Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście

Herbata jest jednym z najpopularniejszych napojów na całym świecie. Pestycydy są czasami stosowane do ochrony krzewów herbacianych przed szkodnikami. Niektóre pestycydy ogólnoustrojowe mogą być wytwarzane w tym celu przez enzymy z drzewa herbacianego.

A następnie integrowane poprzez reakcje utleniania, hydrolizy lub redukcji. Hodowle zawiesinowe komórek roślinnych mogą być łatwo stosowane jako badanie zachowania metabolizmu roślin pod wpływem pestycydów. Ta metoda ma kilka zalet.

Po pierwsze, może być eksploatowany w warunkach wolnych mikroorganizmów, unikając w ten sposób zakłóceń degradacji pestycydów spowodowanych przez drobnoustroje. Po drugie, może zapewnić nam stały materiał w dowolnym momencie. Wreszcie, można go również łatwo wykorzystać do porównania teorii zachowania pestycydów w jednym eksperymencie.

W tym badaniu ustalamy hodowle zawiesiny komórek herbaty ze zmiennych kolorów liści herbaty. Optymalny stan kultur zawiesin komórkowych wykorzystano następnie do porównania zachowania rozpraszającego sześciu pestycydów. Eksperyment ten zostanie przeprowadzony przez Jiao Weitinga i Ge Guoqina.

To są nasze sterylne sadzonki herbaty, które działają jako źródło eksplantatu. Wytnij wzdłuż środkowego skrzydła sterylnego liścia za pomocą nożyczek. A następnie podziel każdą połówkę na małe kawałki o wymiarach około 0,3 razy 0,3 centymetra na szalce Petriego.

Umieścić sterylne eksplantaty na pożywce wizualnej MS zawierającej 2, 4-D i KT. Sześć eksplantatów można umieścić w kolbie o pojemności 300 mililitrów. Hoduj liście eksplantowane w stałej temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Po 28 dniach wybrać kalus pierwszego pokolenia indukowanego, a następnie przenieść do świeżej kolby.

Nabądź luźny i zmienny kalus po trzech do czterech subkulturach. Pokrój duże, zmienne i luźne modzele z stałego podłoża na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w sterylnych warunkach. Mamy około trzech gramów małych kawałków kalusa.

Umieścić kalus w B5 zawierającym 2, 4-D i KT. Zawiesinę komórek płynnych należy hodować w stałej temperaturze w inkubatorze z wytrząsaniem w ciemności. Po siedmiu do dziesięciu dniach hodowli wyjmij kolbę hodowlaną i odstaw ją na kilka minut. Weź supernatant jako osad, który zmusi kulturę do świeżego podłoża.

Usuń wytrącone duże modzele. Uzyskaj ostateczną, dobrze utrzymaną hodowlę zawiesiny komórkowej po czterech do trzech cyklach subkultur po 28 dni każdy. Utrzymuj próbkę żywych komórek w temperaturze stu stopni Celsjusza przez dziesięć minut jako komórkę kontrolną przed barwieniem żywotności.

Odwirować całą hodowlę zawiesiny komórkowej przez osiem minut w temperaturze 6 000 G. Usunąć supernatant przed zawieszeniem komórek w 5 mililitrach buforu PBS i wstrząsać nim ręcznie przez jedną minutę. Dodaj 2,5 mililitra roztworu TTC i ponownie wstrząśnij ręką. Inkubować mieszaninę przez godzinę w inkubatorze stojącym w temperaturze 13 stopni Celsjusza.

Dodać porcję czterystu mikrolitrów w celu wysterylizowania roztworu podstawowego wszystkich neonikotynoidów: tiametoksamu, acetimopidu, imidachloprydu i imidoksazy. Wszystko do pierwszej fazy ekologicznej. dimetoat i ometoat odpowiednio do kultur zawiesinowych komórek.

Próbki hodowlane zawiesin komórkowych z insektycydami w stałej temperaturze i prędkości wytrząsania inkubatora. Próbki należy pobierać w różnych dniach. Aby przetestować próbkę zawierającą neonikotynoid, należy usunąć 1 mililitrową podwielokrotność jednorodnej kultury komórkowej.

Umieść go w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj w temperaturze 4 000 G przez dwie minuty. Przepuścić supernatant przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra przed analizą za pomocą HPLC-UV i UPLC QTOF. Aby przetestować próbkę, kontynuuj w pierwszej fazie organicznej.

Usuń 500 mikrolitrów podwielokrotności kultury komórkowej i umieść w 35-mililitrowej probówce wirówkowej lub 1,5-mililitrowej plastikowej probówce wirówkowej. Dodaj 0,1 grama chlorku sodu i pięć mililitrów rozpuszczalnika ekstrakującego do 35-mililitrowej probówki wirówkowej z 500 mikrolitrów próbek. Mieszaj mieszaninę przez minutę.

A następnie pozwól im odpocząć przez 10 minut. Weź 2,5 mililitra supernatantu do 10-mililitrowej szklanej probówki i odparuj do prawie sucha za pomocą parownika azotu w temperaturze 14 stopni Celsjusza. Rozpuść pozostałość w jednym mililitrze acetonu.

Wirować przez jedną minutę, przepuścić przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra przed analizą za pomocą GC-FPD. Umieść pięć roślin w czterolitrowych plastikowych doniczkach na piętnaście dni. Dodaj zero mikrogramów na mililitr lub 100 mikrogramów na mililitr odpowiednio tiametoksamu lub dimetoksu do plastikowych doniczek.

Przygotować nienaruszoną próbkę roślinną zgodnie z poprzednią metodą, z wyjątkiem wstępnego namaczania, a następnie przeanalizować za pomocą spektrometrii mas Orbitrap. Za pomocą HPLCUV należy wykryć zawartość i produkty przemiany materii tiametoksamu i acetimopidu na długościach fal 254 nanometrów oraz imidachloprydu i imidaploksazy na długości 270 nanometrów. Wykryć zawartość dimetoatu i ometoatu za pomocą GC-FPD za pomocą kolumny rurowej.

Wykrywanie metabolitów insektycydów w hodowli komórkowej za pomocą UPRC QTOF z kolumną węgla-18. Wykryj metabolity insektycydów w ekstrakcie z badanych roślin za pomocą spektrometrii mas UPLC Orbitrap. Kalus jednej sterylnej sadzonki ma mniejsze brązowienie zanieczyszczeń, ale wyższą indukcyjność niż kalus ze zerwanych liści herbaty.

Kalus pochodzący ze sterylnych liści był zawsze jasnożółtawy, podczas gdy kalus pochodzący ze zerwanych liści był biały z brązowymi plamami. Gdy stężenie KT wynosiło 0,1 miligrama na litr, kalus miał żółtawy kolor i luźną teksturę. Tempo wzrostu kalusa było najwyższe i dochodziło do 61,5%, gdy stężenie 2,4-D wynosiło jeden miligram na litr, a stężenie KT wynosiło 0,5 miligrama na litr.

Dane dotyczące wzrostu kalusa były najlepsze, a tempo wzrostu kalusa było najwyższe i wyniosło 46,9%Dlatego najlepszą kombinacją homentu roślinnego był jeden miligram na litr 2, 4-D i 0,1 miligrama na litr KT dla wzrostu kalusa herbacianego. Kalus całkowicie pokrył liście przez czwartą subkulturę i gdy cykl subkultury wynosił 28 dni. Kalus wyrósł energicznie, z żółtawym kolorem i luźną teksturą oraz bez brązowienia.

Po porównaniu danych brutto kalusa i koloru zawiesiny komórkowej, płynna pożywka B5 była bardziej odpowiednia do hodowli zawiesiny komórkowej. Wartość OD hodowli zawiesiny komórkowej wykorzystano do przedstawienia wielkości wzrostu komórek. W ciągu 75 dni uprawy stosunek 15 gramów na 40 mililitrów miał wartość OD znacznie wyższą niż w przypadku pozostałych dwóch stosunków.

Żywotność komórek w kulturze zawiesiny komórek herbaty przetestowano za pomocą barwienia TTC. Bezbarwny związek TTC może zostać przekształcony w czerwoną formadynę przez dehydrogenazę w mitochondriach żywych komórek, ale koloru nie można zmienić w martwych komórkach. I to jest cały proces tworzenia hodowli zawiesiny komórek herbaty.

Jest to pierwsze badanie porównawcze metabolizmu różnych pestycydów w herbacie przy użyciu techniki hodowli w zawiesinie komórkowej. Zidentyfikowano kilka metabolitów pestycydów, a niektóre z nich poddano dalszym badaniom w utrzymywanych roślinach herbacianych. Ta nowa metoda może posłużyć jako model dla badań metabolicznych pestycydów w herbacie lub innych roślinach.