Hamowanie in vivo mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy

Przeprowadzamy pierwszą terapię, opartą na inhibitorze mikroRNA w modelu raka tarczycy. Te rozwijające się terapie są obiecujące w leczeniu tej choroby. Ten rodzaj modelu ortotopowego, wykorzystujący systemową drogę dostarczania leczenia, ułatwia walidację nowych leków opartych na mikroRNA.

Chociaż używamy modelu ortotopowego do wszczepiania ludzkich komórek raka tarczycy do tarczycy myszy, wszystkie te modele mogą być ogólnoustrojowe dla innych typów raka. Zabieg zademonstruje wraz z Julią Ramirez-Moyą i Adrianem Acuną Raquel Arocha Riesco. Jest technikiem z naszego instytutu.

Po ustanowieniu niekompletnej pożywki dla linii komórkowej ludzkiego raka tarczycy CAL-62, zawiesić 1 razy 10 do 6 podwielokrotności komórek w 50 mikrolitrach PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza i wymieszać komórki z równą objętością macierzy błony podstawnej. Załaduj komórki do 1-mililitrowej strzykawki, wyposażonej w półcalową igłę o grubości 27 g i podskórnie wstrzyknij 100 mikrolitrów próbki w lewą flankę 6-tygodniowej myszy z niedoborem odporności C nago. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu dodać antagomiR lub kontrolowany roztwór buforowy do 160 mikrolitrów odczynnika do dostarczania in vivo o temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 1 punktu 5 mililitrów.

I natychmiast wiruj roztwór przez 10 sekund, aby zapewnić kompleksowanie mieszaniny. Inkubować roztwór do zabiegu przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie krótko odwirować w mikrowirówce. Następnie rozcieńczyć osadzony kompleks zabiegowy sześciokrotnie świeżym PBS i dokładnie wymieszać.

I wstrzyknąć całą objętość 200 mikrolitrów leku bezpośrednio do guza. Wstrzyknąć 50 mikrolitrów 40 miligramów na litr roztworu substratu D-Lucyferyny podskórnie 2 razy w tygodniu, każdemu zwierzęciu doświadczalnemu. Upewnij się, że potwierdzasz brak reakcji na szczypanie palca u nogi po znieczuleniu izofluranem.

Umieść zwierzę w komorze systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i zobrazuj sygnał bioluminescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania in vivo zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie przeanalizuj wzrost guza. Porównanie obu zabiegów i określenie istotności i różnic we wzroście za pomocą testu T.

W przypadku ortotopowej inokulacji komórek nowotworu tarczycy zawiesić podwielokrotność komórek CAL-62 w 5 mikrolitrach PBS i podskórnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów środka przeciwbólowego i 100 mikrolitrów antybiotyku do 7-tygodniowej myszy z zaworem C. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi należy umieścić zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym i zdezynfekować szyję zwierzęcia jodopowidonem. Następnie wykonaj około 2-centymetrowe nacięcie w skórze i przesuń żołądź ślinową, aby odsłonić szyję.

Użyj kleszczy preparacyjnych i/lub nożyczek, aby wyciąć mięśnie paska, aby odsłonić tchawicę i tarczycę, a następnie użyj strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów, aby wstrzyknąć 5 mikrolitrów objętości komórek nowotworowych do prawego płata tarczycy, znajdującego się z boku chrząstki sercowej. Kiedy wszystkie komórki zostaną dostarczone, zmień położenie żołędzi ślinowej i użyj jedwabnych plecionych, pokrytych, niewchłanialnych szwów, aby zamknąć nacięcie. Następnie nałóż jodopowidon na obszar rany i umieść mysz na kocu termicznym z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.

Dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu do komórek tarczycy należy przygotować roztwór leczniczy, jak pokazano, i dostarczyć roztwór dożylnie przez wstrzyknięcie zaoczodołowe do zatoki żylnej znieczulonego zwierzęcia z guzem tarczycy. W tym reprezentatywnym eksperymencie wzrost guzów wstrzykniętych domięśniowo bez inhibitora mikroRNA 146B został znacznie zahamowany w stosunku do kontroli negatywnej. Wewnątrznowotworowe poziomy ekspresji niektórych markerów proliferacji obserwowano również na niskich poziomach w guzach leczonych antagomiR, w porównaniu z guzami kontrolnymi.

Ponadto odzyskiwanie celów mikro-RNA można badać poprzez analizę RNA lub białka wyekstrahowanego z guza. Podsumowując, hamowanie in vivo poszczególnych mikro RNA jest skuteczne i może być wykorzystane terapeutycznie w leczeniu raka tarczycy. Analiza histologiczna guzów tarczycy ustalonych u myszy, jak wykazano, umożliwia barwienie komórek nabłonkowych otaczających guz, ujawniając architekturę pęcherzyków tarczycowych w tkance nowotworowej.

Warto zauważyć, że dożylne wstrzyknięcie inhibitora mikroRNA 146B myszom z ustalonym guzem powoduje znaczne zmniejszenie objętości guza w porównaniu ze zwierzętami leczonymi kontrolnie. Co więcej, ekspresja nowo opisanego mikroRNA 146B docelowego DICER1 w guzie pierwotnym wzrasta po leczeniu anty mikro-RNA 146B, co dodatkowo podkreśla potencjał hamowania ekspresji indogennego mikro-RNA, a tym samym przywrócenia genów docelowych jako terapii w raku tarczycy. Ta technika i późniejsze wyniki badania warg otwierają możliwość zbadania nowych terapii opartych na nieutwardzalnym RNA w leczeniu raka tarczycy.