Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej (CBMC) stały się potencjalnym źródłem komórek dla medycyny regeneracyjnej, ponieważ typowanie ludzkiego antygenu leukocytów jest niezbędne dla systemu bankowania komórek. Pluripotencjalne komórki macierzyste indukowane przez CBMC (CMBC-iPSC) mogą różnicować się w keratynocyty i fibroblasty. Aby wygenerować organoid skóry 3D, korzystamy z badań dermatologicznych.

Zacznij od hodowli CBMC-iPSC na 100-mililitrowych płytkach pokrytych witronektyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 80% konfluacji, umyj kultury PBS i potraktuj je jednym mililitrem jednomilimolowego EDTA na płytkę przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję trzema mililitrami pożywki E8 na płytkę i zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach pożywki E8 do liczenia i przenieść jednokrotnie od 10 do szóstych komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić przeniesione komórki za pomocą 2,5-mililitrowego podłoża do tworzenia ciała embrionalnego, uzupełnionego 10-mikromolową kinazą związaną z rho lub inhibitorem ROCK. Za pomocą pipety przenieś 125-mikrolitrowe kropelki komórek na niepowlekaną pokrywę płytki hodowlanej.

Po umieszczeniu wszystkich kropel odwróć naczynie, aby kropelki wisiały z pokrywki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj pokrywkę świeżą pożywką E8 i przenieś roztwór ciała embrionalnego do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Pozostawić ciała zarodkowe na jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić ciała zarodkowe ze świeżą pożywką E8 do hodowli na 90-milimetrowej szalce Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do ich różnicowania.

W celu różnicowania keratynocytów CBMC-iPSC należy zastąpić pożywkę E8 z hodowli ciała embrionalnego świeżą pożywką E8, uzupełnioną jednym nanogramem na mililitr białka morfogenetycznego kości 4 na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zbierz ciała embrionalne do 50-mililitrowej stożkowej probówki, jak pokazano, i pozwól ciału osiąść przez minutę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp supernatant sześcioma mililitrami pożywki różnicującej keratynocyty 1 lub KDM1, uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK i przenieś ciała embrionalne do 100-milimetrowej płytki pokrytej kolagenem typu IV.

W dniach od zera do ósmego hodowli należy zastąpić pożywkę co drugi dzień świeżym KDM1, uzupełnionym trzymikromolowym kwasem retinowym i 25 nanogramami na mililitr każdego białka morfogenetycznego kości 4 i naskórkowego czynnika wzrostu. Między dziewiątym a dwunastym dniem co drugi dzień zastępuj pożywkę KDM2, uzupełnioną trzymikromolowym kwasem retinowym, 25 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości 4 i 20 nanogramami na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu. Między 13 a 30 dniem zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM3, uzupełnioną 10 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości 4 i 20 nanogramami na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu.

W celu różnicowania fibroblastów CBMC-iPSC należy ponownie zawiesić hodowlę ciała embrionalnego w sześciu mililitrach pożywki różnicującej fibroblasty 1, uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK i przenieść zawiesinę ciała zarodka do 100-milimetrowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej. Po trzech dniach inkubacji należy traktować kulturę 0,5-nanomolowym białkiem morfogenetycznym kości 4 przez cztery dni, przed zmianą pożywki na pożywkę do różnicowania fibroblastów 2. W siódmym dniu hodowli zmieniaj pożywkę na FDM2 co drugi dzień przez tydzień.

W 14 dniu hodowli odłączyć komórki za pomocą jednomilimolowego EDTA, jak pokazano, i zebrać komórki w trzech mililitrach pożywki różnicującej fibroblasty 2 do odwirowania. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki różnicującej fibroblasty 1 w celu zliczenia i przenieść dwa razy od 10 do szóstego komórki do niepowlekanego naczynia. W 21 dniu hodowli przenieś dwie komórki od 10 do szóstej z hodowli do 100-milimetrowego naczynia pokrytego kolagenem typu I w świeżej pożywce do różnicowania fibroblastów 1.

W 28 dniu hodowli przenieś dwa razy 10 do sześciu fibroblastów pochodzących z iPSC do nowego niepowlekanego naczynia. Aby uzyskać trójwymiarowe generowanie organoidów skóry, zbierz fibroblasty pochodzące z iPSC z hodowli i przenieś dwa razy od 10 do jednej piątej komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić granulkę fibroblastów w 1,5 mililitra pożywki do różnicowania fibroblastów 1 i 1,5 mililitra zneutralizowanego roztworu kolagenu typu I.

Inkubować komórki na wkładce w sześciodołkowej mikropłytce przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Gdy roztwór stężeje, dodaj dwa mililitry pożywki na górę wkładki i trzy mililitry na dno studzienki. Następnie umieść matrycę fibroblastów w inkubatorze na pięć do siedmiu dni, aż żelowanie zostanie zakończone, a matryca przestanie się kurczyć.

Pod koniec inkubacji zbierz keratynocyty pochodzące z iPSC i przenieś jednokrotnie od 10 do szóstych komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w 50 do 100 mikrolitrach podłoża nabłonkowego o niskiej zawartości wapnia 1 i zastąpić pożywkę nad macierzą fibroblastów roztworem komórek keratynocytów. Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp pożywkę w górnej części wkładu dwoma mililitrami pożywki nabłonkowej 1, a pożywkę w dolnej studzience trzema mililitrami tego samego i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Po dwóch dniach wymień pożywkę we wkładce i studzience na normalne podłoże z nabłonka wapnia 2 na dwa dodatkowe dni hodowli. W czwartym dniu hodowli usuń całą pożywkę i dodaj trzy mililitry pożywki rogowacowej tylko do dolnej studzienki, aby wytworzyć granicę faz powietrze-ciecz. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na okres do 14 dni przed pobraniem organoidu skórnego 3D w celu dalszej analizy.

Keratynocyty pochodzące z CBMC-iPSC mają morfologię podobną do keratynocytów pierwotnych, a ekspresja markerów keratynocytów jest zwiększona w tych komórkach. Fibroblasty pochodzące z CBMC-iPSC mają morfologię podobną do fibroblastów pierwotnych, a ekspresja markera pluripotencjalnych komórek macierzystych Oct-4 jest regulowana w dół, podczas gdy markery fibroblastów są regulowane w górę. Grubość organoidu skórnego 3D zwiększa się podczas hodowli 3D, co potwierdza, że organoid skóry 3D jest generowany z keratynocytów i fibroblastów pochodzących z iPSC.

Po dwóch tygodniach przeszczepiony organoid skóry 3D skutecznie integruje się ze skórą myszy biorcy, co potwierdza analiza HNE. Co więcej, markery dojrzewania keratynocytów i różnicowania naskórka są wyrażane w organoidach skóry 3D pochodzących z CBMC-iPSC, wykazując funkcjonalne różnicowanie, wydajne szczepienie i skuteczne gojenie ubytków skóry myszy. Używaliśmy w przeszłości z podłożem o wysokiej zawartości wapnia, które indukuje warstwowe warstwy organoidów skórnych 3D, aby naśladować bliską skórę.

Analiza pokazuje, że skóra jest rozwarstwiona. CBMC-iPSC są potencjalnym źródłem komórek do przeszczepów skóry, a organoidy 3D skóry pochodzące z CBMC-iPSC mogą być wykorzystywane w badaniach związanych z dermatologią, kosmetycznymi badaniami przesiewowymi i medycyną regeneracyjną.