Pomiar stabilności enzymatycznej za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkowej

Stosowanie enzymów jako katalizatorów w reakcjach może zmniejszyć ilość energii potrzebnej do reakcji i zmniejszyć toksyczne produkty uboczne. Jednak zastosowanie enzymów w przemyśle jest ograniczone, ponieważ enzymy nie są stabilne i mogą być drogie. Protokół ten może skrócić czas potrzebny na określenie, czy warunki są szkodliwe dla aktywności enzymu lub czy modyfikacje enzymu zwiększyły jego stabilność.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ona mniej roboczogodzin niż tradycyjne testy stabilności enzymów. Dodatkowo protokół ten może być stosowany z szeroką gamą enzymów, ponieważ może być stosowany w dowolnej reakcji, która uwalnia lub pochłania ciepło. Na początek przygotuj 0,1-molowy bufor octanu sodu.

Odmierz 800 mililitrów wody destylowanej w zlewce z podziałką o pojemności 1,000 mililitrów. Następnie odważ 8,2 grama bezwodnego octanu sodu i dodaj go do zlewki. Umieść zlewkę na talerzu do mieszania.

Umieść mieszadło w zlewce i włącz płytkę mieszadła, aby mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Gdy bezwodny octan sodu całkowicie się rozpuści, użyj skalibrowanego pH-metru do zmierzenia pH roztworu. Za pomocą pipety dodaj odpowiednio 1 molowy kwas solny lub wodorotlenek sodu, aby uzyskać pożądane pH na poziomie 4,6.

Dodaj wodę destylowaną do zlewki, aż całkowita objętość osiągnie 1 000 mililitrów. Aby przygotować roztwór enzymu, w 15-mililitrowym cylindrze z podziałką odmierz 8 mililitrów 0,1-molowego buforu octanu sodu. Następnie dodaj roztwór buforowy do 15-mililitrowej stożkowej probówki z enzymem i energicznie wstrząsaj, aż enzym się rozpuści.

Dodaj więcej roztworu buforowego, aż całkowita objętość osiągnie 10 mililitrów. Roztwór enzymu należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby przygotować roztwór substratu, zważ substrat i umieść go w szklanej zlewce o pojemności 100 mililitrów.

Za pomocą cylindra z podziałką odmierz 20 mililitrów roztworu buforowego, a następnie dodaj go do szklanej zlewki. Umieść zlewkę na płytce mieszającej i umieść w niej mieszadło magnetyczne. Włącz ogień i odpowiednio dostosuj prędkość mieszania.

Pozostaw mieszanie do momentu, aż podłoże się rozpuści. Wlej roztwór substratu do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i dodaj przygotowany wcześniej bufor octanu sodu, aż całkowita objętość wyniesie 45 mililitrów. Wstrząśnij probówką, aby wymieszać.

Roztwór substratu należy przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Na komputerze otwórz program ITC Run i kliknij przycisk setup. Kliknij szybkość mieszania i ustaw na 350 obr./min.

Sprawdź, czy rozmiar strzykawki wynosi 50 mikrolitrów. Ustaw temperaturę na 55 stopni Celsjusza i naciśnij aktualizuj. Odczekaj co najmniej godzinę przed kontynuowaniem, aby dać wystarczająco dużo czasu na rozgrzanie lub ostygnięcie instrumentu ITC w razie potrzeby.

Przed załadowaniem enzymu upewnij się, że komórka referencyjna jest załadowana 350 mikrolitrami wody destylowanej. Aby oczyścić celę próbki, napełnij strzykawkę ładującą 500 mikrolitrami 2-procentowego roztworu czyszczącego. Ostrożnie włóż igłę do celi próbki, napełnij kuwetę i powoli usuń płyn za pomocą tej samej strzykawki.

Płyn przelać do zlewki. Powtórz ten krok dwa razy z 2-procentowym roztworem czyszczącym, trzy razy z 70-procentowym etanolem, a następnie przemyj dziesięć razy wodą destylowaną. Po oczyszczeniu celi próbki napełnij strzykawkę ładującą 450 mikrolitrami roztworu enzymatycznego.

Ostrożnie włóż igłę do samego dna celi próbki i powoli dociśnij tłok do linii 100 mikrolitrów, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Następnie umyj strzykawkę do miareczkowania o pojemności 50 mikrolitrów wodą destylowaną, umieszczając końcówkę igły w wodzie, aby powoli nabrać wody do strzykawki, a następnie dozując wodę do pojemnika na odpady. Spłukać trzykrotnie roztworem podłoża, aby usunąć resztki wody.

Następnie napełnić strzykawkę do miareczkowania roztworem substratu, wciągając roztwór do momentu, aż strzykawka będzie pełna bez pęcherzyków powietrza. Trzymając strzykawkę nadal w roztworze substratu, wyjąć tłok i pozwolić, aby około 2 mikrolitry powietrza dostały się do górnej części strzykawki, a następnie ponownie włożyć tłok. Zdjąć uchwyt biurety ITC, umieścić strzykawkę w uchwycie biurety i przykręcić do oporu.

Przetrzeć końcówkę strzykawki do miareczkowania niestrzępiącą się chusteczką, a następnie ostrożnie umieścić uchwyt biurety w przyrządzie ITC i zablokować go na miejscu. Jako konfigurację eksperymentu wybierz miareczkowanie przyrostowe. Kliknij przycisk wstaw, aby skonfigurować wstrzykiwanie.

Dostosuj odstęp między wstrzyknięciami do 5, 400 sekund, objętość wstrzyknięcia do 4 mikrolitrów, a liczbę wstrzyknięć do czterech. Naciśnij OK, aby potwierdzić ustawienia. W polu równoważenia wybierz opcję Automatyczne równoważenie i duże oczekiwane biegi.

Ustaw początkową linię bazową na 300 sekund. Aby rozpocząć bieg, kliknij symbol rozpoczęcia obok pozycji Szybkość mieszania, a następnie kliknij przycisk Start, który znajduje się obok symbolu klucza. Zapisz plik i pozwól instrumentowi na uruchomienie.

Aby przeanalizować dane, otwórz plik w programie Nano Analyze. Kliknij pozycję Dane i wybierz pozycję Kolumny danych. Zaznacz wszystkie dane, skopiuj, a następnie wklej je do programu Microsoft Excel.

Dostosuj linię bazową 0, dodając wartość wymaganą po 300 sekundach, aby uzyskać wartość 0. Zastosuj tę poprawkę do całej kolumny wartości szybkości cieplnej. Następnie narysuj wykresy wartości minimalnych lub maksymalnych w stosunku do czasu, w którym wartość wystąpiła podczas miareczkowania.

W tym protokole dane ITC pokazują ślady aktywności laktazy z czterema sekwencyjnymi wstrzyknięciami laktozy do roztworu laktazy w buforze o pH 4,6 w temperaturze 55 stopni Celsjusza, 45 stopni Celsjusza, 35 stopni Celsjusza i 25 stopni Celsjusza. Kontrolę bez enzymów przeprowadzono w temperaturze 55 stopni Celsjusza dla ciepła mieszania. Dla każdego wstrzyknięcia enzymu następuje początkowe egzotermiczne ciepło mieszania, a następnie katalizowana laktazą endotermiczna hydroliza laktozy następuje aż do zakończenia reakcji, a szybkość ogrzewania powróci do wartości wyjściowej.

Minimum piku endotermicznego po każdym wstrzyknięciu jest nieco mniejsze niż w poprzednim wstrzyknięciu ze względu na spadek aktywności enzymatycznej. Zgodnie z oczekiwaniami, stabilność enzymu przy każdym wstrzyknięciu zmniejsza się wraz ze wzrostem temperatury. Eksperyment kontrolny pokazuje, że aktywność laktazy w temperaturze 25 stopni Celsjusza miała 8-procentowy spadek aktywności enzymu z powodu rozcieńczenia po czterech wstrzyknięciach.

Biorąc pod uwagę, że czwarte wstrzyknięcie wykazało 73-procentowy spadek w teście, rzeczywista utrata aktywności enzymu wyniosła 65 procent. Tak więc rozcieńczenie laktazy wynikające z każdego wstrzyknięcia miało stosunkowo niewielki wpływ na aktywność enzymu wynoszący 11 procent. Ważne jest, aby bufor używany do wytwarzania roztworów enzymów i substratów był jak najdokładniej dopasowany.

Niedopasowanie pH lub stężenia może skutkować większym ciepłem mieszania, co może zamaskować ciepło reakcji. Możesz zastosować ten protokół do badania enzymów i określić ich stabilność, mierząc szybkość ciepła uwalnianego lub pochłanianego w trakcie reakcji.