Name: Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę generowania trójwymiarowych organoidów skóry z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych krwi pępowinowej. Protokół obejmuje różnicowanie keratynocytów i fibroblastów oraz tworzenie humanizowanego modelu mysiego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Opieki Zdrowotnej, Ministerstwa Zdrowia, Opieki Społecznej i Spraw Rodzinnych, Republika Korei (H16C2177, H18C1178).

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt Laboratoryjnych, Przewodnikiem po Opiece i Użytkowaniu Zwierząt Laboratoryjnych oraz Wytycznymi i Zasadami Eksperymentów z Gryzoniami dostarczonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Katolickiego Uniwersytetu Korei. Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board Katolickiego Uniwersytetu Korei (CUMC-2018-0191-01). W 2017 r. IACUC i Wydział Zwierząt Laboratoryjnych (DOLA) Katolickiego Uniwersytetu Korei, Kampus Songeui akredytowały laboratorium Korea Excellence Animal Koreańskiej Agencji ds. Żywności i Leków, a w 2018 r. uzyskały pełną akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. Różnicowanie komórek skóry od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
<ol>
	<li>Średni preparat 
	UWAGA: Przechowuj całe podłoże w temperaturze 4 °C w ciemnym otoczeniu przez okres do 3 miesięcy. Przefiltruj całe medium za pomocą systemu filtrów polieterosulfonowych 0,22 μm przed użyciem do sterylizacji. Wszystkie podłoża były dostępne w łącznej objętości 500 ml.
	<ol>
		<li>Przygotować KDM1 (pożywkę do różnicowania keratynocytów 1). Wymieszaj Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/F12 (3:1) z 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,3 mmol/l kwasu L-askorbinowego, 5 μg/ml insuliny i 24 μg/ml adeniny.</li>
		<li>Przygotuj KDM2 (pożywkę do różnicowania keratynocytów 2). Zmieszaj zdefiniowaną pożywkę bez keratynocytów bez surowicy (patrz tabela materiałów) z 0,3 mmol/l kwasu L-askorbinowego, 5 μg/ml insuliny i 10 μg/ml adeniny. 
		UWAGA: Zdefiniowana pożywka wolna od keratynocytów w surowicy jest zoptymalizowana pod kątem wspomagania wzrostu i ekspansji keratynocytów.</li>
		<li>Przygotować KDM3 (pożywkę do różnicowania keratynocytów 3). Zmieszanie zdefiniowanej pożywki bez keratynocytów z pożywką bez surowicy keratynocytów (1:1) Szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów. 
		UWAGA: Pożywka wolna od keratynocytów w surowicy jest zoptymalizowana pod kątem wzrostu i utrzymania keratynocytów.</li>
		<li>Przygotować FDM1 (pożywkę do różnicowania fibroblastów 1). Wymieszaj pożywkę DMEM/F12 (3:1) z 5% FBS, 5 μg/ml insuliny, 0,18 mM adeniny i 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).</li>
		<li>Przygotować FDM2 (pożywkę do różnicowania fibroblastów 2). Wymieszaj pożywkę DMEM/F12 (1:1) z 5% FBS i 1% aminokwasów endogennych.</li>
		<li>Przygotować EP1 (podłoże nabłonkowe 1). Wymieszaj DMEM/F12 (3:1) z 4 mM L-glutaminy, 40 μM adeniny, 10 μg/ml transferyny, 10 μg/ml insuliny i 0,1% FBS.</li>
		<li>Przygotuj EP2 (podłoże nabłonkowe 2). Wymieszaj EP1 i 1,8 mM chlorku wapnia.</li>
		<li>Przygotować EP3 (podłoże nabłonkowe 3, podłoże rogowaciowe). Wymieszaj pożywkę F12 z 4 mM L-glutaminy, 40 μM adeniny, 10 μg/ml transferyny, 10 μg/ml insuliny, 2% FBS i 1,8 mM chlorku wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie ciała embrionalnego
	<ol>
		<li>Wygeneruj CBMC-iPSC przy użyciu protokołu pokazanego w poprzednim badaniu12.</li>
		<li>Pokryj naczynia hodowlane, używając witronektyny. Przygotuj 5 ml do pokrycia naczynia o średnicy 100 mm.
		<ol>
			<li>Rozmrozić i ponownie zawiesić 50 μl 0,5 mg/ml witronektyny (końcowe stężenie: 5 μg/ml) z 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodaj roztwór do naczyń i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Zassać materiał powłokowy przed użyciem (nie wyschnąć).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utrzymywać iPSC pochodzące z CBMC na pokrytej witronektyną płytce o średnicy 100 mm i codziennie zmieniać pożywkę iPSC (E8) w temperaturze 37 °C z 10% CO2 .</li>
		<li>Generuj ciała embrionalne (EB) przy użyciu protokołu pokazanego w poprzednim badaniu15 (opisanego krótko w następujący sposób). Rozpręż iPSC, zmieniając pożywkę, aż komórki osiągną 80% konfluencji. Przy 80% konfluencji usuń podłoże i przemyj PBS.</li>
		<li>Potraktuj komórki 1 ml 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty i zebrać komórki przy użyciu 3 ml pożywki E8. Odwirować komórki przy 250 x g przez 2 min.</li>
		<li>Odessać supernatant i nałożyć 5 ml pożywki E8 na komórki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 1 x 106 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g przez 2 min.</li>
		<li>Ponownie zawiesić przeniesione komórki za pomocą 2,5 ml pożywki do tworzenia EB z inhibitorem 10 μM kinazy związanej z Rho (ROCK). Upuść 1 x 104 komórki (25 μl/kroplę) na niepowlekaną pokrywkę płytki hodowlanej za pomocą pipety wielokanałowej o pojemności 10–100 μl. Utwórz 100 EB z 1 x 106 komórek (1 x 104 komórki/1 EB). Odwróć naczynie i zawieś na kropli na pokrywce. 
		UWAGA: Inhibitor ROCK jest potrzebny na etapie przyłączania w procesie konserwacji i różnicowania. Inhibitor ROCK należy dodać tylko na etapie agregacji EB.</li>
		<li>Kropelki inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 dzień.</li>
		<li>Następnego dnia zbierz 100 EB i użyj ich do różnicowania. Umyć pokrywkę płytki pożywką iPSC (pożywka E8) lub PBS i zebrać jej zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Utrzymuj EB na poziomie RT przez 1 minutę, aby je uspokoić. Odessać supernatant, ponownie zawiesić EB pożywką E8 i utrzymywać je na szalce Petriego o średnicy 90 mm aż do różnicowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie CBMC-iPSC w keratynocyty 
	UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem różnicowania keratynocytów od CBMC-iPSC, zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A.
	<ol>
		<li>Zbierz 100 EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z pożywką iPSC lub PBS. Utrzymuj na poziomie RT przez 1 minutę, aby ustabilizować EB. Upewnij się, że osiadają na dnie stożkowej rurki. Odessać supernatant i ponownie zawiesić EB pożywką E8 z 1 ng/ml białka morfogenetycznego kości 4 (BMP4). Przenieść EB na płytkę Petriego o średnicy 90 mm i utrzymywać je w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 1 dzień.</li>
		<li>Pokryj naczynia hodowlane, używając kolagenu typu IV. Przygotuj 5 ml kolagenu typu IV, aby pokryć naczynie o średnicy 100 mm.
		<ol>
			<li>Rozmrozić i ponownie zawiesić roztwór kolagenu typu IV (końcowe stężenie: 50 μg/ml) z 0,05 N HCl. Dodać roztwór do szalek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przed użyciem odessać materiał powlekający (nie wyschnąć). 
			UWAGA: Przed użyciem talerzy umyj naczynia 3x PBS, aby usunąć kwas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zebrać EB (krok 1.3.1) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i utrzymywać je w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby je ustabilizować. Upewnij się, że osiądą na dnie stożkowej probówki, odessaj supernatant i ponownie zawieś EB w 6 ml KDM1 z 10 μM inhibitorem ROCK. Przenieś EBs do pokrytej kolagenem płytki 100 mm typu IV. 
		UWAGA: Inhibitor ROCK należy dodawać tylko na etapie przyłączania EB.</li>
		<li>Między 0 a 8 dniami zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM1 z 3 μM kwasem retinowym (RA) i 25 ng/ml BMP4 i EGF. Utrzymuj EB na poziomie 37 °C przy 5% CO2 .</li>
		<li>Między 9 a 12 dniem zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM2 z 3 μM RA, 25 ng/ml BMP4 i 20 ng/ml EGF.</li>
		<li>Między 13 a 30 dniem zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM3 z 10 ng/ml BMP4 i 20 ng/ml EGF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie CBMC-iPSC w fibroblasty 
	UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem różnicowania fibroblastów od CBMC-iPSC, zobacz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.
	<ol>
		<li>Pokryj naczynia hodowlane, używając macierzy błony podstawnej. Przygotuj 5 ml do pokrycia naczynia o średnicy 100 mm.
		<ol>
			<li>Rozmrozić matrycę błony podstawnej (stężenie końcowe: 600 ng/ml) i rozcieńczyć ją podłożem DMEM/F12. Dodać roztwór do szalek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zassać materiał powłokowy przed użyciem (nie wyschnąć).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zebrać 100 EB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety z pożywką iPSC lub PBS. Utrzymuj na poziomie RT przez 1 minutę, aby ustabilizować EB. Upewnij się, że osiadają na dnie stożkowej rurki. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić EB za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl w 6 ml FDM1 z inhibitorem 10 μM ROCK. Przenieść EBs (z pożywką) na naczynie o średnicy 100 mm pokrytej matrycą z membraną podstawną i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Odświeżaj FDM1 co drugi dzień przez 3 dni. 
		UWAGA: Inhibitor ROCK należy dodawać tylko na etapie przyłączania EB.</li>
		<li>Dodać 0,5 nM białka morfogenetycznego kości 4 (BMP 4) do FDM1 między 4 a 6 dniem.</li>
		<li>W 7 dniu zmieniaj pożywkę na FDM2 co drugi dzień przez 1 tydzień.</li>
		<li>W dniu 14 dodać 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 min. Zebrać komórki za pomocą 3 ml FDM2 i odwirować przy 250 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml FDM1.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru, ponownie zawieś 2 x 106 komórek za pomocą pożywki FDM1 i przenieś komórki do niepowlekanego naczynia. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.</li>
		<li>Pokryj naczynia kulturowe, używając kolagenu typu I. Przygotuj 5 ml do pokrycia naczynia o średnicy 100 mm. Rozcieńczyć roztwór kolagenu typu I (końcowe stężenie: 50 μg/ml) w 0,02 N kwasie octowym. Dodać roztwór do szalek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Odessać materiał powlekający przed użyciem (nie wyschnąć). 
		UWAGA: Przed użyciem talerzy umyj naczynia 3x PBS, aby usunąć kwas.</li>
		<li>W 21 dniu dodać 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zebrać komórki z 3 ml FDM1 i odwirować przy 250 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml FDM1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 2 x 106 komórek do pokrytej kolagenem płytki 100 mm typu I z pożywką FDM1. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.</li>
		<li>W dniu 28 dodać 1 ml 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zebrać komórki za pomocą 3 ml FDM1 i odwirować przy 250 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml FDM1. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś 2 x 106 komórek do niepowlekanego naczynia z pożywką FDM1. Utrzymuj komórkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj pożywkę co drugi dzień. 
		UWAGA: fibroblasty pochodzące z iPSC proliferują jak pierwotna linia komórkowa fibroblastów i przechodzą do 10 pasaży. W tym badaniu do dalszej analizy wykorzystaliśmy fibroblasty pochodzące z iPSC o dwóch do pięciu pasażach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zastosowanie zróżnicowanych komórek pochodzących z hiPSC
<ol>
	<li>Generowanie organoidu 3D skóry
	<ol>
		<li>Zneutralizowany kolagen typu I przygotuj na lodzie, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Jako stężenie końcowe użyj 3 mg / ml dla kolagenu typu I (stężenie podstawowe kolagenu typu I wynosi 3,47 mg / ml) i upewnij się, że końcowa objętość mieszaniny wynosi 5 ml. Oblicz objętość 10x PBS (objętość końcowa/10 = 0,5 ml). Oblicz objętość kolagenu typu I, który ma być użyty (objętość końcowa x końcowe stężenie kolagenu / stężenie kolagenu podstawowego = 5 ml x 3 mg / ml / 3,47 mg / ml = 4,32 ml). Obliczyć objętość 1 N NaOH (objętość kolagenu do użycia x 0,023 ml = 0,1 ml). Obliczyć objętość dH2O (objętość końcowa - objętość kolagenu - objętość 10x PBS - objętość 1 N NaOH = 5 ml - 4,32 ml - 0,5 ml - 0,1 ml = 0,08 ml). Wymieszaj zawartość tubki i trzymaj ją na lodzie, aż będzie gotowa do użycia.</li>
		<li>Dodać 1 ml EDTA do fibroblastów pochodzących z iPSC z kroku 1.4.10 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zebrać oderwane komórki, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść 2 x 105 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki fibroblastów pochodzących z iPSC w 1,5 ml FDM1 i zneutralizować roztwór kolagenu typu I (1:1). 
		UWAGA: Delikatnie wymieszaj roztwór, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
		<li>Umieścić wkładkę membranową na mikropłytce 6-dołkowej, przenieść mieszaninę do wkładki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. 
		UWAGA: Nie przesuwaj płyt.</li>
		<li>Po potwierdzeniu żelowania dodaj 2 ml pożywki na górę wkładki i 3 ml na dno studzienki. Inkubować macierz fibroblastów i kolagenu w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5-7 dni, aż żelowanie zostanie zakończone i nie będzie się kurczyć.</li>
		<li>Po całkowitym żelowaniu odłącz keratynocyty pochodzące z iPSC (z kroku 1.3.6) za pomocą EDTA. Dodać 1 ml EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty. Zbierz oderwane komórki, policz je za pomocą hemocytometru i przenieś 1 x 106 komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 250 x g przez 2 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić 1 x 106 komórek w 50-100 μl podłoża nabłonkowego o niskiej zawartości wapnia 1 (EP1).</li>
		<li>Odessać całe podłoże w matrycy (patrz krok 2.1.5) i zasiać 1 x 106 komórek keratynocytów pochodzących z iPSC na każdej warstwie fibroblastów. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 30 min. 
		UWAGA: Nie przesuwaj płytki i nie dodawaj żadnego podłoża do przyłączenia keratynocytów.</li>
		<li>Dodaj 2 ml EP1 na górę wkładki i 3 ml EP1 na dno studzienki.</li>
		<li>Po 2 dniach odessać całą pożywkę z płytki wkładanej do membrany i zmieniać pożywkę na normalny wapń EP2 przez 2 dni.</li>
		<li>Po 2 dniach odessać całą pożywkę i dodać 3 ml pożywki rogowacowej tylko na dno, aby wytworzyć granicę faz powietrze-ciecz.</li>
		<li>Utrzymuj organoid skórny 3D przez okres do 14 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i zmieniaj podłoże co drugi dzień. Zbierz organoid skóry 3D, przecinając krawędź wkładki i użyj go do dalszych badań nad barwieniem i przeszczepem skóry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeszczep skóry
	<ol>
		<li>Przeprowadzić znieczulenie wziewne na myszach NOD/scid (samce, 6 tygodni), przy użyciu standardowej, instytucjonalnie zatwierdzonej metody. Aby uzyskać przeszczep skóry, ogol futro na grzbiecie skóry każdej myszy.</li>
		<li>Usuń fragment skóry myszy o wymiarach 1 cm x 2 cm za pomocą zakrzywionych nożyczek z kleszczami.</li>
		<li>Umieść organoid skórny 3D pochodzący z CBMC-iPSC w miejscu ubytku i zszyj metodą opatrunku wiązanego z jedwabnymi szwami.</li>
		<li>Obserwuj myszy przez 2 tygodnie i poświęć je do analizy histologicznej. Protokół barwienia został zweryfikowany w poprzednich badaniach16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetics%3A+its+practice+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomimetics: its practice and theory.</a> Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).</li>
<li>Madison, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+function+of+the+skin%3A+%22la+raison+d%27etre%22+of+the+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Barrier function of the skin: "la raison d'etre" of the epidermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).</li>
<li>Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+for+skin+tissue+engineering+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Stem cells for skin tissue engineering and wound healing.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).</li>
<li>Dixit, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+challenges+associated+with+artificial+skin+grafts%3A+available+solutions+and+stem+cells+in+future+design+of+synthetic+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin.</a> Journal of Biological Engineering. 11, 49(2017).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and nuclear reprogramming.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).</li>
<li>Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+immunogenicity+of+autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).</li>
<li>Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haplotype-based+banking+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation%3A+potential+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations.</a> Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+HLA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">A brief history of HLA.</a> Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Rim, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+of+national+banking+project+on+homozygous+HLA-typed+induced+pluripotent+stem+cells+in+South+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).</li>
<li>Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-haplotype+banking+and+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">HLA-haplotype banking and iPS cells.</a> Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).</li>
<li>Pappas, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings%3A+human+leukocyte+antigen+haplo-homozygous+induced+pluripotent+stem+cell+haplobank+modeled+after+the+california+population%3A+evaluating+matching+in+a+multiethnic+and+admixed+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).</li>
<li>Lin, Y., Chen, G. Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stembook.org/node/6632">https://www.stembook.org/node/6632</a> (2008).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+complex+skin+structure+via+layered+co-culture+of+keratinocytes+and+fibroblasts+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).</li>
<li>Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+technological+updates+and+clinical+applications+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells.</a> The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
<li>Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+heart+extract+facilitates+the+differentiation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+into+heart+muscle+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).</li>
<li>Stecklum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+mediated+by+co-culture+of+human+umbilical+cord+blood+stem+cells+with+murine+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 183-191 (2015).</li>
<li>Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Pellet+Formation+from+Cord+Blood-derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55988(2017).</li>
<li>Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Cord+Blood+and+Cord+Blood-derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Cartilage+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration.</a> Cell Transplantation. , (2018).</li>
<li>Shevde, N. K., Mael, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+embryoid+body+formation+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+fibroblasts+demonstrate+augmented+production+and+assembly+of+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 48 (2), 112-122 (2012).</li>
<li>Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of keratinocyte differentiation.</a> Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).</li>
<li>Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+grown+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes grown at the air-liquid interface.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).</li>
<li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cultivation+of+keratinocytes+with+an+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface.</a> Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).</li>
<li>Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+pathways+of+filaggrin+and+loricrin--two+major+proteins+expressed+by+terminally+differentiated+epidermal+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin--two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes.</a> Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).</li>
<li>Hohl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+loricrin.+Structure+and+function+of+a+new+class+of+epidermal+cell+envelope+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).</li>
<li>Bern, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Original+and+modified+technique+of+tie-over+dressing%3A+Method+and+application+in+burn+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients.</a> Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).</li>
<li>Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Running+Barbed+Tie-over+Dressing%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery+-+Global+Open%22%5BJournal%5D)">The Running Barbed Tie-over Dressing.</a> Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 2 (4), 137(2014).</li>
<li>Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+cell+sorting+of+fibroblasts+and+keratinocytes+creates+an+organotypic+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent.</a> Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+folliculogenic+human+epithelial+stem+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 5, 3071(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ludzkie iPSC zostały zasugerowane jako nowa alternatywa dla spersonalizowanej medycyny regeneracyjnej17. Spersonalizowane iPSC pochodzące od pacjenta odzwierciedlają charakterystykę pacjenta, którą można wykorzystać do modelowania choroby, badań przesiewowych leków i przeszczepu autologicznego18,19. Zastosowanie iPSC pochodzących od pacjenta może również przezwyciężyć problemy związane z komórkami pierwotnymi, brakiem odpowiedniej liczby k...

Skóra pokrywa najbardziej zewnętrzną powierzchnię ciała i chroni organy wewnętrzne. Skóra pełni różne funkcje, w tym ochronę przed patogenami, wchłanianie i magazynowanie wody, regulowanie temperatury ciała i wydalanie produktów przemiany materii2. Przeszczepy skóry można sklasyfikować w zależności od źródła skóry; Przeszczepy z użyciem skóry od innego dawcy nazywane są przeszczepami allogenicznymi, a przeszczepy z użyciem własnej skóry pacjenta są autoprzeszczepami. Chociaż autoprzeszczep jest preferowanym sposobem leczenia ze względu na niskie ryzyko odrzucenia, biopsje skóry są trudne do wykonania u pacjentów z ciężkimi zmianami chorobowymi lub niewystarczającą liczbą komórek skóry. U pacjentów z ciężkimi oparzeniami do pokrycia dużych obszarów potrzeba trzykrotnie większej liczby komórek skóry. Ograniczona dostępność komórek skóry z organizmu pacjenta prowadzi do sytuacji, w których konieczny jest przeszczep allogeniczny. Przeszczep allogeniczny jest tymczasowo stosowany do czasu przeprowadzenia przeszczepu autologicznego, ponieważ zwykle jest odrzucany przez układ odpornościowy gospodarza po około 1 tygodniu3. Aby przezwyciężyć odrzucenie przez układ odpornościowy pacjenta, przeszczepy muszą pochodzić ze źródła o tej samej tożsamości immunologicznej co pacjent4.
Ludzkie iPSC są nowym źródłem komórek do terapii komórkami macierzystymi5. Ludzkie iPSC są generowane z komórek somatycznych przy użyciu czynników przeprogramowujących, takich jak OCT4, SOX2, Klf4 i c-Myc6. Wykorzystanie ludzkich komórek iPS pozwala przezwyciężyć etyczne i immunologiczne problemy związane z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC)7,8. Ludzkie iPSC mają pluripotencję i mogą różnicować się w trzy warstwy zarodkowe9. Obecność HLA, kluczowego czynnika w medycynie regeneracyjnej, determinuje odpowiedź immunologiczną i możliwość odrzucenia10. Zastosowanie iPSC pochodzących od pacjentów rozwiązuje problemy związane z ograniczeniem źródeł komórkowych i odrzuceniem przez układ odpornościowy. CBMC pojawiły się również jako alternatywne źródło komórek dla medycyny regeneracyjnej11. Obowiązkowe typowanie HLA, które ma miejsce podczas bankowania CBMC, może być łatwo wykorzystane do badań i transplantacji. Co więcej, homozygotyczne iPSC typu HLA mogą mieć szerokie zastosowanie u różnych pacjentów12. Bank CBMC-iPSC to nowatorska i skuteczna strategia terapii komórkowej i allogennej medycyny regeneracyjnej12,13,14. W tym badaniu wykorzystujemy CBMC-iPSC, zróżnicowane na keratynocyty i fibroblasty, i generujemy warstwowe warstwy skóry 3D. Wyniki tego badania sugerują, że organoid skóry 3D pochodzący z CBMC-iPSC jest nowym narzędziem do badań dermatologicznych in vitro i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów</td></tr><tr><td>AggreWell Medium (pożywka do tworzenia EB)</td><td>STEMCELL</td><td>05893</td><td>Tworzenie</td></tr><tr><td>EB Przeciwciało anty-fibronektynowe</td><td>abcam</td><td>ab23750</td><td>Marker fibroblastów</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-KRT14</td><td>abcam</td><td>ab7800</td><td>Marker keratynocytów</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Loricrin</td><td>abcam</td><td>ab85679</td><td>Marker warstwy rogowej naskórka</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-p63</td><td>abcam</td><td>ab124762</td><td>Marker keratynocytów</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-wimentyny</td><td>Santa cruz</td><td>sc-7558</td><td>Marker fibroblastów</td></tr><tr><td>TAŚMA WSPOMAGAJĄCA ELASTYCZNĄ TKANINĘ</td><td>Johnson & </td><td></td><td>Johnson-Bandage</td></tr><tr><td>Macierz błony podstawnej (Matrigel)</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów</td></tr><tr><td>JEDWAB</td><td>szew AILEEE</td><td>SK617</td><td>Przeszczep skóry</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Składnik podłoża nabłonkowego do organoidu skóry 3D</td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>organoid</td></tr> <tr><td>skóry 3DKolagen typu IV</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-29010</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów</td></tr><tr><td>Zdefiniowane keratynocyty-Pożywka wolna surowicy</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>różnicującej DMEM/F12 Podłoże</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>Składnik pożywka różnicująca</td></tr><tr><td>Essential 8 pożywka</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>pożywka iPSC</td></tr><tr><td>FBS, Kwalifikowany</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów i keratynocytów</td></tr><tr><td>Suplement Glutamax&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Invtrogen</td><td>12585-014</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla fibroblastów i keratynocytów</td></tr><tr><td>Standardowe zakrzywione nożyczki Iris</td><td>Professional</td><td>PC-02.10</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Podłoże wolne od keratynocytów</td><td>Gibco</td><td>17005-042</td><td>Składnik podłoża różnicującego do keratynocyt</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów</td></tr><tr><td>MEM Aminokwas endogenny</td><td>Gibco</td><td>1140050</td><td>Składnik pożywki różnicującej do fibroblastów</td></tr><tr><td>Meriam Kleszcze Kciuk 16 cm</td><td>HIROSE</td><td>HC 2265-1</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc SCID/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td>Szczep myszy do przeszczepu skóry</td></tr><tr><td>szalka Petriego 90 mm</td><td>Hyundai Micro</td><td>H10090</td><td>Wyroby z tworzywa sztucznego</td></tr><tr><td>Rekombinowany człowiek BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko EGF</td><td>R& D</td><td>236-EG</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Składnik pożywki różnicującej dla keratynocytów</td></tr><tr><td>T/C Petridish 100 mm, 240/bx</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Wyroby z tworzyw sztucznych</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma</td><td>T3705</td><td>Składnik podłoża nabłonkowego dla organoidu 3D skóry</td></tr><tr><td>Wkładki membranowe pokryte kolagenem Transwell-COL& nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3492</td><td>Wyroby z tworzywa sztucznego do organoidów skórnych 3D&nbsp;</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life technologies</td><td>A14700</td><td>Kultura iPSC</td></tr><tr><td>Y-27632 Hodowla dichlorowodorku</td><td>peprotechu</td><td>1293823</td><td>iPSC</td></tr></tbody></table>

generowanie organoidu 3d skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Skóra jest największym organem ciała i pełni wiele funkcji. Skóra działa jako fizyczna bariera i obrońca organizmu oraz reguluje funkcje organizmu. Biomimetyka to imitacja modeli, systemów i elementów natury w celu rozwiązywania złożonych problemów ludzkich1. Biomimetyka skóry jest użytecznym narzędziem w badaniach nad chorobami in vitro i medycynie regeneracyjnej in vivo. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) charakteryzują się nieograniczoną proliferacją i zdolnością różnicowania do trzech listków rozrodczych. Ludzkie iPSC są generowane z różnych komórek pierwotnych, takich jak komórki krwi, keratynocyty, fibroblasty i inne. Wśród nich komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej (CBMC) pojawiły się jako alternatywne źródło komórek z perspektywy allogenicznej medycyny regeneracyjnej. CBMC są przydatne w medycynie regeneracyjnej, ponieważ typowanie ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) jest niezbędne dla systemu bankowania komórek. Udostępniamy metodę różnicowania CBMC-iPSC w keratynocyty i fibroblasty oraz do generowania organoidu 3D skóry. Keratynocyty i fibroblasty pochodzące z CBMC-iPSC mają cechy podobne do pierwotnej linii komórkowej. Organoidy skóry 3D są generowane przez nałożenie warstwy naskórka na warstwę skóry właściwej. Poprzez przeszczepienie tego organoidu skórnego 3D generowany jest humanizowany model myszy. Badanie to pokazuje, że 3D ludzki organoid skóry pochodzący z iPSC może być nowym, alternatywnym narzędziem do badań dermatologicznych in vitro i in vivo.

Skóra składa się w znacznej mierze z naskórka i skóry właściwej. Głównym typem komórek naskórka są keratynocyty, natomiast głównym typem komórek skóry właściwej są fibroblasty. Schemat różnicowania keratynocytów przedstawiono na Rycina 1AKomórki CBMC-iPSC były hodowane w naczyniu powlekanym witronektyną (Rysunek 1B). W niniejszym badaniu zróżnicowaliśmy CBMC-iPSC w keratynocyty i fibroblasty z wykorzystaniem tworzenia ciałek zar...

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej (CBMC) stały się potencjalnym źródłem komórek dla medycyny regeneracyjnej, ponieważ typowanie ludzkiego antygenu leukocytów jest niezbędne dla systemu bankowania komórek. Pluripotencjalne komórki macierzyste indukowane przez CBMC (CMBC-iPSC) mogą różnicować się w keratynocyty i fibroblasty. Aby wygenerować organoid skóry 3D, korzystamy z badań dermatologicznych.Zacznij od hodowli CBMC-iPSC na 100-mililitrowych płytkach pokrytych witronektyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 80% konfluacji, umyj kultury PBS i potraktuj je jednym mililitrem jednomilimolowego EDTA na płytkę przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki się odłączą, zatrzymaj reakcję trzema mililitrami pożywki E8 na płytkę i zbierz komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach pożywki E8 do liczenia i przenieść jednokrotnie od 10 do szóstych komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić przeniesione komórki za pomocą 2,5-mililitrowego podłoża do tworzenia ciała embrionalnego, uzupełnionego 10-mikromolową kinazą związaną z rho lub inhibitorem ROCK. Za pomocą pipety przenieś 125-mikrolitrowe kropelki komórek na niepowlekaną pokrywę płytki hodowlanej.Po umieszczeniu wszystkich kropel odwróć naczynie, aby kropelki wisiały z pokrywki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj pokrywkę świeżą pożywką E8 i przenieś roztwór ciała embrionalnego do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Pozostawić ciała zarodkowe na jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić ciała zarodkowe ze świeżą pożywką E8 do hodowli na 90-milimetrowej szalce Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do ich różnicowania.W celu różnicowania keratynocytów CBMC-iPSC należy zastąpić pożywkę E8 z hodowli ciała embrionalnego świeżą pożywką E8, uzupełnioną jednym nanogramem na mililitr białka morfogenetycznego kości 4 na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zbierz ciała embrionalne do 50-mililitrowej stożkowej probówki, jak pokazano, i pozwól ciału osiąść przez minutę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp supernatant sześcioma mililitrami pożywki różnicującej keratynocyty 1 lub KDM1, uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK i przenieś ciała embrionalne do 100-milimetrowej płytki pokrytej kolagenem typu IV.W dniach od zera do ósmego hodowli należy zastąpić pożywkę co drugi dzień świeżym KDM1, uzupełnionym trzymikromolowym kwasem retinowym i 25 nanogramami na mililitr każdego białka morfogenetycznego kości 4 i naskórkowego czynnika wzrostu. Między dziewiątym a dwunastym dniem co drugi dzień zastępuj pożywkę KDM2, uzupełnioną trzymikromolowym kwasem retinowym, 25 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości 4 i 20 nanogramami na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu. Między 13 a 30 dniem zmieniaj pożywkę co drugi dzień na KDM3, uzupełnioną 10 nanogramami na mililitr białka morfogenetycznego kości 4 i 20 nanogramami na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu.W celu różnicowania fibroblastów CBMC-iPSC należy ponownie zawiesić hodowlę ciała embrionalnego w sześciu mililitrach pożywki różnicującej fibroblasty 1, uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK i przenieść zawiesinę ciała zarodka do 100-milimetrowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej. Po trzech dniach inkubacji należy traktować kulturę 0,5-nanomolowym białkiem morfogenetycznym kości 4 przez cztery dni, przed zmianą pożywki na pożywkę do różnicowania fibroblastów 2. W siódmym dniu hodowli zmieniaj pożywkę na FDM2 co drugi dzień przez tydzień.W 14 dniu hodowli odłączyć komórki za pomocą jednomilimolowego EDTA, jak pokazano, i zebrać komórki w trzech mililitrach pożywki różnicującej fibroblasty 2 do odwirowania. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach pożywki różnicującej fibroblasty 1 w celu zliczenia i przenieść dwa razy od 10 do szóstego komórki do niepowlekanego naczynia. W 21 dniu hodowli przenieś dwie komórki od 10 do szóstej z hodowli do 100-milimetrowego naczynia pokrytego kolagenem typu I w świeżej pożywce do różnicowania fibroblastów 1.W 28 dniu hodowli przenieś dwa razy 10 do sześciu fibroblastów pochodzących z iPSC do nowego niepowlekanego naczynia. Aby uzyskać trójwymiarowe generowanie organoidów skóry, zbierz fibroblasty pochodzące z iPSC z hodowli i przenieś dwa razy od 10 do jednej piątej komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić granulkę fibroblastów w 1,5 mililitra pożywki do różnicowania fibroblastów 1 i 1,5 mililitra zneutralizowanego roztworu kolagenu typu I.Inkubować komórki na wkładce w sześciodołkowej mikropłytce przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Gdy roztwór stężeje, dodaj dwa mililitry pożywki na górę wkładki i trzy mililitry na dno studzienki. Następnie umieść matrycę fibroblastów w inkubatorze na pięć do siedmiu dni, aż żelowanie zostanie zakończone, a matryca przestanie się kurczyć.Pod koniec inkubacji zbierz keratynocyty pochodzące z iPSC i przenieś jednokrotnie od 10 do szóstych komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w 50 do 100 mikrolitrach podłoża nabłonkowego o niskiej zawartości wapnia 1 i zastąpić pożywkę nad macierzą fibroblastów roztworem komórek keratynocytów. Po 15 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp pożywkę w górnej części wkładu dwoma mililitrami pożywki nabłonkowej 1, a pożywkę w dolnej studzience trzema mililitrami tego samego i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.Po dwóch dniach wymień pożywkę we wkładce i studzience na normalne podłoże z nabłonka wapnia 2 na dwa dodatkowe dni hodowli. W czwartym dniu hodowli usuń całą pożywkę i dodaj trzy mililitry pożywki rogowacowej tylko do dolnej studzienki, aby wytworzyć granicę faz powietrze-ciecz. Następnie należy umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na okres do 14 dni przed pobraniem organoidu skórnego 3D w celu dalszej analizy.Keratynocyty pochodzące z CBMC-iPSC mają morfologię podobną do keratynocytów pierwotnych, a ekspresja markerów keratynocytów jest zwiększona w tych komórkach. Fibroblasty pochodzące z CBMC-iPSC mają morfologię podobną do fibroblastów pierwotnych, a ekspresja markera pluripotencjalnych komórek macierzystych Oct-4 jest regulowana w dół, podczas gdy markery fibroblastów są regulowane w górę. Grubość organoidu skórnego 3D zwiększa się podczas hodowli 3D, co potwierdza, że organoid skóry 3D jest generowany z keratynocytów i fibroblastów pochodzących z iPSC.Po dwóch tygodniach przeszczepiony organoid skóry 3D skutecznie integruje się ze skórą myszy biorcy, co potwierdza analiza HNE. Co więcej, markery dojrzewania keratynocytów i różnicowania naskórka są wyrażane w organoidach skóry 3D pochodzących z CBMC-iPSC, wykazując funkcjonalne różnicowanie, wydajne szczepienie i skuteczne gojenie ubytków skóry myszy. Używaliśmy w przeszłości z podłożem o wysokiej zawartości wapnia, które indukuje warstwowe warstwy organoidów skórnych 3D, aby naśladować bliską skórę.Analiza pokazuje, że skóra jest rozwarstwiona. CBMC-iPSC są potencjalnym źródłem komórek do przeszczepów skóry, a organoidy 3D skóry pochodzące z CBMC-iPSC mogą być wykorzystywane w badaniach związanych z dermatologią, kosmetycznymi badaniami przesiewowymi i medycyną regeneracyjną.

generation-3d-skin-organoid-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Ten protokół opisuje tworzenie samoorganizujących się naczyń krwionośnych z ludzkich pluripotencjalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Te sieci naczyń krwionośnych wykazują rozległą i połączoną sieć śródbłonka otoczoną perycytami, aktyną mięśni gładkich i ciągłą błoną podstawną.

Wytwarzanie organoidów ludzkich naczyń krwionośnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę wytwarzania organoidów nerkowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu warunków hodowli zawiesinowych. Główny nacisk tego badania kładzie się na określenie początkowej gęstości komórek i stężenia agonisty WNT, co przynosi korzyści badaczom zainteresowanym badaniami nad organoidami nerkowymi.

Generowanie organoidów nerkowych w zawiesinie z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Edycja genów za pośrednictwem TALEN-TALEN w locus AAVS1 umożliwia wysoce efektywną addycję transgenów w ludzkich iPSC. Protokół ten opisuje procedury przygotowania iPSC do dostarczania TALEN i wektora dawcy, transfekcji iPSC oraz selekcji i izolacji klonów iPSC w celu osiągnięcia ukierunkowanej integracji genu GFP w celu wygenerowania linii reporterowych.

Transfekcja, selekcja i zbieranie kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Ukierunkowanych na TALEN z genem GFP do AAVS1 Safe Harbor

Poznaj metodę generowania trójwymiarowych organoidów skóry z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych krwi pępowinowej. Protokół obejmuje różnicowanie keratynocytów i fibroblastów oraz tworzenie humanizowanego modelu mysiego.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Przeglądaj więcej filmów