytkami. Po całkowitym wylaniu żelu gradientowego zatrzymaj pompę i nałóż jeden mililitr wody na każdą kanapkę z żelem, aby zapobiec wysuszeniu żelu. Pozwól mu polimeryzować przez dwie godziny.

Przygotować 25 mililitrów żelu do układania w kolbie Erlenmeyera i zamieszać, aby dokładnie wymieszać. Delikatnie odwróć montaż, aby usunąć wodę i włóż 15-dołkowe grzebienie do każdej kanapki z żelem. Wlej żel do układania w stos i pozwól mu polimeryzować przez dwie godziny.

Następnie włóż zaciski żelowe i kanapkowe i wyjmij grzebień. Trzymając krótką szklaną płytkę skierowaną w dół, włóż kanapkę z żelem do rdzenia chłodzącego. Powtórz po drugiej stronie i umieść rdzeń w zbiorniku do elektroforezy.

Wlej 300 mililitrów niebieskiego buforu katodowego do wewnętrznej komory zbiornika do elektroforezy. Za pomocą pipety i końcówek ładujących załaduj od 75 do 175 mikrogramów białka na studzienkę. W chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza podłącz elektrody do źródła zasilania i włącz je na 150 woltów, a następnie uruchom żel przez półtorej godziny lub do momentu, gdy wszystkie próbki dostaną się do gradientowego żelu.

Załaduj powtórzone próbki do oddzielnych studzienek, aby umożliwić równoległe oznaczanie aktywności w żelu i analizę immunoblot kompleksów OXPHOS. Usunąć niebieski bufor katodowy za pomocą pipety. Zastąp 300 mililitrami niebieskiego bufora katodowego Coomassie i uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez noc w chłodni.

Przed zakończeniem elektroforezy należy przygotować aktywności w żelu zgodnie z manuskryptem i przechowywać je w ciemności w temperaturze pokojowej. Przerwij elektroforezę i odzyskaj żel. Wytnij plastikową torbę, aby można ją było otworzyć jak książkę.

Przetnij pasy i przenieś pasy żelu do plastikowych worków. Użyj zgrzewarki, aby uszczelnić dwie z trzech stron. Jeżeli przeprowadza się eksperymenty kontroli ujemnej, należy dodać inhibitory do testowych.

W przypadku trzech próbek eksperymentalnych dodać 20 mililitrów buforu aktywności w żelu. Usuń bąbelki i zamknij czwartą stronę plastikowej torby. Inkubuj pasy żelowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności i sprawdzaj co 15 minut.

Czas inkubacji różni się w zależności od ilości białka i kompleksów. Po inkubacji spłucz pasy żelu w wodzie, aby zatrzymać reakcję, i obraz na białym tle dla kompleksu I, kompleksu II, kompleksu IV lub czarnego tła dla kompleksu V. W tym przykładzie przeprowadzono złożoną dożylną aktywność w żelu w celu wizualizacji superkompleksów wyizolowanych ze świeżych mitochondriów wątroby myszy. Optymalna ilość digityniny dla tej próbki wynosi cztery gramy na gram, ponieważ zapewnia dobrą rozdzielczość kompleksu monomerycznego IV i superkompleksów o dużej masie cząsteczkowej.

Przy niższym stosunku prążki nie są przezroczyste i podczas elektroforezy zamieniają się w rozmaz, podczas gdy zastosowanie wyższego stosunku digitoniny prowadzi do rozerwania superkompleksów o dużej masie cząsteczkowej. Mitochondria wątroby wyizolowane od jednej myszy potraktowano optymalną ilością digitoniny w celu ekstrakcji superkompleksów oddechowych. Ruchliwość elektroforetyczna kompleksów OXPHOS jest nieznacznie zmniejszona, gdy białka są rozdzielane przy użyciu hybrydowych przezroczystych/niebieskich natywnych warunków PAGE, w porównaniu ze standardowym natywnym PAGE, ze względu na zmniejszoną ilość błękitu Coomassie.

Ta zmiana ruchliwości jest większa w przypadku złożonych monomerów dożylnych, a następnie złożonych monomerów V i kompleksu I. Niebieskie tło jest niższe w hybrydowej przezroczystej natywnej/niebieskiej natywnej PAGE w porównaniu z niebieską natywną PAGE. Wysokie poziomy tła następujące po niebieskiej natywnej PAGE całkowicie maskują barwienie aktywności w żelu dla kompleksu II i wzmacniają szum tła związany z aktywnością dimerów kompleksu IV. W przypadku tego protokołu miareczkowanie próbek będących przedmiotem zainteresowania różnymi ilościami digitoniny ma kluczowe znaczenie w celu zidentyfikowania warunków, które umożliwiają optymalną rozpuszczalność, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności enzymów i fizjologicznych interakcji białek.

Wszystkie kroki związane z odlewaniem żelu powinny być wykonywane skrupulatnie, aby uzyskać optymalny gradient dla prawidłowej separacji próbek. Należy również zachować szczególną ostrożność przy manipulowaniu tymi dużymi i delikatnymi żelami. Zawsze trzymaj je kilkoma palcami, używając wysokoprocentowej końcówki żelu.

Dzięki tej hybrydowej metodzie PAGE bezbarwnej/niebieskiej próbki są poddawane działaniu anionowego barwnika Coomassie blue tylko przez krótki czas na początku elektroforezy, bez narażenia na działanie jakichkolwiek innych detergentów. Pozwala to na rozdzielanie i rozdzielanie superkompleksów tak skutecznie, jak w przypadku tradycyjnych metod niebieskiego natywnego PAGE, przy jednoczesnym unikaniu negatywnego wpływu wysokich poziomów błękitu Coomassie na testy aktywności w żelu i labilne interakcje białko-białko w superkompleksach. Dzięki temu protokołowi możliwe jest zatem połączenie precyzyjnych i szybkich pomiarów aktywności w żelu z technikami analitycznymi obejmującymi elektroforezę 2D, immunodetekcję i/lub analizę odnoszącą się do proteomiki superkompleksów.