Oczyszczanie i przeszczepianie miogennych egzosomów pochodzących z komórek progenitorowych w celu poprawy funkcji serca u myszy z dystroficznym zapłonem mięśniowym Duchenne'a

Protokół ten przedstawia metodę przejściowej poprawy funkcji serca u myszy z dystrofią mięśniową Duchenne'a poprzez przeszczepienie eksonu pochodzącego z normalnych miogennych komórek progenitorowych. Przeszczep egzosomalny może poprawić czynność serca u myszy z DMD w połączeniu ze zwiększoną ekspresją dystrofii w sercach biorców. Odpowiednia metoda izolacji, oczyszczania i przeszczepu eksonów do mięśnia sercowego przyczynia się do powodzenia przeszczepu eksonu w celu poprawy funkcji serca u myszy z dystrofią mięśniową Duchenne'a.

Terapia egzosomami pochodząca z MPC może poprawić funkcję mięśni szkieletowych poprzez normalny transfer mRNA dystrofiny za pośrednictwem egzosomu. Ten film przedstawia kluczowe techniki oczyszczania egzosomu, dostarczania egzosomów do mięśnia sercowego i echokardiografii po przeszczepie. Demonstracja echokardiografii zostanie wykonana przez Yan Shen, technika z naszego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, zasiaj pięć milionów komórek C2C12 w 15-centymetrowym naczyniu hodowlanym z 20 mililitrami kompletnego DMEM zawierającego 10% FBS i antybiotyki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie użyj wahadłowego wirnika kubełkowego do ultrawirowania FBS w temperaturze 100 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 18 godzin, aby przygotować pożywkę zubożoną w egzosomy.

Wyrzucić osad i zebrać supernatant. Gdy komórki jednowarstwowe osiągną 80% konfluencji w naczyniu hodowlanym, zastąp cały DMEM pożywką zubożoną w egzosomy. Za pomocą pipety transferowej należy co 48 godzin pobierać supernatant z naczynia do hodowli komórkowych.

Odwirować probówki o sile 150 razy G przez dziesięć minut, aby usunąć pozostałe komórki. Przefiltruj supernatant przez filtr 0,22 mikrometra, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenia komórkowe i przenieś przefiltrowane medium do ultra przezroczystych probówek. Następnie użyj obrotowego wirnika kubełkowego, aby ultraodwirować probówki w temperaturze 100, 00 razy G i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 120 minut, aby wytrącić egzosomy.

Ponownie zawiesić osad zawierający egzosom w PBS, a następnie napełnij całą ultra-przezroczystą probówkę PBS. Ultraodwirować tę zawiesinę w temperaturze 100, 00 razy G i w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 120 minut, aby wyeliminować białka zanieczyszczające. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad egzosomu w 100 mikrolitrach PBS.

Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Najpierw zamocuj każdą znieczuloną mysz w pozycji leżącej na platformie operacyjnej, zabezpieczając każdą kończynę taśmą. Umieść szew 3-0 poziomo poniżej górnych zębów, aby utrzymać górną szczękę na miejscu.

Następnie nałóż krem do depilacji po lewej stronie klatki piersiowej myszy, aby usunąć jodłę ze skóry. Za pomocą cewnika o rozmiarze 24 wykonaj intubację dotchawiczą przez jamę ustną. I użyj wentylatora dla gryzoni, aby przewietrzyć mysz powietrzem w pomieszczeniu z szybkością 195 oddechów na minutę.

Zdezynfekuj skórę 70% alkoholem i 10% jodopowidonem. Następnie wykonaj skośne nacięcie o średnicy od 10 do 15 milimetrów od lewej krawędzi mostka do lewej pachy. Użyj nożyczek, aby przeciąć mięsień piersiowy większy i piersiowy mniejszy.

I zrób torakotamię w lewo przez czwartą przestrzeń międzybrzegową. Delikatnie włóż opaski zwijaczające, aby rozciągnąć klatkę piersiową na szerokość 10 milimetrów, uważając, aby nie uszkodzić lewego płuca. Następnie użyj dwóch prostych pęset, aby usunąć osierdzie.

Rozsuń je i umieść za końcówkami zwijacza, aby odsłonić serce. Użyj igły do insuliny o rozmiarze 31, aby wstrzyknąć MPC-Exo lub PBS domięśniowo w przednią ścianę lewej komory w jednym miejscu. Następnie użyj nylonowych szwów 6-0, aby zamknąć kolejno jamę piersiową, mięśnie piersiowe i skórę.

Dwa dni po przeszczepie egzosomu PBS znieczulij myszy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj taśmy, aby ustawić mysz w pozycji leżącej na plecach i nałóż podgrzany żel akustyczny na lewą klatkę piersiową. Następnie użyj echokardiografii, aby ocenić funkcję lewej komory.

Uzyskaj widok przymostkowej osi długiej lewej komory w dwóch wymiarach, a następnie obróć sondę ultradźwiękową o 90 stopni, aby uzyskać widok krótkiej osi lewej komory na poziomie mięśni brodawkowatych. Następnie zapisz obrazy echokardiograficzne w trybie M i zmierz średnicę końcoworozkurczową lewej komory, końcowoskurczową objętość lewej komory, końcowo-rozkurczową objętość lewej komory i końcowoskurczową objętość lewej komory. Tętno myszy powinno być kontrolowane na poziomie co najmniej 400 uderzeń na minutę dla funkcji pomiaru serca.

Po wyizolowaniu i oczyszczeniu egzosomów z komórek C2C12 ich obecność potwierdza się za pomocą analizy transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Obraz z transmisyjnej mikroskopii elektronowej pokazuje morfologię jasnych i okrągłych pęcherzyków egzosomów pochodzących z C2C12. Analiza Western blot potwierdza obecność markerów egzosomów, w tym CD63 i Tsg101.

Po wstrzyknięciu domięśniowym do mięśnia sercowego do przedniej ściany lewej komory myszy mdx obserwuje się półprzezroczysty obszar obrzęku, co wskazuje, że wstrzyknięcie do mięśnia sercowego zakończyło się sukcesem. Następnie przeprowadza się barwienie immunofluorescencyjne dystrofiny w celu określenia, czy sercowe dostarczanie MPC-Exo przywraca ekspresję białka dystrofiny w sercach MDX. Częściowe przywrócenie ekspresji dystrofiny obserwuje się przy lokalizacji błonowej w niektórych kardiomiocytach.

Czynność serca mierzy się za pomocą echokardiografii dwa dni po dostarczeniu do mięśnia sercowego w celu ustalenia, czy transplacja MPC-Exo poprawia czynność serca u myszy mdx. Obserwuje się, że leczenie MPC-Exo poprawia ruch ścian wewnętrznych w porównaniu z PBS, co sugeruje, że przeszczep MPC-Exo poprawił czynność serca u myszy mdx. Użycie igły insulinowej o rozmiarze 31 z końcówką pod kątem około 20 stopni ma kluczowe znaczenie dla powodzenia dostarczania większości egzosomów do mięśnia sercowego i maksymalizuje ekspozycję wstrzykniętych egzosomów na kardiomiocyty gospodarza.

Po zabiegu ekspresję dystrofiny można wykryć po wstrzyknięciu egzosomu pochodzącego z MPC za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, co wskazuje, że dostarczanie egzosomu pochodzącego z serca MPC przywraca ekspresję białka dystrofiny. Technika ta utoruje drogę do leczenia kardiomiopatii terapeutycznymi materiałami genetycznymi przenoszącymi egzosomy, w tym DNA, mRNA, lncRNA lub mikroRNA.