Name: Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę badania stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans. Ta technika pozwala analizować patogenność i aktywację odpowiedzi stresowej w organizmie modelowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Bing-Yan Wang, dr Gena Tribble (Uniwersytet Teksański, Szkoła Stomatologii), dr Richardowi Lamontowi (Uniwersytet w Louisville, Szkoła Stomatologii) i dr Samuelowi Shelburne'owi (MD Anderson Cancer Center) za dostarczenie laboratoryjnych i klinicznych szczepów paciorkowców z grupy mitis. Dziękujemy również dr Keithowi Blackwellowi (Wydział Genetyki, Harvard Medical School) za szczepy C. elegans. Na koniec dziękujemy dr Danielle Garsin i jej laboratorium (The University of Texas, McGovern Medical School) za dostarczenie odczynników i szczepów robaków do przeprowadzenia badania. Niektóre szczepy robaków zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

1. Przygotowanie płytek agarowych THY (Todd-Hewitt Yeast Extract)
<ol>
	<li>Na 1 l pożywki dodać 30 g proszku Todda-Hewitta, 2 g ekstraktu drożdżowego i 20 g agaru do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 litrów. Dodać 970 ml wody dejonizowanej do zawartości kolby i dołączyć mieszadło. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 lb/cal2 przez 30 min. Następnie umieść podłoże na talerzu do mieszania i pozostaw do ostygnięcia, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Wlać pożywkę na sterylne szalki Petriego o odpowiedniej wielkości (szalki 100 mm x 15 mm do wzrostu i utrzymania bakterii, szalki 35 mm x 10 mm do oznaczania zabijania) pod przepływem laminarnym. Pozostaw podłoże do wyschnięcia na 2 godziny pod pokrywą laminarną. Następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pożywki dla nicieni (NGM) i płytek do karmienia RNAi (NGM RNAi)
<ol>
	<li>Za pomocą mieszadła rozpuść 2,5 g peptonu i 3 g NaCl w 970 ml wody dejonizowanej w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera. Dodaj 20 g agaru do podłoża. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 lb/cal2 przez 30 min. Umieść podłoże na talerzu mieszającym i pozwól mu ostygnąć, delikatnie mieszając.</li>
	<li>Dodać następujące roztwory do pożywki w celu przygotowania płytek NGM: 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg / ml w 95% etanolu) cholesterolu, 1 ml (10% v/w w etanolu) nystatyny i 1 ml 25 mg / ml streptomycyny.</li>
	<li>Do pożywki w celu przygotowania płytek do karmienia RNAi NGM dodać następujące roztwory: 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/ml w 95% etanolu) cholesterolu, 1 ml (10% v/w w etanolu) nystatyny, 1 ml 50 mg/ml karbenicyliny i 1 ml IM IPTG.</li>
	<li>Wlać pożywkę do sterylnych szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm pod przepływem laminarnym. Pozostaw podłoże do wyschnięcia na 2 godziny pod pokrywą laminarną. Następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
</ol>
3. Utrzymanie C. elegans
<ol>
	<li>Wysiewaj płytki NGM, zauważając 50 μl wyhodowanej przez noc E. coli OP50 na środku płytek. Kultura E. coli jest przygotowywana uprzednio w pożywce Luria-Bertani (LB) i przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Przykryj talerze i pozostaw je do wyschnięcia na 24 godziny pod pokrywą laminarną, a następnie przechowuj je w pojemniku z polistyrenu.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym podnieś od 10 do 12 ciężarnych dorosłych osobników za pomocą sterylnego kilofa do robaków i przenieś robaki na płytkę NGM z nasionami E. coli OP50. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia usuń dorosłe osobniki za pomocą sterylnego kilofa do robaków i pozwól zarodkom rozwinąć się w larwy L4 w temperaturze 20 °C (~2,5 dnia).</li>
</ol>
4. Przygotowanie populacji robaków synchronicznej pod względem wieku
<ol>
	<li>Umyj gravidy dorosłe osoby z dwóch do czterech płytek NGM za pomocą M9W i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
	<ol>
		<li>Aby przygotować M9W: połączyć 3 g NaCl, 6 g Na2HPO4 i 3 g KH2PO4 i rozpuścić w końcowej objętości 1 l wody dejonizowanej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i dodać 1 ml 1 MMgSO4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować probówkę o masie 450 x g przez 1 minutę, a następnie zdekantować supernatant, upewniając się, że osad ślimakowy pozostaje nienaruszony.</li>
	<li>Dodać 400 μl 8,25% podchlorynu sodu (wybielacz domowy) i 100 μl 5 N NaOH, aby przygotować roztwór do lizy robaków. Dodaj roztwór do lizy do osadu robaka i wymieszaj zawartość, przesuwając probówkę, aż 70% dorosłych robaków zostanie zlizowanych. Okresowo obserwuj zawartość probówki pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że jaja nie są nadmiernie bielone.</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę wybielacza, dodając 10 ml M9W do zawartości stożkowej probówki.</li>
	<li>Wirować probówkę o masie 450 x g przez 1 minutę. Zdekantować supernatant, a następnie dodać 10 ml M9W.</li>
	<li>Powtórz krok 4.5 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Zawiesić powstały osad jajeczny w 3-5 ml M9W. Umieść rurkę na rotatorze rurowym. Pozwól rurkom obracać się z prędkością 18 obr./min w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia obracaj probówkę o gramaturze 450 x g przez 1 minutę, aby wypluć larwy L1. Usuń większość M9W przez aspirację, pozostawiając ~250 μL płynu w probówce. Ponownie zawiesić larwy L1 i umieścić trzy krople zawiesiny robaków o pojemności 5 μl na pokrywie szalki Petriego, a następnie oszacować liczbę robaków na μl za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
</ol>
5. Indukcja RNAi u robaków
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli lub kilofa wyrzuć pożądane szczepy E. coli zawierające RNAi z zamrożonych wywarów (biblioteki Ahringer i Vidal) na płytki agarowe LB o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierające 50 μg/ml karbenicyliny i 15 μg/ml tetracykliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Pobrać i zaszczepić izolowaną kolonię z pożądanego szczepu RNAi do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml zawierających 2 ml LB uzupełnionych 50 μg/ml karbenicyliny. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min.</li>
	<li>Następnego dnia rozprowadź 150 μl wyhodowanej przez noc kultury na płytkach do karmienia NGM RNAi o wymiarach 65 mm x 15 mm za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Pozostawić płytki do ostygnięcia do temperatury pokojowej po inkubacji w temperaturze 37 °C. Dodać odpowiednią objętość M9W zawierającą ~200 larw L1 (uzyskaną z etapów synchronicznej populacji robaków) do płytek karmiących NGM RNAi wysiewanych przez E. coli. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C, aż larwy osiągną stadium L4 (~2,5 dnia).</li>
</ol>
6. Przygotowanie paciorkowców z grupy Mitis do zakażenia
<ol>
	<li>Na agarze THY o wymiarach 100 mm x 15 mm należy rozprowadzić pożądane szczepy paciorkowców (jeśli płytki były przechowywane w temperaturze 4 °C, należy je wstępnie ogrzać do 37 °C przed nałożeniem smug odpowiednich szczepów), a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc (~18 godzin) w słoiku ze świecą, zapewniając mikroaerofilne środowisko do wzrostu paciorkowców (płytki z prążkami można przechowywać przez tydzień w temperaturze 4 °C).</li>
	<li>Aby rozmnażać kliniczne izolaty paciorkowców, użyj tryptycznego agaru z krwią sojową. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w słoiku ze świecą przez noc (~18 h).</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij płytki ze słoika ze świecą i zbierz izolowane kolonie za pomocą sterylnej pętli. Zaszczepić 15 ml sterylnych stożkowych probówek zawierających 2 ml bulionu THY. Aby rozmnażać kliniczne izolaty paciorkowców, należy uzupełnić bulion THY o 5% v/v krwi owczej. Zamknąć szczelnie nakrętki i inkubować probówki w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych.</li>
</ol>
7. Testy przeżycia
UWAGA: Kroki związane z tym testem są przedstawione w Rysunek 1. W celu wykazania, żeH2O2uzyskany przez grupę mitis jest odpowiedzialny za zabijanie robaka, należy uzupełnić pożywkę katalazą lub zmutowanym szczepem ΔspxB i szczepem dopełniacza Δ spxB; można użyć spxB+ S. gordonii. SpxB koduje oksydazę pirogronianową, która jest odpowiedzialna za produkcjęH2O2w grupie mitis.
<ol>
	<li>Podgrzej płytki THY o wymiarach 35 mm x 10 mm do temperatury 37 °C. Dodać 80 μl wyhodowanych przez noc kultur pożądanych szczepów paciorkowców i całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni agaru za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w słoiku ze świecą przez noc (~18 h). Jako kontrolę, wysiewaj dwie płytki NGM o wymiarach 35 mm x 10 mm z 80 μl wyhodowanych przez noc kultur E. coli OP50. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Aby potwierdzić, że H2O2 wytwarzany przez grupę mitis jest odpowiedzialny za zabijanie robaków, dodaj 50 μl zawierających 1000 jednostek katalazy c na płytkę THY. Rozprowadzić roztwór katalazy za pomocą sterylnego rozsiewacza i pozostawić płytki do wyschnięcia w przepływie laminarnym przez 30 minut. Następnie wysiać płytki odpowiednimi szczepami paciorkowców, jak opisano w kroku 7.1.</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij płytki ze słoika ze świecą i pozwól im ostygnąć do temperatury RT przez 10-15 minut. Za pomocą sterylnego kilofa do robaków przenieś 30 larw L4 z płytek karmiących NGM lub NGM RNAi na płytki THY wysiewane paciorkowcami. Użyj dwóch płytek THY z nasionami z łącznie 60 robakami na szczep paciorkowców. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz liczbę żywych i martwych larw L4 na każdej płytce w kilku punktach czasowych. Początkowo oceniaj robaki jako martwe lub żywe co 30 minut. Następnie, gdy robaki szybko zaczną umierać, nacinaj je w odstępach 15-minutowych. Użyj sterylnego kilofa, aby delikatnie szturchnąć robaki i określić, czy są żywe, czy martwe. Robak jest uważany za martwego, jeśli nie ma ruchu w odpowiedzi na szturchanie.</li>
	<li>Test zajmie 5-6 godzin. Powtórz eksperyment jeszcze dwa razy. Po zakończeniu testu połącz dane z dwóch płytek. Wprowadź dane każdej grupy, porównaj krzywe przeżycia i przeprowadź analizę przeżycia Kaplana-Meiera za pomocą oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>
8. Przygotowanie płatków agarozowych do mikroskopii
<ol>
	<li>Rozpuść 2% w/v agarozy w wodzie dejonizowanej, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej. Objętość 5 ml roztworu wystarcza do przygotowania 20 szkiełek.</li>
	<li>Przyklej taśmę laboratoryjną wzdłuż dwóch szklanych szkiełek. To określi grubość płatków agarozowych. Umieść czyste szklane szkiełko między dwoma zaklejonymi taśmą szkiełkami.</li>
	<li>Umieść 100 μl stopionej agarozy na środku czystego szkiełka. Natychmiast umieść kolejną czystą szklankę na stopionej agarozie i delikatnie dociśnij, aby zrobić podkładkę. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje, a następnie zdejmij górny szkiełko. Podkładka agarozowa jest gotowa do użycia.</li>
</ol>
9. Obserwacja lokalizacji SKN-1 w odpowiedzi na zakażenie Streptococcus
UWAGA: Kroki związane z tym testem są przedstawione w Rysunek 2. Lokalizację SKN-1 określono przy użyciu transgenicznego szczepu robaka SKN-1B/C::GFP. Wykazanie lokalizacji SKN-1 w wyniku wytwarzaniaH2O2przez grupę mitis, typu dzikiego (WT), Δ spxB i szczepu dopełniacza ΔspxB; Zastosowano spxB+ S. gordonii. Ponadto wykorzystano transgeniczny szczep reporterowy SKN-1B/C::GFP i technikę interferencji RNAi, aby wykazać, że składniki szlaku p38 MAPK regulują lokalizację SKN-1.
<ol>
	<li>Podgrzej płytki THY o wymiarach 35 mm x 10 mm do temperatury 37 °C. Dodać 80 μl wyhodowanych przez noc kultur pożądanych szczepów paciorkowców i całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni agaru za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w słoiku ze świecą przez noc (~18 h). Jako kontrolę, wysiewaj trzy płytki NGM o wymiarach 35 mm x 10 mm z 80 μl wyhodowanych na noc kultur E. coli OP50. Inkubować te płytki w temperaturze 37 °C przez ~18 godzin.</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij płytki ze słoika ze świecą i pozwól im ostygnąć do temperatury RT przez 10-15 minut. Umyj larwy L4 za pomocą M9W z płytek do karmienia NGM i NGM RNAi. Zbierz robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować probówki o masie 450 x g przez 1 minutę. Zdekantować supernatant i dodać 10 ml M9W.</li>
	<li>Powtórz krok 9.3 jeszcze trzy razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić robaki w ~250 μL M9W i umieścić trzy krople zawiesiny robaków po 5 μl na czystej pokrywie szalki Petriego i oszacuj liczbę robaków na μl za pomocą mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Dodaj ~ 100 larw L4 do każdej płytki wysiewanej paciorkowcami THY i NGM E. coli. Użyj trzech płytek na szczep bakterii. Inkubować płytki przez 2-3 godziny w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Następnie wyjmij płytki z inkubatora, umyj je M9W i zbierz robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyj robaki 3 razy, jak opisano w krokach 9.3.</li>
	<li>Usunąć większość M9W przez aspirację i dodać 500 μl M9W zawierającego 2 mM azydku sodu lub 2 mM chlorowodorek tetramizolu do osadu robaka. Spowoduje to znieczulenie robaków, zapewniając, że podczas obrazowania pod mikroskopem nie wystąpi żaden ruch. 
	ostrożność: Podczas pracy z azydkiem sodu należy stosować środki ochrony osobistej (PPE). Przygotuj roztwór azydku pod kapturem chemicznym.</li>
	<li>Inkubować granulki robaków w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie naniec 15 μl zawiesiny ślimakowej na przygotowaną podkładkę agarozową. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe nr 1,5 na waduszce agarozowej zawierającej znieczulone robaki.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zwizualizuj lokalizację SKN-1 za pomocą filtrów FITC i DAPI. Robaki obrazu przy powiększeniach 10x i 20x.</li>
	<li>Oceniaj robaki na podstawie poziomu lokalizacji SKN-1. Brak lokalizacji jądrowej, lokalizacja SKN-1B / C: : GFP w przedniej lub tylnej części robaka oraz lokalizacja jądrowa SKN-1B / C: : GFP we wszystkich komórkach jelitowych są klasyfikowane odpowiednio jako niski, średni i wysoki poziom lokalizacji.</li>
	<li>Po nacięciu mikrofotografii fluorescencyjnych określ różnice statystyczne za pomocą testów chi-kwadrat i dokładnych testów Fishera za pomocą oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>

<ol><li>Human Microbiome Project, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).</li>
<li>Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+mitis%3A+walking+the+line+between+commensalism+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis.</a> Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).</li>
<li>Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%3A+an+epidemiological+review+of+128+episodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes.</a> Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).</li>
<li>Sahasrabhojane, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-level+assessment+of+the+molecular+basis+of+fluoroquinolone+resistance+among+viridans+group+streptococci+causing+bacteraemia+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).</li>
<li>Shelburne, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+mitis+strains+causing+severe+clinical+disease+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).</li>
<li>van der Meer, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+antibiotic+susceptibility+and+tolerance+of+bacterial+isolates+in+culture-positive+cases+of+endocarditis+in+The+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).</li>
<li>Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viridans+streptococci+isolated+by+culture+from+blood+of+cancer+patients%3A+clinical+and+microbiologic+analysis+of+50+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases.</a> Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).</li>
<li>Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+phylogenetic+and+phenotypic+analyses+to+identify+nonhemolytic+streptococci+isolated+from+bacteremic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).</li>
<li>Kohno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+complications+in+patients+receiving+autologous+CD34-selected+hematopoietic+stem+cell+transplantation+for+severe+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases.</a> Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).</li>
<li>Zhu, L., Kreth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hydrogen+peroxide+in+environmental+adaptation+of+oral+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843(2012).</li>
<li>Okahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+contributes+to+the+epithelial+cell+death+induced+by+the+oral+mitis+group+of+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci.</a> PLoS One. 9 (1), 88136(2014).</li>
<li>Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+and+killing+of+human+endothelial+cells+by+viridans+group+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).</li>
<li>Rai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+secretes+hydrogen+peroxide+leading+to+DNA+damage+and+apoptosis+in+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).</li>
<li>Braun, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+pneumolysin+and+H%282%29O%282%29+mediate+brain+cell+apoptosis+during+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).</li>
<li>Naji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+the+oxidative+stress+response+transcription+factor+SKN-1+in+Caenorhabditis+elegans+by+mitis+group+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci.</a> PLoS One. 13 (8), 0202233(2018).</li>
<li>Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide-mediated+killing+of+Caenorhabditis+elegans%3A+a+common+feature+of+different+streptococcal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species.</a> Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).</li>
<li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+worm+has+turned--microbial+virulence+modeled+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans.</a> Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).</li>
<li>Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((99th+Dahlem+conference+on+infection%2C+inflammation+and+chronic+inflammatory+disorders%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+to+study+tissues+involved+in+host+immunity+and+microbial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis.</a> Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+Causal+or+Casual+Relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).</li>
<li>Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+C.+elegans+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Reproduction+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Using C. elegans for aging research.</a> Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).</li>
<li>Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1%2FNrf%2C+stress+responses%2C+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).</li>
<li>Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+host+innate+defence%3A+insights+from+Caenorhabditis+elegans+and+primitive+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).</li>
<li>Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+as+mediated+by+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1.</a> Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).</li>
<li>An, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Caenorhabditis+elegans+oxidative+stress+defense+protein+SKN-1+by+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).</li>
<li>An, J. H., Blackwell, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+links+C.+elegans+mesendodermal+specification+to+a+conserved+oxidative+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response.</a> Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).</li>
<li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li>
<li>Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+as+a+measure+of+senescence+in+C.+elegans%3A+look+to+red%2C+not+blue+or+green%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green.</a> Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).</li>
<li>Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+Autofluorescence+to+Assess+GFP+Expression+During+Normal+Physiology+and+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8 (14), (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane metody mogą być stosowane w odniesieniu do innych bakterii chorobotwórczych, takich jak Enterococcus faecium, które również wytwarzająH2O2uprawiane w warunkach beztlenowych lub mikroaerofilnych26. Zazwyczaj w przypadku większości organizmów chorobotwórczych przeprowadzenie testów przeżycia zajmuje od kilku dni do kilku tygodni. Jednak ze względu na intensywne wytwarzanieH2O2przez członków grupy mitis, testy te można było wykonać w ciągu...

paciorkowce z grupy Mitis to ludzkie komensale jamy ustnej i gardła1. Jednak organizmy te mogą uciec z tej niszy i powodować różne choroby inwazyjne2. Infekcje wywoływane przez te mikroorganizmy obejmują bakteriemię, zapalenie wsierdzia i zapalenie tkanki łącznej oczodołu2,3,4,5,6. Co więcej, stają się one czynnikami wywołującymi infekcje krwi u pacjentów z obniżoną odpornością, neutropeną i rakiem, którzy przeszli chemioterapię5,7,8,9.
Mechanizmy leżące u podstaw patogenezy grupy mitis są niejasne, ponieważ zidentyfikowano niewiele czynników wirulencji. Wiadomo, że grupa mitis wytwarzaH2O2, który odgrywa ważną rolę w społecznościach drobnoustrojów jamy ustnej10. Ostatnio kilka badań podkreśliło rolęH2O2jako cytotoksyny, która indukuje śmierć komórek nabłonka11,12. Wykazano, że S. pneumonia, który należy do tej grupy, wytwarza wysoki poziomH2O2, który indukuje uszkodzenie DNA i apoptozę w komórkach pęcherzyków płucnych13. Korzystając z modelu zwierzęcego ostrego zapalenia płuc, ci sami naukowcy wykazali, że wytwarzanieH2O2przez bakterie daje przewagę w zakresie zjadliwości. Badania nad pneumokokowym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych wykazały również, żeH2O2 pochodzący z patogenu działa synergistycznie z pneumolizyną, wywołując śmierć komórek neuronalnych14. Obserwacje te jednoznacznie wskazują, żeH2O2wytwarzany przez tę grupę bakterii jest ważny dla ich patogenności.
Co ciekawe, wykazano również, że członkowie grupy mitis S. mitis i S. oralis powodują śmierć nicieni C. elegans poprzez produkcję H2O215,16. Ten wolno żyjący nicień został wykorzystany jako prosty, genetycznie podatny model do badania wielu procesów biologicznych. Niedawno robak pojawił się jako model do badania interakcji gospodarz-patogen17,18. Ponadto kilka badań podkreśliło znaczenie badania stresu oksydacyjnego za pomocą tego organizmu19,20,21. Jego krótki cykl życiowy, zdolność do eliminowania interesujących genów przez RNAi oraz wykorzystanie reporterów połączonych z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do monitorowania ekspresji genów to tylko niektóre z atrybutów, które czynią go atrakcyjnym systemem modelowym. Co ważniejsze, szlaki regulujące stres oksydacyjny i wrodzoną odporność robaka są wysoce konserwatywne u ssaków20,22.
W tym protokole pokazano, jak używać C. elegans do wyjaśnienia patogenności wywołanej przez H2O2 pochodzące z paciorkowców. Pokazano zmodyfikowany test przeżycia, a członkowie grupy mitis są w stanie szybko zabić robaki poprzez produkcjęH2O2. Wykorzystując członków grupy mitis, zapewnia się trwałe biologiczne źródło reaktywnych form tlenu (ROS), w przeciwieństwie do źródeł chemicznych, które indukują stres oksydacyjny u robaków. Co więcej, bakterie są w stanie szybko skolonizować robaki, co pozwala na bezpośrednie skierowanieH2O2do komórek jelitowych (w porównaniu z innymi źródłami, które muszą przekroczyć kilka barier). Test jest walidowany albo 1) poprzez określenie przeżycia zmutowanego szczepu skn-1, albo 2) poprzez strącenie skn-1 za pomocą RNAi u robaków w stosunku do robaków N2 typu dzikiego i kontrolnego wektorowego. SKN-1 jest ważnym czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje odpowiedź na stres oksydacyjny u C. elegans23,24,25. Oprócz testów przeżycia, szczep robaka wykazujący ekspresję transgenicznego reportera SKN-1B / C::GFP jest używany do monitorowania aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny poprzez produkcjęH2O2 przez grupę mitis.

<table><tbody><tr><td><silny>Media i chemikalia</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Pepton bakto&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Todd Hewitt Rosół</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td></td></tr><tr><td>BD BBL Krew owcza, defibrynowana&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11947</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Agar do krwi (TSA z krwią owczą)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1345-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP21021012</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>Acros organics</td><td>AC455500050</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8,25% Podchloryn sodu Fosforan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodu Dibasic&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Chlorowodorek tetramizolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><mocne>materiały eksploatacyjne&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologiczne szalki Petriego Falcon z pokrywką (35 mm x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Nr 1.5&nbsp; 18 mm x 18 mm Osłona Płytki</td> Petriego <td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr> z <tr><td>przezroczystą pokrywką (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr> szalki <tr><td>Petriego z przezroczystą pokrywką (100 mm x 15 mm)</td><td></td>Szkiełka mikroskopowe <td>Fisher Scientific</td> FB0875712 <td></td></tr><tr><td>ze szkła zwykłego (75 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Oprogramowanie&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Strain </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. oralis ATCC 35037</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. mitis ATCC 49456</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. gordonii DL1 Challis&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HT115</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>szczepy robaków</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>szczep</silny><</td><td>silny>Genotyp</silny></td><td><silny>Transgen</silny><</td><td>silny>Źródło</silny> </td></tr><tr><td>N2</td><td>C. elegans izolat</td><td></td> dziki <td>CGC</td></tr><tr><td>EU1</td><td>skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?( n754) niech -?] (IV;V)</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C::GFP + ROL-6(su1006)</td><td>Keith Blackwell</td></tr></tbody></table>

badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy mitis w caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), wolno żyjący nicień, stał się atrakcyjnym modelem do badania interakcji gospodarz-patogen. Prezentowany protokół wykorzystuje ten model do określenia patogenności wywoływanej przez paciorkowce z grupy mitis poprzez produkcjęH2O2. Paciorkowce z grupy mitis są nowym zagrożeniem, które powoduje wiele chorób u ludzi, takich jak bakteriemia, zapalenie wsierdzia i zapalenie tkanki łącznej oczodołu. Opisano tutaj protokół określający przeżywalność tych robaków w odpowiedzi na H2O2 wytwarzany przez tę grupę patogenów. Wykorzystując gen skn-1 kodujący czynnik transkrypcyjny odpowiedzi na stres oksydacyjny, wykazano, że model ten jest ważny dla identyfikacji genów gospodarza, które są niezbędne przeciwko infekcji paciorkowcowej. Ponadto wykazano, że aktywacja odpowiedzi na stres oksydacyjny może być monitorowana w obecności tych patogenów za pomocą transgenicznego szczepu robaka reporterowego, w którym SKN-1 jest połączony z białkiem zielonej fluorescencji (GFP). Testy te dają możliwość zbadania odpowiedzi na stres oksydacyjny naH2O2pochodzącą ze źródła biologicznego, w przeciwieństwie do źródeł egzogennie dodanych reaktywnych form tlenu (ROS).

Przedstawiciele grupy mitis S. mitis, S. oralis, i *S. gordonii* szybko uśmierciło nicienie, w przeciwieństwie do *S. mutans*, S. salivarius, i niepatogenny *E. coli* OP50 (Rycina 3A). Mediana przeżycia dla *S. mitis*, *S. oralis*, i S. gordonii wynosiły odpowiednio 300 min, 300 min i 345 min. Aby określić, czy proces zabijania był zapośredniczony przez H2</...

Nicień Caenorhabditis elegans jest doskonałym modelem do analizy interakcji gospodarz-patogen. Opisano tutaj protokół zakażenia robaka paciorkowcami z grupy mitis i określenia aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny przeciwkoH2O2wytwarzanej przez tę grupę organizmów.

Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

W tym protokole pokazujemy, jak wykorzystać metodę swobodnego życia C. elegans w celu wyjaśnienia patogenności spowodowanej przez nadtlenek wodoru wytwarzany przez paciorkowce Mitis Group. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy badać patogenność i aktywację reakcji stresowych u robaka przy użyciu zrównoważonego biologicznego źródła reaktywnych form tlenu, a nie źródeł chemicznych Na jeden litr pożywki dodaj 30 g proszku Todd Hewitt, 2 g ekstraktu drożdżowego i 20 g ageru do 2 litrowej kolby Erlin Myer.Do zawartości kolby dodać 970 ml wody dejonizowanej i umieścić w mieszadle. Użyj folii aluminiowej, aby zakryć otwór. Autoklawuj pożywkę w kolbie w temperaturze 121 stopni Celsjusza i ciśnieniu 15 funtów na cal kwadratowy przez 30 minut.Następnie umieść kolbę na płytce mieszającej, aby ostygła, delikatnie mieszając. Pod pokrywą laminarną wlej pożywkę do sterylnych szalek Petriego o odpowiedniej wielkości. Pozostaw podłoże do wyschnięcia na 2 godziny.Następnie przechowuj płytki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez okres do 1 miesiąca. Przed przygotowaniem paciorkowców Mitis Group należy podgrzać płytki agarowe THY w inkubatorze do temperatury 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj sterylnej pętli, aby usunąć pożądane szczepy paciorkowców w miejscach.Następnie umieść talerze w słoiku ze świecą i inkubuj słoik w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przez około 18 godzin, aby zapewnić środowisko mikroerofilne. Następnego dnia wyjmij talerze ze słoika ze świecą i użyj sterylnej pętli, aby wybrać izolowane kolonie. Zaszczepić 15 ml sterylnych stożkowych probówek zawierających 2 ml bulionu THY.Zamknij szczelnie nakrętki i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach statycznych. Podgrzej płytki THY w inkubatorze do temperatury 37 stopni Celsjusza, dodaj 50 mikrolitrów roztworu zawierającego 1000 jednostek katalazy na płytkę THY. Użyj sterylnego rozsiewacza, aby rozprowadzić roztwór katalazy i pozostaw płytki do wyschnięcia na okapie z przepływem laminarnym przez 30 minut.Aby wysiać płytki szczepami paciorkowców, użyj pipety, aby dodać 80 mikrolitrów kultur wyhodowanych przez noc na płytkę i użyj sterylnego rozsiewacza, aby całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w słoiku ze świecą przez noc. Jako kontrolę, na dwóch płytkach NGM, dodaj 80 mikrolitrów wyhodowanych przez noc kultur E.coli OP-50 do wysiewu.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wyjmij talerze ze słoika ze świecą i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą sterylnego kilofa do robaków przenieś 30 larw L4 z płytek karmiących NGM na płytki THY wysiewane paciorkowcami.Inkubować płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem preparacyjnym policz liczbę żywych i martwych larw L4 na każdej płytce w kilku punktach czasowych. Użyj sterylnego kilofa, aby delikatnie szturchnąć robaki i określić, czy są żywe, czy martwe.Początkowo co 30 minut oceniaj robaki jako martwe lub żywe. Kiedy robaki szybko zaczną umierać, nacinaj je w 15-minutowych odstępach. Test zajmie od 5 do 6 godzin.Następnie powtórz eksperyment jeszcze dwa razy. Aby przygotować podkładkę z agarozy, przyklej taśmę laboratoryjną wzdłuż dwóch szklanych szkiełek. To określi grubość płatków agarozowych.Umieść czyste szklane szkiełko między dwoma zaklejonymi taśmą szkiełkami. Rozpuść agarozę w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać 2 procent objętości i podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej. Za pomocą pipety umieść 100 mikrolitrów stopionej agarozy na środku czystego szkiełka.Natychmiast umieść kolejne czyste szkiełko na stopionej agarozie i delikatnie dociśnij, aby zrobić podkładkę. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje, a następnie zdejmij górny szkiełko. Podkładka agarozowa jest gotowa do użycia.Rozgrzej talerze THY do 37 stopni Celsjusza. Wysiewać płytki szczepami paciorkowca, tak jak to miało miejsce wcześniej w testach przeżycia. Wysiać 3 płytki NGM z E-coli OP-50 jako kontrolą i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia ostudź talerze do temperatury pokojowej. Za pomocą bufora M9W przemyć larwy L4 z płytek zasilających NGM lub NGM RNAi do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Wirować probówki 450 razy g przez jedną minutę w wirówce.Zdekantować sklarowany osad i dodać 10 ml M9W do każdej probówki. Powtórz krok odśrodkowy jeszcze trzy razy. Ponownie zawieś robaki w 250 mikrolitrach M9W i umieść trzy krople zawiesiny ślimakowej o pojemności 5 mikrolitrów na czystej pokrywie szalki Petriego.Pod mikroskopem preparacyjnym oszacuj liczbę robaków na mikrolitr. Za pomocą pipety dodaj około 100 larw L4 do każdej płytki wysiewanej paciorkowcami THY i NGM E.coli. Użyj trzech płytek na szczep bakterii.Inkubuj płytki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij płytki z inkubatora. Umyj je M9W i zbierz robaki do stożkowych tubek o pojemności 15 ml.Umyj robaki trzy razy, tak jak to miało miejsce wcześniej w kroku odśrodkowym. Usuń większość M9W przez aspirację. I dodaj 500 mikrolitrów M9W zawierających 2 milimolowy azydek sodu lub chlorowodorek tetraizolu do granulki robaka w celu znieczulenia.Inkubować probówkę z granulkami robaków w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie upuść 15 mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na przygotowaną podkładkę agorozową. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zwizualizuj lokalizację skn-1 za pomocą filtrów Fitzy i Dappy.Robaki obrazowe w 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniu. Oceniaj robaki na podstawie trzech poziomów lokalizacji; niska lokalizacja, w której nie obserwuje się lokalizacji jądrowej, lokalizacja średnia, z SKN 1 BCGFP w przedniej lub tylnej części robaka oraz lokalizacja wysoka, w której obserwuje się lokalizację jądrową skn-1 BCGFP we wszystkich komórkach jelitowych. W tym eksperymencie członkowie Mitis Group szybko zabili robaki, w przeciwieństwie do S.mutans, S.salivarius i niepatogennych E.coli OP-50.Kiedy katalaza została uzupełniona do THY ager, zabijanie robaków zostało zniesione. Nie zaobserwowano śmierci robaków w przypadku zmutowanego szczepu delta spxB w porównaniu ze szczepami typu dzikiego i komplementarnego. Dane te sugerują, że nadtlenek wodoru wytwarzany przez Mitis Group pośredniczy w zabijaniu robaków.Zaobserwowano znaczny spadek przeżywalności robaków knockdown skn-1 w porównaniu z robakami leczonymi kontrolą wektorów. Podobny fenotyp zabijania zaobserwowano w przypadku zmutowanego szczepu skn-1 i robaków typu dzikiego N2. To pokazuje, że skn-1 wpływa na przetrwanie robaków w grupie Mitis.Lokalizację skn-1 BCGFP zaobserwowano u robaków narażonych na szczepy N-komplementów typu dzikiego, a nie w odpowiedzi na zmutowany szczep Delta spxB S cordonae. Po zniszczeniu składników szlaku kinazy mapy P38 zaobserwowano zmniejszoną lokalizację skn-1 BCGFP i robaków poddanych knockdown, w stosunku do robaków poddanych kontroli wektorowej. Za pomocą paciorkowców c.Wpływ nadtlenku wodoru na endoplazmatyczny stres pionowy, uszkodzenie mitochondriów, mitophogię i tophogy można dalej badać. Co więcej, można zidentyfikować mechanizmy, dzięki którym nadtlenek wodoru działa jako czynnik męskości w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez zakłócenie podstawowych procesów komórki.

studying-oxidative-stress-caused-mitis-group-streptococci

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Źródło: Naji, A., et al. Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).Ten film przedstawia metodę hodowli Streptococcus mitis w warunkach mikroaerofilnych przy użyciu ekstraktu drożdżowego Todda-Hewitta lub pożywki agarowej THY w celu przygotowania kultur bakteryjnych do badań interakcji gospodarz-patogen.

Przygotowanie hodowli Streptococcus mitis do badań interakcji gospodarz-patogen

Źródło: Naji, A. i inni. Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce grupy Mitis u Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje użycie zielonej, fluorescencyjnej białkowej oznakowanej SKN-1 w C. elegans do monitorowania stresu oksydacyjnego poprzez śledzenie zielonej fluorescencji. Robaki narażone na S. gordonii wykazują silną fluorescencję jądrową, potwierdzając stres wywołany patogenem, podczas gdy te karmione E. coli wykazują rozproszoną zieloną fluorescencję...

Wizualizacja stresu oksydacyjnego wywołanego przez patogeny u C. elegans za pomocą SKN-1 oznaczonego GFP

C. elegans jest atrakcyjnym organizmem modelowym do badania szlaków transdukcji sygnałów zaangażowanych w odporność na stres oksydacyjny. Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru odporności zwierząt C. elegans na stres oksydacyjny w fazie ciekłej, przy użyciu kilku środków utleniających w 96-dołkowych płytkach.

Pomiar odporności Caenorhabditis elegans na stres oksydacyjny w 96-dołkowych płytkach mikromiareczkowych

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę badania stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans. Ta technika pozwala analizować patogenność i aktywację odpowiedzi stresowej w organizmie modelowym.

Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów