Konwersja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w funkcjonalne neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki przy użyciu wektorów PiggyBac

Możliwość generowania różnych podtypów neuronów ruchowych jest szczególnie istotna dla modelowania współczesnych chorób neuronów ruchowych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne. Metoda ta pozwala na pozyskanie populacji komórek, które są bardzo sztywne dla neuronów ruchowych o tożsamości rdzeniowej lub czaszkowej w krótkim czasie i bez etapu oczyszczania. Generowanie ludzkich neuronów ruchowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC w uproszczonych warunkach hodowli może ułatwić badania przesiewowe leków w kierunku chorób neuronu ruchowego.

Indukowalna ekspresja programującego czynnika transkrypcyjnego może być wykorzystana do generowania innych typów komórek, takich jak neurony, mięśnie szkieletowe i komórki glejowe z repozytorium iPSC. W celu wytworzenia linii NIL i NIP iPSC, przepłucz ludzką hodowlę iPSC PBS wolnym od wapnia i magnezu, a następnie potraktuj komórki odczynnikiem do dysocjacji komórek przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki zaczną odłączać się od pojemnika hodowlanego, użyj pipety P1000, aby delikatnie ręcznie oddzielić komórki trzy do czterech razy.

Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i doprowadź końcową objętość do 10 mililitrów świeżym PBS bez wapnia i magnezu do liczenia. Zebrać jeden razy od 10 do szóstego ogniwa przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu R z zestawu do elektroporacji. Dodać 4,5 mikrograma transpozycyjnego wektorowego DNA osocza i 0,5 mikrograma DNA transpozazy osocza piggyBac w celu transfekcji.

Transfekcja z systemem elektroporacji ogniw zgodnie z instrukcją producenta o wskazanych parametrach. Następnie wysiewaj komórki w ludzkim pożywce iPSC uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK Y-27632 w sześciomilimetrowym naczyniu pokrytym matrycą. Dwa dni po transfekcji dodaj 5 mikrogramów na mililitr blastycydyny do pożywki hodowlanej, utrzymując komórki w antybiotyku przez co najmniej siedem do 10 dni, aby przeciwselekcjonować komórki, które nie zintegrowały transgenów.

Pod koniec inkubacji należy utrzymać stabilnie transfekowane komórki jako mieszaną populację złożoną z komórek o różnej liczbie transgenów i różnych miejscach integracji lub wyizolować pojedyncze klony. Przygotować dodatkowe naczynie, aby umożliwić efektywną ekspresję transgenów na jednym mikrogramie na mililitr indukcji doksycykliny, która ma być oceniona za pomocą RT-PCR ze starterami specyficznymi dla transgenu dla neurogeniny-2, jak opisano wcześniej. Na tym etapie zapasy nowych linii NIL i NIP iPSC powinny być również zamrożone w pożywce do zamrażania dla ludzkich iPSC.

W celu różnicowania neuronów ruchowych należy zdysocjować stabilnie transfekowane kultury komórkowe za pomocą odczynnika dysocjacyjnego, jak wykazano, aby umożliwić zebranie komórek w 15-mililitrowej probówce zawierającej pięć objętości pożywki DMEM / F12. Po odwirowaniu ponownie zawieś komórki w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej mikromolowym inhibitorem ROCK do liczenia. Zasiaj komórki na szalkach pokrytych matrycą w proporcji 6,25 razy 10 czwarta komórka na centymetr kwadratowy gęstości.

Przez następne dwa dni należy zastąpić supernatanty świeżą pożywką różnicującą uzupełnioną doksycykliną. W drugim dniu zmień pożywkę na neurobazalną pożywkę B27 uzupełnioną inhibitorem gamma sekretazy, inhibitorem receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego i doksycyliną. W piątym dniu rozdziel komórki, jak pokazano, i ponownie zawieś odłączone komórki w czterech mililitrach pożywki DMEM / F12 w celu zliczenia.

Pipetowanie jest ważne dla całkowitej dysocjacji komórek. Zamrozić podwielokrotność komórek progenitorowych neuronu ruchowego w pożywce do zamrażania komórek zgodnie z instrukcjami producenta i zebrać resztę komórek przez odwirowanie. Zawiesić osad w pożywce neuronalnej uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK.

Zasiać komórki na mikroszkiełkach pokrytych poliornityną lamininą z polimerowymi szkiełkami nakrywkowymi w gęstości od jednego do 10 do piątego ogniwa na centymetr kwadratowy. W szóstym dniu ostrożnie zastąp pożywkę świeżą pożywką neuronalną bez inhibitora do hodowli do czasu dalszej analizy bez odłączania komórek od powierzchni podpory. Jednolitą ekspresję markera pluripotencji czynnika transkrypcyjnego wiążącego oktamer czwartego lub OTC4 można zaobserwować w różnicujących się kulturach komórkowych w dniu zerowym przy braku dodatniego wyniku TUJ1 beta-tubuliny klasy trzeciej specyficznego dla markera neuronalnego.

W trzecim dniu widoczny jest silny spadek liczby komórek OCT4-dodatnich. Jest to odzwierciedlone przez ekspresję TUJ1 w podzbiorze różnicujących się iPSC. W piątym dniu nie obserwuje się ekspresji OCT4 w populacji, która wykazuje stałą ekspresję TUJ1 i nabytą morfologię neuronów.

Analiza barwienia immunologicznego siedem dni po ponownym posiewie komórek progenitorowych neuronu ruchowego ujawnia jednolitą ekspresję TUJ1 i markera dojrzałego neuronu ruchowego, acetylotransferazy choliny. Neurony pochodzące z iPSC NIL z powodzeniem wyświetlają zależne od napięcia prądy sodowe i zależne od napięcia prądy potasowe. 80% neuronów ruchowych pochodzących z iPSC NIL zaciśniętych w modalności zacisków prądowych jest w stanie wyzwolić ciągi kolców po wstrzyknięciu impulsu prądu o wartości plus 60 pikoamperów lub więcej.

Minimalny prąd wymagany do wywołania powtarzalnego odpalania w ponad 50% zarejestrowanych komórek wynosi plus 40 pikoamperów z progiem skoku około minus 38 miliwoltów i średnią częstotliwością wyzwalania na plus 40 pikoamperów około ośmiu herców, co sugeruje, że rdzeniowe neurony ruchowe pochodzące z iPSC NIL wykazują właściwości funkcjonalne typowe dla dojrzałych neuronów. Neurony ruchowe rdzenia kręgowego i czaszki mogą pochodzić z kontrolowanych iPSC lub iPSC przenoszących patologiczne mutacje, a komórki te mogą być wykorzystywane jako modele pracy dyplomowej lub do badań przesiewowych leków. Nasza metoda może być wykorzystana do zrozumienia, dlaczego różne jednostki neuronów ruchowych są w różny sposób dotknięte ALS.