Name: Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę pomiaru stabilności aktywności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej. Technika ta wymaga mniej czasu niż tradycyjne testy i pozwala na bezpośrednią ocenę wpływu modyfikacji na stabilność enzymów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>1 000 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,6
	<ol>
		<li>Odmierzyć 800 ml wody destylowanej w zlewce miarowej o pojemności 1 000 ml.</li>
		<li>Odważyć 8,2 g bezwodnego octanu sodu i dodać go do zlewki.</li>
		<li>Umieść zlewkę na talerzu do mieszania, umieść w niej mieszadło, włącz płytkę mieszającą i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Gdy bezwodny octan sodu całkowicie się rozpuści, zmierzyć pH roztworu za pomocą skalibrowanego pH-metru.</li>
		<li>Dodać odpowiednio 1 M HCl lub NaOH, aby uzyskać pożądane pH 4,6.</li>
		<li>Dodaj wodę destylowaną, aż całkowita objętość wyniesie 1,000 ml.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór enzymatyczny
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml roztworu enzymatycznego w zakresie 10-30 mg/ml, najpierw mierząc 8 ml 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,6 w cylindrze miarowym o pojemności 15 ml. </li>
		<li>Dodać roztwór buforowy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z enzymem i energicznie wstrząsać, aż enzym się rozpuści.</li>
		<li>Dodaj więcej roztworu buforowego, aż całkowita objętość wyniesie 10 ml.</li>
		<li>Roztwór enzymu przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór podłoża
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór substratu w zakresie 300-600 mM, należy obliczyć ilość substratu potrzebną w gramach, aby uzyskać pożądane stężenie.</li>
		<li>Odważyć podłoże i umieścić w szklanej zlewce o pojemności 100 ml</li>
		<li>Odmierzyć 20 ml roztworu buforowego za pomocą cylindra miarowego o pojemności 25 ml, a następnie dodać go do szklanej zlewki.</li>
		<li>Umieścić zlewkę na płytce mieszającej i umieścić w niej mieszadło magnetyczne. Włącz ogień i odpowiednio dostosuj prędkość mieszania.</li>
		<li>Pozostaw mieszanie do momentu, aż podłoże się rozpuści.</li>
		<li>Wlać roztwór substratu do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodać 0,1 M buforu octanu sodu o pH 4,6, aż całkowita objętość wyniesie 45 ml. Wymieszać przez potrząsanie.</li>
		<li>Roztwór substratu należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprowadzanie eksperymentu
<ol>
	<li>Przygotowanie instrumentu ITC
	<ol>
		<li>Upewnij się, że komórka referencyjna jest załadowana 350 μl wody destylowanej. Przed załadowaniem enzymu do celi próbki sprawdź, czy cela próbki została oczyszczona.</li>
		<li>Protokół czyszczenia- Napełnij strzykawkę ładującą 500 μl 2% roztworu czyszczącego (tabela materiałów), ostrożnie włóż igłę do komórki próbki, napełnij kuwetę i powoli usuń płyn za pomocą tej samej strzykawki. Płyn przelać do zlewki. Powtórz ten krok dwa razy z 2% roztworem czyszczącym (tabela materiałów), trzy razy z 70% etanolem, a następnie przemyj dziesięć razy wodą destylowaną.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę ładującą 450 μl roztworu enzymu, ostrożnie włóż igłę do samego dna celi próbki i powoli dociskaj tłok do linii 100 μl, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Umyć strzykawkę do miareczkowania o pojemności 50 μl wodą destylowaną trzykrotnie, umieszczając końcówkę igły w wodzie, następnie powoli nabierając wody do strzykawki, a następnie dozując wodę do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Usunąć resztki wody, trzykrotnie spłukując je roztworem substratu.</li>
		<li>Napełnić strzykawkę do miareczkowania roztworem substratu, wciągając roztwór do momentu, aż strzykawka będzie pełna i nie będzie zawierał pęcherzyków powietrza. </li>
		<li>Trzymając strzykawkę nadal w roztworze substratu, zdjąć tłok i pozwolić, aby około 2 μl powietrza dostało się do górnej części strzykawki i ponownie włożyć tłok.</li>
		<li>Zdjąć uchwyt biurety ITC, umieścić strzykawkę w uchwycie biurety i przykręcić do oporu. </li>
		<li>Przetrzyj końcówkę mieszadła niestrzępiącą się chusteczką, a następnie ostrożnie umieść uchwyt biurety w instrumencie ITC i zablokuj go na miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Konfiguracja ITCrun 
<ol>
	<li>Na komputerze otwórz ITCrun i kliknij przycisk Konfiguruj.</li>
	<li>Kliknij Szybkość mieszania i ustaw na 350 obr./min. Sprawdzić rozmiar strzykawki (μl) i upewnić się, że wynosi 50 μl.</li>
	<li>Ustaw temperaturę i naciśnij Aktualizuj. Zaleca się, aby ten krok został wykonany co najmniej 1 godzinę przed przygotowaniem ITC. Daje to wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie lub ostygnięcie instrumentu w razie potrzeby.</li>
	<li>Jako konfigurację eksperymentu wybierz miareczkowanie przyrostowe.</li>
	<li>Kliknij przycisk Wstaw, aby skonfigurować wtryski. Ustawić odstęp między wstrzyknięciami na 5 400 s, objętość wstrzyknięcia (μL) na 4, a liczbę wstrzyknięć na 4. Naciśnij OK, aby potwierdzić ustawienia.</li>
	<li>W polu Equilibration (Równoważenie) wybierz opcję Auto-equilibrate (Automatyczne równoważenie) i Large expected heats (Duże oczekiwane biegi). (Jeśli oczekiwane ruje są małe, można wybrać małe poniżej oczekiwanych upałów, jednak wydłuży to czas równowagi).</li>
	<li>Ustaw początkową linię bazową na 300 s.</li>
	<li>Aby rozpocząć uruchamianie, kliknij symbol Start obok opcji Szybkość mieszania, a następnie kliknij przycisk Start, który znajduje się obok symbolu klucza.</li>
	<li>Zapisz plik i pozwól instrumentowi na uruchomienie.</li>
</ol>
4. Analizowanie danych
<ol>
	<li>Otwórz plik w programie NanoAnalyze. Kliknij Dane i wybierz Kolumny danych.</li>
	<li>Zaznacz wszystkie dane, skopiuj, a następnie wklej je do programu Microsoft Excel.</li>
	<li>Dostosuj linię bazową do zera, dodając wartość wymaganą w 300 s, aby wyzerować ją. Zastosuj tę poprawkę do całej kolumny wartości szybkości cieplnej. </li>
	<li>Znajdź minimalną lub maksymalną wartość szybkości ogrzewania dla każdego wstrzyknięcia, korzystając z równania: =MIN(komórka:komórka) lub MAX(komórka:komórka). Każdy punkt danych reprezentuje szczytową aktywność enzymatyczną enzymu przy każdym wstrzyknięciu.</li>
	<li>Wykresy wartości MIN lub MAX w odniesieniu do czasu, w którym wartość wystąpiła podczas miareczkowania.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

Główną zaletą opisanego tutaj testu stabilności enzymatycznej ITC jest automatyzacja. Po wykonaniu wszystkich odpowiednich i roztworów, czas przygotowania dla każdego testu wynosi około 15 minut dla osoby wykonującej test. W przeciwieństwie do tego, konwencjonalne testy aktywności inwertazy i laktazy wymagają około 2 godzin przy ciągłym zaangażowaniu osoby wykonującej test, a wiele testów aktywności enzymatycznej zajmuje znacznie więcej roboczogodzin. W poprzedniej publikacji wykazaliśmy, jak dane z metody ITC wypadają w...

Enzymy to białka zdolne do katalizowania szerokiego wachlarza reakcji organicznych. Większość enzymów działa w roztworze wodnym o pH zbliżonym do neutralnego, unikając w ten sposób stosowania ostrych rozpuszczalników. Ze względu na ich wysoką selektywność, reakcje katalizowane enzymatycznie wytwarzają mniej produktów ubocznych (w niektórych przypadkach nie wytwarzają żadnych produktów ubocznych) niż katalizatory nieselektywne, takie jak kwasy i zasady1. Jest to szczególnie istotne w produkcji żywności, gdzie wszystkie reakcje chemiczne muszą być przeprowadzane, aby produkt końcowy był bezpieczny do spożycia przez ludzi. Obecnie enzymy są wykorzystywane do produkcji syropu kukurydzianego o wysokiej zawartości fruktozy2, cheese3, beer4, mleko bez laktozy5 i inne ważne produkty spożywcze. Chociaż niniejszy artykuł koncentruje się na wykorzystaniu enzymów w przemyśle spożywczym, istnieje wiele innych zastosowań enzymów, w tym w zielonej chemii i syntezie leków. 
Użyteczność enzymów jest ograniczona przez stabilność aktywności enzymu, która zależy od utrzymania trójwymiarowej struktury enzymu. Strukturę enzymu można ustabilizować poprzez modyfikacje, takie jak PEGylacja6, unieruchomienie na solidnym podłożu7, modyfikacje genetyczne8 i preparaty. Obecnie stabilność enzymu jest zwykle mierzona za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) i testów aktywności enzymów w punkcie końcowym9. DSC mierzy temperaturę, w której rozwija się enzym; Im wyższa temperatura, tym bardziej stabilna konstrukcja. Jednak utrata aktywności często występuje w niższej temperaturze niż wymagana do rozwinięcia enzymu lub domen w enzymie10. W związku z tym DSC nie jest wystarczające do określenia, czy modyfikacja enzymu zwiększa stabilność aktywności enzymu. Testy enzymatyczne w punkcie końcowym są zwykle czasochłonne, wymagają wielu próbek i często obejmują sprzężoną reakcję kolorymetryczną, która nie ma zastosowania do wysoce zabarwionych lub nieprzezroczystych roztworów lub zawiesin.
Ta praca demonstruje metodę bezpośredniego pomiaru stabilności aktywności enzymu za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). ITC mierzy szybkość ciepła uwalnianego lub pochłanianego w trakcie reakcji. Ponieważ prawie wszystkie reakcje wytwarzają lub pochłaniają ciepło, ITC może być stosowany w większości reakcji katalizowanych enzymami, w tym w reakcjach, które nie mają reakcji sprzężonej lub zachodzą w nieprzezroczystych podłożach, takich jak mleko. ITC jest używany od wielu dziesięcioleci do pomiaru chemicznych parametrów kinetycznych dla wielu rodzajów reakcji, ale przedstawiony tutaj protokół koncentruje się na wykorzystaniu ITC do pomiaru szczytowej szybkości ciepła reakcji katalizowanych enzymami i pokazuje, że aktywność enzymu jest liniowo skorelowana ze szczytową szybkością ciepła. Pomiary ITC szczytowych szybkości ciepła są w większości autonomiczne i wymagają bardzo mało czasu personelu na konfigurację i analizę.

<table><tbody><tr><td>a-Laktoza</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>nieznany (zbyt stary)</td><td>500g</td></tr><tr><td>Octan sodu, bezwodny 99% min</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>Laktaza&nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu hydrocholowego, 1N&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>SA48-500</td> Miernik stołowy <td>500 ml</td></tr><tr><td>- pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td> <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td>1 galon</td></tr><tr><td>Micro-90</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L (roztwór czyszczący)</td></tr></tbody></table>

pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Ta praca demonstruje nową metodę pomiaru stabilności aktywności enzymu za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Szczytowa szybkość ogrzewania obserwowana po pojedynczym wstrzyknięciu roztworu substratu do roztworu enzymatycznego jest skorelowana z aktywnością enzymu. Wielokrotne wstrzyknięcia substratu do tego samego roztworu enzymatycznego w czasie wykazują utratę aktywności enzymu. Test jest autonomiczny, wymaga bardzo mało czasu personelu i ma zastosowanie do większości pożywek i enzymów.

Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 1 oraz Rysunku 5 ukazują dane dotyczące dwóch enzymów: laktazy i inwertazy. Laktaza i inwertaza katalizują hydrolizę disacharydu do dwóch monosacharydów, odpowiednio endotermicznie i egzotermicznie. Obie reakcje enzymatyczne przeprowadzono przy stężeniach, które wykluczały nasycenie enzymu.
Dane dla laktazy demonstrują, w jaki sposób dane z ITC mogą być wykorzystane do oceny stabilności ...

Stabilność termiczną aktywności enzymu można łatwo zmierzyć za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC). Większość obecnie stosowanych testów stabilności białek mierzy rozwijanie białek, ale nie dostarcza informacji o aktywności enzymatycznej. ITC umożliwia bezpośrednie określenie wpływu modyfikacji enzymów na stabilność aktywności enzymu.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Stosowanie enzymów jako katalizatorów w reakcjach może zmniejszyć ilość energii potrzebnej do reakcji i zmniejszyć toksyczne produkty uboczne. Jednak zastosowanie enzymów w przemyśle jest ograniczone, ponieważ enzymy nie są stabilne i mogą być drogie. Protokół ten może skrócić czas potrzebny na określenie, czy warunki są szkodliwe dla aktywności enzymu lub czy modyfikacje enzymu zwiększyły jego stabilność.Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona mniej roboczogodzin niż tradycyjne testy stabilności enzymów. Dodatkowo protokół ten może być stosowany z szeroką gamą enzymów, ponieważ może być stosowany w dowolnej reakcji, która uwalnia lub pochłania ciepło. Na początek przygotuj 0,1-molowy bufor octanu sodu.Odmierz 800 mililitrów wody destylowanej w zlewce z podziałką o pojemności 1,000 mililitrów. Następnie odważ 8,2 grama bezwodnego octanu sodu i dodaj go do zlewki. Umieść zlewkę na talerzu do mieszania.Umieść mieszadło w zlewce i włącz płytkę mieszadła, aby mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Gdy bezwodny octan sodu całkowicie się rozpuści, użyj skalibrowanego pH-metru do zmierzenia pH roztworu. Za pomocą pipety dodaj odpowiednio 1 molowy kwas solny lub wodorotlenek sodu, aby uzyskać pożądane pH na poziomie 4,6.Dodaj wodę destylowaną do zlewki, aż całkowita objętość osiągnie 1 000 mililitrów. Aby przygotować roztwór enzymu, w 15-mililitrowym cylindrze z podziałką odmierz 8 mililitrów 0,1-molowego buforu octanu sodu. Następnie dodaj roztwór buforowy do 15-mililitrowej stożkowej probówki z enzymem i energicznie wstrząsaj, aż enzym się rozpuści.Dodaj więcej roztworu buforowego, aż całkowita objętość osiągnie 10 mililitrów. Roztwór enzymu należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować roztwór substratu, zważ substrat i umieść go w szklanej zlewce o pojemności 100 mililitrów.Za pomocą cylindra z podziałką odmierz 20 mililitrów roztworu buforowego, a następnie dodaj go do szklanej zlewki. Umieść zlewkę na płytce mieszającej i umieść w niej mieszadło magnetyczne. Włącz ogień i odpowiednio dostosuj prędkość mieszania.Pozostaw mieszanie do momentu, aż podłoże się rozpuści. Wlej roztwór substratu do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj przygotowany wcześniej bufor octanu sodu, aż całkowita objętość wyniesie 45 mililitrów. Wstrząśnij probówką, aby wymieszać.Roztwór substratu należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Na komputerze otwórz program ITC Run i kliknij przycisk setup. Kliknij szybkość mieszania i ustaw na 350 obr./min.Sprawdź, czy rozmiar strzykawki wynosi 50 mikrolitrów. Ustaw temperaturę na 55 stopni Celsjusza i naciśnij aktualizuj. Odczekaj co najmniej godzinę przed kontynuowaniem, aby dać wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie lub ostygnięcie instrumentu ITC w razie potrzeby.Przed załadowaniem enzymu upewnij się, że komórka referencyjna jest załadowana 350 mikrolitrami wody destylowanej. Aby oczyścić celę próbki, napełnij strzykawkę ładującą 500 mikrolitrami 2-procentowego roztworu czyszczącego. Ostrożnie włóż igłę do celi próbki, napełnij kuwetę i powoli usuń płyn za pomocą tej samej strzykawki.Płyn przelać do zlewki. Powtórz ten krok dwa razy z 2-procentowym roztworem czyszczącym, trzy razy z 70-procentowym etanolem, a następnie przemyj dziesięć razy wodą destylowaną. Po oczyszczeniu celi próbki napełnij strzykawkę ładującą 450 mikrolitrami roztworu enzymatycznego.Ostrożnie włóż igłę do samego dna celi próbki i powoli dociśnij tłok do linii 100 mikrolitrów, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Następnie umyj strzykawkę do miareczkowania o pojemności 50 mikrolitrów wodą destylowaną, umieszczając końcówkę igły w wodzie, aby powoli nabrać wody do strzykawki, a następnie dozując wodę do pojemnika na odpady. Spłukać trzykrotnie roztworem podłoża, aby usunąć resztki wody.Następnie napełnić strzykawkę do miareczkowania roztworem substratu, wciągając roztwór do momentu, aż strzykawka będzie pełna bez pęcherzyków powietrza. Trzymając strzykawkę nadal w roztworze substratu, wyjąć tłok i pozwolić, aby około 2 mikrolitry powietrza dostały się do górnej części strzykawki, a następnie ponownie włożyć tłok. Zdjąć uchwyt biurety ITC, umieścić strzykawkę w uchwycie biurety i przykręcić do oporu.Przetrzeć końcówkę strzykawki do miareczkowania niestrzępiącą się chusteczką, a następnie ostrożnie umieścić uchwyt biurety w przyrządzie ITC i zablokować go na miejscu. Jako konfigurację eksperymentu wybierz miareczkowanie przyrostowe. Kliknij przycisk wstaw, aby skonfigurować wstrzykiwanie.Dostosuj odstęp między wstrzyknięciami do 5, 400 sekund, objętość wstrzyknięcia do 4 mikrolitrów, a liczbę wstrzyknięć do czterech. Naciśnij OK, aby potwierdzić ustawienia. W polu równoważenia wybierz opcję Automatyczne równoważenie i duże oczekiwane biegi.Ustaw początkową linię bazową na 300 sekund. Aby rozpocząć bieg, kliknij symbol rozpoczęcia obok pozycji Szybkość mieszania, a następnie kliknij przycisk Start, który znajduje się obok symbolu klucza. Zapisz plik i pozwól instrumentowi na uruchomienie.Aby przeanalizować dane, otwórz plik w programie Nano Analyze. Kliknij pozycję Dane i wybierz pozycję Kolumny danych. Zaznacz wszystkie dane, skopiuj, a następnie wklej je do programu Microsoft Excel.Dostosuj linię bazową 0, dodając wartość wymaganą po 300 sekundach, aby uzyskać wartość 0. Zastosuj tę poprawkę do całej kolumny wartości szybkości cieplnej. Następnie narysuj wykresy wartości minimalnych lub maksymalnych w stosunku do czasu, w którym wartość wystąpiła podczas miareczkowania.W tym protokole dane ITC pokazują ślady aktywności laktazy z czterema sekwencyjnymi wstrzyknięciami laktozy do roztworu laktazy w buforze o pH 4,6 w temperaturze 55 stopni Celsjusza, 45 stopni Celsjusza, 35 stopni Celsjusza i 25 stopni Celsjusza. Kontrolę bez enzymów przeprowadzono w temperaturze 55 stopni Celsjusza dla ciepła mieszania. Dla każdego wstrzyknięcia enzymu następuje początkowe egzotermiczne ciepło mieszania, a następnie katalizowana laktazą endotermiczna hydroliza laktozy następuje aż do zakończenia reakcji, a szybkość ogrzewania powróci do wartości wyjściowej.Minimum piku endotermicznego po każdym wstrzyknięciu jest nieco mniejsze niż w poprzednim wstrzyknięciu ze względu na spadek aktywności enzymatycznej. Zgodnie z oczekiwaniami, stabilność enzymu przy każdym wstrzyknięciu zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. Eksperyment kontrolny pokazuje, że aktywność laktazy w temperaturze 25 stopni Celsjusza miała 8-procentowy spadek aktywności enzymu z powodu rozcieńczenia po czterech wstrzyknięciach.Biorąc pod uwagę, że czwarte wstrzyknięcie wykazało 73-procentowy spadek w teście, rzeczywista utrata aktywności enzymu wyniosła 65 procent. Tak więc rozcieńczenie laktazy wynikające z każdego wstrzyknięcia miało stosunkowo niewielki wpływ na aktywność enzymu wynoszący 11 procent. Ważne jest, aby bufor używany do wytwarzania roztworów enzymów i substratów był jak najdokładniej dopasowany.Niedopasowanie pH lub stężenia może skutkować większym ciepłem mieszania, co może zamaskować ciepło reakcji. Możesz zastosować ten protokół do badania enzymów i określić ich stabilność, mierząc szybkość ciepła uwalnianego lub pochłanianego w trakcie reakcji.

measuring-enzymatic-stability-by-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Przedstawiono ogólny protokół wykorzystania izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do monitorowania termodynamiki wiązania w układach biologicznych o umiarkowanym powinowactwie wiązania.

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa w pomiarach powinowactwa makrocząsteczek do ligandów

Pobrać seryjne rozcieńczenia kultury bakteryjnej i dodać podwielokrotności do fiolek kalorymetrycznych zawierających pożywkę wzrostową.Załadować szczelnie zamknięte fiolki do wielodołkowej płytki mikrokalorymetru izotermicznego w celu zmierzenia produkcji ciepła metabolicznego.Urządzenie jest utrzymywane w stałej temperaturze, aby zapewnić, że wykryte ciepło pochodzi wyłącznie z metabolizmu bakteryjnego.Gdy bakterie metabolizują składniki odżywcze i namnażają się, uwalniają ciepło, które...

Mikrokalorymetria izotermiczna do monitorowania aktywności metabolicznej bakterii

Kursy czasowe aktywności glikozylazy DNA 8-oksoguaniny są dwufazowe, wykazując gwałtowne tworzenie produktu i liniową fazę stanu ustalonego. Wykorzystując techniki przepływu gaszącego, można zmierzyć szybkość rozerwania i stanu ustalonego, które odpowiadają odpowiednio wycięciu 8-oksoguaniny i uwolnieniu glikozylazy z DNA produktu.

Pomiar kinetyczny w stanie ustalonym, przed stanem ustalonym i pojedynczym obrotem dla aktywności glikozylazy DNA

Izotermiczna kalorymetria miareczkowa mierzy przepływ ciepła uwalnianego lub pochłanianego w reakcjach chemicznych. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania katalizy enzymatycznej. W tym artykule ogólnie opisano protokół konfiguracji instrumentalnej, prowadzenia eksperymentu i analizy danych, który jest stosowany do charakterystyki enzymatycznej hydrolizy mocznika za pomocą ureazy fasoli jack.

Gorąca kataliza biologiczna: kalorymetria miareczkowa izotermiczna w celu scharakteryzowania reakcji enzymatycznych

Opisujemy podstawowy protokół ilościowego oznaczania aktywności ATPazy in vitro. Protokół ten można zoptymalizować w oparciu o poziom aktywności i wymagania dla danej oczyszczonej ATPazy.

Pomiar aktywności ATPazy in vitro w celu charakterystyki enzymatycznej

Różnicowa kalorymetria skaningowa mierzy temperaturę(y) przemiany termicznej i całkowitą energię cieplną potrzebną do denaturacji białka. Uzyskane wyniki służą do oceny stabilności termicznej antygenów białkowych w formulacjach szczepionek.

Różnicowa kalorymetria skaningowa – metoda oceny stabilności termicznej i konformacji antygenu białkowego

A przedstawiono protokół do szybkiego testowania stabilności termicznej białek w różnych warunkach za pomocą testów przesunięcia termicznego i nano różnicowej fluorymetrii skaningowej. Systemy buforowe, sole i dodatki, składające się z trzech unikalnych ekranów stabilności, są testowane z białkami w celu zidentyfikowania odpowiednich do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Jak ustabilizować białko: badania przesiewowe stabilności do testów przesunięcia termicznego i nanoróżnicowej fluorymetrii skaningowej w projekcie Virus-X

Obecny protokół opisuje użycie izotermicznej kalorymetrii miareczkowej (ITC) do analizy kinetyki asocjacji i dysocjacji wiązania między aptamerem DNA a tetracykliną, w tym przygotowania próbek, uruchamiania wzorców i próbek oraz interpretacji uzyskanych danych.

Określanie asocjacji termodynamicznej i kinetycznej aptameru DNA i tetracykliny za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

In planta pomiar strumieni składników odżywczych i toksycznych jest niezbędny do badania odżywiania i toksyczności roślin. W tym miejscu omawiamy protokoły radioznacznikowe do oznaczania napływu i odpływu w nienaruszonych korzeniach roślin, używając jako przykładów strumieni potasu (K+) i amoniaku/amonu (NH3/NH4+). Omówiono zalety i ograniczenia takich technik.

Pomiar strumieni mineralnych składników odżywczych i substancji toksycznych w roślinach z radioaktywnymi znacznikami

Poznaj metodę pomiaru stabilności aktywności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej. Technika ta wymaga mniej czasu niż tradycyjne testy i pozwala na bezpośrednią ocenę wpływu modyfikacji na stabilność enzymów.

Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Przeglądaj więcej filmów