Name: Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac. Protokół umożliwia szybkie badanie chorób neuronów ruchowych, takich jak ALS, bez konieczności etapów oczyszczania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Zakładowi Obrazowania w Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, za wsparcie i porady techniczne. Jesteśmy wdzięczni członkom Center for Life Nano Science za pomocną dyskusję. Prace te zostały częściowo wsparte grantem z AriSLA (grant pilotażowy 2016 "StressFUS") dla AR.

1. Utrzymanie ludzkich iPSC
<ol>
	<li>Przygotowanie płyt pokrytych matrycą
	<ol>
		<li>Rozmrozić jedną fiolkę o pojemności 5 ml z matrycą (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez noc. Oryginalne zapasy matrycowe występują w różnych stężeniach, a podwielokrotności są sporządzane zgodnie ze współczynnikiem rozcieńczenia wskazanym w arkuszu danych, właściwym dla danej partii. Ważne jest, aby fiolka i probówki były lodowate, aby zapobiec przedwczesnemu zżelowaniu matrycy. Dozować matrycę do podwielokrotności we wstępnie schłodzonych krioprobówkach na lodzie. Niewykorzystane podwielokrotności zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Umieść jedną porcję na lodzie na około 2 godziny do rozmrożenia.</li>
		<li>Rozcieńczyć podwielokrotność matrycy 20 ml zimnego DMEM/F12 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i rozlać 1 ml rozcieńczonej matrycy do szalek o średnicy 35 mm (równoważne ilości na powierzchnię innych szalek).</li>
		<li>Naczynia zawierające rozcieńczoną matrycę należy przechowywać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić powlekanie. 
		nuta: Naczynia uszczelnione parafilmem można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego (20 ml) i 1x porcji roboczych delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Rozpuścić proszek do 10 mg/ml w PBS (wolny od Ca2+/Mg2+).</li>
		<li>Filtr sterylizuje przez membranę filtracyjną 0,22 μm.</li>
		<li>Przygotować 20 porcji (po 1 ml każdy) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przed użyciem rozcieńczyć jedną podwielokrotność w PBS (wolne od Ca2+/Mg2+) do 1 mg/ml (1x podwielokrotności robocze). 
		UWAGA: 1x porcje robocze mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenikanie ludzkich komórek iPS.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem: W przypadku przechowywania w temperaturze 4 °C należy wstępnie ogrzać płytki pokryte matrycą w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20-30 min. Wstępnie podgrzej w temperaturze pokojowej ilość potrzebnej pożywki iPSC dla ludzi (patrz Tabela materiałów). Wstępnie rozgrzej DMEM/F12.</li>
		<li>Aspirować pożywkę hodowlaną.</li>
		<li>Przepłukać iPSC PBS (wolne od Ca2+/Mg2+).</li>
		<li>Dodaj 1x delikatny roztwór dysocjacyjny (0,5 ml na naczynie 35 mm). Inkubować w temperaturze 37 °C, aż krawędzie kolonii zaczną odrywać się od płytki, zwykle 3-5 minut.</li>
		<li>Zassać delikatny roztwór dysocjacyjny, uważając, aby nie oderwać kolonii iPSC.</li>
		<li>Umyj komórki DMEM/F12 (2 ml na naczynie 35 mm) i odessać, uważając, aby nie oderwać komórek. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
		<li>Dodać ludzką pożywkę iPSC (1 ml na szalkę o średnicy 35 mm).</li>
		<li>Delikatnie odłącz kolonie za pomocą podnośnika komórkowego i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Delikatnie rozbić grudki komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.</li>
		<li>Odessać supernatant z płytki(-ek) pokrytej matrycą(-ych).</li>
		<li>Wysiewać komórki w odpowiedniej objętości hodowli ludzkiej pożywki iPSC. Współczynnik podziału może się różnić w zależności od wiersza i wynosi około 1:4-1:8. Zmieniaj medium codziennie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie indukowanych przez NIL i NIP linii iPSC
<ol>
	<li>Transfekcja komórek.
	<ol>
		<li>Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca2+ / Mg2+).</li>
		<li>Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż pojedyncze komórki zostaną oddzielone (5-10 min).</li>
		<li>Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 3-4 razy.</li>
		<li>Zebrać w probówce o pojemności 15 ml i dodać PBS (wolny od Ca2+ / Mg2 +) do 10 ml. Policz komórki.</li>
		<li>Osad 106 ogniw i ponownie zawiesić w 100 μl buforu R (dołączonego do zestawu do elektroporacji ogniw, patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dodaj plazmidowe DNA do transfekcji: 4,5 μg wektora transpozycyjnego (epB-Bsd-TT-NIL lub epB-Bsd-TT-NIP12) i 0,5 μg plazmidu transpozazy piggyBac13.</li>
		<li>Transfekcja z systemem elektroporacji ogniw (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i zgodnie z wcześniejszym opisem3 o następujących parametrach: napięcie 1 200 V, szerokość 30 ms, 1 impuls. Wysiewać komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej 10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK, patrz tabela materiałów) w naczyniu pokrytym matrycą o średnicy 6 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selekcja antybiotykami.
	<ol>
		<li>Dwa dni po transfekcji dodać 5 μg/ml blasticydyny do pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Większość komórek nietransfekowanych umrze w ciągu 48 godzin od selekcji blasticydyny. Utrzymuj komórki w blasticydynie przez co najmniej 7-10 dni, aby dokonać kontrselekcji komórek, które nie zintegrowały transgenów z genomem.</li>
		<li>Utrzymuj stabilnie transfekowane komórki jako populację mieszaną, składającą się z komórek o różnej liczbie transgenów i różnych miejscach integracji, lub izoluj pojedyncze klony.</li>
		<li>Przygotować dodatkowe naczynie w celu sprawdzenia skutecznej ekspresji transgenów, po indukcji doksycykliny 1 μg/ml metodą RT-PCR ze starterami specyficznymi dla transgenu dla Ngn2 (Dalej: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Odwrotny: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), zgodnie z wcześniejszym opisem12.</li>
		<li>Na tym etapie należy zamrozić zapasy nowych linii NIL i NIP-iPSC w pożywce do zamrażania dla ludzkich iPSC (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Różnicowanie neuronów ruchowych
<ol>
	<li>Oddzielić komórki za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek, jak opisano (kroki 2.1.1.-2.1.3.). Zebrać zdysocjowane komórki w probówce o pojemności 15 ml i rozcieńczyć 5 objętościami DMEM/F12. Osadzać komórki i ponownie zawiesić w ludzkim pożywce iPSC uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Policz komórki i nasiona na szalkach pokrytych matrycą o gęstości 62 500 komórek/cm2.</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę DMEM/F12, uzupełnioną 1x stabilnym analogiem L-glutaminy, 1x suplementem hodowli komórkowej aminokwasów endogennych (NEAA) i 0,5x penicyliną/streptomycyną i zawierającą 1 μg/ml doksycykliny. Jest to traktowane jako dzień 0 różnicowania. W dniu 1 odśwież pożywkę i doksycyklinę.</li>
	<li>W dniu 2 zmień pożywkę na pożywkę Neurobasal/B27 (pożywka neuropodstawowa uzupełniona 1x B27, 1x stabilny analog L-glutaminy, 1x NEAA i 0,5x penicylina/streptomycyna), zawierającą 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 i 1 μg/ml doksycykliny (patrz tabela materiałów). Odświeżaj pożywkę i doksycyklinę codziennie aż do 5 dnia.</li>
	<li>Dzień 5: Dysocjacja komórek za pomocą odczynnika do dysocjacji komórek (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przepłukać komórki PBS (wolne od Ca2+ / Mg2+).</li>
		<li>Dodać odczynnik do dysocjacji komórek (0,35 ml dla szalki o średnicy 35 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C, aż cała monowarstwa komórek oddzieli się od naczynia. Należy pamiętać, że pojedyncze komórki nie zostaną oddzielone podczas inkubacji.</li>
		<li>Dodać 1 ml DMEM/F12 i zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Delikatnie zakończ separację komórek, pipetując w górę i w dół pipetorem P1000 10-15 razy.</li>
		<li>Dodaj 4 ml DMEM/F12 i policz komórki.</li>
		<li>Na tym etapie należy zamrozić komórki progenitorowe neuronów ruchowych w pożywce do zamrażania komórek (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Osadzać komórki i ponownie zawiesić w pożywce neuronalnej (pożywka Neurobaseal/B27 uzupełniona 20 ng/ml BDNF, 10 ng/mL GDNF i 200 ng/ml kwasu L-askorbinowego, patrz tabela materiałów) uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK.</li>
		<li>Wysiewaj komórki na poliornitynie/lamininie lub alternatywnie na podłożach pokrytych matrycą o gęstości 100 000 komórek/cm2. Do analizy barwienia immunologicznego należy użyć plastikowych podpór μ-Slide z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W 6 dniu zmień pożywkę na świeżą pożywkę neuronalną pozbawioną inhibitora ROCK. W kolejnych dniach odświeżać połowę podłoża co 3 dni. Pożywkę hodowlaną należy wymieniać bardzo ostrożnie, aby zapobiec oderwaniu się od powierzchni.</li>
</ol>
4. Analiza immunologiczna
<ol>
	<li>Utrwalenie komórek. Przepłukać komórki PBS (z Ca2+/Mg2+) i inkubować przez 15 minut w 4% paraformaldehydzie w PBS (z Ca2+/Mg2+) w temperaturze pokojowej. 
	ostrożność: Paraformaldehyd jest toksyczny i podejrzewa się, że powoduje raka. Unikać kontaktu ze skórą i oczami oraz obchodzić się z nimi pod wyciągiem chemicznym.</li>
	<li>Przepuszczać PBS (z Ca2+/Mg2+) zawierającym 0,1% Triton X-100 przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym przeciwciała (ABS: 3% BSA w PBS z Ca2+/Mg2+).</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z pierwszorzędowymi przeciwciałami w ABS: anty-TUJ1 (1:1000; królik) i anty-Oct4 (1:200; mysz) lub anty-CHAT (anty-cholina acetylotransferaza; 1:150; koza). Zobacz tabelę materiałów.</li>
	<li>Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej z odpowiednią parą przeciwciał drugorzędowych osła w ABS: anty-mysim Alexa Fluor 647 (1:250), anty-króliczym Alexa Fluor 594 (1:250) i anty-kozim Alexa Fluor 488 (1:250). Zobacz tabelę materiałów.</li>
	<li>Inkubować w 0,4 μg/ml DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu znakowania jąder.</li>
	<li>Zamontuj ogniwa za pomocą pożywki montażowej (patrz tabela materiałów) do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
5. Charakterystyka funkcjonalna za pomocą nagrań z zaciskiem krosowym
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zewnętrzny równoważony HEPES (NES) w następujący sposób: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES i 10 mM glukozy. Ustaw osmolarność w zakresie 290-300 mΩ. Doprowadzić pH do 7,3 za pomocą 1N NaOH i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór wewnętrzny: 140 mM K-glukonian, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP. Dostosuj pH do 7,3 za pomocą 1M KOH i sprawdź, czy osmolarność jest ustawiona na około 290 mΩ. Zamrozić roztwór w temperaturze -20 °C w małych porcjach.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentów należy wstępnie podgrzać roztwór NES w łaźni wodnej do temperatury około 28-30 °C.</li>
	<li>Wyciągnąć kilka mikropipet borokrzemianowych (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) z końcówką o rezystancji 5-6 MΩ i napełnić roztworem wewnątrzkomórkowym przed zamontowaniem w uchwycie na pipety. 
	nuta: Należy pamiętać o chlorowaniu srebrnych drutów elektrody rejestrującej i elektrody odniesienia w wybielaczu przez co najmniej 30 minut, aby na powierzchni drutu powstała jednolita warstwa AgCl.</li>
	<li>Przenieść szalkę Petriego do komory rejestracyjnej i pozostawić komorę z roztworem NES na poziomie 1-2 ml/min. Pozwól, aby przepływ przepływał przez grzałkę liniową ustawioną na temperaturę 30 °C, aby utrzymać ciepło roztworu.</li>
	<li>Umieścić elektrofizjologiczną komorę zapisową pod mikroskopem pionowym. Rejestruj prądy membranowe za pomocą wzmacniacza krosowego i pozyskuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Otwórz amplifier oprogramowanie sterujące i ustaw wzmocnienie sygnału na wartość 1, a filtr Bessela na 10 kHz. Upewnij się, że filtr Bessela jest 2.5 razy niższy niż częstotliwość próbkowania.</li>
	<li>Ustaw protokoły eksperymentalne dla eksperymentów z cęgami napięciowymi i prądowymi w oprogramowaniu do nagrywania.</li>
	<li>W ustawieniach protokołu zaznacz tryb stymulacji epizodycznej i ustaw częstotliwość próbkowania na 25 kHz. Następnie przejdź do zakładki przebiegu i wpisz amplitudę i długość kroku napięcia lub prądu w następujący sposób.</li>
	<li>W przypadku prądów sodowych bramkowanych napięciem należy zastosować 15 stopni napięcia (każdy czas trwania 50 ms) od -100 mV do +40 mV (przyrost 10 mV). Uruchom protokół po nałożeniu na załatane ogniwo potencjału podtrzymania -60 mV przez wzmacniacz. Podobnie, prądy potasowe bramkowane napięciem są wywoływane przez kroki napięcia (każdy czas trwania 250 ms) od -30 mV do +50 mV (przyrost 10 mV) utrzymujące zarejestrowane ogniwo do -40 mV.</li>
	<li>Do zbadania właściwości wypalania MN czaszkowych i rdzeniowych pochodzących z iPSC, należy zacisnąć komórki w trybie cęgowania prądowego przy potencjale błonowym -70 mV i użyć 4 impulsów prądowych (każdy o czasie trwania 1 s) o rosnącej amplitudzie (od +20 pA do +80 pA; przyrost 20 pA).</li>
	<li>Uzyskaj dla każdego ogniwa prądy aktywowane napięciem, wywołaną aktywność wypalania i trzy właściwości pasywne, takie jak pojemność całego ogniwa (Cm), rezystancja błony komórkowej (Rm) i spoczynkowy potencjał błonowy (RMP).</li>
</ol>

<ol><li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+%28iPSCs%29+derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li>
<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+journal+of+rare+diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS%2Fdementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960(2016).</li>
<li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
<li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells%2C+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons%2C+Skeletal+Myocytes%2C+and+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li>
<li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Protokół ten pozwala na skuteczne przekształcanie ludzkich iPSC w rdzeniowe i czaszkowe neurony ruchowe dzięki ektopowej ekspresji czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii. Te transgeny są indukowane przez doksycyklinę i stabilnie zintegrowane z genomem dzięki wektorowi opartemu na transpozonach piggyBac. W populacji mieszanej jedna lub kilka kopii wektora piggyBac zostanie losowo zintegrowanych z genomem poszczególnych komórek, co zwiększa ryzyko zmian integralności genomu. Co więcej, z czasem może dojść do po...

Zwyrodnienie neuronu ruchowego (MN) odgrywa przyczynową rolę w chorobach ludzkich, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i rdzeniowy zanik mięśni (SMA). Stworzenie odpowiednich systemów modeli komórkowych in vitro, które podsumowują złożoność ludzkiego MN, jest ważnym krokiem w kierunku opracowania nowych podejść terapeutycznych. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), które są obdarzone niezwykłymi właściwościami różnicowania pluriline, zostały obecnie uzyskane od wielu pacjentów dotkniętych chorobami neuronu ruchowego1,2. Dodatkowe linie iPSC niosące patogenne mutacje związane z chorobami MN zostały wygenerowane przez edycję genów, zaczynając od kontrolnych "zdrowych" pluripotencjalnych komórek macierzystych3. Linie te stanowią użyteczne narzędzia do modelowania chorób in vitro i badań przesiewowych leków, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie metody różnicowania iPSC w MN. Przesłanką do opracowania tej metody jest zapewnienie środowisku naukowemu zainteresowanemu chorobami MN szybkiego i skutecznego protokołu różnicowania, który prowadzi do powstania dojrzałych funkcjonalnych MN. Pierwszą zaletą tej metody jest czas jej wykonania. Kolejnym istotnym punktem mocnym jest wyeliminowanie jakiegokolwiek etapu oczyszczania. Wreszcie, protokół może być wykorzystany do wygenerowania dwóch odrębnych populacji neuronów ruchowych.
Możliwość generowania różnych podtypów MN jest szczególnie istotna dla modelowania chorób MN. Nie wszystkie podtypy MN są jednakowo podatne na ALS i SMA, a wystąpienie objawów w różnych jednostkach motorycznych ma duży wpływ na rokowanie. W ALS początek kręgosłupa z objawami rozpoczynającymi się w kończynach górnych i dolnych prowadzi do śmierci po około 3-5 latach4. I odwrotnie, początek opuszkowy, rozpoczynający się zwyrodnieniem MN czaszki, ma najgorsze rokowanie. Co więcej, odsetek wystąpienia objawów opuszkowych jest znacznie wyższy u pacjentów z mutacjami w białkach wiążących RNA FUS i TDP-43 niż u osób z mutacjami SOD15. Prawie wszystkie alternatywne protokoły różnicowania MN opierają się na aktywności kwasu retinowego (RA), który nadaje kręgosłupowy charakter różnicującym się iPSCs6,7,8. Ogranicza to możliwość badania czynników wewnętrznych, które mogą działać ochronnie w określonych podtypach MN9,10.
Zgodnie z poprzednią pracą nad embrionalnymi komórkami macierzystymi myszy11, ostatnio wykazaliśmy, że w ludzkich iPSC ektopowa ekspresja Ngn2, Isl1 i Lhx3 (NIL) indukuje rdzeniową tożsamość MN, podczas gdy Ngn2 i Isl1 plus Phox2a (NIP) określają czaszkowe MNs12. W związku z tym opracowaliśmy skuteczny protokół, który doprowadził do wytworzenia ludzkich MN obdarzonych właściwościami funkcjonalnymi w ciągu 12 dni. Celem tej metody jest uzyskanie, w krótkim czasie i bez konieczności oczyszczania (np. przez FACS), populacji komórek wysoce wzbogaconych dla MN z tożsamością rdzeniową lub czaszkową.

<table><tbody><tr><td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&nbsp;</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>anty-CHAT</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>AB144P</td><td>Acetylotransferaza antycholinowa. Przeciwciało pierwotne stosowane w testach barwienia immunologicznego. RRID: AB_2079751; Numer serii: 2971003</td></tr><tr><td>antykozioł Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>A11055</td><td>Przeciwciało drugorzędowe stosowane do testów immonofluorescencyjnych. RRID: AB_2534102; Numer serii: 1915848</td></tr><tr><td>anty-mysz Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A31571</td><td>Przeciwciało drugorzędowe stosowane do testów immonofluorescencyjnych. RRID: AB_162542; Numer serii: 1757130</td></tr><tr><td>anty-Oct4&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w testach barwienia immunologicznego. RRID: AB_398736; Numer serii: 5233722</td></tr><tr><td>anty-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w testach barwienia immunologicznego. Numer serii: E0117</td></tr><tr><td>anty-królik Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Nauki immunologiczne</td><td>IS-20152-1</td><td>Przeciwciało drugorzędowe stosowane do testów immonofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>anty-TUJ1&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T2200</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w testach barwienia immunologicznego. RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>Suplement bez surowicy do utrzymania komórek nerwowych</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>Pożywka do zamrażania komórek, stosowana tutaj do progenitorów neuronów ruchowych</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>Antybiotyk nukleozydowy hamujący syntezę białek u prokariontów i eukariontów</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Albumina surowicy bydlęcej. Środek blokujący zapobiegający nieswoistemu wiązaniu przeciwciał w testach barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Chemikalia CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Clampex 10</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Clampex 10</td><td>System rejestracji prądów membranowych</td></tr><tr><td>Corning Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Odtworzony preparat błony podstawnej z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Służy do przyczepności iPSC do podłoży plastikowych i szklanych</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF MROŻENIE</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>05-710-1E</td><td>Podłoże do zamrażania dla ludzkich iPSC</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Proszek DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>4&,6-diamidino-2-fenyloindol. Barwnik fluorescencyjny, który wiąże się z adeniną&ndash; Regiony bogate w tyminę w DNA używane do barwienia jąder w testach immonofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>Inhibitor sekretazy gamma</td></tr><tr><td>Dypaza</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>Podłoże bazowe do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G& nbsp;</td><td>Służy do indukowania ekspresji transgenów z wektorów epB-Bsd-TT-NIL i epB-Bsd-TT-NIP</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>Komercyjna ludzka linia iPSC</td></tr><tr><td>E.Z.N.A Total RNA Kit&nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>Zestaw do całkowitej ekstrakcji RNA z hodowanych komórek eukariotycznych</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>Glejowy czynnik neurotroficzny</td></tr><tr><td>Gibco Episomal hiPSC Line</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>Komercyjna linia iPSC dla ludzi</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Alternatywa dla L-glutaminy o zwiększonej stabilności. Poprawia zdrowie komórek.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>iScript Odwrotna transkrypcja Supermix dla RT-qPCR&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td>Kit do analizy ekspresji genów za pomocą qPCR</td></tr><tr><td>iTaqTM w czasie rzeczywistym Uniwersalny SYBR Green Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td>Gotowa do użycia główna mieszanka reakcji zoptymalizowana pod kątem ilościowego PCR na bazie barwnika (qPCR) na dowolnym urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>LKT Laboratories</td><td>A7210</td><td>Stosowany w hodowlach komórkowych jako przeciwutleniacz</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny&nbsp;</td><td>Olimpia</td><td>&nbsp; iX83 FluoView1200</td><td>Mikroskop konfokalny do akwizycji obrazów barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Medium montażowe&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>Rozwiązanie montażowe stosowane do mikroskopii konfokalnej i testów immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Wzmacniacz z wieloma zaciskami krosowymi</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>700B</td><td>System rejestracji prądów membranowych</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>chemikalia do roztworów elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>aminokwasy endogenne. Stosowany jako suplement do pożywki do hodowli komórkowych w celu zwiększenia wzrostu i żywotności komórek.</td></tr><tr><td>Neon 100 &mu; L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Zestaw do elektroporacji komórek</td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>System elektroporacji komórek</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Podłoże bazowe przeznaczone do długotrwałego utrzymania i dojrzewania populacji komórek nerwowych bez konieczności stosowania warstwy zasilającej astrocyty</td></tr><tr><td>NutriStem-XF/FF&nbsp;</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>05-100-1A</td><td>Pożywka hodowlana ludzkiego iPSC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>157-8</td><td>Służy do utrwalania komórek w testach barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>Bufor fosforanowy Dulbecco, sól fizjologiczna, z wapniem, z magnezem</td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+ wolny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Bufor fosforanowy Dulbecco, bez wapnia, bez penicyliny magnezowej</td></tr><tr><td>/streptomycyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny stosowany w celu zapobiegania zanieczyszczeniu kultur komórkowych bakteriami.</td></tr><tr><td>poliornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Wspomaga przyłączanie i wzrost komórek nerwowych in vitro</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0443-5MG</td><td>Selektywny inhibitor receptora 2 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR-2)</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy,&nbsp; t-oktylofenoksypolietylen, glikol polietylenowy&nbsp; eter tert-oktylofenylowy. Służy do przenikania komórek w testach barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51VI</td><td>Mikroskop do zapisu elektrofizjologicznego wyposażony w kamerę CoolSnap Myo&nbsp;</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp; (inhibitor ROCK)</td><td>Enzo Nauki Przyrodnicze</td><td>ALX-270-333-M005&nbsp;</td><td>Przepuszczalny przez komórkę selektywny inhibitor kinazy białkowej zawierającej zwiniętą cewkę (ROCK) związaną z Rho. Zwiększa przeżywalność iPSC</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Well&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Wsparcie dla wysokich&ndash; Końcowa analiza mikroskopowa komórek stałych</td></tr></tbody></table>

konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ipsc) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów piggybac

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Opisujemy tutaj metodę uzyskiwania funkcjonalnych neuronów ruchowych rdzenia kręgowego i czaszki z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Bezpośrednia konwersja do neuronu ruchowego uzyskuje się poprzez ektopową ekspresję alternatywnych modułów czynników transkrypcyjnych, a mianowicie Ngn2, Isl1 i Lhx3 (NIL) lub Ngn2, Isl1 i Phox2a (NIP). NIL i NIP określają, odpowiednio, tożsamość neuronów ruchowych rdzenia i czaszki. Nasz protokół rozpoczyna się od wygenerowania zmodyfikowanych linii iPSC, w których NIL lub NIP są stabilnie zintegrowane z genomem za pomocą wektora transpozonowego piggyBac. Ekspresja transgenów jest następnie indukowana przez doksycyklinę i prowadzi w ciągu 5 dni do przekształcenia iPSC w komórki progenitorowe MN. Późniejsze dojrzewanie, przez 7 dni, prowadzi do jednorodnych populacji rdzeniowych lub czaszkowych MN. Nasza metoda ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi protokołami: jest niezwykle szybka i uproszczona; nie wymaga infekcji wirusowej ani dalszej izolacji MN; pozwala na generowanie różnych subpopulacji MN (rdzeniowych i czaszkowych) o niezwykłym stopniu dojrzałości, o czym świadczy zdolność do wystrzeliwania ciągów potencjałów czynnościowych. Co więcej, dużą liczbę neuronów ruchowych można uzyskać bez oczyszczania z populacji mieszanych. Neurony ruchowe rdzenia i czaszki pochodzące z iPSC mogą być wykorzystywane do modelowania in vitro stwardnienia zanikowego bocznego i innych chorób neurodegeneracyjnych neuronu ruchowego. Jednorodne populacje neuronów ruchowych mogą stanowić ważny zasób dla badań przesiewowych leków specyficznych dla typu komórki.

Schematyczny opis metody różnicowania przedstawiono na Rysunku 1. Ludzkie iPSC (linia WT I3) transfekowano konstruktami epB-Bsd-TT-NIL lub epB-Bsd-TT-NIP, co po selekcji blastycydyną pozwoliło na wygenerowanie stabilnych i indukowalnych linii komórkowych12, zwanych odpowiednio iPSC-NIL i iPSC-NIP. Różnicujące się komórki charakteryzowano pod kątem ekspresji markera pluripotencji OCT4 oraz pan-neuronalnego markera TUJ1. Analiza immunobarwienia w...

Ten protokół umożliwia szybką i efektywną konwersję indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony ruchowe o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej, poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych z indukowalnych wektorów piggyBac.

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Możliwość generowania różnych podtypów neuronów ruchowych jest szczególnie istotna dla modelowania współczesnych chorób neuronów ruchowych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne. Metoda ta pozwala na pozyskanie populacji komórek, które są bardzo sztywne dla neuronów ruchowych o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej w krótkim czasie i bez etapu oczyszczania. Generowanie ludzkich neuronów ruchowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC w uproszczonych warunkach hodowli może ułatwić badania przesiewowe leków w kierunku chorób neuronu ruchowego.Indukowalna ekspresja programującego czynnika transkrypcyjnego może być wykorzystana do generowania innych typów komórek, takich jak neurony, mięśnie szkieletowe i komórki glejowe z repozytorium iPSC. W celu wytworzenia linii NIL i NIP iPSC, przepłucz ludzką hodowlę iPSC PBS wolnym od wapnia i magnezu, a następnie potraktuj komórki odczynnikiem do dysocjacji komórek przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki zaczną odłączać się od pojemnika hodowlanego, użyj pipety P1000, aby delikatnie ręcznie oddzielić komórki trzy do czterech razy.Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i doprowadź końcową objętość do 10 mililitrów świeżym PBS bez wapnia i magnezu do liczenia. Zebrać jeden razy od 10 do szóstego ogniwa przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu R z zestawu do elektroporacji. Dodać 4,5 mikrograma transpozycyjnego wektorowego DNA osocza i 0,5 mikrograma DNA transpozazy osocza piggyBac w celu transfekcji.Transfekcja z systemem elektroporacji ogniw zgodnie z instrukcją producenta o wskazanych parametrach. Następnie wysiewaj komórki w ludzkim pożywce iPSC uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK Y-27632 w sześciomilimetrowym naczyniu pokrytym matrycą. Dwa dni po transfekcji dodaj 5 mikrogramów na mililitr blastycydyny do pożywki hodowlanej, utrzymując komórki w antybiotyku przez co najmniej siedem do 10 dni, aby przeciwselekcjonować komórki, które nie zintegrowały transgenów.Pod koniec inkubacji należy utrzymać stabilnie transfekowane komórki jako mieszaną populację złożoną z komórek o różnej liczbie transgenów i różnych miejscach integracji lub wyizolować pojedyncze klony. Przygotować dodatkowe naczynie, aby umożliwić efektywną ekspresję transgenów na jednym mikrogramie na mililitr indukcji doksycykliny, która ma być oceniona za pomocą RT-PCR ze starterami specyficznymi dla transgenu dla neurogeniny-2, jak opisano wcześniej. Na tym etapie zapasy nowych linii NIL i NIP iPSC powinny być również zamrożone w pożywce do zamrażania dla ludzkich iPSC.W celu różnicowania neuronów ruchowych należy zdysocjować stabilnie transfekowane kultury komórkowe za pomocą odczynnika dysocjacyjnego, jak wykazano, aby umożliwić zebranie komórek w 15-mililitrowej probówce zawierającej pięć objętości pożywki DMEM / F12. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej mikromolowym inhibitorem ROCK do liczenia. Zasiaj komórki na szalkach pokrytych matrycą w proporcji 6,25 razy 10 czwarta komórka na centymetr kwadratowy gęstości.Przez następne dwa dni należy zastąpić supernatanty świeżą pożywką różnicującą uzupełnioną doksycykliną. W drugim dniu zmień pożywkę na neurobazalną pożywkę B27 uzupełnioną inhibitorem gamma sekretazy, inhibitorem receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego i doksycyliną. W piątym dniu rozdziel komórki, jak pokazano, i ponownie zawieś odłączone komórki w czterech mililitrach pożywki DMEM / F12 w celu zliczenia.Pipetowanie jest ważne dla całkowitej dysocjacji komórek. Zamrozić podwielokrotność komórek progenitorowych neuronu ruchowego w pożywce do zamrażania komórek zgodnie z instrukcjami producenta i zebrać resztę komórek przez odwirowanie. Zawiesić osad w pożywce neuronalnej uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK.Zasiać komórki na mikroszkiełkach pokrytych poliornityną lamininą z polimerowymi szkiełkami nakrywkowymi w gęstości od jednego do 10 do piątego ogniwa na centymetr kwadratowy. W szóstym dniu ostrożnie zastąp pożywkę świeżą pożywką neuronalną bez inhibitora do hodowli do czasu dalszej analizy bez odłączania komórek od powierzchni podpory. Jednolitą ekspresję markera pluripotencji czynnika transkrypcyjnego wiążącego oktamer czwartego lub OTC4 można zaobserwować w różnicujących się kulturach komórkowych w dniu zerowym przy braku dodatniego wyniku TUJ1 beta-tubuliny klasy trzeciej specyficznego dla markera neuronalnego.W trzecim dniu widoczny jest silny spadek liczby komórek OCT4-dodatnich. Jest to odzwierciedlone przez ekspresję TUJ1 w podzbiorze różnicujących się iPSC. W piątym dniu nie obserwuje się ekspresji OCT4 w populacji, która wykazuje stałą ekspresję TUJ1 i nabytą morfologię neuronów.Analiza barwienia immunologicznego siedem dni po ponownym posiewie komórek progenitorowych neuronu ruchowego ujawnia jednolitą ekspresję TUJ1 i markera dojrzałego neuronu ruchowego, acetylotransferazy choliny. Neurony pochodzące z iPSC NIL z powodzeniem wyświetlają zależne od napięcia prądy sodowe i zależne od napięcia prądy potasowe. 80% neuronów ruchowych pochodzących z iPSC NIL zaciśniętych w modalności zacisków prądowych jest w stanie wyzwolić ciągi kolców po wstrzyknięciu impulsu prądu o wartości plus 60 pikoamperów lub więcej.Minimalny prąd wymagany do wywołania powtarzalnego odpalania w ponad 50% zarejestrowanych komórek wynosi plus 40 pikoamperów z progiem skoku około minus 38 miliwoltów i średnią częstotliwością wyzwalania na plus 40 pikoamperów około ośmiu herców, co sugeruje, że rdzeniowe neurony ruchowe pochodzące z iPSC NIL wykazują właściwości funkcjonalne typowe dla dojrzałych neuronów. Neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki mogą pochodzić z kontrolowanych iPSC lub iPSC przenoszących patologiczne mutacje, a komórki te mogą być wykorzystywane jako modele pracy dyplomowej lub do badań przesiewowych leków. Nasza metoda może być wykorzystana do zrozumienia, dlaczego różne jednostki neuronów ruchowych są w różny sposób dotknięte ALS.

conversion-human-induced-pluripotent-stem-cells-ipscs-into-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Ten film demonstruje procedurę generowania neuronów ruchowych poprzez transfekcję ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac poprzez ektopową ekspresję czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii.

Edycja genów za pośrednictwem transpozonów PiggyBac w ludzkich iPSC: procedura integracji genu zainteresowania w ludzkich iPSC za pomocą systemu transpozonów PiggyBac

Ten film pokazuje proces różnicowania ludzkich iPSC w neurony ruchowe. Uzasadnienie obejmuje wykorzystanie iPSC, które zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji określonych czynników transkrypcyjnych. Po wyhodowaniu w pożywce zawierającej doksycyklinę, antybiotyk ten wyzwala ekspresję czynników transkrypcyjnych, promując w ten sposób różnicowanie iPSC w komórki progenitorowe neuronów ruchowych. Ostatecznie przodkowie są hodowani w pożywce neuronalnej, aby uzyskać dojrzałe i...

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne neurony ruchowe

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac. Protokół umożliwia szybkie badanie chorób neuronów ruchowych, takich jak ALS, bez konieczności etapów oczyszczania.

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac (Wideo) | JoVE Journal

Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

Przeglądaj więcej filmów