Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego
May 13th, 2019
Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.
Test mikrojądrowy oparty na strumieniu obrazu może przezwyciężyć kilka ograniczeń metod, takich jak zautomatyzowana mikroskopia i konwencjonalna cytometria przepływowa, w tym niską przepustowość i brak wizualnego potwierdzenia zdarzeń. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie zdarzenia wymagane do określenia genotoksyczności i cytotoksyczności mogą być automatycznie obrazowane, identyfikowane i oceniane bez konieczności tworzenia szkiełek mikroskopowych. W przypadku narażenia komórek na klastogeny i/lub aneugeny, dodać jeden milimetr substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania do siedmiu do ośmiu razy 10 do piątej komórki doświadczalnej w dziewięciu mililitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych w kolbie T25 i jeden mililitr wody do kultur kontrolnych.
Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez trzy godziny przed przeniesieniem komórek do jednej 15-mililitrowej probówki polipropylenowej na kolbę. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej na probówkę do wysiewu w nowych kolbach hodowlanych T25. Następnie dodać 150 mikrolitrów podstawowego stężenia cytochalazyny B do każdej kolby, aby uzyskać końcowe stężenie trzech mikrogramów na mililitr.
Zwróć kolby do inkubatora na czas rekonwalescencji równy 1,5 do dwóch razy podwojenia, zgodnie z zaleceniami wytycznych Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. Pod koniec okresu rekonwalescencji przenieść kultury do pojedynczych 15-mililitrowych probówek polipropylenowych do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach 75-milimolowego chlorku potasu. Delikatnie wymieszać przez odwrócenie trzy razy i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem minut.
Pod koniec inkubacji dodać dwa mililitry czteroprocentowej formaliny do każdej próbki i delikatnie wymieszać z trzema inwersjami. Przywrócić próbki do czterech stopni Celsjusza na 10 minut przed zebraniem komórek przez odwirowanie. Ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach świeżej czteroprocentowej formaliny na 20 minut.
Pod koniec inkubacji przemyć utrwalone komórki w pięciu mililitrach buforu do przemywania na probówkę przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach buforu do przemywania na probówkę. Następnie przenieś próbki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych w celu zliczenia na hemocytometrze. Dodaj pięć mikrolitrów po 100 mikrogramów na mililitr Hoechst 33342 na 1,0 x 10 do sześciu komórek na mililitr i 10 mikrolitrów po 500 mikrogramów na mililitr RNazy na 100 mikrolitrów próbki na probówkę.
Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla, odwirować próbki w mikrowirówce i usunąć z każdej probówki tylko 30 mikrolitrów supernatantu. Następnie ostrożnie ponownie zawiesić próbki, uważając, aby nie wywołać tworzenia się pęcherzyków. Jeśli po ponownym zamieszaniu pojawią się pęcherzyki, delikatnie przesuń tubkę, aby je usunąć.
Aby uruchomić próbki za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, najpierw włącz laser 405 nanometrów i ustaw moc lasera na 10 miliwatów. Wyłącz wszystkie inne lasery, w tym boczny laser rozpraszający, i ustaw jasne pole na kanały pierwszy i dziewiąty. Upewnij się, że suwak powiększenia jest ustawiony na 60x, że wybrany jest tryb wysokiej czułości i że w galerii obrazów wyświetlane są tylko kanały pierwszy, siódmy i dziewiąty.
Kliknij wykres punktowy i wybierz całą populację i obszar M01 na osi X. Wybierz współczynnik proporcji M01 na osi Y i kliknij kwadratowy region, aby narysować region wokół pojedynczych komórek. Nazwij ten region pojedynczymi komórkami i kliknij prawym przyciskiem myszy wykres, aby wybrać regiony.
Podświetl obszar pojedynczych komórek i zmień współrzędne X na 100 i 900, a współrzędne Y na 0,75 i jeden. Ustaw parametry pobierania i określ nazwę pliku oraz folder docelowy. Następnie zmień liczbę zdarzeń na 20 000, wybierz populację DNA dodatniego i uruchom pierwszą próbkę.
Aby otworzyć plik danych w programie IDEAS, kliknij przycisk Rozpocznij analizę, aby uruchomić Kreatora otwierania pliku, a następnie przejdź do żądanego pliku obrazu RAW. Następnie kliknij przycisk Dalej i wyszukaj komórkę dwujądrową w galerii obrazów. Aby utworzyć maskę, kliknij, aby wybrać interesujący Cię obraz i otwórz kartę analizy.
Kliknij opcję Maski, Nowy i Funkcja, aby wybrać opcję LevelSet. W obszarze Maska wybierz M07 i Maska średniego poziomu, a następnie ustaw skalę szczegółów konturu na trzy. Następnie kliknij przycisk OK dwa razy.
Aby zliczyć punktowo cechy komórek dwujądrowych, otwórz kartę Analiza i wybierz Funkcje i Nowy. W polu Typ elementu wybierz opcję Liczba punktów punktowych. W polu Maska wybierz końcową maskę dwujądrową i ustaw łączność na cztery, a następnie zmień nazwę na Spot Count BNC i kliknij przycisk OK i zamknij, aby obliczyć wartości funkcji.
W przypadku histogramu komórek dwujądrowych z liczbą punktową kliknij histogram i wybierz opcję nieapoptopową jako populację nadrzędną. Dla funkcji osi X wybierz Spot Count BNC i kliknij OK i region liniowy, a następnie narysuj region w poprzek Bim Two i nazwij ten region 2N. Aby utworzyć maskę mikrojądrową, wybierz komórkę dwujądrową, która zawiera mikrojądro z galerii obrazów, a następnie otwórz maski na karcie Analiza.
Aby utworzyć maskę identyfikacyjną punktu, kliknij Nowy i Funkcja, a następnie wybierz opcję Punktowa. Upewnij się, że wybrano przycisk radiowy Jasny, a następnie wybierz M07 pod maską. Ustaw Stosunek miejsca do tła komórki i Minimalny promień na dwa, a Maksymalny promień na sześć.
Kliknij przycisk OK i OK, aby dodać maskę do listy po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk Nowa, aby utworzyć kolejną maskę. Kliknij maskę Spot M07 Channel seven Bright two six two i kliknij strzałkę w dół, aby dodać ją do definicji maski, a następnie kliknij operatory And i Not. Kliknij strzałkę w dół, aby dodać maskę rozszerzonego zakresu do definicji maski.
Aby utworzyć maskę populacji polijądrowej, kliknij opcje Analiza, Maski, Nowy i Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz pozycję Zakres. W obszarze Maska wybierz opcję Watershed Dilate Set M07 Channel07, Middle, three, two i ustaw obraz do wyświetlenia na Channel 07.
Ustaw minimalne i maksymalne wartości obszaru odpowiednio na 135 i 5000, a minimalne i maksymalne wartości współczynnika proporcji ustaw odpowiednio na 0,4 i jeden. Kliknij przycisk OK i w polu nazwy zmień tekst na odczytany Maska POLY, a następnie kliknij przycisk OK i Zamknij. Aby utworzyć widok niestandardowy, kliknij przycisk Właściwości galerii obrazów, otwórz kartę Kompozyty i kliknij przycisk Nowy.
W obszarze Nazwa wprowadź Kanał 01 do Kanał 07. Kliknij przycisk Dodaj obraz, a następnie w obszarze Obraz wybierz opcję Kanał 01 i ustaw wartość procentową na 100. Kliknij ponownie przycisk Dodaj obraz, a następnie w obszarze obraz wybierz Kanał 07 i ustaw wartość procentową na 100.
Kliknij kartę Widok, kliknij przycisk Nowy, a następnie w polu Nazwa wprowadź maski BNC i MN. Następnie kliknij pozycję Dodaj kolumnę, a następnie w obszarze Typ obrazu wybierz opcję Kanał 01, a następnie w obszarze Maska wybierz opcję Brak. Kliknij pozycję Dodaj kolumnę, a następnie w obszarze Typ obrazu wybierz opcję Kanał 07, a następnie w obszarze Maska wybierz opcję Brak.
Kliknij przycisk Dodaj kolumnę, kliknij przycisk radiowy Kompozyt, a następnie kliknij przycisk OK, aby zakończyć tworzenie widoku niestandardowego. Kliknij menu rozwijane Widok, a następnie kliknij widok masek BNC i MN. Kliknij przycisk Pokaż maski ukrywania.
Aby wyliczyć kluczowe zdarzenia, otwórz kartę Raporty i kliknij przycisk Zdefiniuj raport statystyczny, a następnie w nowym oknie kliknij przycisk Dodaj kolumny. Aby dodać statystykę liczby komórek dwujądrowych, w obszarze Statystyka wybierz pozycję Liczba, a następnie w obszarze Wybrana populacja wybierz populację BNC, a następnie kliknij przycisk Dodaj statystyki, aby dodać statystykę do listy i zapisać szablon. Po dodaniu wszystkich statystyk do listy kliknij przycisk Zamknij, a następnie kliknij przycisk OK, a następnie zapisz szablon analizy danych.
Aby przetworzyć wsadowo pliki eksperymentalne, w menu Narzędzia kliknij polecenie Pliki danych wsadowych, a następnie kliknij polecenie Dodaj partię w nowym oknie. Kliknij przycisk Dodaj pliki, aby wybrać pliki eksperymentu, które mają zostać dodane do partii, a następnie kliknij przycisk Otwórz folder w obszarze Wybierz szablon lub plik analizy danych. Przejdź do szablonu, który został właśnie zapisany, i otwórz go.
Kliknij przycisk OK, aby zamknąć bieżące okno. Następnie kliknij przycisk Prześlij partie, aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe wszystkich plików. W tym miejscu pokazano cztery wybrane panele do identyfikacji komórek dwujądrowych.
Te dwuwymiarowe wykresy i histogramy umożliwiają selekcję komórek dwujądrowych, a także identyfikację tych komórek, które mają dwa jądra o podobnej okrągłości, obszarach i intensywności oraz które są dobrze oddzielone od siebie. Obrazy Brightfield i Hoechst, a także dwujądrowe maski komórkowe i mikrojądrowe, ułatwiają identyfikację i liczenie komórek dwujądrowych i mikrojąder. Zastosowanie funkcji zliczania punktowego wykorzystuje maskę polijądrową do identyfikacji komórek jednojądrowych, trójjądrowych i czworojądrowych.
Liczba komórek trój- i czterojądrzastych może być następnie zsumowana w celu uzyskania ostatecznej liczby komórek wielojądrowych wymaganych do obliczenia cytotoksyczności. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne wartości genotoksyczności i cytotoksyczności dla endogenu kolchicyny, klastogenu mitomycyny C i kontroli ujemnej, mannitolu, w celu wykazania ważności protokołu. Znakowanie komórek odpowiednim stężeniem barwienia DNA ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej jakości przechwytywania obrazu, co pozwala na łatwą identyfikację i ocenę wszystkich kluczowych zdarzeń.
Techniki te mają również zastosowanie do testu mikrojądrowego do biodozymetrii promieniowania, który umożliwia oszacowanie dawki u osób, które mogły być narażone na promieniowanie.
Przegląd
Oparty na przepływie obrazów test mikrojąder oferuje w pełni zautomatyzowane podejście do oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, rozwiązując ograniczenia tradycyjnych metod. Ten protokół wykorzystuje wielospektralną cytometrię przepływową z obrazowaniem, aby zwiększyć przepustowość i zmniejszyć subiektywność w ocenie.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Ocena genotoksyczności
- Ocena cytotoksyczności
- Zautomatyzowane techniki obrazowania
Tło
- Tradycyjne testy mikrojąder opierają się na manualnym mikroskopowaniu, które jest pracochłonne i subiektywne.
- Zautomatyzowane mikroskopy i konwencjonalna cytometria przepływowa mają ograniczenia w przepustowości i potwierdzeniu wizualnym.
- Wielospektralna cytometria przepływowa z obrazowaniem może zautomatyzować obrazowanie i ocenę mikrojąder.
- To badanie prezentuje szczegółowy protokół implementacji tego zautomatyzowanego testu.
Cel badania
- Opracowanie w pełni zautomatyzowanego protokołu testu mikrojąder.
- Poprawa dokładności i efektywności ocen genotoksyczności i cytotoksyczności.
- Minimalizacja różnic w ocenie mikrojąder między oceniającymi.
Zastosowane metody
- Ekspozycja komórek na klastogeny i/lub aneugeny, po której następuje inkubacja i regeneracja.
- Zastosowanie cytochalazyny B w celu ułatwienia testu.
- Wielospektralna cytometria przepływowa z obrazowaniem do zautomatyzowanego obrazowania i oceny.
- Stworzenie masek do identyfikacji dwujadrowych komórek i mikrojąder.
Główne wyniki
- Udana automatyzacja testu mikrojąder za pomocą cytometrii przepływowej z obrazowaniem.
- Poprawa przepustowości i zmniejszenie subiektywności w ocenie.
- Wszystkie wymagane zdarzenia do określenia genotoksyczności i cytotoksyczności były automatycznie obrazowywane i oceniane.
- Protokół wykazał się powtarzalnością i niezawodnością wyników.
Wnioski
- Zautomatyzowany test mikrojąder jest opłacalną alternatywą dla tradycyjnych metod.
- To podejście poprawia efektywność badań genotoksyczności i cytotoksyczności.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować wysokoszybkie przesiewowe badania w rozwoju leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automated genotoxicity assessment using multispectral imaging flow cytometry addresses critical bottlenecks in early safety testing by eliminating scorer subjectivity and enabling high-throughput, reproducible data generation. This capability supports predictive de-risking of lead compounds by providing quantitative, image-verified micronucleus frequency data essential for go/no-go decisions in preclinical development. The method enhances translational continuity by delivering standardized, auditable outputs that align with regulatory expectations for mechanistic biomarker validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of clastogenic and aneugenic pathways through automated detection of micronuclei in binucleated cells.
- Operational Value: Reduces inter-scorer variability and labor-intensive manual microscopy, increasing assay reproducibility across discovery teams.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of DNA damage mechanisms by providing statistically significant micronucleus frequency data at varying cytotoxicity levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates image-verified, dose-responsive micronucleus and cytotoxicity readouts suitable for assay standardization.
- Operational Value: Enables batch processing of 20,000 events per sample with automated feature extraction, improving throughput and data consistency.
- Platform Reuse: Stores all imagery in dose-specific files, facilitating retrospective analysis and cross-study comparison in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers quantitative genotoxicity metrics that align with preclinical safety assessment requirements for lead optimization.
- Operational Value: Provides reproducible, automated scoring of binucleated cells with and without micronuclei, supporting continuity from discovery to IND-enabling studies.
- Risk Mitigation: Enables detection of statistically significant micronucleus increases at sub-lethal cytotoxicity levels, improving early identification of genotoxic liabilities.
Pipeline & Workflow Integration
The automated micronucleus assay integrates into the discovery continuum from early mechanistic interrogation through lead identification to preclinical safety evaluation, providing image-based genotoxicity data that informs compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification of DNA damage mechanisms by enabling automated identification of micronuclei in fixed, stained cell populations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized mask-based identification of binucleated cells and micronuclei, ensuring reproducible event enumeration.
- Analytics: Provides quantitative outputs including micronucleus frequency, cytotoxic index, and polynucleated cell counts, facilitating comparative analysis across test conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating auditable, image-stored data suitable for regulatory submission and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging flow cytometry capability for genotoxicity screening across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in genotoxicity assessment through automated, image-verified scoring of micronuclei and cytotoxic endpoints.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated feature extraction and batch processing of imaging flow cytometry data.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by delivering early, quantitative genotoxicity signals.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on statistically significant micronucleus frequency data relative to solvent controls.
Implementation Considerations
- Expertise in multispectral imaging flow cytometry operation, mask creation, and feature analysis using IDEAS software.
- Instrumentation requiring 405 nm laser excitation, high sensitivity mode, and specific channel configuration for Hoechst 33342 DNA staining.
- Cross-team standardization of analysis templates, mask definitions, and region settings to ensure consistent binucleated cell and micronucleus identification.
- Adaptation considerations include optimizing cytochalasin B concentration and recovery time based on cell line doubling characteristics.
- Practical limitations include the requirement for cell enlargement via hypotonic treatment and dependence on high-quality DNA staining for accurate nuclear segmentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Clastogen and/or Aneugen Exposure
1:49
Sample Processing
3:50
Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC)
5:15
Binucleated Cell (BNC) Identification
6:48
Micronucleus (MN) Identification
7:53
Polynucleated Population Identification
8:41
BNC and MN Mask Examination
9:52
Statistics Table Creation
10:31
Experimental File Batch Processing
11:10
Results: Representative Cell Scoring and Cytotoxicity Quantification
12:23
Conclusion
