Name: Hamowanie in vivo mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj metodę hamowania mikroRNA w modelu raka tarczycy u myszy. Technika obejmuje iniekcję ortotopową komórek nowotworowych i systemowe podawanie inhibitorów. Umożliwia walidację nowych terapii przeciwnowotworowych opartych na mikroRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Raquel Arocha Riesco za pomoc w leczeniu i opiece nad myszami. Dziękujemy dr J. Blanco (Kataloński Instytut Zaawansowanej Chemii - CSIC) i dr E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Hiszpania) za podarowanie komórek CMV-Firefly luc-IRES-EGFP i Cal62-Luc. Finansowanie: SAF2016-75531-R (MICIU), Fondo Europeo de Desarrollo Regional FEDER, B2017/BMD-3724 (Comunidad de Madrid), oraz GCB14142311CRES (Fundación Española contra el Cáncer, AECC).

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Prawem Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) i prawem hiszpańskim (R.D. 1201/2005), za zgodą Komisji Etyki Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, Hiszpania).
1. Inokulacja komórek bokiem i wewnątrznowotworowe leczenie antagomiR
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Inżynieria linii komórkowej ludzkiego raka tarczycy Cal62 (mutacje KRASG12R i p53A161D) w celu nadekspresji transgenicznego konstruktu, który konstytutywnie wyraża GFP i lucyferazy (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Selekcjonować komórki transgeniczne na podstawie oporności na antybiotyki lub sortowania komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Hoduj komórki w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej penicyliną, streptomycyną i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zawiesić 1 x 106 komórek w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja komórek w bokach myszy 
	<ol>
		<li>Wymieszaj komórki z taką samą ilością macierzy błony podstawnej. Na przykład dodać 1 x 106 komórek w 50 μl PBS do 50 μl matrycy błony podstawnej (patrz tabela materiałów) i delikatnie wymieszać. 
		Nuta:</li>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl próbki (komórki w PBS + matryca błony podstawnej) podskórnie w lewy bok 6-tygodniowych myszy z niedoborem odporności BALB/c nu/nu za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 27G 1/2'' (0,4x13 mm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie antagomiR donowotworowe. 
	<ol>
		<li>Zawiesić antagomiR (patrz tabela materiałów) lub kontrolę ujemną w 500 μl wody destylowanej wolnej od RNaz.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy przygotować 2 nmol antagomiR lub próbki kontrolnej wraz z odczynnikiem do dostarczania in vivo (patrz tabela materiałów) do każdego wstrzyknięcia.
		<ol>
			<li>Najpierw wymieszać roztwór antagomiR (patrz tabela materiałów) i bufor kompleksujący (patrz tabela materiałów) w stosunku 1:1. Na przykład dodać 80 μl roztworu inhibitora miRNA (16 nmol) do 80 μl buforu kompleksującego (zawartego w zestawie odczynników do dostarczania in vivo, patrz tabela materiałów).</li>
			<li>Doprowadź odczynnik do dostarczania in vivo do temperatury pokojowej. Dodać 160 μl do probówki o pojemności 1,5 ml i natychmiast dodać 160 μl rozcieńczonego roztworu antagomiR. Przywrócić pozostały odczynnik do temperatury -20 °C. W razie potrzeby odczynnik należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia po rozmrożeniu.</li>
			<li>Natychmiast (10 s) przeprowadzić wirowanie, aby zapewnić kompleksowanie odczynnika do dostarczania in vivo-antagomiR.</li>
			<li>Inkubować mieszaninę odczynnika do dostarczania in vivo i antagomiR przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Krótko odwirować probówkę w celu odzyskania próbki.</li>
			<li>Rozcieńczyć kompleks 6-krotnie, dodając 1360 μl PBS o pH 7,4 i dobrze wymieszać.</li>
			<li>Kontynuować podawanie in vivo kompleksu odczynnik-antagomiR (8 myszy/stan) lub przechowywać kompleks w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia przed wstrzyknięciem. Wstrzyknąć domięśniowo 200 μl domięśniowo do każdego guza (2 nmol antagomiR). 
			UWAGA: Objętość i ilość antagomiR jest niezależna od objętości guza.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zabieg wykonuj 3 razy w tygodniu (poniedziałek, środa i piątek) przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wzrostu guza
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 50 μl roztworu 40 mg/ml substratu D-lucyferyny (patrz tabela materiałów) podskórnie w każdym punkcie czasowym za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
		<ol>
			<li>Po 8 minutach od wstrzyknięcia znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z tlenem. Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i dostosuj podanie znieczulenia zgodnie z potrzebami, aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.</li>
			<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zobrazuj sygnał bioluminescencyjny za pomocą oprogramowania do obrazowania in vivo (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Suwmiarki mogą być również używane do pomiaru objętości guza i wzrostu guza.</li>
		<li>Po uzyskaniu sygnałów bioluminescencyjnych przeanalizuj wzrost guza, porównując oba zabiegi i określ znaczenie za pomocą testu t. Aby przeanalizować wariancję wewnątrz grupy, należy użyć SEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wycięcie guza
	<ol>
		<li>Siedem dni po zakończeniu leczenia antagomiR należy złożyć myszy w ofierze, wyciąć guz i wyekstrahować białko i/lub RNA do przyszłej analizy. Alternatywnie, należy przeciąć guzy i naprawić je do immunohistochemii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ortotopowa inokulacja komórek tarczycy i ogólnoustrojowe leczenie antagomiR
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Zaprojektuj linię komórkową ludzkiego raka tarczycy Cal62 w celu nadekspresji transgenicznego konstruktu, który konstytutywnie wyraża GFP i lucyferazy. Selekcjonować komórki transgeniczne na podstawie oporności na antybiotyki lub sortowania komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Hoduj te komórki w DMEM uzupełnionym antybiotykami (penicyliną i streptomycyną) i 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Zawiesić 1 x 105 komórek w 5 μl PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inokulacja komórek do tarczycy myszy
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 100 μl leku przeciwbólowego (buprenorfina) i 100 μl antybiotyku (cefalosporyna) podskórnie 7-tygodniowym myszom BALB/c nu/nu. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia alkoholem.</li>
		<li>Wstrzyknąć 5 μl roztworu komórkowego do tarczycy myszy.
		<ol>
			<li>Znieczulij mysz za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z tlenem i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym w sterylnej komorze przepływowej. Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca) i dostosuj podawanie znieczulenia zgodnie z potrzebami, aby utrzymać płaszczyznę operacyjną.</li>
			<li>Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. </li>
			<li>Dla każdej myszy zdezynfekuj szyję jodopowidonem i wykonaj nożyczkami nacięcie około 2 cm w skórze. Po otwarciu odsłoń szyję, przesuwając gruczoły ślinowe.</li>
			<li>Wypreparuj mięśnie paska za pomocą kleszczy preparacyjnych i/lub nożyczek, aby odsłonić tchawicę i tarczycę. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 μl w mikrolitrach wstrzyknąć 5 μl roztworu komórkowego do prawego zrazika tarczycy, znajdującego się z boku chrząstki sercowatej.</li>
			<li>Zmień położenie gruczołów ślinowych i zszyj nacięcie jedwabiem za pomocą plecionych, powlekanych, niewchłanialnych szwów.</li>
			<li>Dodaj jodopowidon do obszaru rany i umieść mysz na kocu termicznym, podczas gdy wraca do zdrowia po znieczuleniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Następnego dnia po operacji wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy (buprenorfina) i dodać 3 ml płynnego ibuprofenu (40 mg/ml) do 250 ml wody do picia przez 1 tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogólnoustrojowe leczenie antagomiR 
	UWAGA: Wykonaj ten krok 2-3 tygodnie po wstrzyknięciu komórki, gdy sygnał bioluminescencyjny jest wykrywalny.
	<ol>
		<li>Zawiesić antagomiR lub kontrolę ujemną w destylowanej wodzie wolnej od RNaz.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy przygotować 7 nmol antagomiR lub próbki kontrolnej wraz z odczynnikiem do podawania in vivo do każdego wstrzyknięcia.
		<ol>
			<li>W przypadku preparatu antagomiR i roztworu odczynnika do dostarczania in vivo, patrz krok 1.3, ale dodać 7 nmol inhibitora miRNA na mysz.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Roztwór należy podawać dożylnie przez wstrzyknięcie zaoczodołowe do zatoki żylnej myszy. Użyj izofluranu do wywołania znieczulenia. 
		UWAGA: Oceń poziom znieczulenia za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca</li>).
		<li>Traktuj myszy 3 razy w tygodniu (poniedziałek, środę i piątek) przez 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wzrostu guza
	<ol>
		<li>Określ sygnał bioluminescencyjny guza dwa razy w tygodniu, aby obliczyć wzrost guza.
		<ol>
			<li>Wstrzyknąć 50 μl roztworu 40 mg/ml substratu D-lucyferyny w każdym punkcie czasowym poprzez wstrzyknięcie podskórne.</li>
			<li>Po 8 minutach od wstrzyknięcia znieczulij myszy za pomocą 3% izofluranu zmieszanego z tlenem i zobrazuj sygnał bioluminescencyjny za pomocą oprogramowania do obrazowania in vivo.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po uzyskaniu sygnałów bioluminescencyjnych przeanalizuj wzrost guza, porównując oba zabiegi i określ znaczenie za pomocą testu t. Aby przeanalizować wariancję wewnątrz grupy, należy użyć SEM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wycięcie guza
	<ol>
		<li>Siedem dni po zakończeniu okresu leczenia antagomiR należy złożyć myszy w ofierze, wyciąć guz i wyekstrahować białko i/lub RNA do przyszłej analizy. Alternatywnie, należy przeciąć guzy i naprawić je do immunohistochemii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+Thyroid+Cancer+Incidence+and+Mortality+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).</li>
<li>Landa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+hallmarks+of+poorly+differentiated+and+anaplastic+thyroid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).</li>
<li>Gregory, R. I., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis and cancer.</a> Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).</li>
<li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li>
<li>Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as oncogenes.</a> Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Reserch Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+characterization+of+papillary+thyroid+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma.</a> Cell. 159 (3), 676-690 (2014).</li>
<li>Li, Z., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+microRNAs%3A+current+status+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).</li>
<li>Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+microRNA+expression+in+thyroid+neoplasias%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).</li>
<li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+thyroid+development%2C+function+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).</li>
<li>Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Deregulation+in+Anaplastic+Thyroid+Cancer+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 743450(2014).</li>
<li>Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+Tumours%3A+Advances+in+the+molecular+pathogenesis+of+thyroid+cancer%3A+lessons+from+the+cancer+genome%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome.</a> European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).</li>
<li>Riesco-Eizaguirre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-146b-3p%2FPAX8%2FNIS+Regulatory+Circuit+Modulates+the+Differentiation+Phenotype+and+Function+of+Thyroid+Cells+during+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis.</a> Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).</li>
<li>Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-146b-5p+upregulates+migration+and+invasion+of+different+Papillary+Thyroid+Carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 16, 108(2016).</li>
<li>Lee, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-222+and+microRNA-146b+are+tissue+and+circulating+biomarkers+of+recurrent+papillary+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer.</a> Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).</li>
<li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-146b-5p+promotes+metastasis+and+induces+epithelial-mesenchymal+transition+in+thyroid+cancer+by+targeting+ZNRF3.+Cellular+Physiology+and+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry.</a> International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).</li>
<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-146b+promotes+PI3K%2FAKT+pathway+hyperactivation+and+thyroid+cancer+progression+by+targeting+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN.</a> Oncogene. , (2018).</li>
<li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+microRNA+processing+by+DICER1+downregulation+endows+thyroid+cancer+with+increased+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness.</a> Oncogene. , In press (2019).</li>
<li>Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+and+mechanisms+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano metodę badania funkcji miRNA in vivo w celu lepszego zrozumienia jego roli w inicjacji i progresji nowotworu oraz jego potencjału jako celu terapeutycznego w raku tarczycy. Opisane tutaj modele ksenoprzeszczepów nowotworowych opierają się na wykorzystaniu komórek, które można śledzić za pomocą ich sygnału bioluminescencji, co pozwala na pomiar wzrostu guza in vivo pod wpływem leczenia. Ponadto opisujemy zastosowanie leczenia opartego na miRNA w przypadku raka tarczycy, który jest obecnie we wczesnym st...

Rak tarczycy jest nowotworem złośliwym endokrynnym, którego częstość występowania rośnie, chociaż ogólnie rzecz biorąc, daje dobre wyniki1. Niemniej jednak u niektórych pacjentów rozwijają się agresywne formy choroby, które są nieuleczalne, a podstawy molekularne są słabo poznane2.
miRNA to 22-nukleotydowe niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów w wielu tkankach, zazwyczaj poprzez wiązanie par zasad z nietranslacyjnym regionem 3' (3'UTR) docelowych informacyjnych RNA (mRNA), wywołując degradację mRNA lub represję translacyjną3,4. Istnieje coraz więcej dowodów wskazujących na to, że deregulacja ekspresji mikroRNA jest cechą charakterystyczną raka, ponieważ cząsteczki te modulują sygnalizację proliferacyjną, migrację, inwazję i przerzuty oraz mogą zapewniać odporność na apoptozę5,6. W ostatnich latach wiele badań zidentyfikowało miRNA jako potencjalne biomarkery do diagnozowania i prognozowania raka, a także cele terapeutyczne7, zapewniając nowy wymiar oceny i leczenia raka.
miRNA zajęły centralne miejsce w ludzkiej onkologii molekularnej jako kluczowe czynniki powodujące nowotwory tarczycy u ludzi8,9,10,11,12. Wśród miRNA regulowanych w górę, miR-146b ulega silnej nadekspresji w guzach raka brodawkowatego tarczycy (PTC) i wykazano, że znacznie zwiększa proliferację komórek oraz wiąże się z agresywnością i ponurym rokowaniem6,12,13,14,15. Ponadto miR-146b reguluje kilka genów tarczycy zaangażowanych w różnicowanie12, a także ważne geny supresorowe nowotworów, takie jak PTEN16 i DICER117. Pomimo ich znaczenia w biologii nowotworów, terapia przeciwnowotworowa oparta na miRNA jest wciąż na wczesnym etapie i bardzo niewiele badań dotyczyło raka tarczycy - najczęstszego z nowotworów endokrynnych18. Tutaj opisujemy protokół wykorzystujący dwa różne modele myszy z nowotworami pochodzenia ludzkiego, w którym podanie syntetycznego inhibitora miRNA (antagomiR), który specyficznie hamuje komórkowe miRNA, może blokować wzrost guza. Najpierw użyliśmy powszechnego modelu ksenoprzeszczepu, a miejscowe podanie antagomiR do guza zmniejszyło wzrost guza mierzone jako zmniejszenie bioluminescencji guza16. Ponieważ stworzenie solidnych modeli mysich naśladujących progresję ludzkiego nowotworu jest niezbędne do opracowania unikalnych podejść terapeutycznych, ortotopowa implantacja pierwotnych guzów ludzkich jest bardziej wartościową platformą do klinicznej walidacji nowych leków niż modele implantacji podskórnej. W związku z tym, aby lepiej ocenić potencjał terapeutyczny antagomiR, zastosowaliśmy ortotopowy model myszy z ogólnoustrojowym podawaniem do krwiobiegu, uzyskując te same wyniki.

<table><tbody><tr><td>AntagomiR: inhibitor miRNA mirVana</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464088</td><td>In Vivo Ready</td></tr><tr><td>Podstawna matryca membranowa: Matrigel Basement Membrane Matrix Przeciwciało o wysokim stężeniu</td><td>Corning</td><td>#354248</td><td></td></tr><tr><td>DICER</td><td>Abcam</td><td>ab14601</td><td>IHQ: 1/100</td></tr><tr><td>In vivo odczynnik dostarczający: Odczynnik Invivofectamine 3.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>IVF3005</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania In vivo: IVIS-Lumina II Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrola negatywna: inhibitor miRNA mirVana, kontrola negatywna #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464077</td><td>Przeciwciało PCNA gotowe do in vivo</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab92552</td><td>WB: 1/2,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało PTEN</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7974</td><td>WB: 1/1,000</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - Sól K+ Podłoże bioluminescencyjne</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>rozcieńczony w PBS</td></tr></tbody></table>

hamowanie in vivo mikrorna w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MikroRNA (miRNA) są ważnymi regulatorami ekspresji genów dzięki swojej zdolności do destabilizacji mRNA i hamowania translacji docelowych mRNA. Coraz większa liczba badań identyfikuje miRNA jako potencjalne biomarkery do diagnozowania i prognozowania raka, a także jako cele terapeutyczne, dodając dodatkowy wymiar do oceny i leczenia raka. W kontekście raka tarczycy nowotworzenie wynika nie tylko z mutacji w ważnych genach, ale także z nadekspresji wielu miRNA. W związku z tym rola miRNA w kontroli ekspresji genów tarczycy ewoluuje jako ważny mechanizm w raku. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół badania skutków dostarczania inhibitora miRNA jako metody terapeutycznej w raku tarczycy przy użyciu ksenoprzeszczepu ludzkiego guza i ortotopowych modeli mysich. Po zmodyfikowaniu stabilnych komórek nowotworowych tarczycy eksprymujących GFP i lucyferazę, komórki są wstrzykiwane nagim myszom w celu rozwinięcia guzów, po których może nastąpić bioluminescencja. Hamowanie miRNA in vivo może zmniejszyć wzrost guza i zwiększyć cele genów miRNA. Metoda ta może być stosowana do oceny znaczenia oznaczonego miRNA in vivo, a także do identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

W celu ustalenia, czy neutralizacja miRNA może hamować wzrost guza, wykorzystaliśmy dwa różne modele mysie. W związku z tym ludzkie komórki raka tarczycy Cal62-luc wstrzykiwano podskórnie w okolice boków myszy nago, aby stworzyć model ksenoprzeszczepu. Po dwóch tygodniach guzy rozwinęły się i można je było zmierzyć za pomocą suwmiarki. W tym punkcie czasowym myszom wstrzyknięto wewnątrzguzowo inhibitor miR-146b lub odpowiednią kontrolę, a objętość guza monitorowano przez kolejne dwa tygodnie (Rycyna ...

Ten protokół opisuje mysie modele ksenoprzeszczepu i ortotopowego nowotworu ludzkiej tarczycy jako platformę do testowania terapii inhibitorami opartymi na mikroRNA. Takie podejście idealnie nadaje się do badania funkcji niekodujących RNA i ich potencjału jako nowych celów terapeutycznych.

Hamowanie in vivo mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Przeprowadzamy pierwszą terapię, opartą na inhibitorze mikroRNA w modelu raka tarczycy. Te rozwijające się terapie są obiecujące w leczeniu tej choroby. Ten rodzaj modelu ortotopowego, wykorzystujący systemową drogę dostarczania leczenia, ułatwia walidację nowych leków opartych na mikroRNA.Chociaż używamy modelu ortotopowego do wszczepiania ludzkich komórek raka tarczycy do tarczycy myszy, wszystkie te modele mogą być ogólnoustrojowe dla innych typów raka. Zabieg zademonstruje wraz z Julią Ramirez-Moyą i Adrianem Acuną Raquel Arocha Riesco. Jest technikiem z naszego instytutu.Po ustanowieniu niekompletnej pożywki dla linii komórkowej ludzkiego raka tarczycy CAL-62, zawiesić 1 razy 10 do 6 podwielokrotności komórek w 50 mikrolitrach PBS w temperaturze 4 stopni Celsjusza i wymieszać komórki z równą objętością macierzy błony podstawnej. Załaduj komórki do 1-mililitrowej strzykawki, wyposażonej w półcalową igłę o grubości 27 g i podskórnie wstrzyknij 100 mikrolitrów próbki w lewą flankę 6-tygodniowej myszy z niedoborem odporności C nago. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu dodać antagomiR lub kontrolowany roztwór buforowy do 160 mikrolitrów odczynnika do dostarczania in vivo o temperaturze pokojowej w probówce o pojemności 1 punktu 5 mililitrów.I natychmiast wiruj roztwór przez 10 sekund, aby zapewnić kompleksowanie mieszaniny. Inkubować roztwór do zabiegu przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie krótko odwirować w mikrowirówce. Następnie rozcieńczyć osadzony kompleks zabiegowy sześciokrotnie świeżym PBS i dokładnie wymieszać.I wstrzyknąć całą objętość 200 mikrolitrów leku bezpośrednio do guza. Wstrzyknąć 50 mikrolitrów 40 miligramów na litr roztworu substratu D-Lucyferyny podskórnie 2 razy w tygodniu, każdemu zwierzęciu doświadczalnemu. Upewnij się, że potwierdzasz brak reakcji na szczypanie palca u nogi po znieczuleniu izofluranem.Umieść zwierzę w komorze systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo i zobrazuj sygnał bioluminescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania in vivo zgodnie ze standardowymi protokołami. Następnie przeanalizuj wzrost guza. Porównanie obu zabiegów i określenie istotności i różnic we wzroście za pomocą testu T.W przypadku ortotopowej inokulacji komórek nowotworu tarczycy zawiesić podwielokrotność komórek CAL-62 w 5 mikrolitrach PBS i podskórnie wstrzyknąć 100 mikrolitrów środka przeciwbólowego i 100 mikrolitrów antybiotyku do 7-tygodniowej myszy z zaworem C. Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi należy umieścić zwierzę pod mikroskopem preparacyjnym i zdezynfekować szyję zwierzęcia jodopowidonem. Następnie wykonaj około 2-centymetrowe nacięcie w skórze i przesuń żołądź ślinową, aby odsłonić szyję.Użyj kleszczy preparacyjnych i/lub nożyczek, aby wyciąć mięśnie paska, aby odsłonić tchawicę i tarczycę, a następnie użyj strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów, aby wstrzyknąć 5 mikrolitrów objętości komórek nowotworowych do prawego płata tarczycy, znajdującego się z boku chrząstki sercowej. Kiedy wszystkie komórki zostaną dostarczone, zmień położenie żołędzi ślinowej i użyj jedwabnych plecionych, pokrytych, niewchłanialnych szwów, aby zamknąć nacięcie. Następnie nałóż jodopowidon na obszar rany i umieść mysz na kocu termicznym z monitorowaniem aż do pełnego wyzdrowienia.Dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu do komórek tarczycy należy przygotować roztwór leczniczy, jak pokazano, i dostarczyć roztwór dożylnie przez wstrzyknięcie zaoczodołowe do zatoki żylnej znieczulonego zwierzęcia z guzem tarczycy. W tym reprezentatywnym eksperymencie wzrost guzów wstrzykniętych domięśniowo bez inhibitora mikroRNA 146B został znacznie zahamowany w stosunku do kontroli negatywnej. Wewnątrznowotworowe poziomy ekspresji niektórych markerów proliferacji obserwowano również na niskich poziomach w guzach leczonych antagomiR, w porównaniu z guzami kontrolnymi.Ponadto odzyskiwanie celów mikro-RNA można badać poprzez analizę RNA lub białka wyekstrahowanego z guza. Podsumowując, hamowanie in vivo poszczególnych mikro RNA jest skuteczne i może być wykorzystane terapeutycznie w leczeniu raka tarczycy. Analiza histologiczna guzów tarczycy ustalonych u myszy, jak wykazano, umożliwia barwienie komórek nabłonkowych otaczających guz, ujawniając architekturę pęcherzyków tarczycowych w tkance nowotworowej.Warto zauważyć, że dożylne wstrzyknięcie inhibitora mikroRNA 146B myszom z ustalonym guzem powoduje znaczne zmniejszenie objętości guza w porównaniu ze zwierzętami leczonymi kontrolnie. Co więcej, ekspresja nowo opisanego mikroRNA 146B docelowego DICER1 w guzie pierwotnym wzrasta po leczeniu anty mikro-RNA 146B, co dodatkowo podkreśla potencjał hamowania ekspresji indogennego mikro-RNA, a tym samym przywrócenia genów docelowych jako terapii w raku tarczycy. Ta technika i późniejsze wyniki badania warg otwierają możliwość zbadania nowych terapii opartych na nieutwardzalnym RNA w leczeniu raka tarczycy.

in-vivo-inhibition-of-microrna-to-decrease-tumor-growth-in-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

Ten film pokazuje dostarczanie in vivo inhibitorów miRNA jako środków terapeutycznych przeciwko wzrostowi guza w ortotopowych modelach mysich. Donowotworowe podawanie syntetycznych inhibitorów miRNA lub antagomiR pozwala im wiązać i hamować endogenne miRNA, powodując w ten sposób regulację mRNA w górę i zahamowanie wzrostu guza.

Modelowanie leczenia wewnątrznowotworowego inhibitorami miRNA: metoda analizy wpływu inhibitorów miRNA na wzrost guza w modelu mysim

Ten film opisuje procedurę ortotopowej inokulacji komórek raka tarczycy do tarczycy mysich modeli, które mogą następnie służyć jako cenna platforma do oceny kancerogenezy i odkrywania potencjalnych strategii leczenia.

Ortotopowa inokulacja komórek raka tarczycy do mysiej tarczycy: procedura ustalania ortotopowego modelu myszy raka tarczycy

Hamowanie mikroRNA specyficzne dla tkanek to technologia, która jest słabo rozwinięta w dziedzinie mikroRNA. W tym artykule opisujemy protokół skutecznego hamowania rodziny mikroRNA miR-181 w komórkach mioblastów z serca. Technologia nanowektorowa jest wykorzystywana do dostarczania gąbki mikroRNA, która wykazuje znaczące inhibicję rodziny miR-181 specyficznej dla układu krążenia in vivo.

In vivo (in vivo) Nanowektorowe dostarczanie gąbki mikroRNA specyficznej dla serca

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Ten protokół wykorzystuje opartą na sondzie reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), test sulforodaminy B (SRB), klonowanie 3' nietranslowanych regionów (3' UTR) oraz test lucyferazy w celu weryfikacji docelowych genów interesującego miRNA i zrozumienia funkcji miRNA.

Protokół in vitro do oceny poziomów, funkcji i powiązanych genów docelowych w komórkach nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Rezonans paramagnetyczny elektronów o niskim polu (pasmo L, 1,2 GHz) przy użyciu rozpuszczalnych sond nitroksylowych i trytylowych jest demonstrowany do oceny fizjologicznie ważnych parametrów w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi.

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

Poznaj metodę hamowania mikroRNA w modelu raka tarczycy u myszy. Technika obejmuje iniekcję ortotopową komórek nowotworowych i systemowe podawanie inhibitorów. Umożliwia walidację nowych terapii przeciwnowotworowych opartych na mikroRNA.

Hamowanie in vivo mikroRNA w celu zmniejszenia wzrostu guza u myszy

Przeglądaj więcej filmów