Badanie normalnych efektów promieniowania tkanek za pomocą hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej
24 lipca 2019
Ten protokół przedstawia metodę decelularyzacji i późniejszego tworzenia hydrożelu mysich poduszeczek tłuszczowych sutka po napromieniowaniu ex vivo.
Protokół ten pokazuje, że promieniowanie wpływa na właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki tłuszczowej w mysiej poduszce tłuszczowej sutka. Dodanie promieniowania w modelu decelularyzacji nie było wcześniej wykonywane. Technika ta wykorzystuje kilka etapów mycia, z których każdy służy unikalnemu celowi chemicznemu w procesie decelularyzacji.
Specyfika tej techniki pozwala na delikatniejsze mycie chemiczne, aby lepiej zachować właściwości tkanek. Nawrót raka piersi występuje po terapii, zwłaszcza w przypadkach potrójnie ujemnych. Ocena, w jaki sposób napromieniowana macierz zewnątrzkomórkowa zmienia zachowanie komórek nowotworowych, doprowadzi do ważnych odkryć dotyczących mechanizmów nawrotu.
Po napromieniowaniu próbek, przy użyciu źródła cezu, należy przenieść napromieniowane urządzenia wielofunkcyjne i kompletne media RPMI do komory bezpieczeństwa biologicznego. Napełnij naczynia o średnicy sześciu centymetrów lub 10 centymetrów wystarczającą ilością nośnika, aby zanurzyć urządzenie wielofunkcyjne. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa dni.
Najpierw umieść urządzenia wielofunkcyjne w sześciocentymetrowych naczyniach z pięcioma mililitrami roztworu trypsyny-EDTA. Spryskaj i przetrzyj naczynia 70% etanolem i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Użyj sitek o pojemności 0,7 mililitra, aby umyć urządzenia wielofunkcyjne wodą dejonizowaną, trzykrotnie zalewając chusteczkę wodą.
Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między myciami. Następnie krótko osusz tkankę na delikatnej chusteczce i zważ ją. Umieścić wysuszone tkanki we wstępnie autoklawowanej zlewce, zawierającej mieszadło o odpowiedniej wielkości i przykryć tkanki 60 mililitrami 3% t-oktylofenoksypolietylenu na gram tkanki.
Mieszaj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie wrzuć zawartość zlewki do sitka. Opłucz zlewkę wodą dejonizowaną i wylej ją na tkanki.
Powtórz ten proces płukania jeszcze dwa razy, upewniając się, że używasz kleszczy do ręcznego masowania tkanki między płukaniami. Następnie krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść chusteczki i mieszadła z powrotem w tych samych zlewkach i przykryj je 60 mililitrami 4% kwasu dezoksycholowego na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie wrzuć zawartość zlewki do sitka o oczkach, przepłucz zlewkę wodą dejonizowaną i wylej ją na tkanki. Powtórz ten proces płukania jeszcze dwa razy, upewniając się, że używasz kleszczy do ręcznego masowania tkanki między płukaniami.
Krótko osusz wypłukaną chusteczkę na delikatnej chusteczce roboczej i zważ ją. Umieść wysuszone tkanki w tej samej zlewce wraz ze świeżą wodą dejonizowaną, uzupełnioną 1% penicyliną-streptomycyną. Przykryj zlewkę szczelnie folią parafinową i pozostaw na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odcedź zawartość zlewki do sitka, krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ ją. Następnie umieść urządzenia wielofunkcyjne w tej samej zlewce z mieszadłem o odpowiedniej wielkości. Przykryj tkankę 60 mililitrami roztworu zawierającego 4% etanolu i 0,1% kwasu nadoctowego na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Wrzuć zawartość zlewki do sitka o średnicy 0,7 milimetra. Za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę i umieść zawartość z powrotem w zlewce.
Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 mililitrami 1X PBS na gram tkanki. Mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz cały proces prania jeszcze raz.
Następnie wrzuć zawartość zlewki do sitka o średnicy 0,7 milimetra. Za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę i umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 mililitrami wody dejonizowanej na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz cały proces prania jeszcze raz. Umytą chusteczkę krótko osuszyć na delikatnej chusteczce roboczej i zważyć.
Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka i za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę. Umieść zawartość z powrotem w zlewce i przykryj chusteczki 60 mililitrami 100% n-propanolu na gram tkanki. Mieszaj w temperaturze pokojowej przez godzinę.
Następnie krótko osusz tkankę na delikatnej chusteczce i zważ ją. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 milimetra i za pomocą kleszczy ręcznie masuj tkankę. Umieść zawartość z powrotem w zlewce i umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 mililitrami wody dejonizowanej na gram tkanki.
Mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powtórz ten proces prania trzy razy. Następnie krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ ją.
Przenieś tkankę do oznakowanej 15-mililitrowej probówki i zamroź w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc. Najpierw napełnij płytki pojemnik ciekłym azotem. Wyjmij próbki z zamrażarki i zważ każde liofilizowane urządzenie wielofunkcyjne.
Umieść jedną próbkę w moździerzu, użyj rękawicy kriogenicznej, aby utrzymać zaprawę w ciekłym azocie. Następnie użyj tłuczka, dołączonego do ręcznej wiertarki, aby zmielić próbkę. Miel w jednominutowych odstępach, aby sprawdzić postęp i wyjmij rękę w rękawiczce z ciekłego azotu.
Powtórz ten proces mielenia dla wszystkich próbek, upewniając się, że między każdą próbką spryskałeś i przetarłeś moździerz i tłuczek etanolem. Przechowuj sproszkowane próbki w 15-mililitrowych probówkach w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia. Na początek wyjmij próbki z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej.
Podczas rozmrażania próbek wymieszaj pepsynę z kwasem solnym, aby utworzyć roztwór pepsyny-HCL. Następnie dodaj próbkę proszku i roztwór pepsyny-HCL do 15-mililitrowej probówki, dodaj małą mieszadło i mieszaj przez 48 godzin. Następnie umieść rurki na lodzie na pięć minut.
Dodać 10X PBS do każdej próbki, tak aby końcowy roztwór miał stężenie 1X PBS. Następnie dodaj 10% objętości/objętości, 0,1 molowego wodorotlenku sodu do każdego roztworu, aby osiągnąć pH 7,4, używając papieru pH do przetestowania każdego roztworu indywidualnie. Używając roztworu żelu o pH 7,4, ponownie zawiesić granulowane komórki 4T1 znakowane GFP i lucyferazyą do stężenia 500 000 lub 1 000 000 komórek na mililitr roztworu żelu.
Dodać 16 mikrolitrów roztworu komórek żelowych do każdego dołka 16-dołkowego szkiełka podstawowego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnego podłoża RPMI do każdej studzienki. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.
Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby obserwować komórki przy długości fali wzbudzenia 519 nanometrów i długości fali emisji 618 nanometrów. W tym badaniu badane są normalne efekty promieniowania tkanek przy użyciu hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej. Barwienie hematoksyliną i eozyną służy do potwierdzenia decelularyzacji, poprzez utratę jąder i innych śladów DNA.
Podczas gdy barwienie czerwienią olejową O służy do oceny zawartości lipidów i potwierdzenia zachowania morfologii dipazytu. Właściwości reologiczne hydrożeli ECM oceniane są w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Moduł spichrożenia jest wyższy niż moduł strat we wszystkich warunkach, co świadczy o stabilnym tworzeniu hydrożelu.
Komórki raka sutka znakowane GFP i lucyferazyą 4T1 są następnie kapsułkowane w hydrożelach. Proliferację komórek bada się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, pomiarów oświetlenia i barwienia żywotności, 48 godzin po enkapsulacji. Napromieniowane hydrożele wykazują tendencję wzrostową w proliferacji komórek nowotworowych.
Koniugat falloidyny służy do wizualizacji F-aktyny w kapsułkowanych komórkach. Należy pamiętać o schłodzeniu zaprawy przed włożeniem chusteczki do wnętrza młyna, ciepła zaprawa może doprowadzić do niepełnego zmielenia. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z n-propanalem i pepsyną, tylko otwarte n-propanal i inne środki decelularyzacyjne pod kapturem chemicznym.
Jeśli to możliwe, zważyć pepsynę pod kapturem chemicznym, ponieważ istnieje niebezpieczeństwo wdychania. Zmiany składu ECM po napromieniowaniu i decelularyzacji można ocenić za pomocą spektrometrii mas i spektroskopii Ramana. Ponadto strukturę włókien hydrożeli ECM można analizować za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
Metoda ta może zostać rozszerzona o badanie wpływu promieniowania nie tylko na komórki nowotworowe, ale także na komórki odpornościowe, a także tkanki, które w wyniku terapii ulegają uszkodzeniom popromiennym. Ta technika decelularyzacji pozwoli naukowcom ocenić właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki po promieniowaniu, które jest ważną opcją leczenia w większości nowotworów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia metodę decelularyzacji i następującego po niej tworzenia hydrożelu z poduszeczek tłuszczowych gruczołu mlekowego myszy po naświetlaniu ex vivo. Technika ta pozwala na zastosowanie łagodniejszych płukań chemicznych w celu lepszego zachowania właściwości tkanki, co jest kluczowe dla badania wpływu promieniowania na właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Onkologia
Wstęp
- Promieniowanie wpływa na właściwości macierzy pozakomórkowej tkanki tłuszczowej.
- Modele decelularyzacji nie uwzględniały wcześniej promieniowania.
- Nawroty raka piersi stanowią istotny problem, szczególnie w przypadkach potrójnie ujemnych.
- Zrozumienie efektów działania promieniowania na macierz pozakomórkową może ujawnić mechanizmy nawrotów.
Cel badania
- Ocena wpływu promieniowania na macierz pozakomórkową w tkance tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy.
- Opracowanie metody decelularyzacji pozwalającej na zachowanie właściwości tkanki.
- Zbadanie wpływu napromieniowanej macierzy pozakomórkowej na zachowanie komórek nowotworowych.
Zastosowane metody
- Protokół decelularyzacji z określonymi etapami płukania.
- Naświetlanie ex vivo podskórnych poduszek tłuszczowych gruczołu piersiowego myszy.
- Tworzenie hydrożelu z tkanki decelularyzowanej.
- Ocena właściwości macierzy pozakomórkowej po naświetlaniu.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczną decelularyzację podskórnych poduszek tłuszczowych gruczołu mlekowego myszy.
- Promieniowanie zmienia właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Łagodniejsze płukanie chemiczne pozwala zachować kluczowe cechy tkanki.
- Uzyskana wiedza może pomóc w opracowaniu strategii przeciwdziałania nawrotom raka piersi.
Wnioski
- Niniejsze badanie wprowadza nową metodę badania napromieniowanej tkanki tłuszczowej.
- Wyniki mogą prowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów nawrotów nowotworów.
- Podejście to może zostać zastosowane w dalszych badaniach nad biologią raka.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie sposobu, w jaki promieniowanie zmienia macierz zewnątrzkomórkową w zdrowej tkance piersi, dostarcza mechanistycznych informacji na temat miejscowego nawrotu guza, co stanowi krytyczne wyzwanie w terapii potrójnie ujemnego raka piersi. Metoda ta umożliwia modelowanie in vitro mikrośrodowisk tkanek napromieniowanych, co pozwala zminimalizować ryzyko podczas walidacji celów i opracowywania testów poprzez powiązanie zmian w ECM z proliferacją komórek nowotworowych oraz reorganizacją cytoszkieletu. Wspiera ona pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych, uwzględniając wkład zrębu w oporność na terapię i nawroty choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmy
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Badanie wpływu napromieniowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z롬stromy na zachowanie komórek nowotworowych w celu wyjaśnienia roli mikrośrodowiska w oporności terapeutycznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów stromalnych poprzez ocenę proliferacji komórek nowotworowych oraz organizacji cytoszkieletu w fizjologicznie odpowiednich hydrożelach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie zstandaryzowanych, powtarzalnych hydrożeli o mierzalnych parametrach reologicznych i biochemicznych do screeningu związków w napromieniowanych mikrośrodowiskach.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie testów dzięki przechowywaniu liofilizowanego proszku ECM oraz kontrolowanej rehydratacji w celu zapewnienia spójnych warunków eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje istotne dla przebiegu choroby oddziaływania między zrąbem a guzem po napromieniowaniu w celu oceny mechanistycznego zmniejszenia ryzyka w przypadku kandydatów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zachowanie ciągłości od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie natywnej architektury i składu ECM po napromieniowaniu i decelularyzacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając regulowaną platformę stromalną, która łączy zmiany ECM indukowane promieniowaniem z fenotypami komórek nowotworowych, co wspomaga identyfikację związków wiodących oraz podejmowanie decyzji dotyczących postępów w badaniach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów oporności pośredniczonej przez zręb, umożliwiając kontrolowane porównanie wpływu napromieniowanej i nienapromieniowanej ECM na zachowanie komórek nowotworowych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy hydrożeli z mierzalnymi wskaźnikami proliferacji i stanu cytoszkieletu w celu oceny efektów modulatorów w zestandaryzowanym mikrośrodowisku.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe, w tym intensywność fluorescencji, luminescencję oraz parametry reologiczne, aby porównać warunki i ocenić wpływ zrębu na fenotypy nowotworowe.
- Badania translacyjne: Modeluje interakcje między zrębem a nowotworem w tkance napromieniowanej, co jest spójne z przedkliniczną oceną środków celujących w czynniki mikrośrodowiskowe odpowiedzialne za nawroty.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Umożliwia standaryzację platformy dzięki przechowywaniu liofilizowanej ECM, co pozwala na powtarzalne wytwarzanie hydrożeli przez różne zespoły i w różnych punktach czasowych w ramach podłużnych badań nad zrębem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez modelowanie wpływu zrębu na nawroty nowotworów oraz redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w napromieniowanych mikrośrodowiskach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji etapów decelularyzacji, napromieniowania i tworzenia hydrożeli z określonymi parametrami płukania i odczynnikami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację celów w obrębie zrębu, które modulują zachowanie komórek nowotworowych po radioterapii, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich skuteczność w kontekście napromieniowanego zrębu, który naśladuje kliniczne scenariusze nawrotów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie decelularyzacji tkanek, pracy z hydrożelami oraz prowadzenia testów żywotności komórek i analizy cytoszkieletu z wykorzystaniem fluorescencji.
- Zależność od dostępu do sprzętu do napromieniowania (np. źródła cezu), reometrów oraz systemów mikroskopowych do obrazowania proliferacji i F-aktyny.
- Konieczność standaryzacji pozyskiwania tkanek, dawek napromieniowania i przygotowania hydrożelu między zespołami w celu zapewnienia spójności eksperymentalnej.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych przy stosowaniu metody do innych rodzajów tkanek lub źródeł stromy poza poduszeczkami tłuszczowymi gruczołów mlekowych myszy.
- Ograniczenie wynikające z mysiego pochodzenia ECM, co może wymagać walidacji w modelach stromy istotnych dla ludzi w celu ekstrapolacji translacyjnej.
