Badanie normalnych efektów promieniowania tkanek za pomocą hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej
July 24th, 2019
Ten protokół przedstawia metodę decelularyzacji i późniejszego tworzenia hydrożelu mysich poduszeczek tłuszczowych sutka po napromieniowaniu ex vivo.
Protokół ten pokazuje, że promieniowanie wpływa na właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki tłuszczowej w mysiej poduszce tłuszczowej sutka. Dodanie promieniowania w modelu decelularyzacji nie było wcześniej wykonywane. Technika ta wykorzystuje kilka etapów mycia, z których każdy służy unikalnemu celowi chemicznemu w procesie decelularyzacji.
Specyfika tej techniki pozwala na delikatniejsze mycie chemiczne, aby lepiej zachować właściwości tkanek. Nawrót raka piersi występuje po terapii, zwłaszcza w przypadkach potrójnie ujemnych. Ocena, w jaki sposób napromieniowana macierz zewnątrzkomórkowa zmienia zachowanie komórek nowotworowych, doprowadzi do ważnych odkryć dotyczących mechanizmów nawrotu.
Po napromieniowaniu próbek, przy użyciu źródła cezu, należy przenieść napromieniowane urządzenia wielofunkcyjne i kompletne media RPMI do komory bezpieczeństwa biologicznego. Napełnij naczynia o średnicy sześciu centymetrów lub 10 centymetrów wystarczającą ilością nośnika, aby zanurzyć urządzenie wielofunkcyjne. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa dni.
Najpierw umieść urządzenia wielofunkcyjne w sześciocentymetrowych naczyniach z pięcioma mililitrami roztworu trypsyny-EDTA. Spryskaj i przetrzyj naczynia 70% etanolem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Użyj sitek o pojemności 0,7 mililitra, aby umyć urządzenia wielofunkcyjne wodą dejonizowaną, trzykrotnie zalewając chusteczkę wodą.
Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między myciami. Następnie krótko osusz tkankę na delikatnej chusteczce i zważ ją. Umieścić wysuszone tkanki we wstępnie autoklawowanej zlewce, zawierającej mieszadło o odpowiedniej wielkości i przykryć tkanki 60 mililitrami 3% t-oktylofenoksypolietylenu na gram tkanki.
Mieszaj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wrzuć zawartość zlewki do sitka. Opłucz zlewkę wodą dejonizowaną i wylej ją na tkanki.
Powtórz ten proces płukania jeszcze dwa razy, upewniając się, że używasz kleszczy do ręcznego masowania tkanki między płukaniami. Następnie krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść chusteczki i mieszadła z powrotem w tych samych zlewkach i przykryj je 60 mililitrami 4% kwasu dezoksycholowego na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie wrzuć zawartość zlewki do sitka o oczkach, przepłucz zlewkę wodą dejonizowaną i wylej ją na tkanki. Powtórz ten proces płukania jeszcze dwa razy, upewniając się, że używasz kleszczy do ręcznego masowania tkanki między płukaniami.
Krótko osusz wypłukaną chusteczkę na delikatnej chusteczce roboczej i zważ ją. Umieść wysuszone tkanki w tej samej zlewce wraz ze świeżą wodą dejonizowaną, uzupełnioną 1% penicyliną-streptomycyną. Przykryj zlewkę szczelnie folią parafinową i pozostaw na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odcedź zawartość zlewki do sitka, krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ ją. Następnie umieść urządzenia wielofunkcyjne w tej samej zlewce z mieszadłem o odpowiedniej wielkości. Przykryj tkankę 60 mililitrami roztworu zawierającego 4% etanolu i 0,1% kwasu nadoctowego na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Wrzuć zawartość zlewki do sitka o średnicy 0,7 milimetra. Za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę i umieść zawartość z powrotem w zlewce.
Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 mililitrami 1X PBS na gram tkanki. Mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz cały proces prania jeszcze raz.
Następnie wrzuć zawartość zlewki do sitka o średnicy 0,7 milimetra. Za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę i umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 mililitrami wody dejonizowanej na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz cały proces prania jeszcze raz. Umytą chusteczkę krótko osuszyć na delikatnej chusteczce roboczej i zważyć.
Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka i za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę. Umieść zawartość z powrotem w zlewce i przykryj chusteczki 60 mililitrami 100% n-propanolu na gram tkanki. Mieszaj w temperaturze pokojowej przez godzinę.
Następnie krótko osusz tkankę na delikatnej chusteczce i zważ ją. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 milimetra i za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę. Umieść zawartość z powrotem w zlewce i umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 mililitrami wody dejonizowanej na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz ten proces prania trzy razy. Następnie krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ ją.
Przenieś tkankę do oznakowanej 15-mililitrowej probówki i zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Najpierw napełnij płytki pojemnik ciekłym azotem. Wyjmij próbki z zamrażarki i zważ każde liofilizowane urządzenie wielofunkcyjne.
Umieść jedną próbkę w moździerzu, użyj rękawicy kriogenicznej, aby utrzymać zaprawę w ciekłym azocie. Następnie użyj tłuczka, dołączonego do ręcznej wiertarki, aby zmielić próbkę. Miel w jednominutowych odstępach, aby sprawdzić postęp i wyjmij rękę w rękawiczce z ciekłego azotu.
Powtórz ten proces mielenia dla wszystkich próbek, upewniając się, że między każdą próbką spryskałeś i przetarłeś moździerz i tłuczek etanolem. Przechowuj sproszkowane próbki w 15-mililitrowych probówkach w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Na początek wyjmij próbki z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej.
Podczas rozmrażania próbek wymieszaj pepsynę z kwasem solnym, aby utworzyć roztwór pepsyny-HCL. Następnie dodaj próbkę proszku i roztwór pepsyny-HCL do 15-mililitrowej probówki, dodaj małą mieszadło i mieszaj przez 48 godzin. Następnie umieść rurki na lodzie na pięć minut.
Dodać 10X PBS do każdej próbki, tak aby końcowy roztwór miał stężenie 1X PBS. Następnie dodaj 10% objętości/objętości, 0,1 molowego wodorotlenku sodu do każdego roztworu, aby osiągnąć pH 7,4, używając papieru pH do przetestowania każdego roztworu indywidualnie. Używając roztworu żelu o pH 7,4, ponownie zawiesić granulowane komórki 4T1 znakowane GFP i lucyferazyą do stężenia 500 000 lub 1 000 000 komórek na mililitr roztworu żelu.
Dodać 16 mikrolitrów roztworu komórek żelowych do każdego dołka 16-dołkowego szkiełka podstawowego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnego podłoża RPMI do każdej studzienki. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.
Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby obserwować komórki przy długości fali wzbudzenia 519 nanometrów i długości fali emisji 618 nanometrów. W tym badaniu badane są normalne efekty promieniowania tkanek przy użyciu hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej. Barwienie hematoksyliną i eozyną służy do potwierdzenia decelularyzacji, poprzez utratę jąder i innych śladów DNA.
Podczas gdy barwienie czerwienią olejową O służy do oceny zawartości lipidów i potwierdzenia zachowania morfologii dipazytu. Właściwości reologiczne hydrożeli ECM oceniane są w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Moduł spichrożenia jest wyższy niż moduł strat we wszystkich warunkach, co świadczy o stabilnym tworzeniu hydrożelu.
Komórki raka sutka znakowane GFP i lucyferazyą 4T1 są następnie kapsułkowane w hydrożelach. Proliferację komórek bada się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, pomiarów oświetlenia i barwienia żywotności, 48 godzin po enkapsulacji. Napromieniowane hydrożele wykazują tendencję wzrostową w proliferacji komórek nowotworowych.
Koniugat falloidyny służy do wizualizacji F-aktyny w kapsułkowanych komórkach. Należy pamiętać o schłodzeniu zaprawy przed włożeniem chusteczki do wnętrza młyna, ciepła zaprawa może doprowadzić do niepełnego zmielenia. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z n-propanalem i pepsyną, tylko otwarte n-propanal i inne środki decelularyzacyjne pod kapturem chemicznym.
Jeśli to możliwe, zważyć pepsynę pod kapturem chemicznym, ponieważ istnieje niebezpieczeństwo wdychania. Zmiany składu ECM po napromieniowaniu i decelularyzacji można ocenić za pomocą spektrometrii mas i spektroskopii Ramana. Ponadto strukturę włókien hydrożeli ECM można analizować za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
Metoda ta może zostać rozszerzona o badanie wpływu promieniowania nie tylko na komórki nowotworowe, ale także na komórki odpornościowe, a także tkanki, które w wyniku terapii ulegają uszkodzeniom popromiennym. Ta technika decelularyzacji pozwoli naukowcom ocenić właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki po promieniowaniu, które jest ważną opcją leczenia w większości nowotworów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia metodę decelularyzacji i następczego tworzenia żelów hydrofilowych z mysich poduszek tłuszczowych sutka po naświetleniu ex vivo. Technika ta pozwala na łagodniejsze chemiczne płukanie, aby lepiej zachować właściwości tkanki, co jest kluczowe dla badań nad wpływem promieniowania na właściwości macierzy pozakomórkowej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia
- Onkologia
Tło
- Promieniowanie wpływa na właściwości macierzy pozakomórkowej tkanki tłuszczowej.
- Modele decelularyzacji dotąd nie uwzględniały promieniowania.
- Nawroty raka piersi są istotnym problemem, szczególnie w przypadku raka trójujemnego ujemnego.
- Zrozumienie wpływu naświetlenia na właściwości macierzy pozakomórkowej może ujawniać mechanizmy nawrotu.
Cel badania
- Ocenić, jak promieniowanie wpływa na matrycę pozakomórkową w myszych poduszkach tłuszczowych sutka.
- Opracować metodę decelularyzacji, która zachowuje właściwości tkanki.
- Zbadać wpływ naświetlonej macierzy pozakomórkowej na zachowanie komórek nowotworowych.
Stosowane metody
- Protokół decelularyzacji z określonymi krokami płukania.
- Naświetlenie ex vivo myszych poduszek tłuszczowych sutka.
- Tworzenie żelu hydrofilowego z decelularyzowanej tkanki.
- Ocena właściwości macierzy pozakomórkowej po naświetleniu.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie decelularyzuje mysze poduszki tłuszczowe sutka.
- Promieniowanie zmienia właściwości macierzy pozakomórkowej.
- Łagodniejsze chemiczne płukanie zachowuje krytyczne cechy tkanki.
- Zdobyte wglądy mogą wpłynąć na strategie radzenia sobie z nawrotem raka piersi.
Wnioski
- To badanie wprowadza nową metodę badania naświetlonej tkanki tłuszczowej.
- Wyniki mogą prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów nawrotu nowotworu.
- Podejście może być zastosowane do dalszych badań w biologii nowotworów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding how radiation alters the extracellular matrix in healthy breast tissue provides mechanistic insights into local tumor recurrence, a critical challenge in triple-negative breast cancer therapy. This method enables in vitro modeling of irradiated tissue microenvironments to de-risk target validation and assay development by linking ECM changes to tumor cell proliferation and cytoskeletal reorganization. It supports predictive confidence in preclinical models by capturing stromal contributions to therapy resistance and disease relapse.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how irradiated stromal ECM influences tumor cell behavior to clarify microenvironmental contributions to therapeutic resistance.
- Operational Value: Enables functional validation of stromal targets by assessing tumor cell proliferation and cytoskeleton organization in physiologically relevant hydrogels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible hydrogels with quantifiable rheological and biochemical outputs for compound screening in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Supports assay scalability and reuse through lyophilized ECM powder storage and controlled rehydration for consistent experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant stromal-tumor interactions post-radiation to evaluate mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by preserving native ECM architecture and composition after irradiation and decellularization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable stromal platform that connects radiation-induced ECM changes to tumor cell phenotypes, informing lead identification and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal-mediated resistance mechanisms by enabling controlled comparison of irradiated versus non-irradiated ECM on tumor cell behavior.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with measurable proliferation and cytoskeletal readouts for evaluating modulator effects in a standardized microenvironment.
- Analytics: Provides quantitative outputs including fluorescence intensity, luminescence, and rheological parameters to compare conditions and assess stromal impact on tumor phenotypes.
- Translational Research: Models stromal-tumor crosstalk in irradiated tissue to align with preclinical evaluation of agents targeting microenvironmental drivers of recurrence.
- Enterprise Reuse: Enables platform standardization through lyophilized ECM storage, allowing reproducible hydrogel generation across teams and timepoints for longitudinal stromal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling stromal contributions to tumor recurrence and reducing mechanistic ambiguity in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization, irradiation, and hydrogel formation steps with defined washing and reagent parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stromal targets that modulate tumor cell behavior post-radiation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on efficacy in irradiated stromal contexts that mimic clinical relapse scenarios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, hydrogel handling, and fluorescence-based cell viability and cytoskeleton assays.
- Depends on access to irradiation equipment (e.g., cesium source), rheometers, and microscopy systems for proliferation and F-actin imaging.
- Necessitates cross-team standardization of tissue sourcing, irradiation dosing, and hydrogel preparation to ensure experimental consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other tissue types or stromal sources beyond murine mammary fat pads.
- Limited by the murine origin of the ECM, which may require validation in human-relevant stromal models for translational extrapolation.
