Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

W tym protokole pokazujemy, jak wykorzystać metodę swobodnego życia C. elegans w celu wyjaśnienia patogenności spowodowanej przez nadtlenek wodoru wytwarzany przez paciorkowce Mitis Group. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy badać patogenność i aktywację reakcji stresowych u robaka przy użyciu zrównoważonego biologicznego źródła reaktywnych form tlenu, a nie źródeł chemicznych Na jeden litr pożywki dodaj 30 g proszku Todd Hewitt, 2 g ekstraktu drożdżowego i 20 g ageru do 2 litrowej kolby Erlin Myer.

Do zawartości kolby dodać 970 ml wody dejonizowanej i umieścić w mieszadle. Użyj folii aluminiowej, aby zakryć otwór. Autoklawuj pożywkę w kolbie w temperaturze 121 stopni Celsjusza i ciśnieniu 15 funtów na cal kwadratowy przez 30 minut.

Następnie umieść kolbę na płytce mieszającej, aby ostygła, delikatnie mieszając. Pod pokrywą laminarną wlej pożywkę do sterylnych szalek Petriego o odpowiedniej wielkości. Pozostaw podłoże do wyschnięcia na 2 godziny.

Następnie przechowuj płytki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez okres do 1 miesiąca. Przed przygotowaniem paciorkowców Mitis Group należy podgrzać płytki agarowe THY w inkubatorze do temperatury 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj sterylnej pętli, aby usunąć pożądane szczepy paciorkowców w miejscach.

Następnie umieść talerze w słoiku ze świecą i inkubuj słoik w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przez około 18 godzin, aby zapewnić środowisko mikroerofilne. Następnego dnia wyjmij talerze ze słoika ze świecą i użyj sterylnej pętli, aby wybrać izolowane kolonie. Zaszczepić 15 ml sterylnych stożkowych probówek zawierających 2 ml bulionu THY.

Zamknij szczelnie nakrętki i inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w warunkach statycznych. Podgrzej płytki THY w inkubatorze do temperatury 37 stopni Celsjusza, dodaj 50 mikrolitrów roztworu zawierającego 1000 jednostek katalazy na płytkę THY. Użyj sterylnego rozsiewacza, aby rozprowadzić roztwór katalazy i pozostaw płytki do wyschnięcia na okapie z przepływem laminarnym przez 30 minut.

Aby wysiać płytki szczepami paciorkowców, użyj pipety, aby dodać 80 mikrolitrów kultur wyhodowanych przez noc na płytkę i użyj sterylnego rozsiewacza, aby całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni agaru. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w słoiku ze świecą przez noc. Jako kontrolę, na dwóch płytkach NGM, dodaj 80 mikrolitrów wyhodowanych przez noc kultur E.coli OP-50 do wysiewu.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wyjmij talerze ze słoika ze świecą i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą sterylnego kilofa do robaków przenieś 30 larw L4 z płytek karmiących NGM na płytki THY wysiewane paciorkowcami.

Inkubować płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod mikroskopem preparacyjnym policz liczbę żywych i martwych larw L4 na każdej płytce w kilku punktach czasowych. Użyj sterylnego kilofa, aby delikatnie szturchnąć robaki i określić, czy są żywe, czy martwe.

Początkowo co 30 minut oceniaj robaki jako martwe lub żywe. Kiedy robaki szybko zaczną umierać, nacinaj je w 15-minutowych odstępach. Test zajmie od 5 do 6 godzin.

Następnie powtórz eksperyment jeszcze dwa razy. Aby przygotować podkładkę z agarozy, przyklej taśmę laboratoryjną wzdłuż dwóch szklanych szkiełek. To określi grubość płatków agarozowych.

Umieść czyste szklane szkiełko między dwoma zaklejonymi taśmą szkiełkami. Rozpuść agarozę w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać 2 procent objętości i podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej. Za pomocą pipety umieść 100 mikrolitrów stopionej agarozy na środku czystego szkiełka.

Natychmiast umieść kolejne czyste szkiełko na stopionej agarozie i delikatnie dociśnij, aby zrobić podkładkę. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje, a następnie zdejmij górny szkiełko. Podkładka agarozowa jest gotowa do użycia.

Rozgrzej talerze THY do 37 stopni Celsjusza. Wysiewać płytki szczepami paciorkowca, tak jak to miało miejsce wcześniej w testach przeżycia. Wysiać 3 płytki NGM z E-coli OP-50 jako kontrolą i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia ostudź talerze do temperatury pokojowej. Za pomocą bufora M9W przemyć larwy L4 z płytek zasilających NGM lub NGM RNAi do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Wirować probówki 450 razy g przez jedną minutę w wirówce.

Zdekantować sklarowany osad i dodać 10 ml M9W do każdej probówki. Powtórz krok odśrodkowy jeszcze trzy razy. Ponownie zawieś robaki w 250 mikrolitrach M9W i umieść trzy krople zawiesiny ślimakowej o pojemności 5 mikrolitrów na czystej pokrywie szalki Petriego.

Pod mikroskopem preparacyjnym oszacuj liczbę robaków na mikrolitr. Za pomocą pipety dodaj około 100 larw L4 do każdej płytki wysiewanej paciorkowcami THY i NGM E.coli. Użyj trzech płytek na szczep bakterii.

Inkubuj płytki przez 2 do 3 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie wyjmij płytki z inkubatora. Umyj je M9W i zbierz robaki do stożkowych tubek o pojemności 15 ml.

Umyj robaki trzy razy, tak jak to miało miejsce wcześniej w kroku odśrodkowym. Usuń większość M9W przez aspirację. I dodaj 500 mikrolitrów M9W zawierających 2 milimolowy azydek sodu lub chlorowodorek tetraizolu do granulki robaka w celu znieczulenia.

Inkubować probówkę z granulkami robaków w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie upuść 15 mikrolitrów zawiesiny ślimakowej na przygotowaną podkładkę agorozową. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zwizualizuj lokalizację skn-1 za pomocą filtrów Fitzy i Dappy.

Robaki obrazowe w 10-krotnym i 20-krotnym powiększeniu. Oceniaj robaki na podstawie trzech poziomów lokalizacji; niska lokalizacja, w której nie obserwuje się lokalizacji jądrowej, lokalizacja średnia, z SKN 1 BCGFP w przedniej lub tylnej części robaka oraz lokalizacja wysoka, w której obserwuje się lokalizację jądrową skn-1 BCGFP we wszystkich komórkach jelitowych. W tym eksperymencie członkowie Mitis Group szybko zabili robaki, w przeciwieństwie do S.mutans, S.salivarius i niepatogennych E.coli OP-50.

Kiedy katalaza została uzupełniona do THY ager, zabijanie robaków zostało zniesione. Nie zaobserwowano śmierci robaków w przypadku zmutowanego szczepu delta spxB w porównaniu ze szczepami typu dzikiego i komplementarnego. Dane te sugerują, że nadtlenek wodoru wytwarzany przez Mitis Group pośredniczy w zabijaniu robaków.

Zaobserwowano znaczny spadek przeżywalności robaków knockdown skn-1 w porównaniu z robakami leczonymi kontrolą wektorów. Podobny fenotyp zabijania zaobserwowano w przypadku zmutowanego szczepu skn-1 i robaków typu dzikiego N2. To pokazuje, że skn-1 wpływa na przetrwanie robaków w grupie Mitis.

Lokalizację skn-1 BCGFP zaobserwowano u robaków narażonych na szczepy N-komplementów typu dzikiego, a nie w odpowiedzi na zmutowany szczep Delta spxB S cordonae. Po zniszczeniu składników szlaku kinazy mapy P38 zaobserwowano zmniejszoną lokalizację skn-1 BCGFP i robaków poddanych knockdown, w stosunku do robaków poddanych kontroli wektorowej. Za pomocą paciorkowców c.

Wpływ nadtlenku wodoru na endoplazmatyczny stres pionowy, uszkodzenie mitochondriów, mitophogię i tophogy można dalej badać. Co więcej, można zidentyfikować mechanizmy, dzięki którym nadtlenek wodoru działa jako czynnik męskości w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej poprzez zakłócenie podstawowych procesów komórki.