Name: Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego. Ta technika zwiększa przepustowość i eliminuje subiektywność w ocenie genotoksyczności oraz cytotoksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Christine Probst (Luminex Corporation) za jej wysiłki w rozwijaniu poprzednich form szablonu analizy danych, a także dr Haley Pugsley (Luminex Corporation) i dr Philowi Morrisseyowi (Luminex Corporation) za przejrzenie i redakcję manuskryptu.

<ol><li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Fundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphocyte+Cytokinesis-Block+Micronucleus+Cytome+Assay+and+its+Application+in+Radiation+Biodosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry.</a> Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).</li>
<li>Hintzsche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+micronuclei+and+micronucleated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Reviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Fate of micronuclei and micronucleated cells.</a> Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+and+disadvantages+of+the+cytokinesis-block+micronucleus+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method.</a> Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HUman+MicroNucleus+Project+-+An+international+collaborative+study+on+the+use+of+the+micronucleus+technique+for+measuring+DNA+damage+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Fundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans.</a> Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).</li>
<li>Kirsch-Volders, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+working+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Report from the in vitro micronucleus assay working group.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).</li>
<li>OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , (2016).</li>
<li>Aardema, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+III.+Using+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).</li>
<li>Clare, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+II.+Using+human+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).</li>
<li>Lorge, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+I.+General+conditions+and+overall+conclusions+of+the+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).</li>
<li>Oliver, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+V.+Using+L5178Y+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).</li>
<li>Wakata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SFTG+international+collaborative+study+on+in+vitro+micronucleus+test.+IV.+Using+CHL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes%3A+Results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li>
<li>Decordier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+cytokinesis-blocked+micronuclei%3A+an+adapted+protocol+and+a+validated+scoring+procedure+for+biomonitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring.</a> Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).</li>
<li>Decordier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+micronuclei+by+IMSTAR+for+biomonitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring.</a> Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).</li>
<li>Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+automated+cytogenetic+imaging%3A+unattended+scoring+of+dicentric+chromosomes%2C+micronuclei%2C+single+cell+gel+electrophoresis%2C+and+fluorescence+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals.</a> Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).</li>
<li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li>
<li>Nüsse, M., Marx, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+micronuclei+in+cell+cultures+and+human+lymphocytes%3A+Advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).</li>
<li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry%3A+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li>
<li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).</li>
<li>Bryce, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+96-well+microplate-based+in+vitro+micronucleus+assay+with+human+TK6+cells%3A+Protocol+optimization+and+transferability+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test%3A+to+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBasiji%2C+DA+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 1389, 13-21 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+radiation+biodosimetry+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+and+Environmental+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parameter+dose+estimations+in+radiation+biodosimetry+using+the+automated+cytokinesis-block+micronucleus+assay+with+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+for+high+throughput+radiation+biodosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry.</a> Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+automated+data+analysis+for+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+for+high+throughput+radiation+biodosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry.</a> Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+an+optimized+imaging+flow+cytometry+analysis+template+on+sample+throughput+in+the+reduced+culture+cytokinesis-block+micronucleus+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Protection+Dosimetry%22%5BJournal%5D)">The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay.</a> Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Triage+Radiation+Biodosimetry%3A+Integrating+Imaging+Flow+Cytometry+with+High-Throughput+Robotics+to+Perform+the+Cytokinesis-Block+Micronucleus+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay.</a> Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+Of+The+In+vitro+Micronucleus+Assay+Using+The+ImageStream%C2%AE+Imaging+Flow+Cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer.</a> Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).</li>
<li>Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+complete+automated+scoring+of+the+cytokinesis+block+micronucleus+cytome+assay+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project%3A+Detailed+description+of+the+scoring+criteria+for+the+cytokinesis-block+micronucleus+assay+using+isolated+human+lymphocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research+-+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures.</a> Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+automated+MicroFlow%C2%AE+and+Metafer%E2%84%A2+platforms+for+high-throughput+micronucleus+scoring+and+dose+response+analysis+in+human+lymphoblastoid+TK6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells.</a> Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).</li>
<li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project+initiative+and+review+of+validation%2C+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hygiene+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li>
<li>Kirkland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+recommended+lists+of+genotoxic+and+non-genotoxic+chemicals+for+assessment+of+the+performance+of+new+or+improved+genotoxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+FlowSight%C2%AE+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li>
</ol>

Autor jest zatrudniony przez firmę Luminex Corporation, producenta cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego ImageStream, który został wykorzystany w tej pracy.

W niedawnej publikacji Verma i in. podkreślili znaczenie opracowania systemu, który łączy zalety cytometrii przepływowej o wysokiej przepustowości z korzyściami płynącymi z analizy obrazu i przechowywania danych35. Test MIFC in vitro MN opisany w tym artykule spełnia ten cytat i ma potencjał do przezwyciężenia wielu z wyżej wymienionych wyzwań w metodach mikroskopii i cytometrii przepływowej. Opisany tutaj protokół pokazuje, że zarówno cytotoksyczność, jak i genotoksyczność mogą być oceniane za pomocą MIFC. Przygotowanie próbki, barwienie komórkowe i zbieranie danych są proste, ale w protokole jest kilka krytycznych kroków, które zawsze powinny być wdrażane. Dodanie chlorku potasu (KCl) do komórek ma kluczowe znaczenie dla pęcznienia komórek, powodując separację między głównymi jądrami. Dzięki temu algorytm maskujący może zidentyfikować wszystkie pojedyncze jądra w komórkach BNC i POLY (komórkach POLY), co jest niezbędne do ich zliczenia. Dodatkowo KCL zapewnia separację między jądrami a MN, co jest niezbędne do dokładnego maskowania MN i oceny ilościowej. Co więcej, stosowanie formaliny po dodaniu KCl zapobiega lizie komórek podczas wirowania. Dodanie cytochalazyny B powoduje, że komórki TK6, które przeszły więcej niż jeden podział jądrowy, są dość duże. W rezultacie cytoplazma staje się krucha i może ulegać lizie, jeśli wirowanie zostanie przeprowadzone natychmiast po dodaniu KCl. Ponadto bardzo ważne jest, aby wprowadzić Hoechst do próbki zgodnie z liczbą komórek w próbce, a nie zgodnie ze stężeniem końcowym. Na przykład końcowe stężenie 10 μg/ml Hoechst równomiernie zabarwi próbkę 1 x 106 komórek, ale może nie zabarwić odpowiednio próbki zawierającej 5 x 106 komórek i może spowodować, że wiele komórek będzie miało słabo zabarwione jądra, co utrudni analizę. Ważne jest również, aby pamiętać, że Hoechst można zastąpić innym barwnikiem DNA, takim jak DAPI, jeśli MIFC jest wyposażony w laser wzbudzający 405 nm lub DRAQ5, jeśli MIFC jest wyposażony w laser wzbudzający 488 nm i/lub 642 nm. W przypadku modyfikowania barwienia jądrowego bardzo ważne jest miareczkowanie barwienia w celu znalezienia odpowiedniego stężenia dla wymaganej/pożądanej mocy lasera.
Podczas zbierania danych na temat MIFC ważne jest, aby określić optymalne granice regionów dla funkcji Gradient RMS. Granice przedstawione w tym protokole mogą wymagać korekty ze względu na pewne niewielkie różnice między instrumentami MIFC. Zastosowanie tej funkcji podczas zbierania danych jest niezbędne, aby zapewnić przechwytywanie wysoce ostrych obrazów. Jeśli pliki danych zawierają wiele rozmytych lub nieostrych obrazów, istnieje prawdopodobieństwo, że algorytmy maskowania w oprogramowaniu analitycznym nieprawidłowo podświetlą artefakty barwienia w rozmytych obszarach, co doprowadzi do dużej liczby artefaktów fałszywie dodatnich ocenianych jako MN. Chociaż opisane tutaj techniki przetwarzania obrazu mogą być trudne, po opracowaniu szablonu analizy w oprogramowaniu MIFC, przetwarzanie wsadowe pozwala na automatyczną analizę plików danych, eliminując interwencję użytkownika, a tym samym stronniczość oceniającego. Ponadto, jeśli do przeprowadzenia testu zostanie użyta linia komórkowa inna niż komórki TK6, konieczna będzie modyfikacja masek i granic regionów, ponieważ właściwości morfologiczne (np. rozmiar) komórek będą się różnić od komórek TK6.
Przedstawione tutaj wyniki (ryc. 5) pokazują statystycznie istotny wzrost indukcji MN podczas wystawiania komórek TK6 na działanie różnych dawek mitomycyny C i kolchicyny. Statystycznie istotne zwiększenie częstości występowania MN w porównaniu z kontrolnymi rozpuszczalnikami zaobserwowano dla kilku dawek w obu substancjach chemicznych. Ponadto, żadna dawka mannitolu nie wywołała cytotoksyczności powyżej 30%, ani statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania MN w porównaniu z kontrolnymi rozpuszczalnikami, zgodnie z oczekiwaniami. Protokół opisany w tym artykule wykorzystujący MIFC do przeprowadzenia testu MN in vitro daje oczekiwane wyniki zarówno dla pozytywnych, jak i ujemnych substancji chemicznych kontrolnych. Bardzo ważne jest przeprowadzenie szeregu eksperymentów z użyciem zarówno kontroli rozpuszczalników, jak i chemikaliów kontroli ujemnej w celu opracowania wartości wyjściowych zarówno częstości MN, jak i wskaźnika proliferacji bloku cytokinezy (CBPI). W przypadku genotoksyczności statystycznie istotne zwiększenie częstości występowania MN określa się poprzez porównanie z wyjściowymi częstościami występowania MN, które muszą być dobrze znane dla wykorzystywanego typu komórki. Ponadto wszystkie obliczenia cytotoksyczności opierają się na CBPI próbek kontrolnych i dlatego wyjściowe wskaźniki komórek MONO, BNC i POLY muszą być dobrze określone ilościowo w kontrolach.
Kilka ograniczeń i zalet stosowania MIFC w kontekście testu MN zostało opisanych w poprzednich pracach29,32. Główne ograniczenia dotyczą niższych częstotliwości MN w porównaniu z mikroskopią, co prawdopodobnie wynika zarówno z braku elastyczności przy implementacji kryteriów punktacji w oprogramowaniu analitycznym, jak i ograniczonej głębi ostrości MIFC. Dobrze wyprofilowane maski mogą być tworzone w celu dokładnej identyfikacji głównych jąder, ale MN, które stykają się (lub bardzo blisko) głównych jąder, mogą zostać uchwycone w masce BNC. Dodatkowo, bardzo małe MN, które można dość łatwo ocenić za pomocą mikroskopii, są prawdopodobnie nieprawidłowo pomijane podczas korzystania z MIFC ze względu na dolny limit parametru powierzchni maski MN, aby uniknąć punktacji małych artefaktów. Oprócz trudności związanych z analizą danych opartych na obrazie, ze względu na swoją konstrukcję, MIFC uzyskuje dwuwymiarowe obrazy projekcyjne trójwymiarowych obiektów komórkowych. To prawdopodobnie powoduje, że niektóre MN są rejestrowane z inną głębokością ostrości niż dwa główne MN, co sprawia, że wydają się one bardzo ciemne i niemożliwe do usunięcia za pomocą maskowania. Co więcej, niewielka frakcja MN może znajdować się za jednym z dwóch głównych jąder, co uniemożliwia ich wizualizację i ocenę. Dlatego, biorąc pod uwagę te trudności, należy zachować ostrożność przy interpretacji znacznego wzrostu częstości występowania MN przy niskich dawkach.
Pomimo tych niedociągnięć, opisana tutaj metoda MIFC oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi technikami. Fenech i wsp. zaproponowali kryteria i wytyczne, które należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu zautomatyzowanych systemów i metodologii oznaczania MN36. Obejmują one między innymi bezpośrednią wizualizację głównych jąder i cytoplazmy, określenie częstotliwości MN na podstawie różnych dawek badanej substancji chemicznej lub czynnika oraz możliwość ilościowego określenia morfologii i określenia położenia wszystkich jąder i MN w celu upewnienia się, że znajdują się w cytoplazmie. W artykule wykazano, że metoda MIFC opracowana do wykonywania testu MN in vitro spełnia (lub ma potencjał do spełnienia) te kryteria. W szczególności obrazy jąder i MN mogą być rejestrowane przez lasery fluorescencyjne, podczas gdy obrazy cytoplazmatyczne można uzyskać za pomocą BF LED. Obrazowanie komórek o normalnej morfologii jądrowej może być automatycznie odróżnione od komórek o nieregularnej morfologii przy użyciu kombinacji zaawansowanych masek i cech. Wyniki przedstawione dla kolchicyny i mitomycyny C (ryc. 5) pokazują, że zarówno genotoksyczność, jak i cytotoksyczność mogą być oceniane przy różnych dawkach w porównaniu z kontrolami z rozpuszczalnikiem i że statystycznie istotne częstości występowania MN obserwuje się tam, gdzie się tego spodziewano. Ponadto w wytycznej OECD dotyczącej badań nr 487 zaleca się ocenę 2 000 BNC na stężenie testowe w celu oceny obecności MN w celu określenia genotoksyczności oraz co najmniej 500 komórek na stężenie testowe w celu określenia cytotoksyczności9; Może to zająć ponad 1 godzinę przy użyciu mikroskopii ręcznej. Protokół i wyniki w tym artykule pokazują, że średnio około 6 000 komórek BNC, 16 000 komórek MONO i 800 komórek POLY zostało przechwyconych i ocenionych na stężenie testowe w ciągu około 20 minut. Szybkie tempo pozyskiwania danych i duża liczba komórek kandydujących uzyskanych w tak krótkim czasie podkreślają kolejną ważną zaletę stosowania MIFC do przeprowadzania testu MN in vitro.
Chociaż wyniki przedstawione w tym artykule są zachęcające, są one reprezentatywne dla wczesnej metody weryfikacji koncepcji. Prace te powinny być kontynuowane przez bardziej szczegółowe badania większego, bardziej zróżnicowanego zestawu chemicznego, który obejmuje wiele klas i mechanizmów genotoksyczności i cytotoksyczności, takich jak te sugerowane przez Kirklanda i wsp.37 Prowadzenie takich badań jest czasochłonne i pracochłonne, a także wykracza poza zakres tego artykułu. Te badania na większą skalę dostarczą cennych informacji na temat zdolności metody do wiarygodnej identyfikacji czynników o słabo genotoksycznych właściwościach. Przedstawiona tutaj metodologia nie została jeszcze zminiaturyzowana do formatu mikrostudzienki, co pozwoliłoby na szybsze i skuteczniejsze badania przesiewowe w większym zakresie dawek. W związku z tym, w swojej obecnej formie, przedstawiony tutaj test MN in vitro oparty na MIFC może najlepiej nadawać się do pracochłonnych badań kontrolnych lub badań nad dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Jednak metoda będzie nadal optymalizowana i walidowana, a także ma potencjał, aby pozwolić na zwiększenie elastyczności w wykrywaniu specyficznych zdarzeń chemicznych związanych z morfologią, takich jak ekspozycja na aneugen, która zwiększa odsetek komórek z niekolistymi jądrami, które są nadal podatnena korozję 38. Wreszcie, metoda MIFC stwarza możliwość wprowadzenia dodatkowych biomarkerów do testu MN (np. barwienie kinetochorem), aby zapewnić bardziej wszechstronny obraz mechanizmu indukcji MN.

Test mikrojądrowy in vitro (MN) jest powszechnie stosowanym testem do oceny cytotoksyczności i genotoksyczności jako narzędzie przesiewowe w kilku dziedzinach nauki, takich jak rozwój chemiczny i farmaceutyczny, a także biomonitoring człowieka wśród osób narażonych na różne czynniki środowiskowe, zawodowe lub związane ze stylem życia1,2,3. MN składa się z fragmentów chromosomów lub całych chromosomów powstałych podczas podziału komórki, które nie są włączone do jednego z dwóch głównych jąder potomnych. Po telofazie ten materiał chromosomalny formuje się w indywidualne, zaokrąglone ciało wewnątrz cytoplazmy, które jest oddzielone od któregokolwiek z głównych jąder2. W związku z tym MN są reprezentatywne dla uszkodzeń DNA i są używane od wielu lat jako punkt końcowy w testach genotoksyczności4. Najodpowiedniejszą metodą pomiaru MN jest test mikrojądrowy z blokiem cytokinezy (CBMN). Korzystając z testu CBMN, częstość występowania MN w komórkach dwujądrowych (BNC) można ocenić poprzez włączenie cytochalazyny B (Cyt-B) do próbki. Cyt-B pozwala na podział jądrowy, ale zapobiega podziałowi komórkowemu, a tym samym ogranicza punktację MN do BNC, które podzieliły się tylko raz5.
Protokoły wykorzystujące zarówno mikroskopię, jak i cytometrię przepływową zostały opracowane i zatwierdzone i są rutynowo używane do przeprowadzania testu MN in vitro6,7,8,9,10,11,12,13,14. Mikroskopia korzysta z możliwości wizualnego potwierdzenia, że MN są legalne, ale jest czasochłonna i podatna na różnice między oceniającymi15. Aby rozwiązać ten problem, opracowano zautomatyzowane metody mikroskopii do skanowania preparatów i przechwytywania obrazów jąder i MN16,17,18,19, ale cytoplazmy nie można zobrazować, co utrudnia określenie, czy MN jest rzeczywiście powiązany z konkretną komórką. Ponadto metody te mają trudności z identyfikacją komórek wielojądrowych (POLY) (w tym komórek trój- i czterojądrowych), które są wymagane do obliczenia cytotoksyczności przy użyciu Cyt-B9. Metody cytometrii przepływowej opracowane do wykonywania testu MN wykorzystują fluorescencję, a także intensywność rozpraszania do przodu i na boki do identyfikacji populacji zarówno jąder, jak i MN, które zostały uwolnione z komórki w wyniku lizy20,21,22. Pozwala to na pozyskanie danych z kilku tysięcy komórek w ciągu kilku minut i umożliwia automatyczną analizę23; Jednak brak możliwości wizualizacji komórek uniemożliwia potwierdzenie, że ocenione zdarzenia są autentyczne. Dodatkowo, liza błony komórkowej hamuje użycie Cyt-B, a także tworzenie zawiesiny zawierającej inne zanieczyszczenia, takie jak agregaty chromosomowe lub ciała apoptotyczne i nie ma sposobu, aby je odróżnić od MN24.
W świetle tych ograniczeń, Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) jest idealnym systemem do wykonywania testu MN, ponieważ łączy w sobie obrazy fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości mikroskopii z statystyczną solidnością i szybkością konwencjonalnej cytometrii przepływowej. W MIFC wszystkie ogniwa są wprowadzane do systemu fluidycznego, a następnie są hydrodynamicznie skupiane w środku kuwety z komórką przepływową. Ortogonalne oświetlenie wszystkich ogniw odbywa się za pomocą diody elektroluminescencyjnej (LED) o jasnym polu (BF), lasera o bocznym rozproszeniu i (co najmniej) jednego lasera fluorescencyjnego. Fotony fluorescencyjne są przechwytywane przez jedną z trzech (20x, 40x lub 60x) soczewek obiektywowych o dużej aperturze numerycznej, a następnie przechodzą przez element rozkładu widmowego. Fotony są następnie ogniskowane w kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości wszystkich komórek przechodzących przez komórkę przepływową. Aby uniknąć rozmycia lub smug, przetwornik CCD działa w trybie integracji z opóźnieniem czasowym (TDI), który śledzi obiekty, przesyłając zawartość pikseli z rzędu do rzędu w dół CCD w synchronizacji z prędkością przepływu komórki. Informacje o pikselach są następnie zbierane z ostatniego rzędu pikseli. Obrazowanie TDI w połączeniu z dekompozycją spektralną pozwala na jednoczesne uchwycenie do 12 obrazów (2 BF, 10 fluorescencyjnych) ze wszystkich komórek przechodzących przez komórkę przepływową. Wszystkie przechwycone obrazy są przechowywane w plikach danych specyficznych dla próbki, co pozwala na przeprowadzenie analizy w dowolnym momencie za pomocą oprogramowania do analizy danych MIFC. Wreszcie, pliki danych zachowują powiązanie między obrazami komórkowymi a kropkami na wszystkich wykresach dwuwymiarowych. Oznacza to, że dowolna kropka na tradycyjnym wykresie dwuwymiarowym może zostać podświetlona, a odpowiadające jej obrazy BF i fluorescencyjne zostaną wyświetlone pod adresem25.
Ostatnio opracowano metody oparte na MIFC do przeprowadzania testu MN zarówno dla biodozymetrii radiacyjnej triage26,27,28,29,30,31 jak i toksykologii genetycznej32,33testowanie. Praca ta wykazała, że obrazy komórkowe głównych jąder, MN i cytoplazmy mogą być obrazowane z większą przepustowością niż inne metody26. Wszystkie typy komórek wymagane do analizy, w tym komórki MONO, BNC (z MN i bez) oraz komórki POLY, mogą być automatycznie identyfikowane w oprogramowaniu do analizy danych MIFC, a implementacja kryteriów punktacji opracowanych przez Fenecha i wsp. odbywa się za pomocą różnych algorytmów matematycznych6,34. Wyniki biodozymetrii wykazały, że krzywe kalibracji dawka-odpowiedź były podobne pod względem wielkości do tych uzyskanych za pomocą innych zautomatyzowanych metod dostępnych w literaturze podczas ilościowego określania szybkości MN na BNC29. Ponadto niedawne prace toksykologiczne wykazały, że obrazy komórek MONO, BNC (z MN i bez MN) oraz komórek POLY mogą być automatycznie rejestrowane, identyfikowane, klasyfikowane i liczone za pomocą MIFC. Protokół i analiza danych umożliwiły obliczenie cytotoksyczności i genotoksyczności po wystawieniu komórek TK6 na działanie kilku klastogenów i aneugenów32.
Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje metodę przeprowadzania testu MN in vitro przy użyciu MIFC. Technika przetwarzania próbki zastosowana w tej pracy wymaga mniej niż 2 godziny na przetworzenie pojedynczej próbki i jest stosunkowo łatwa do wykonania w porównaniu z innymi metodami. Analiza danych w oprogramowaniu do analizy MIFC jest skomplikowana, ale utworzenie szablonu analizy można wykonać w ciągu kilku godzin, postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym dokumencie. Co więcej, po utworzeniu szablonu można go automatycznie zastosować do wszystkich zebranych danych bez żadnych dalszych prac. Protokół przedstawia wszystkie kroki wymagane do wystawienia komórek TK6 na działanie klastogenów i aneugenów, opisuje sposób hodowli, przetwarzania i barwienia komórek oraz pokazuje, jak uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą MIFC. Ponadto w artykule przedstawiono aktualne najlepsze praktyki w zakresie analizy danych w oprogramowaniu MIFC w celu automatycznej identyfikacji i oceny komórek MONO, BNC i komórek POLY w celu obliczenia zarówno cytotoksyczności, jak i genotoksyczności.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Pojemnik do napełniania 200 ml środka czyszczącego.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>Colchicine</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-86-8</td><td></td></tr><tr><td>Filtr próżniowy do butelek Corning&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430769</td><td>filtr 0,22 um, butelka 500 ml</td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>MiliporeSigma</td><td>14930-96-2</td><td>Butelka 5 mg</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td>Napełnij pojemnik 200 ml Debubbler.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>MiliporeSigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1X</td><td>EMD Milipor</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++MG++ Wolny&nbsp;</td></tr><tr><td>Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, bez metanolu, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>To jest to, co jest używane do 4% i 1% formaliny. UWAGA: Formalina/formaldehyd toksyczny przez drogi oddechowe i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Może powodować uczulenie przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Potencjalne zagrożenie rakiem.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>10 mg/ml roztwór</td></tr><tr><td>Miliporowy mannitolSigma</td><td></td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne 100X</td><td>Hyklon</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td>Zastosowano kamerę <td>EMD Millipore</td><td>100220</td><td>A 2 ImageStreamX Mark II wyposażoną w lasery 405nm, 488nm i 642nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy MIFC - IDEAS</td><td>EMD Millipore</td><td>100220</td><td>Oprogramowanie towarzyszące MIFC ( Oprogramowanie ImageStreamX MKII)</td></tr><tr><td>MIFC - INSPIRE</td><td>EMD Millipore</td><td>100220</td><td>Jest to oprogramowanie, które uruchamia MIFC (ImageStreamX MKII)</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>MiliporeSigma</td><td>50-07-7</td><td></td></tr><tr><td>NEAA Mieszanina 100X</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycyna/Glutamina roztwór 100X</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu ( KCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Rinse - Woda ultraczysta lub woda dejonizowana</td><td>NA</td><td>Możesz</td><td>użyć dowolnej wody ultraczystej lub wody dejonizowanej.&nbsp; Napełnij pojemnik 900 ml płukania.</td></tr><tr><td>RNase</td><td>MilliporeSigma</td><td>9001-99-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1X</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Osłona - PBS</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td>To jest to samo, co sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1X&nbsp; Ca++MG++ za darmo.&nbsp; Napełnij pojemnik 900 ml osłony.</td></tr><tr>Sterylizator <td>HyClone</td><td>SH30529.01</td><td></td> <td>sterylnej wody</td></tr><tr><td>- 0,4-0,7% podchlorynu</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Jest to zdecydowanie 10% wybielacz Clorox, który można uzyskać, rozcieńczając wybielacz Clorox wodą.&nbsp; Napełnij pojemnik 200 ml sterylizatora.</td></tr><tr><td>Odczynnik do kalibracji systemu - SpeedBead</td><td>EMD Millipore</td><td>400041</td><td>Każda probówka mieści ~10 ml.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolba T25</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa TK6</td><td>MilliporeSigma</td><td>95111735</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Test mikrojądrowy in vitro (MN) jest często używany do oceny cytotoksyczności i genotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii ręcznej jest pracochłonna i wprowadza niepewność do wyników z powodu zmienności między oceniającymi. Aby temu zaradzić, wprowadzono zautomatyzowaną mikroskopię skaningową z szkiełkami, a także konwencjonalne metody cytometrii przepływowej, w celu wyeliminowania stronniczości punktora i poprawy przepustowości. Metody te mają jednak swoje nieodłączne ograniczenia, takie jak niemożność wizualizacji cytoplazmy komórki oraz brak wizualnej weryfikacji MN lub przechowywania danych obrazowych za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa obrazowania wielospektralnego (MIFC) ma potencjał, aby przezwyciężyć te ograniczenia. MIFC łączy obrazy fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości z mikroskopii z solidnością statystyczną i szybkością konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Ponadto wszystkie zebrane obrazy mogą być przechowywane w plikach specyficznych dla danej dawki. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu MN na MIFC. Ludzkie komórki limfoblastoidalne TK6 powiększono za pomocą roztworu hipotonicznego (75 mM KCl), utrwalonego 4% formaliną, a zawartość jądrową wybarwiono Hoechst 33342. Wszystkie próbki poddano badaniu w zawiesinie MIFC, co pozwoliło na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości wszystkich kluczowych zdarzeń wymaganych do przeprowadzenia testu (np. komórki dwujądrowe z MN i bez niego, a także komórki jednojądrowe i wielojądrowe). Obrazy zostały automatycznie zidentyfikowane, skategoryzowane i zliczone w oprogramowaniu do analizy danych MIFC, co pozwoliło na automatyczną ocenę zarówno cytotoksyczności, jak i genotoksyczności. Wyniki pokazują, że zastosowanie MIFC do przeprowadzenia testu MN in vitro pozwala na wykrycie statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania MN na kilku różnych poziomach cytotoksyczności w porównaniu z kontrolami rozpuszczalnikowymi po ekspozycji komórek TK6 na mitomycynę C i kolchicynę, oraz że nie obserwuje się znaczącego wzrostu częstości MN po ekspozycji na mannitol.

Metoda analizy opisana w niniejszej pracy umożliwia automatyczną identyfikację i punktowanie BNC, z obecnością lub bez MN, w celu obliczenia genotoksyczności. Ponadto automatycznie identyfikowane i punktowane są komórki MONO i POLY w celu obliczenia cytotoksyczności. W oprogramowaniu do analizy danych MIFC zaimplementowano opublikowane kryteria punktowania6,34, których należy przestrzegać podczas oceny tych zdarzeń. Przedstawione tutaj wyniki wskazują, że po narażeniu ludzkich limfoblastoidalnych komórek TK6 na znane substancje indukujące MN (mitomycynę C i kolchicynę) można wykryć statystycznie istotne wzrosty częstotliwości występowania MN wraz ze wzrostem cytotoksyczności. Podobne wyniki dla dodatkowych testowanych substancji chemicznych zostały przedstawione w oddzielnej publikacji32. Ponadto wyniki uzyskanego z zastosowania mannitolu wykazują, że substancje nieindukujące MN mogą być również prawidłowo zidentyfikowane przy użyciu opisanej tutaj metody MIFC. Parametry opisane w protokole służące do tworzenia wszystkich masek, cech i granic obszarów będą prawdopodobnie wymagały dostosowania, jeśli do przeprowadzenia testu zostaną użyte inne typy komórek (np. komórki chomika chińskiego).
Rysunek 3 przedstawia cztery wybrane panele służące do identyfikacji BNC (Rysunek 3A-3D). Przedstawiono tutaj histogram umożliwiający selekcję komórek z dwoma jądrami (Rysunek 3A) oraz wykresy dwumianowe umożliwiające selekcję BNC o podobnej kolistości (Rysunek 3B), podobnych polach i intensywnościach (Rysunek 3C) oraz BNC z dobrze oddzielonymi, niepokrywającymi się jądrami (Rysunek 3D) zgodnie z kryteriami oceny6,34. Rysunek 3E pokazuje obrazy BF i Hoechst, a także maski BNC i MN, wskazując, że BNC z pojedynczymi lub wieloma MN mogą zostać zidentyfikowane i policzone. Pozwala to na obliczenie genotoksyczności poprzez wyznaczenie odsetka BNC z mikronukleusami w końcowej populacji BNC. Rysunek 4 pokazuje zastosowanie funkcji Spot Count z użyciem maski POLY do identyfikacji komórek MONO, TRI i QUAD. Liczbę komórek TRI i QUAD można następnie zsumować, aby uzyskać końcową liczbę komórek POLY (Tabela 1). Umożliwia to obliczenie cytotoksyczności przy użyciu formuły przedstawionej w protokole. W związku z tym każdy punkt dawkowania w eksperymencie może zostać oceniony pod kątem parametrów genotoksyczności i cytotoksyczności.
Rysunek 5 przedstawia wartości genotoksyczności i cytotoksyczności dla aneugenu kolchicyny, klastogenu mitomycyny C oraz dla kontroli negatywnej, mannitolu. W przypadku kolchicyny (Rysunek 5A) dawki od 0,02 do 0,05 μg/mL spowodowały statystycznie istotny wzrost częstotliwości występowania jąderek MN, wynoszący odpowiednio od 1,28% do 2,4% w stosunku do kontroli rozpuszczalnika (Tabela 1). W przypadku mitomycyny C (Rysunek 5B) dwie najwyższe dawki, 0,4 i 0,5 μg/mL, spowodowały statystycznie istotną częstotliwość MN w porównaniu z kontrolami rozpuszczalnika. Częstotliwości MN wynosiły odpowiednio 0,93% przy 0,4 μg/mL oraz 1,02% przy 0,5 μg/mL (Tabela 2). W końcu, w przypadku mannitolu (Rysunek 5C), zgodnie z oczekiwaniami, żadna z badanych dawek nie wywoła cytotoksyczności powyżej 30%, ani nie spowodowała istotnego wzrostu częstotliwości MN w porównaniu z kontrolami rozpuszczalnika (Tabela 3).
<img alt="Konfiguracja cytometrii przepływowej do analizy DNA z oświetleniem, układem hydraulicznym oraz wykresem gradientu RMS BF i wyników intensywności barwnika Hoechst." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Ustawienia instrumentu MIFC. Zrzut ekranu ustawień MIFC opisanych w punkcie 7 protokołu.A) Ustawienie mocy lasera 405 nm na 10 mW. (B) Ustawianie kanałów BF 1 i 9. (C) Wybór obiektywu o powiększeniu 60x. (D) Wybór najniższej prędkości przepływu, która pozwala na uzyskanie obrazów o najwyższej rozdzielczości. (E) Określenie liczby zdarzeń do zebrania na 20 0. (FKliknięcie Załaduj przycisk do rozpoczęcia procesu ładowania próbek. (G) Kliknięcie Pozyskać przycisk rozpoczynający akwizycję obrazów. (H) Kliknięcie Powrót przycisk do zwracania każdej niewykorzystanej próbki. (I) Wykres rozrzutu stosunku boków BF do pola BF w celu wyboru pojedynczych komórek. (J) Wykres rozrzutu RMS gradientu barwnika Hoechst w stosunku do RMS gradientu BF w celu wyboru komórek w ostrości. (K) Histogram intensywności Hoechst w celu wyboru komórek z dodatnim sygnałem DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przetwarzanie obrazów jąder komórkowych; segmentacja; analiza; wykresy rozrzutu; dane mikroskopowe; kategoryzacja komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Strategia bramowania w oprogramowaniu analitycznym. Zrzut ekranu strategii bramowania opisanej w sekcji 9 protokołu. Regiony przedstawiono w kolejności sekwencyjnej w celu identyfikacji komórek dwojądrowych (czerwone pole), mikrojąder (żółte pole) oraz komórek jednojądrowych i wielojądrowych (niebieskie pole). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy jąder komórkowych; współczynniki kształtu, liczba punktów; mikroskopia, wykresy stosunków intensywności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Identyfikacja i punktacja BNC z obecnością i bez obecności MN. (A) Wybór komórek posiadających dwa wyraźne jądra. (BIdentyfikacja komórek dwojądrowych (BNCs), które posiadają dwa silnie koliste jądra, przy użyciu funkcji Aspect Ratio Intensity.CWybór BNC, których jądra mają zbliżoną powierzchnię i intensywność. Osiąga się to poprzez obliczenie stosunku powierzchni obu jąder oraz stosunku ich współczynników kształtu (aspect ratio).D) Wykorzystanie cech Shape Ratio (stosunku kształtu) i Aspect Ratio (stosunku proporcji) do identyfikacji BNC, które posiadają dwa wyraźnie oddzielone jądra. (E) Funkcja Spot Count z wykorzystaniem maski mikrąjąder (MN), demonstrująca możliwość identyfikacji i przeliczania BNC zawierających pojedyncze lub wiele mikrąjąder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazowanie komórek wielojądrowych; mikroskopia fluorescencyjna; wykres zliczania plamek; metoda analizy komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4Identyfikacja i punktowanie komórek MONO i POLYWykorzystanie funkcji zliczania punktowego (spot count) do identyfikacji i enumeracji komórek jedno-, trzy- i czterojądrowych. Maska komponentu 1 umożliwia identyfikację komórek jednojądrowych (górny obraz). Maski komponentów od 1 do 3 umożliwiają identyfikację komórek trójjądrowych (środkowy obraz). Maski komponentów od 1 do 4 umożliwiają identyfikację komórek czterojądrowych (dolny obraz). Rysunek zmodyfikowano na podstawie publikacji Rodrigues 2018.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Komórki z mikrąjądrami a cytotoksyczność; wykres zależności dawka-odpowiedź; traktowanie kolchicyną, MMC i mannitolem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5Ilościowe oznaczanie cytotoksyczności. Cytotoksyczność określona za pomocą indeksu proliferacji z blokadą cytokinezy (czarne kółka) oraz genotoksyczność określona za pomocą procentowej liczby MN (puste słupki) po 3-godzinnej ekspozycji i 24-godzinnej regeneracji dla (A) kolchicyna, (B) mitomycyną C oraz (C) Mannitol. Statystycznie istotne wzrosty częstości występowania MN w porównaniu z grupami kontrolnymi zaznaczono gwiazdkami (test chi-kwadrat; *p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; (p < 0,01). Wszystkie ilości stanowią średnią z dwóch powtórzeń dla każdego punktu dawkowania. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie publikacji Rodrigues 2018.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Tabela danych dotyczących cytotoksyczności i genotoksyczności kolchicyny z efektami zależnymi od dawki w kulturach komórkowych." src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Parametry niezbędne do obliczenia cytotoksyczności (liczba komórek jedno-, dwu- i wielojądrowych) oraz genotoksyczności (liczba i odsetek dwu-jądrowych komórek z mikronukleuszami) dla kolchicyny. Wszystkie obliczone ilości stanowią średnią z dwóch powtórzeń dla każdego punktu dawkowania.
<img alt="Tabela cytotoksyczności i genotoksyczności Mitomycyny C; zależne od dawki efekty w odniesieniu do liczby komórek i mikrojąder." src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2: Tparametry wymagane do obliczenia cytotoksyczności (liczba komórek jedno-, dwu- i wielojądrowych) oraz genotoksyczności (liczba i procent dwujądrzastych komórek z mikrojądrami) dla mitomycyny C. Wszystkie obliczone wartości stanowią średnią z dwóch powtórzeń dla każdego punktu dawkowania.
<img alt="Tabela cytotoksyczności i genotoksyczności mannitolu: odpowiedź na dawkę, liczba komórek, istotność statystyczna (cytotoksyczność)." src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 3: Parametry wymagane do obliczenia cytotoksyczności (liczba komórek jedno-, dwu- i wielojądrzastych) oraz genotoksyczności (liczba i procent dwujądrzastych komórek z mikrojądrami) dla mannitolu. Wszystkie obliczone wartości stanowią średnią z dwóch powtórzeń dla każdego punktu dawkowania.
Suplement 1: Pełny protokół. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Suplement 2: Lista masek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Test mikrojądrowy oparty na strumieniu obrazu może przezwyciężyć kilka ograniczeń metod, takich jak zautomatyzowana mikroskopia i konwencjonalna cytometria przepływowa, w tym niską przepustowość i brak wizualnego potwierdzenia zdarzeń. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie zdarzenia wymagane do określenia genotoksyczności i cytotoksyczności mogą być automatycznie obrazowane, identyfikowane i oceniane bez konieczności tworzenia szkiełek mikroskopowych. W przypadku narażenia komórek na klastogeny i/lub aneugeny, dodać jeden milimetr substancji chemicznej będącej przedmiotem zainteresowania do siedmiu do ośmiu razy 10 do piątej komórki doświadczalnej w dziewięciu mililitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych w kolbie T25 i jeden mililitr wody do kultur kontrolnych.Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowego dwutlenku węgla przez trzy godziny przed przeniesieniem komórek do jednej 15-mililitrowej probówki polipropylenowej na kolbę. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej na probówkę do wysiewu w nowych kolbach hodowlanych T25. Następnie dodać 150 mikrolitrów podstawowego stężenia cytochalazyny B do każdej kolby, aby uzyskać końcowe stężenie trzech mikrogramów na mililitr.Zwróć kolby do inkubatora na czas rekonwalescencji równy 1,5 do dwóch razy podwojenia, zgodnie z zaleceniami wytycznych Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. Pod koniec okresu rekonwalescencji przenieść kultury do pojedynczych 15-mililitrowych probówek polipropylenowych do odwirowania i ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach 75-milimolowego chlorku potasu. Delikatnie wymieszać przez odwrócenie trzy razy i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem minut.Pod koniec inkubacji dodać dwa mililitry czteroprocentowej formaliny do każdej próbki i delikatnie wymieszać z trzema inwersjami. Przywrócić próbki do czterech stopni Celsjusza na 10 minut przed zebraniem komórek przez odwirowanie. Ponownie zawieś granulki w 100 mikrolitrach świeżej czteroprocentowej formaliny na 20 minut.Pod koniec inkubacji przemyć utrwalone komórki w pięciu mililitrach buforu do przemywania na probówkę przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach buforu do przemywania na probówkę. Następnie przenieś próbki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych w celu zliczenia na hemocytometrze. Dodaj pięć mikrolitrów po 100 mikrogramów na mililitr Hoechst 33342 na 1,0 x 10 do sześciu komórek na mililitr i 10 mikrolitrów po 500 mikrogramów na mililitr RNazy na 100 mikrolitrów próbki na probówkę.Po 30-minutowej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla, odwirować próbki w mikrowirówce i usunąć z każdej probówki tylko 30 mikrolitrów supernatantu. Następnie ostrożnie ponownie zawiesić próbki, uważając, aby nie wywołać tworzenia się pęcherzyków. Jeśli po ponownym zamieszaniu pojawią się pęcherzyki, delikatnie przesuń tubkę, aby je usunąć.Aby uruchomić próbki za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, najpierw włącz laser 405 nanometrów i ustaw moc lasera na 10 miliwatów. Wyłącz wszystkie inne lasery, w tym boczny laser rozpraszający, i ustaw jasne pole na kanały pierwszy i dziewiąty. Upewnij się, że suwak powiększenia jest ustawiony na 60x, że wybrany jest tryb wysokiej czułości i że w galerii obrazów wyświetlane są tylko kanały pierwszy, siódmy i dziewiąty.Kliknij wykres punktowy i wybierz całą populację i obszar M01 na osi X. Wybierz współczynnik proporcji M01 na osi Y i kliknij kwadratowy region, aby narysować region wokół pojedynczych komórek. Nazwij ten region pojedynczymi komórkami i kliknij prawym przyciskiem myszy wykres, aby wybrać regiony.Podświetl obszar pojedynczych komórek i zmień współrzędne X na 100 i 900, a współrzędne Y na 0,75 i jeden. Ustaw parametry pobierania i określ nazwę pliku oraz folder docelowy. Następnie zmień liczbę zdarzeń na 20 000, wybierz populację DNA dodatniego i uruchom pierwszą próbkę.Aby otworzyć plik danych w programie IDEAS, kliknij przycisk Rozpocznij analizę, aby uruchomić Kreatora otwierania pliku, a następnie przejdź do żądanego pliku obrazu RAW. Następnie kliknij przycisk Dalej i wyszukaj komórkę dwujądrową w galerii obrazów. Aby utworzyć maskę, kliknij, aby wybrać interesujący Cię obraz i otwórz kartę analizy.Kliknij opcję Maski, Nowy i Funkcja, aby wybrać opcję LevelSet. W obszarze Maska wybierz M07 i Maska średniego poziomu, a następnie ustaw skalę szczegółów konturu na trzy. Następnie kliknij przycisk OK dwa razy.Aby zliczyć punktowo cechy komórek dwujądrowych, otwórz kartę Analiza i wybierz Funkcje i Nowy. W polu Typ elementu wybierz opcję Liczba punktów punktowych. W polu Maska wybierz końcową maskę dwujądrową i ustaw łączność na cztery, a następnie zmień nazwę na Spot Count BNC i kliknij przycisk OK i zamknij, aby obliczyć wartości funkcji.W przypadku histogramu komórek dwujądrowych z liczbą punktową kliknij histogram i wybierz opcję nieapoptopową jako populację nadrzędną. Dla funkcji osi X wybierz Spot Count BNC i kliknij OK i region liniowy, a następnie narysuj region w poprzek Bim Two i nazwij ten region 2N. Aby utworzyć maskę mikrojądrową, wybierz komórkę dwujądrową, która zawiera mikrojądro z galerii obrazów, a następnie otwórz maski na karcie Analiza.Aby utworzyć maskę identyfikacyjną punktu, kliknij Nowy i Funkcja, a następnie wybierz opcję Punktowa. Upewnij się, że wybrano przycisk radiowy Jasny, a następnie wybierz M07 pod maską. Ustaw Stosunek miejsca do tła komórki i Minimalny promień na dwa, a Maksymalny promień na sześć.Kliknij przycisk OK i OK, aby dodać maskę do listy po lewej stronie, a następnie kliknij przycisk Nowa, aby utworzyć kolejną maskę. Kliknij maskę Spot M07 Channel seven Bright two six two i kliknij strzałkę w dół, aby dodać ją do definicji maski, a następnie kliknij operatory And i Not. Kliknij strzałkę w dół, aby dodać maskę rozszerzonego zakresu do definicji maski.Aby utworzyć maskę populacji polijądrowej, kliknij opcje Analiza, Maski, Nowy i Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz pozycję Zakres. W obszarze Maska wybierz opcję Watershed Dilate Set M07 Channel07, Middle, three, two i ustaw obraz do wyświetlenia na Channel 07.Ustaw minimalne i maksymalne wartości obszaru odpowiednio na 135 i 5000, a minimalne i maksymalne wartości współczynnika proporcji ustaw odpowiednio na 0,4 i jeden. Kliknij przycisk OK i w polu nazwy zmień tekst na odczytany Maska POLY, a następnie kliknij przycisk OK i Zamknij. Aby utworzyć widok niestandardowy, kliknij przycisk Właściwości galerii obrazów, otwórz kartę Kompozyty i kliknij przycisk Nowy.W obszarze Nazwa wprowadź Kanał 01 do Kanał 07. Kliknij przycisk Dodaj obraz, a następnie w obszarze Obraz wybierz opcję Kanał 01 i ustaw wartość procentową na 100. Kliknij ponownie przycisk Dodaj obraz, a następnie w obszarze obraz wybierz Kanał 07 i ustaw wartość procentową na 100.Kliknij kartę Widok, kliknij przycisk Nowy, a następnie w polu Nazwa wprowadź maski BNC i MN. Następnie kliknij pozycję Dodaj kolumnę, a następnie w obszarze Typ obrazu wybierz opcję Kanał 01, a następnie w obszarze Maska wybierz opcję Brak. Kliknij pozycję Dodaj kolumnę, a następnie w obszarze Typ obrazu wybierz opcję Kanał 07, a następnie w obszarze Maska wybierz opcję Brak.Kliknij przycisk Dodaj kolumnę, kliknij przycisk radiowy Kompozyt, a następnie kliknij przycisk OK, aby zakończyć tworzenie widoku niestandardowego. Kliknij menu rozwijane Widok, a następnie kliknij widok masek BNC i MN. Kliknij przycisk Pokaż maski ukrywania.Aby wyliczyć kluczowe zdarzenia, otwórz kartę Raporty i kliknij przycisk Zdefiniuj raport statystyczny, a następnie w nowym oknie kliknij przycisk Dodaj kolumny. Aby dodać statystykę liczby komórek dwujądrowych, w obszarze Statystyka wybierz pozycję Liczba, a następnie w obszarze Wybrana populacja wybierz populację BNC, a następnie kliknij przycisk Dodaj statystyki, aby dodać statystykę do listy i zapisać szablon. Po dodaniu wszystkich statystyk do listy kliknij przycisk Zamknij, a następnie kliknij przycisk OK, a następnie zapisz szablon analizy danych.Aby przetworzyć wsadowo pliki eksperymentalne, w menu Narzędzia kliknij polecenie Pliki danych wsadowych, a następnie kliknij polecenie Dodaj partię w nowym oknie. Kliknij przycisk Dodaj pliki, aby wybrać pliki eksperymentu, które mają zostać dodane do partii, a następnie kliknij przycisk Otwórz folder w obszarze Wybierz szablon lub plik analizy danych. Przejdź do szablonu, który został właśnie zapisany, i otwórz go.Kliknij przycisk OK, aby zamknąć bieżące okno. Następnie kliknij przycisk Prześlij partie, aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe wszystkich plików. W tym miejscu pokazano cztery wybrane panele do identyfikacji komórek dwujądrowych.Te dwuwymiarowe wykresy i histogramy umożliwiają selekcję komórek dwujądrowych, a także identyfikację tych komórek, które mają dwa jądra o podobnej okrągłości, obszarach i intensywności oraz które są dobrze oddzielone od siebie. Obrazy Brightfield i Hoechst, a także dwujądrowe maski komórkowe i mikrojądrowe, ułatwiają identyfikację i liczenie komórek dwujądrowych i mikrojąder. Zastosowanie funkcji zliczania punktowego wykorzystuje maskę polijądrową do identyfikacji komórek jednojądrowych, trójjądrowych i czworojądrowych.Liczba komórek trój- i czterojądrzastych może być następnie zsumowana w celu uzyskania ostatecznej liczby komórek wielojądrowych wymaganych do obliczenia cytotoksyczności. W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne wartości genotoksyczności i cytotoksyczności dla endogenu kolchicyny, klastogenu mitomycyny C i kontroli ujemnej, mannitolu, w celu wykazania ważności protokołu. Znakowanie komórek odpowiednim stężeniem barwienia DNA ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej jakości przechwytywania obrazu, co pozwala na łatwą identyfikację i ocenę wszystkich kluczowych zdarzeń.Techniki te mają również zastosowanie do testu mikrojądrowego do biodozymetrii promieniowania, który umożliwia oszacowanie dawki u osób, które mogły być narażone na promieniowanie.

an-automated-method-to-perform-vitro-micronucleus-assay-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

W tym badaniu, głównym celem było monitorowanie wychwytu komórkowego i ewentualnej egzocytozy nanorurek węglowych (CNT). Z tej perspektywy zaproponowaliśmy tutaj unikalną metodę wykorzystującą obrazowanie wielospektralne cytometrii przepływowej, pozwalającą na kwantyfikację i lokalizację CNT w statystycznie istotnej liczbie komórek.

Lokalizacja i względna kwantyfikacja nanorurek węglowych w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Tutaj, wielospektralna cytometria przepływowa z funkcją analityczną, która porównuje jasne obrazy szczegółów 3 markerów autofagii i określa ilościowo ich kolokalizację, wraz z liczeniem plamek LC3, została użyta do pomiaru autofagii w obiektywny, ilościowy i statystycznie solidny sposób.

Ocena strumienia autofagicznego poprzez pomiar kolokalizacji LC3, p62 i LAMP1 za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Zautomatyzowane testy wykorzystujące wielodołkowe mikropłytki są korzystnym podejściem do identyfikacji regulatorów szlaku, umożliwiając ocenę wielu warunków w jednym eksperymencie. W tym przypadku dostosowaliśmy dobrze znany protokół obrazowania i kwantyfikacji makropinosomów do 96-dołkowego formatu mikropłytek i zapewniamy kompleksowy zarys automatyzacji przy użyciu wielomodowego czytnika płytek.

Zautomatyzowane obrazowanie i analiza w celu ilościowego oznaczania makropinosomów znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Test mikrojądrowy (MN) jest sprawdzonym testem do ilościowego określania uszkodzeń DNA. Jednak ocena testu przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak mikroskopia ręczna lub analiza obrazu oparta na cechach, jest pracochłonna i wymagająca. W artykule opisano metodologię opracowania modelu sztucznej inteligencji do oceny testu MN przy użyciu danych z obrazowej cytometrii przepływowej.

Automatyzacja testu mikrojądrowego z wykorzystaniem obrazowania, cytometrii przepływowej i sztucznej inteligencji

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Poznaj zautomatyzowaną metodę testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego. Ta technika zwiększa przepustowość i eliminuje subiektywność w ocenie genotoksyczności oraz cytotoksyczności.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Przeglądaj więcej filmów