Name: Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę hodowli zawiesiny komórkowej z liści herbaty Camellia sinensis do badania metabolizmu insektycydów. Protokół umożliwia analizę szlaków metabolicznych pestycydów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy (2016YFD0200900) z Chin, Narodową Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 31772076 i nr 31270728), Chińską Fundację Nauk Podoktoranckich (2018M630700) oraz Otwarty Fundusz Państwowego Kluczowego Laboratorium Biologii i Wykorzystania Roślin Herbacianych (SKLTOF20180111).

1. Kultura kalusa herbacianego
UWAGA: Sterylne liście pochodzą z linii sadzonek uprawianych in vitro, po raz pierwszy opracowanych w grupie badawczej17. Wszystkie procedury do sekcji 5 przeprowadzono w sterylnym okapie z przepływem laminarnym, z wyjątkiem czasu hodowli w inkubatorze.
<ol>
	<li>Przed autoklawowaniem (121 °C, 20 min) należy dostosować pH obu pożywek (pożywka podstawowa Murashige i Skoog [MS] oraz płynna pożywka B5 Gamborga) do 5,8</li>.
	<li>Przetnij wzdłuż środkowej żyły sterylnego liścia za pomocą nożyczek, a następnie podziel każdą połówkę na małe kawałki o wymiarach około 0,3 cm x 0,3 cm na szalce Petriego.</li>
	<li>Umieścić sterylne eksplantaty (małe kawałki liści) na pożywce podstawowej MS zawierającej hormony roślinne 2,4-D (1,0 mg L-1) i KT (0,1 mg L-1). Sześć eksplantatów można umieścić w kolbie o pojemności 300 ml zawierającej 100 ml pożywki podstawowej MS.</li>
	<li> Hodowla powyższych liści eksplantuje się w stałej temperaturze 25 °C w ciemności. Po 28 dniach wybierz pierwsze pokolenie indukowanego kalusa i przenieś do świeżej kolby (subkultury). Zdobądź luźny i kruchy modzel po 3−4 subkulturach.</li>
</ol>
2. Hodowla zawiesiny komórek herbaty
<ol>
	<li>Pokrój energiczne, kruche i luźne modzele z stałego podłoża na małe kawałki (zakres tutaj 0,5−2 mm) za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Waż około 3 g małych kawałków kalusa. Umieścić kalus w kolbie o pojemności 150 ml zawierającej 20 ml płynnej pożywki B5 uzupełnionej 2,4-D (1,0 mg L-1) i KT (0,1 mg L-1).</li>
	<li>Zawiesinę komórek płynnych hodować w stałej temperaturze (25 ± 1 °C) w inkubatorze z wytrząsaniem przy 120 obr./min w ciemności.</li>
	<li>Po 7 do 10 dniach hodowli wyjmij kolby hodowlane i odstaw je na kilka minut.</li>
	<li>Weź cały sklaratysz jako materiał siewny dla subkultury do świeżej pożywki (stosunek subkultury zawiesiny cieczy macierzystej do świeżej pożywki wahał się od 1:1 do 1:2). Usuń wytrącone, duże modzele.</li>
	<li>Otrzymaj końcową, dobrze wyhodowaną hodowlę zawiesinową komórek po 3-4 cyklach subkultur po 28 dni każdy.</li>
</ol>
3. Test żywotności komórek na bazie chlorku trifenylotetrazolu
<ol>
	<li>Uśmiercić próbkę żywych komórek w temperaturze 100 °C przez 10 minut jako komórkę kontrolną przed barwieniem żywotności.</li>
	<li>Odwirować hodowlę zawiesiny wszystkich komórek przez 8 minut przy 6000 x g. Usuń sklarowany osad przed zawieszeniem komórek w 2,5 ml buforu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,3) i potrząsaj nim ręcznie przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml 0,4% roztworu chlorku trifenylotetrazolu (TTC) i ponownie wstrząsnąć ręką.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w inkubatorze stojącym (30 °C).</li>
</ol>
4. Leczenie i pobieranie próbek z kultur zawiesinowych komórek herbaty za pomocą środków owadobójczych
<ol>
	<li>Dodać podwielokrotność 400 μl wysterylizowanego filtrem roztworu podstawowego (500 μg mL-1) czterech neonikotynoidów (tiametoksamu, acetamiprydu, imidachloprydu i imidakotyzu) lub dwóch fosforanów organicznych (dimetoatu i ometyatu) odpowiednio do kultur zawiesinowych komórek. 
	UWAGA: Jeśli celem jest porównanie zachowań ksenobiotyków, należy użyć tej samej partii macierzystej zawiesin komórkowych do przetestowania różnych związków.</li>
	<li>Hodować próbki zawiesin komórkowych za pomocą środków owadobójczych w stałej temperaturze (25 ± 1 °C) i prędkości wytrząsania inkubatora (120 obr./min). Próbki należy pobrać (patrz krok 4.3 lub 4.4) w dniu 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 i 75 dni.</li>
	<li>Aby przetestować próbkę zawierającą neonikotynoid, należy pobrać 1 ml podwielokrotności jednorodnej kultury komórkowej, umieścić ją w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 4000 x g przez 2 minuty.
	<ol>
		<li>Przepuścić supernatanty przez membranę filtracyjną o wielkości porów 0,22 μm przed analizą za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w ultrafiolecie (HPLC-UV) i ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej z kwadrupolową spektrometrią mas czasu przelotu (UPLC-QTOF) (tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu zbadania próbki zawierającej fosforoorganiczne należy pobrać 500 μl podwielokrotności kultury komórkowej i umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 35 ml lub plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml (tę ostatnią próbkę należy przygotować jak próbkę neonikotynoidu).
	<ol>
		<li>Dodać 0,1 g chlorku sodu i 5 ml acetonu/octanu etylu (3:7, v/v) do probówki wirówkowej o pojemności 35 ml zawierającej 500 μl próbek.</li>
		<li>Mieszaj mieszaniny przez 1 minutę, a następnie pozwól im odpocząć przez 10 minut.</li>
		<li>Pobrać 2,5 ml supernatantu do szklanej probówki o pojemności 10 ml i odparować do stanu bliskiego suchości za pomocą parownika azotu w temperaturze 40 °C.</li>
		<li>Rozpuść pozostałość w 1 ml acetonu, wiruj przez 1 minutę, przepuść przez membranę filtracyjną 0,22 μm przed analizą za pomocą chromatografii gazowej z detektorem fotometrycznym płomieniowym (GC-FPD).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbki nienaruszonej rośliny herbacianej za pomocą środków owadobójczych
UWAGA: Próba z nienaruszoną rośliną herbaty została przeprowadzona w systemie hydroponicznym przy użyciu sadzonek herbaty wyhodowanych w 50 ml pożywki (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2+, 25 Mg2+, 0.35 Fe2+, 0.1 B3+, 1.0 Mn2+, 0.1 Zn2+, 0.025 Cu2+, 0.05 Mo+, i 10 Al3+, w mg L-1)18. Eksperymentalna szklarnia znajdowała się w cyklu światło-ciemność (12 godzin światła i 12 godzin ciemności) w temperaturze 20 °C na Uniwersytecie Rolniczym Anhui.
<ol>
	<li>Umieść pięć roślin w plastikowej doniczce o pojemności 4 litrów na 15 dni.</li>
	<li>Dodaj odpowiednio 0 ppm (kontrola) lub 100 ppm tiametoksamu lub dimetoatu do plastikowych doniczek.</li>
	<li>Przygotuj nienaruszoną próbkę rośliny zgodnie z poprzednią metodą, z wyjątkiem wstępnego namaczania19, a następnie przeanalizuj za pomocą spektrometrii mas, aby uzyskać dokładne widmo masowe.</li>
</ol>
6. Analiza instrumentów
<ol>
	<li>Analiza HPLC zachowania metabolicznego neonikotynoidów
	<ol>
		<li>Użyć HPLC-UV (tabela materiałów) w celu wykrycia zawartości i produktów przemiany materii tiametoksamu i acetamiprydu o długości fali 254 nm oraz imidachloprydu i imidaklostyzu o długości fali 270 nm w próbkach z sekcji 4.3. 
		UWAGA: Warunek HPLC-UV był taki sam jak w poprzednim badaniu19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza GC zachowania metabolicznego fosforanów organicznych
	<ol>
		<li>Wykryć zawartość dimetoatu i ometoatu w próbkach z sekcji 4.4 za pomocą GC-FPD przy użyciu kolumny chiralnej (tabela materiałów).</li>
		<li>Użyj azotu jako gazu nośnego i ustaw natężenie przepływu na 1,0 ml min-1.</li>
		<li>Ustaw temperaturę początkową na 120 °C i przytrzymaj ją przez 5 minut. Zwiększ temperaturę do 150 °C przy 30 °C min-1 i przytrzymaj przez 3 minuty. Zwiększ do 170 °C przy 10 °C min-1 i przytrzymaj przez 7 minut. Na koniec zwiększyć do 210 °C w temperaturze 30 °C min-1, a następnie przytrzymać przez 5 minut.</li>
		<li>Ustawić temperaturę wtrysku na 200 °C w trybie bez podziału; Ustaw temperaturę detektora na 250 °C.</li>
		<li>Ustawić objętość wstrzykniętego wstrzykiwacza na 1 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza UPLC-QTOF metabolitów insektycydów w hodowli komórkowej
	<ol>
		<li>Wykryć metabolity insektycydów w hodowli komórkowej (próbki z sekcji 4.3) przy użyciu UPLC-QTOF z kolumną C18 (tabela materiałów).</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml min-1. Ustawić objętość wstrzykniętego wstrzykiwacza na 10 μl.</li>
		<li>W przypadku próbek poddanych działaniu neonikotynoidów należy ustawić początkową fazę ruchomą na 85% A (5 mM wody mrówczanu amonu) i 15% B (acetonitryl). W ciągu 10 minut zwiększ fazę ruchomą B do 38% i wróć do 15% w ciągu 1 minuty, przytrzymaj przez 9 minut.</li>
		<li>W przypadku próbek poddanych działaniu fosforoorganicznych należy ustawić początkową fazę ruchomą na 55% A (0,1% wody z kwasem mrówkowym) i 45% B (acetonitryl). W ciągu 5 minut zwiększ ruchomą fazę B do 70%, a następnie wróć do 45% B w ciągu 0,5 minuty, przytrzymaj przez 2,5 minuty.</li>
		<li>Ustawić parametry pracy QTOF w następujący sposób: temperatura gazu, 325 °C; gaz suszący (azot), 10 L min-1; temperatura gazu w osłonie, 350 °C; przepływ gazu w osłonie, 11 L min-1; napięcie kapilarne, 4000 V; napięcie dyszy, 1000 V; napięcie fragmentora, 100 V dla insektycydów neonikotynoidowych lub 110 V dla insektycydów fosforoorganicznych; napięcie skimmera, 65 V; praca w trybie jonów dodatnich.</li>
		<li>Ustaw przyrząd na pełne spektrum skanowania i tryb docelowego MS/MS.</li>
		<li>Przetwarzaj dane za pomocą dokładnych narzędzi masowych; Wywnioskuj metabolity bez standardowych produktów z adnotacji MS/MS, a także literatury12,15,20,21,22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza UPLC-Orbitrap metabolitów insektycydów w nienaruszonym ekstrakcie roślinnym
	<ol>
		<li>Wykrywanie metabolitów insektycydów w nienaruszonym ekstrakcie roślinnym za pomocą spektrometrii mas UPLC-Orbitrap (tabela materiałów).</li>
		<li>Ustaw parametry pracy spektrometrii mas (tabela materiałów) w następujący sposób: ciśnienie gazu w osłonie, 35 arb, temperatura gazu, 300 °C, napięcie dyszy, 3,5 KV, temperatura kapilary, 350 °C.</li>
		<li>Ustaw programy elucji jak powyżej (kroki 6.3.3 i 6.3.4) dla analizy UPLC-QTOF hodowli komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+identification%2C+quantitation%2C+and+principal+component+analysis+of+green+pu-erh%2C+green%2C+and+white+teas+using+UPLC%2FDAD%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS.</a> Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).</li>
<li>Alcazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+green%2C+white%2C+black%2C+Oolong%2C+and+Pu-erh+teas+according+to+their+free+amino+acids+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of green, white, black, Oolong, and Pu-erh teas according to their free amino acids content.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55 (15), 5960-5965 (2007).</li>
<li>Kopjar, M., Tadic´, M., Pilizˇota, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+content+and+antioxidant+activity+of+green%2C+yellow+and+black+tea+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+and+Biological+Technologies+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Phenol content and antioxidant activity of green, yellow and black tea leaves.</a> Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2 (1), 1-6 (2015).</li>
<li>Chen, H., Yin, P., Wang, Q., Jiang, Y., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+QuEChERS+sample+preparation+method+for+the+analysis+of+70+pesticide+residues+in+tea+using+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified QuEChERS sample preparation method for the analysis of 70 pesticide residues in tea using gas chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Food Analytical Methods. 7 (8), 1577-1587 (2014).</li>
<li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+the+Nonsystemic+Behavior+of+the+Pesticide+Ferbam+on+Tea+Leaves+by+Engineered+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Alteration of the Nonsystemic Behavior of the Pesticide Ferbam on Tea Leaves by Engineered Gold Nanoparticles.</a> Environmental Science & Technology. 50 (12), 6216-6223 (2016).</li>
<li>Abdel-Gawad, H., Mahdy, F., Hashad, A., Elgemeie, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+C-14-Ethion+insecticide+in+the+presence+of+deltamethrin+and+dimilin+pesticides+in+cotton+seeds+and+oils%2C+removal+of+ethion+residues+in+oils%2C+and+bioavailability+of+its+bound+residues+to+experimental+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fate of C-14-Ethion insecticide in the presence of deltamethrin and dimilin pesticides in cotton seeds and oils, removal of ethion residues in oils, and bioavailability of its bound residues to experimental animals.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (51), 12287-12293 (2014).</li>
<li>Fang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+Dynamics+and+Dietary+Risk+Assessments+of+Two+Neonicotinoid+Insecticides+during+Lonicerajaponica+Planting%2C+Drying%2C+and+Tea+Brewing+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food%22%5BJournal%5D)">Degradation Dynamics and Dietary Risk Assessments of Two Neonicotinoid Insecticides during Lonicerajaponica Planting, Drying, and Tea Brewing Processes.</a> Journal of Agricultural and Food. 65 (8), 1483-1488 (2017).</li>
<li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissipation+pattern%2C+processing+factors%2C+and+safety+evaluation+for+dimethoate+and+its+metabolite+%28omethoate%29+in+tea+%28Camellia+sinensis%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissipation pattern, processing factors, and safety evaluation for dimethoate and its metabolite (omethoate) in tea (Camellia sinensis).</a> PloS One. 10 (9), e0138309(2015).</li>
<li>Pavlic, M., Haidekker, A., Grubwieser, P., Rabl, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+intoxication+with+omethoate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fatal intoxication with omethoate.</a> International Journal of Legal Medicine. 116 (4), 238-241 (2002).</li>
<li>Mohapatra, S., Ahuja, A. K., Deepa, M., Sharma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residues+of+acephate+and+its+metabolite+methamidophos+in%2Fon+mango+fruit+%28Mangifera+indica+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Environmental+Contamination+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Residues of acephate and its metabolite methamidophos in/on mango fruit (Mangifera indica L.).</a> Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 86 (1), 101-104 (2011).</li>
<li>Phugare, S. S., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+acephate+using+a+developed+bacterial+consortium+and+toxicological+analysis+using+earthworms+%28Lumbricus+terrestris%29+as+a+model+animal%5BTitle%5D)+AND+%22International+Biodeterioration+%26+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of acephate using a developed bacterial consortium and toxicological analysis using earthworms (Lumbricus terrestris) as a model animal.</a> International Biodeterioration & Biodegradation. 69, 1-9 (2012).</li>
<li>Ford, K. A., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolism+and+pharmacokinetics+of+seven+neonicotinoid+insecticides+in+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolism and pharmacokinetics of seven neonicotinoid insecticides in spinach.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10168-10175 (2008).</li>
<li>Frear, D. S., Swanson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+cisanilide+%28cis-2%2C5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide%29+by+Excised+Leaves+and+Cell+Suspension+Cultures+of+Carrot+and+Cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of cisanilide (cis-2,5-Dimethyl-1-Pyrrolidinecarboxanilide) by Excised Leaves and Cell Suspension Cultures of Carrot and Cotton.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 5, 73-80 (1975).</li>
<li>Sandermann, H. Jr, Scheel, D., Trenck, T. H. V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+plant+cell+cultures+to+study+the+metabolism+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Use of plant cell cultures to study the metabolism of environmental chemicals.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 8 (2), 167-182 (1984).</li>
<li>Karmakar, R., Bhattacharya, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolite+profiling+of+the+insecticide+thiamethoxam+in+plant+and+cell+suspension+culture+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolite profiling of the insecticide thiamethoxam in plant and cell suspension culture of tomato.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (14), 6369-6374 (2009).</li>
<li>Lichtner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+mobility+of+crop+protection+products%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phloem mobility of crop protection products.</a> Australian Journal of Plant Physiology. 27, 609-614 (2000).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot+basal+ends+as+novel+explants+for+in+vitro+plantlet+regeneration+in+an+elite+clone+of+tea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Horticultural+Science+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Shoot basal ends as novel explants for in vitro plantlet regeneration in an elite clone of tea.</a> Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 87 (1), 71-76 (2012).</li>
<li>Meng, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake%2C+Translocation%2C+Metabolism%2C+and+Distribution+of+Glyphosate+in+Nontarget+Tea+Plant+%28Camellia+sinensis+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake, Translocation, Metabolism, and Distribution of Glyphosate in Nontarget Tea Plant (Camellia sinensis L).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. (65), 7638-7646 (2017).</li>
<li>Hou, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Extraction+Method+for+Determination+of+Neonicotinoid+Residues+in+Tea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effective Extraction Method for Determination of Neonicotinoid Residues in Tea.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 12565-12571 (2013).</li>
<li>Karmakar, R., Kulshrestha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence%2C+metabolism+and+safety+evaluation+of+thiamethoxam+in+tomato+crop%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Persistence, metabolism and safety evaluation of thiamethoxam in tomato crop.</a> Pest Management Science. 65 (8), 931-937 (2009).</li>
<li>Dauterman, W. C., Viado, G. B., Casida, J. E., O'Brien, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Dimethoate+and+Metabolites+Following+Foliar+Application+to+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Persistence of Dimethoate and Metabolites Following Foliar Application to Plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 8 (2), 115-119 (1960).</li>
<li>Lucier, G. W., Menzer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+oxidative+metabolites+of+dimethoate+formed+in+rats%2C+liver+microsomes%2C+and+bean+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nature of oxidative metabolites of dimethoate formed in rats, liver microsomes, and bean plants.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 18 (4), 698-704 (1970).</li>
<li>Yang, G. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYang%2C+GW+%22Construction+of+Camellia+sinensis+Cell+Suspension+Culture+and+Primary+Study+on+Kineties%22">Construction of Camellia sinensis Cell Suspension Culture and Primary Study on Kineties</a>. , College of Food Science and Nutrition Engineering. China Agricultural University. (2004).</li>
<li>Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Metabolic+Behaviors+of+Six+Systemic+Insecticides+in+a+Newly+Established+Cell+Suspension+Culture+Derived+from+Tea+%28L.%29+Leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Metabolic Behaviors of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (L.) Leaves.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66, 8593-8601 (2018).</li>
<li>Mustafa, N. R., Winter, D. W., Iren, F. V., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nature Protocols. 6, 715-742 (2011).</li>
<li>Zhong, J. J., Bai, Y., Wang, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plant+growth+regulators+on+cell+growth+and+ginsenoside+saponin+production+by+suspension+cultures+of+Panax+quinquefolium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Effects of plant growth regulators on cell growth and ginsenoside saponin production by suspension cultures of Panax quinquefolium.</a> Journal of Biotechnology. 45, 227-234 (1996).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoterpenoids+and+aroma+compounds+from+cell+suspension+cultures+of+Camellia+sinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue+and+Organ+Culture%22%5BJournal%5D)">Production of monoterpenoids and aroma compounds from cell suspension cultures of Camellia sinensis.</a> Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 108, 323-331 (2012).</li>
<li>Lei, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevent+Browning+of+Axillary+Buds+in+vitro+Culture+of+Camellia+sinensis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Agricultural+Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Prevent Browning of Axillary Buds in vitro Culture of Camellia sinensis.</a> Chinese Agricultural Science Bulletin. 28, 190-193 (2012).</li>
<li>Hou, X., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+various+nitrogen+sources+on+the+growth+and+nitrate+assimilation+indicator+of+suspension+roselle+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Guihaia%22%5BJournal%5D)">The effect of various nitrogen sources on the growth and nitrate assimilation indicator of suspension roselle cell.</a> Guihaia. 18, 169-172 (1998).</li>
<li>Shimabukuro, R. H., Walsh, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenobiotic+Metabolism+in+Plants%3A+In+vitro+Tissue%2C+Organ%2C+and+Isolated+Cell+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Xenobiotic Metabolism in Plants: In vitro Tissue, Organ, and Isolated Cell Techniques.</a> ACS Symposium Series. 97 (1), 3-34 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono szczegółowy proces tworzenia modelu metabolizmu pestycydów w tkance rośliny herbacianej, w tym selekcję eksplantatów, określenie żywotności komórek oraz ustanowienie kultury zawiesinowej komórek herbaty o wysokiej aktywności metabolicznej. Dowolne części tkanki roślinnej mogą być użyte do zainicjowania kalusa w wysterylizowanym środowisku25. Liście herbaty zostały wybrane do inicjacji kalusa w tym badaniu, nie tylko dlatego, że liście są mniej zanieczyszczone niż części po...

Herbata jest jednym z najczęściej spożywanych napojów bezalkoholowych na świecie1,2. Herbata jest produkowana z liści i pąków drzewiastej byliny Camellia sinensis L. Rośliny herbaty są uprawiane na rozległych plantacjach i są podatne na liczne szkodniki owadzie3,4. Insektycydy fosforoorganiczne i neonikotynoidowe są często stosowane jako insektycydy ogólnoustrojowe5 do ochrony roślin herbaty przed szkodnikami, takimi jak mączliki, skoczki liściowe i niektóre gatunki Lepidoptera6,7. Po zastosowaniu te insektycydy są wchłaniane lub przemieszczane do rośliny. W roślinie te ogólnoustrojowe środki owadobójcze mogą być przekształcane w wyniku reakcji hydrolizy, utleniania lub redukcji przez enzymy roślinne. Te produkty przemian mogą być bardziej polarne i mniej toksyczne niż związki macierzyste. Jednak w przypadku niektórych fosforoorganicznych bioaktywność niektórych produktów jest wyższa. Na przykład acefat jest metabolizowany do bardziej toksycznego methamidophos8,9, a dimetoat do omethoate10,11. Badania metabolizmu roślin są zatem ważne dla określenia losu pestycydu w obrębie plant12.
Udowodniono, że kultury tkanek roślinnych są użyteczną platformą do badania metabolizmu pestycydów, z zidentyfikowanymi metabolitami podobnymi do tych znalezionych w nienaruszonych roślinach13,14,15. Stosowanie kultur tkankowych, w szczególności kultur zawiesinowych komórek, ma kilka zalet. Po pierwsze, eksperymenty można przeprowadzać bez mikroorganizmów, unikając w ten sposób zakłóceń związanych z przemianą pestycydów lub degradacją przez drobnoustroje. Po drugie, hodowla tkankowa zapewnia spójne materiały do wykorzystania w dowolnym momencie. Po trzecie, metabolity są łatwiejsze do wyekstrahowania z kultur tkankowych niż z nienaruszonych roślin, a kultury tkankowe często mają mniej związków wzajemnych i mniejszą złożoność związków. Wreszcie, hodowle tkankowe mogą być łatwiej wykorzystane do porównania szeregu metabolizmów pestycydów w jednym eksperymencie16.
W tym badaniu, udało się stworzyć zawiesinę komórkową pochodzącą z liści sterylnie uprawianej sadzonki herbaty. Hodowla zawiesiny komórek herbaty została następnie wykorzystana do porównania zachowań związanych z rozpraszaniem sześciu ogólnoustrojowych środków owadobójczych.
Ten szczegółowy protokół ma na celu dostarczenie pewnych wskazówek, dzięki którym badacze mogą stworzyć platformę do hodowli tkanek roślinnych przydatną do badania metabolicznego losu ksenobiotyków w herbacie.

<table><tbody><tr><td>Acetamipryd (99,8%)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>46717</td><td>Nr CAS: 135410-20-7</td></tr><tr><td>Acetonitryl (CAN, 99,9%)</td><td>Tedia</td><td>AS1122-801</td><td>Nr CAS: 75-05-8</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Solarbio Science & Technologia</td><td>A8190</td><td>Nr CAS: 9002-18-0</td></tr><tr><td>Klotianidyna (99,8%)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>525</td><td>Nr CAS: 210880-92-5</td></tr><tr><td>Dimetoat (98,5%)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>109217</td><td>Nr CAS: 60-51-5</td></tr><tr><td>Imidaklopryd (99,8%)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>91029</td><td>Nr CAS: 138261-41-3</td></tr><tr><td>Imidaclothiz (99,5%)</td><td>Torontońska I275000 Chemiczna</td><td></td><td>Nr CAS: 105843-36-5</td></tr><tr><td>Kinetyna (KT, >98.0%)</td><td>Solarbio Science & Technologia</td><td>K8010</td><td>Nr CAS: 525-79-1</td></tr><tr><td>Omethoate (98,5%)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>105491</td><td>Nr CAS: 1113-02-6</td></tr><tr><td>Poliwinylopolipirolidon (PVPP)</td><td>Solarbio Science & Technologia</td><td>P8070</td><td>Nr CAS: 25249-54-1</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5511</td><td>Nr CAS: 57-50-1</td></tr><tr><td>Tiametoksam (99,8%)</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>20625</td><td>Nr CAS: 153719-23-4</td></tr><tr><td>Chlorek trifenylotetrazolu (TTC, 98,0%)</td><td>Solarbio Science & Technologia</td><td>T8170</td><td>Nr CAS: 298-96-4</td></tr><tr><td>Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D, >98,0%)</td><td>Guangzhou Saiguo Biotech</td><td>D8100</td><td>Nr CAS: 94-75-7</td></tr><tr><td>kolumna chiralna</td><td>Agilent CYCLOSIL-B</td><td>112-6632</td><td>Kolumna chromatograficzna (30 m &times; 0,25 mm &times; 0,25 &mu; m)</td></tr> <tr><td>Chromatografia gazowa (GC)</td><td>Shimadu</td><td>2010-Plus</td><td>w połączeniu z detektorem fotometrycznym płomienia (FPD)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>W połączeniu z detektorem ultrafioletu (UV)</td></tr><tr><td>Kolumna HSS T3 C18</td><td>Wody</td><td>186003539</td><td>Kolumna chromatograficzna (100 mm & razy 2,1 mm & razy; 1,8 &mu; m)</td></tr> <tr><td>Ultra-wysokowydajna chromatografia cieczowa (UPLC)</td><td>Agilent</td><td>1290-6545</td><td>Tandemowy kwadrupolowy spektrometr masowy czasu przelotu (QTOF)</td></tr><tr><td>Ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa (UPLC)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000-Q Exactive Focus</td><td>podłączony do spektrometru masowego Orbitrap</td></tr></tbody></table>

badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (camellia sinensis l.) liście

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Platforma do badania metabolizmu insektycydów przy użyciu tkanek in vitro rośliny herbacianej została stworzona. Liście sterylnych sadzonek herbaty indukowano do tworzenia luźnego kalusa na podłożach podstawowych Murashige i Skoog (MS) z hormonami roślinnymi kwasem 2,4-dichlorofenoksyoctowym (2,4-D, 1,0 mg L-1) i kinetyną (KT, 0,1 mg L-1). Kalus powstał po 3 lub 4 rundach subkulturowania, z których każda trwała 28 dni. Luźny kalus (około 3 g) został następnie zaszczepiony w płynnej pożywce B5 zawierającej te same hormony roślinne i hodowany w inkubatorze z wytrząsaniem (120 obr./min) w ciemności w temperaturze 25 ± 1 °C. Po 3−4 subkulturach ustalono zawiesinę komórkową pochodzącą z liści herbaty w stosunku subkultury w zakresie od 1:1 do 1:2 (zawiesina płynu macierzystego: świeże podłoże). Korzystając z tej platformy, sześć insektycydów (po 5 μg mL-1 tiametoksamu, imidachloprydu, acetamiprydu, imidakotyzu, dimetoatu i ometoatu) dodano do hodowli zawiesiny komórkowej pochodzącej z liści herbaty. Metabolizm insektycydów śledzono za pomocą chromatografii cieczowej i chromatografii gazowej. Aby potwierdzić przydatność hodowli zawiesiny komórek herbaty, metabolity tiametoksanu i dimetoatu obecne w hodowlach komórkowych poddanych działaniu substancji i nienaruszonych roślinach porównano za pomocą spektrometrii mas. W hodowlach komórek herbaty poddanych działaniu substancji znaleziono siedem metabolitów tiametoksanu i dwa metabolity dimetoatu, podczas gdy w nienaruszonych roślinach poddanych działaniu środka znaleziono tylko dwa metabolity tiametoksamu i jeden dimetoat. Zastosowanie zawiesiny komórkowej uprościło analizę metaboliczną w porównaniu z użyciem nienaruszonych roślin herbacianych, szczególnie w przypadku trudnej matrycy, takiej jak herbata.

Porównano indukcję kalusa z liści pobranych z drzew herbacianych rosnących w polu oraz z liści wyciętych z sadzonek herbaty hodowanych in vitro w warunkach sterylnych, mierząc stopień kontaminacji, brunatnienia oraz indukcję po 28 dniach hodowli na pośrodku MS (Rycina 1A). Wzrost kalusa rejestrowano w 20., 37., 62. i 90. dniu hodowli (Rycina 1B). Kalus pochodzący z liści hodowanych in vitro wykazywał bardziej intensywny wzrost ni...

Ta praca przedstawia protokół tworzenia kultury zawiesiny komórkowej pochodzącej z liści herbaty (Camellia sinensis L.), która może być wykorzystana do badania metabolizmu zewnętrznych związków, które mogą być pobierane przez całą roślinę, takich jak insektycydy.

Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Herbata jest jednym z najpopularniejszych napojów na całym świecie. Pestycydy są czasami stosowane do ochrony krzewów herbacianych przed szkodnikami. Niektóre pestycydy ogólnoustrojowe mogą być wytwarzane w tym celu przez enzymy z drzewa herbacianego.A następnie integrowane poprzez reakcje utleniania, hydrolizy lub redukcji. Hodowle zawiesinowe komórek roślinnych mogą być łatwo stosowane jako badanie zachowania metabolizmu roślin pod wpływem pestycydów. Ta metoda ma kilka zalet.Po pierwsze, może być eksploatowany w warunkach wolnych mikroorganizmów, unikając w ten sposób zakłóceń degradacji pestycydów spowodowanych przez drobnoustroje. Po drugie, może zapewnić nam stały materiał w dowolnym momencie. Wreszcie, można go również łatwo wykorzystać do porównania teorii zachowania pestycydów w jednym eksperymencie.W tym badaniu ustalamy hodowle zawiesiny komórek herbaty ze zmiennych kolorów liści herbaty. Optymalny stan kultur zawiesin komórkowych wykorzystano następnie do porównania zachowania rozpraszającego sześciu pestycydów. Eksperyment ten zostanie przeprowadzony przez Jiao Weitinga i Ge Guoqina.To są nasze sterylne sadzonki herbaty, które działają jako źródło eksplantatu. Wytnij wzdłuż środkowego skrzydła sterylnego liścia za pomocą nożyczek. A następnie podziel każdą połówkę na małe kawałki o wymiarach około 0,3 razy 0,3 centymetra na szalce Petriego.Umieścić sterylne eksplantaty na pożywce wizualnej MS zawierającej 2, 4-D i KT. Sześć eksplantatów można umieścić w kolbie o pojemności 300 mililitrów. Hoduj liście eksplantowane w stałej temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Po 28 dniach wybrać kalus pierwszego pokolenia indukowanego, a następnie przenieść do świeżej kolby.Nabądź luźny i zmienny kalus po trzech do czterech subkulturach. Pokrój duże, zmienne i luźne modzele z stałego podłoża na małe kawałki za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego w sterylnych warunkach. Mamy około trzech gramów małych kawałków kalusa.Umieścić kalus w B5 zawierającym 2, 4-D i KT. Zawiesinę komórek płynnych należy hodować w stałej temperaturze w inkubatorze z wytrząsaniem w ciemności. Po siedmiu do dziesięciu dniach hodowli wyjmij kolbę hodowlaną i odstaw ją na kilka minut. Weź supernatant jako osad, który zmusi kulturę do świeżego podłoża.Usuń wytrącone duże modzele. Uzyskaj ostateczną, dobrze utrzymaną hodowlę zawiesiny komórkowej po czterech do trzech cyklach subkultur po 28 dni każdy. Utrzymuj próbkę żywych komórek w temperaturze stu stopni Celsjusza przez dziesięć minut jako komórkę kontrolną przed barwieniem żywotności.Odwirować całą hodowlę zawiesiny komórkowej przez osiem minut w temperaturze 6 000 G. Usunąć supernatant przed zawieszeniem komórek w 5 mililitrach buforu PBS i wstrząsać nim ręcznie przez jedną minutę. Dodaj 2,5 mililitra roztworu TTC i ponownie wstrząśnij ręką. Inkubować mieszaninę przez godzinę w inkubatorze stojącym w temperaturze 13 stopni Celsjusza.Dodać porcję czterystu mikrolitrów w celu wysterylizowania roztworu podstawowego wszystkich neonikotynoidów: tiametoksamu, acetimopidu, imidachloprydu i imidoksazy. Wszystko do pierwszej fazy ekologicznej. dimetoat i ometoat odpowiednio do kultur zawiesinowych komórek.Próbki hodowlane zawiesin komórkowych z insektycydami w stałej temperaturze i prędkości wytrząsania inkubatora. Próbki należy pobierać w różnych dniach. Aby przetestować próbkę zawierającą neonikotynoid, należy usunąć 1 mililitrową podwielokrotność jednorodnej kultury komórkowej.Umieść go w plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj w temperaturze 4 000 G przez dwie minuty. Przepuścić supernatant przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra przed analizą za pomocą HPLC-UV i UPLC QTOF. Aby przetestować próbkę, kontynuuj w pierwszej fazie organicznej.Usuń 500 mikrolitrów podwielokrotności kultury komórkowej i umieść w 35-mililitrowej probówce wirówkowej lub 1,5-mililitrowej plastikowej probówce wirówkowej. Dodaj 0,1 grama chlorku sodu i pięć mililitrów rozpuszczalnika ekstrakującego do 35-mililitrowej probówki wirówkowej z 500 mikrolitrów próbek. Mieszaj mieszaninę przez minutę.A następnie pozwól im odpocząć przez 10 minut. Weź 2,5 mililitra supernatantu do 10-mililitrowej szklanej probówki i odparuj do prawie sucha za pomocą parownika azotu w temperaturze 14 stopni Celsjusza. Rozpuść pozostałość w jednym mililitrze acetonu.Wirować przez jedną minutę, przepuścić przez membranę filtracyjną o średnicy 0,22 mikrometra przed analizą za pomocą GC-FPD. Umieść pięć roślin w czterolitrowych plastikowych doniczkach na piętnaście dni. Dodaj zero mikrogramów na mililitr lub 100 mikrogramów na mililitr odpowiednio tiametoksamu lub dimetoksu do plastikowych doniczek.Przygotować nienaruszoną próbkę roślinną zgodnie z poprzednią metodą, z wyjątkiem wstępnego namaczania, a następnie przeanalizować za pomocą spektrometrii mas Orbitrap. Za pomocą HPLCUV należy wykryć zawartość i produkty przemiany materii tiametoksamu i acetimopidu na długościach fal 254 nanometrów oraz imidachloprydu i imidaploksazy na długości 270 nanometrów. Wykryć zawartość dimetoatu i ometoatu za pomocą GC-FPD za pomocą kolumny rurowej.Wykrywanie metabolitów insektycydów w hodowli komórkowej za pomocą UPRC QTOF z kolumną węgla-18. Wykryj metabolity insektycydów w ekstrakcie z badanych roślin za pomocą spektrometrii mas UPLC Orbitrap. Kalus jednej sterylnej sadzonki ma mniejsze brązowienie zanieczyszczeń, ale wyższą indukcyjność niż kalus ze zerwanych liści herbaty.Kalus pochodzący ze sterylnych liści był zawsze jasnożółtawy, podczas gdy kalus pochodzący ze zerwanych liści był biały z brązowymi plamami. Gdy stężenie KT wynosiło 0,1 miligrama na litr, kalus miał żółtawy kolor i luźną teksturę. Tempo wzrostu kalusa było najwyższe i dochodziło do 61,5%, gdy stężenie 2,4-D wynosiło jeden miligram na litr, a stężenie KT wynosiło 0,5 miligrama na litr.Dane dotyczące wzrostu kalusa były najlepsze, a tempo wzrostu kalusa było najwyższe i wyniosło 46,9%Dlatego najlepszą kombinacją homentu roślinnego był jeden miligram na litr 2, 4-D i 0,1 miligrama na litr KT dla wzrostu kalusa herbacianego. Kalus całkowicie pokrył liście przez czwartą subkulturę i gdy cykl subkultury wynosił 28 dni. Kalus wyrósł energicznie, z żółtawym kolorem i luźną teksturą oraz bez brązowienia.Po porównaniu danych brutto kalusa i koloru zawiesiny komórkowej, płynna pożywka B5 była bardziej odpowiednia do hodowli zawiesiny komórkowej. Wartość OD hodowli zawiesiny komórkowej wykorzystano do przedstawienia wielkości wzrostu komórek. W ciągu 75 dni uprawy stosunek 15 gramów na 40 mililitrów miał wartość OD znacznie wyższą niż w przypadku pozostałych dwóch stosunków.Żywotność komórek w kulturze zawiesiny komórek herbaty przetestowano za pomocą barwienia TTC. Bezbarwny związek TTC może zostać przekształcony w czerwoną formadynę przez dehydrogenazę w mitochondriach żywych komórek, ale koloru nie można zmienić w martwych komórkach. I to jest cały proces tworzenia hodowli zawiesiny komórek herbaty.Jest to pierwsze badanie porównawcze metabolizmu różnych pestycydów w herbacie przy użyciu techniki hodowli w zawiesinie komórkowej. Zidentyfikowano kilka metabolitów pestycydów, a niektóre z nich poddano dalszym badaniom w utrzymywanych roślinach herbacianych. Ta nowa metoda może posłużyć jako model dla badań metabolicznych pestycydów w herbacie lub innych roślinach.

study-on-metabolism-six-systemic-insecticides-newly-established-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy artykuł demonstruje i omawia techniki stosowane do badania wrażliwości na pestycydy oraz wykrywania oporności na pestycydy kontaktowe i systemiczne u szkodników z grupy stawonogów.

Bioanalizy w monitorowaniu oporności na insektycydy

Ten manuskrypt opisuje, jak tempo metabolizmu herbicydów może być skutecznie określone ilościowo za pomocą wyciętych liści z chwastów dwuliściennych, zmniejszając w ten sposób zmienność i usuwając wszelkie możliwe zakłócające efekty pobierania lub translokacji herbicydów, zwykle obserwowane w testach na całej roślinie.

Pomiar tempa metabolizmu herbicydów w chwastach dwuskrzydłowych za pomocą testu wyciętych liści

Oceny insektycydów są często skierowane przeciwko dorosłym owadom, a nie niedojrzałym stadiom. W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny insektycydów przeciwko jajom pluskiew z porównaniem do pierwszego stadium nimfalnego pluskwy. Protokoły te można dostosować do innych owadów w celu oceny skuteczności insektycydów w stadiach życia niebędących dorosłymi.

Metoda oceny skuteczności insektycydów przeciwko pluskwom, Cimex lectularius, jajom i pierwszym stadium rozwojowym

Tutaj prezentujemy protokół produkcji białek karboksyloesterazy u muchy domowej in vitro z systemem ekspresji komórek owadów za pośrednictwem bakulowirusa, a następnie funkcjonalnie charakteryzujemy ich role w metabolizowaniu permetryny, nadając w ten sposób odporność na pyretroidy poprzez przeprowadzanie testów MTT na bazie komórek i badań metabolicznych in vitro.

Charakterystyka funkcjonalna karboksylesterazy u much domowych odpornych na insektycydy, Musca domestica

Tutaj prezentujemy protokół do badania preferencji przepoczwarzania dojrzałych larw Ectropis grisescens w odpowiedzi na czynniki glebowe (np. rodzaj podłoża i wilgotność) za pomocą wybranych testów biologicznych. Przedstawiamy również protokół testów biologicznych bez wyboru w celu określenia czynników wpływających na zachowania przepoczwarzające i przeżywalność E. grisescens.

Testy biologiczne typu "choice" i "no-choice" w celu zbadania preferencji przepoczwarzenia i powodzenia w pojawianiu się Ectropis grisescens

Obecny protokół wyjaśnia metodę karmienia larwami samotnicy, pszczoły samotnicy, Osmia excavata, skażonymi pestycydami. W ramach procedury bada się ekotoksyczność pestycydu dla larw pszczół samotnic.

Ocena wpływu pestycydów na larwy pszczół samotnic

Metoda wykorzystująca zielone owoce kawy (GFs) została opracowana w celu zbadania toksyczności insektycydów przeciwko omacnicy kawowej (CBB). Insektycydy lub substancje toksyczne stosowano do zdezynfekowanych GF przed lub po inwazji CBB. Oceniano śmiertelność owadów, odstraszalność i zdolność reprodukcyjną, a także inne parametry.

Metodyka badania środków kontrolnych i insektycydów przeciwko omacnicy kawowej Hypothenemus hampei

Obecny protokół opisuje prostą i skuteczną metodę identyfikacji metabolitów 2,4-dibromofenolu w roślinach.

Wyjaśnienie metabolizmu 2,4-dibromofenolu w roślinach

Ten protokół opisuje obowiązkowy test żywieniowy w celu oceny potencjalnie toksycznego wpływu substancji fitochemicznej na larwy owadów z rzędu Lepidoptera. Jest to wysoce skalowalny test biologiczny owadów, łatwy do optymalizacji dawki subletalnej i śmiertelnej, działania odstraszającego i efektu fizjologicznego. Można to wykorzystać do badań przesiewowych przyjaznych dla środowiska środków owadobójczych.

Opracowanie systemu oznaczania żywienia do oceny owadobójczego wpływu fitochemikaliów na Helicoverpa armigera

Protokół opisuje nową metodę oceny całkowitej cytotoksyczności metabolitów triazolowych pestycydów w roślinach.

Ocena cytotoksyczności metabolitów typowych pestycydów triazolowych w roślinach

Poznaj metodę hodowli zawiesiny komórkowej z liści herbaty Camellia sinensis do badania metabolizmu insektycydów. Protokół umożliwia analizę szlaków metabolicznych pestycydów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście (Wideo) | JoVE Journal

Badanie metabolizmu sześciu ogólnoustrojowych insektycydów w nowo powstałej kulturze zawiesiny komórkowej pochodzącej z herbaty (Camellia Sinensis L.) Liście

Przeglądaj więcej filmów