Name: Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Poznaj technikę barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka mysiej aorty. Ta metoda umożliwia analizę fenotypu komórkowego pod wpływem różnych warunków ścinania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) oraz Science Technology Committee of the Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju.
1. Perfuzja aorty myszy
<ol>
	<li>Krótko mówiąc, znieczulij 12-tygodniowe myszy C57BL/6 za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć pentobarbitalu sodu (50 mg/kg masy ciała). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc ogon. 
	UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.</li>
	<li>Przyklej łapki myszy do stosu ręczników papierowych za pomocą taśm samoprzylepnych.</li>
	<li>Podnieś skórę myszy kleszczami i przetnij skórę nożyczkami od brzucha do górnej części klatki piersiowej.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną poniżej klatki piersiowej ostrymi nożyczkami.</li>
	<li>Podnieś mostek za pomocą kleszczy i przetnij przeponę, a następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Odetnij żyłę główną tuż nad wątrobą nożyczkami.</li>
	<li>Ciśnienie perfuzji (100 mmHg) drzewa tętniczego przez 5 minut za pomocą wstępnie schłodzonego normalnego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 40 jednostek/ml heparyny przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade. Następnie perfuzjować wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez 3 minuty.</li>
	<li>Usuń wszystkie mięśnie, narządy i tłuszcz, aż aorta zostanie odsłonięta.</li>
	<li>Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie i wzdłużne otwarcie aorty
<ol>
	<li>Odsłoń aortę wyraźnie pod mikroskopem preparacyjnym i usuń tkanki łączne wzdłuż aorty tak czyste, jak to możliwe, za pomocą delikatnych kleszczyków i pary delikatnych nożyczek (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Wypreparuj aortę piersiową od serca do pnia trzewnej za pomocą delikatnych nożyczek i umieść aortę w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 6 cm z PBS. Rozetnij aortę wzdłużnie, wzdłuż mniejszej krzywej i wzdłuż większej krzywej, aż do zetknięcia się z prostym segmentem. Rozetnij mikronożyczkami trzy gałęzie łuku aorty, w tym bezimienną, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rycina 2.</li>
</ol>
3. Wstępne leczenie i barwienie immunologiczne aorty
<ol>
	<li>Przesiąknij aortę 0,1% eterem polioksyetylenooktylofenylowym w PBS przez 10 minut i zablokuj ją 10% normalną surowicą kozią w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającej 2,5% polisorbatu 20 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej.</li>
	<li>Następnie inkubować aortę z 5 g/ml króliczej anty-VCAM-1 i 5 g/ml szczurzej anty-VE-kadheryny w buforze blokującym, przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po 3-krotnym przepłukaniu próbki roztworem myjącym (TBS zawierający 2,5% polisorbatu 20), należy zastosować sprzężone z fluorescencją przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczenie 1:1,000, anty-królicze IgG znakowane Alexa Fluor 555 i anty-szczurze IgG znakowane Alexa Fluor 488) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Spłucz 3x w roztworze myjącym.</li>
	<li>Przeciwbarwić aortę 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI) (1 μg/ml) przez 10 minut i płukać ją 3x w roztworze myjącym.</li>
</ol>
4. Montaż aorty na szkiełku
<ol>
	<li>Umieść aortę na szkiełku nakrywkowym powierzchnią światła skierowaną w dół i powoli przesuwaj ją do roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu, który wcześniej został upuszczony na szkiełko nakrywkowe. Delikatnie rozciągnij aortę, aby próbka była płaska.</li>
	<li>Odwróć szkiełko nakrywkowe i połóż je na szkiełku szkiełkowym. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do pozostawienia pęcherzyków powietrza między próbką a szkłem.</li>
</ol>
5. Obserwacja aorty
<ol>
	<li>Zbadaj aortę za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Analizuj intensywność kolorów różnych kanałów z żądanego obszaru na obrazach en face za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus.</li>
</ol>

<ol><li>Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li>
<li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li>
<li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li>
<li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+%26%2334%3Ben+face%26%2334%3B+preparations+one+cell+in+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A method for the production of &#34;en face&#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li>
<li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li>
<li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000(2013).</li>
<li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346(2014).</li>
<li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12%2F15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration%3A+a+new+role+for+15%28S%29-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li>
<li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q%2FTNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li>
<li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li>
<li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li>
<li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CRP%2C+Atherogenic+LDL%2C+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li>
<li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Śródbłonek jest narażony na liczne czynniki proaterogenne, w tym lipidy, mediatory stanu zapalnego i stres ścinający płyny 1,11,12. Bezpośrednia obserwacja komórek śródbłonka in situ zapewnia szczególne korzyści w analizie zmian w morfologii komórek, połączeniach międzykomórkowych i wzorcach ekspresji cząsteczek w odpowiedzi na bodźce urazowe.
Wcześniejsze badania dostarczyły dwóch różnych technik imm...

Wczesne zmiany w układzie naczyniowym rozpoczynają się przede wszystkim w śródbłonku, który funkcjonuje jako selektywna bariera między krwią a ścianą naczynia z jego międzykomórkowymi kompleksami ściśle połączeniowymi1. Istotne dowody wskazują na kluczową rolę mechanicznych skutków przepływu krwi w modulowaniu funkcji śródbłonka2. Naprężenie ścinające płynu, siła tarcia generowana przez przepływ krwi, w różny sposób kształtuje morfologię i funkcję komórek śródbłonka, w zależności od konkretnych paradygmatów przepływu w różnych miejscach naczyniowych2,3. Zmiany miażdżycowe występują preferencyjnie w miejscach zaburzonego przepływu krwi (d-flow), takich jak krzywizny naczyń, rozdzielacze przepływu i punkty rozgałęzień, w porównaniu z obszarami stałego przepływu (s-flow), takimi jak prosty odcinek tętnicy. Dlatego bezpośrednia obserwacja morfologii śródbłonka i wzorców ekspresji cząsteczek powinna dostarczyć ważnych informacji na temat strukturalnych i funkcjonalnych fenotypów komórek śródbłonka w różnych paradygmatach przepływu.
Hodowane komórki śródbłonka mogą nie wyrażać rzeczywistego fenotypu, tak jak robią to in vivo, częściowo z powodu utraty wpływu naprężeń ścinających płyn, otaczających cytokin i interakcji komórka-komórka lub komórka-macierz zewnątrzkomórkowa. Aby to wspomóc, nienaruszoną monowarstwę komórek śródbłonka można badać na przekrojach poprzecznych przy użyciu klasycznej immunohistochemii. Jednak monowarstwa śródbłonka jest tak cienka i delikatna, że zwykle nie można jej wyraźnie zaobserwować. Immunohistochemia en face została wykorzystana do obserwacji wewnętrznej powierzchni śródbłonka, ale jej wyniki są albo skomplikowane, albo niekonsekwentne, ponieważ śródbłonek jest łatwo usuwany z leżącej poniżej tkanki lub tylko część ściany tętnicy szczurów lub królików, których ściany są grube, jest montowany4,5.
Modele myszy mają znaczną przewagę nad innymi zwierzętami pod wieloma względami. Tutaj stosujemy zmodyfikowaną technikę immunofluorescencji en face do analizy komórek śródbłonka łuku aorty i aorty piersiowej u myszy C57BL / 6. Taka technika jest szeroko stosowana do badania patofizjologii śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy6,7,8,9,10. Metoda ta pozwala naukowcom na wyraźną obserwację całej powierzchni śródbłonka i porównanie wzorców ekspresji danego białka w regionach narażonych na różne naprężenia ścinające płynu.

<table><tbody><tr><td>Mocowanie zapobiegające blaknięciu</td><td>Servicebio</td><td>G1401</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne kleszcze</td><td>RWD Life Science</td><td>F11001-11</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki</td><td>RWD Life Science</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>RWD Life Science</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Mciro</td><td>RWD Life Science</td><td>S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>Eter polioksyetylenooktylofenylowy (Triton X-100)</td><td>Amresco</td><td>M143</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (Tween 20)</td><td>Przeciwciało Amresco</td><td>0777</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>Abcam</td><td>ab134047</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało VE-Cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>555289</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 oznakowane anty-króliczym IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 oznaczone anty-szczurzy IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-21208</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Nieprawidłowe zmiany w fenotypie i morfologii śródbłonka są uważane za początkowe zdarzenia w patogenezie miażdżycy. Bezpośrednia obserwacja nienaruszonego śródbłonka dostarczy cennych informacji potrzebnych do zrozumienia zdarzeń komórkowych i molekularnych w dysfunkcyjnych komórkach śródbłonka. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowaną technikę barwienia immunofluorescencyjnego en face, która umożliwia naukowcom uzyskanie wyraźnych obrazów nienaruszonej powierzchni śródbłonka i analizę wzorców ekspresji cząsteczek in situ. Metoda jest prosta i niezawodna do obserwacji całej monowarstwy śródbłonka w różnych miejscach aorty. Technika ta może być obiecującym narzędziem do zrozumienia patofizjologii miażdżycy, zwłaszcza na wczesnym etapie.

Myszy szczepu C57BL/6 w wieku 12 tygodni poddano eutanazji, a następnie przeprowadzono perfuzję solą fizjologiczną zawierającą 40 jednostek/ml heparyny, a następnie schłodzonym 4-procentowym paraformaldehydem. Aortę myszy odsłonięto pod mikroskopem operacyjnym (Rycina 1), poddano sekcji i rozcięto wzdłużniesz (Rysunek 2). Barwienie immunofluorescencyjne komórek śródbłonka naczyniowego metodą en face przeprowadzono zgodnie z ilust...

Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Protokół ten pomaga ludziom analizować morfologię komórek śródbłonka i ekspresję cząsteczek w regionach pod wpływem różnych naprężeń ścinających płyn. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia bezpośrednią ocenę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych pod wpływem różnych naprężeń ścinających płyn. Podczas wykonywania tej procedury kluczowymi krokami są użycie świeżo przygotowanego paraformaldehydu i wykonanie dobrej perfuzji.Procedurę tę należy rozpocząć od znieczulenia 12-tygodniowej myszy C57BL/6, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc ogon. Przyklej łapki myszy do stosu ręczników papierowych za pomocą taśmy klejącej.Przytrzymaj skórę myszy kleszczami i przetnij skórę nożyczkami od brzucha do górnej części klatki piersiowej. Otwórz jamę brzuszną, poniżej klatki piersiowej, ostrymi nożyczkami. Podnieś mostek za pomocą kleszczy i przetnij przeponę.Następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową. Odetnij nożyczkami żyłę główną tuż nad wątrobą. Ciśnienie przenikać do drzewa tętniczego przez pięć minut, za pomocą wstępnie schłodzonej normalnej soli fizjologicznej zawierającej 40 jednostek na mililitr heparyny, przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade.Następnie perfuzjuj wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydem w PBS przez cztery minuty. Usuń wszystkie mięśnie, narządy i tłuszcz, aż aorta zostanie odsłonięta. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.Użyj delikatnych kleszczyków i delikatnych nożyczek, aby wyraźnie odsłonić aortę pod mikroskopem preparacyjnym i usunąć tkankę łączną wzdłuż aorty, tak czysto, jak to możliwe. Wypreparuj aortę piersiową od serca do pnia trzewnej za pomocą delikatnych nożyczek. Umieść aortę w sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej z PBS.Rozetnij aortę wzdłużnie, najpierw wzdłuż mniejszej krzywej, a następnie użyj mikronożyczek, aby rozciąć trzy gałęzie łuku aorty, w tym bezimienną, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową wzdłuż większej krzywej, aż do spotkania z odcinkiem prostym. Przepuszczalność aorty za pomocą 1% eteru polioksyetylenowooktylofenylowego w PBS przez 10 minut. Następnie zablokuj aortę 10% normalną surowicą kozią w tris-buforowanym roztworze soli fizjologicznej zawierającym 2,5% polisorbatu 20 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, na 12-dołkowej płytce do hodowli komórek.Następnie inkubuj aortę w buforze blokującym zawierającym pięć gramów na mililitr królika anty-VCAM1 i pięć gramów na mililitr anty-VE-Kadheryny szczura, przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzykrotnym przepłukaniu próbki roztworem myjącym, nakładać sprzężone z fluorescencją przeciwciała drugorzędowe na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, trzymając w ciemnym miejscu. Spłucz kolejne trzy razy w roztworze myjącym.Przeciwbarwić aortę DAPI przez 10 minut, trzymając w ciemnym miejscu. Następnie przepłukać poplamioną aortę trzykrotnie w roztworze myjącym. Umieść aortę na szkiełku nakrywkowym powierzchnią światła skierowaną w dół i powoli przesuwaj ją do roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu, który został wcześniej upuszczony na szkiełko nakrywkowe.Delikatnie rozciągnij aortę, aby próbka była płaska. Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na szkiełku podstawowym. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza między próbką a szkłem.Zbadaj aortę za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Analizuj intensywność kolorów różnych kanałów z żądanego obszaru na obrazach en face za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus. Pokazano obrazy barwienia immunofluorescencyjnego en face komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z aorty myszy.Immunofluorescencja en face białka adhezyjnego komórek naczyniowych i ekspresja z VE-kadheryną jako markerem śródbłonka są pokazane przy różnych wzorcach przepływu z różnych obszarów aorty myszy. DAPI poddano również barwieniu przeciwstawnemu, aby pokazać jądra komórkowe w celu lepszej wizualizacji. Patrząc przez stosy Z pod mikroskopem, komórki śródbłonka i mięśni gładkich można łatwo odróżnić na podstawie morfologii jąder komórkowych.Jądra komórek śródbłonka mają owalny kształt i są większe niż wrzecionowate jądra komórek mięśni gładkich. Ekspresja VCAM-1 była bardziej obfita w regionach o zaburzonym przepływie, przy mniejszej krzywiźnie łuku aorty w porównaniu z regionami o stałym przepływie, przy większej krzywiźnie łuku aorty i w aorcie piersiowej. Tutaj obszary o mniejszej krzywiźnie aorty myszy są wskazane jako obszary przepływu d, a większa krzywizna i klatka piersiowa.Przy odpowiedniej modyfikacji technika ta może być również stosowana do analizy przepuszczalności naczyń krwionośnych i położenia makrocząsteczek w błonie wewnętrznej komórki śródbłonka.

using-en-face-immunofluorescence-staining-to-observe-vascular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Źródło: Gucciardo, E., et. al., model hodowli tkankowej ex vivo dla powikłań włóknisto-naczyniowych w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film szczegółowo opisuje protokół barwienia immunologicznego dla hodowli ex vivo tkanki włóknisto-naczyniowej osadzonej w żelu fibryny. Umożliwia to szczegółową wizualizację zmian naczyniowych związanych z proliferacyjną retinopatią...

Barwienie immunofluorescencyjne chorej tkanki włóknisto-naczyniowej pochodzącej od pacjenta z żelem

Źródło: Alluri, H., et al. Deprywacja tlenowo-glukozowa i reoksygenacja jako model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego in vitro do badania dysfunkcji bariery krew-mózg. J. Vis. Exp. (2015). Film pokazuje fluorescencyjną lokalizację białek połączeń ścisłych i włókien stresowych w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu szczura (RBMEC). W zestresowanej monowarstwie przeciwciała znakowane fluorescencyjnie są używane do znakowania białek połączeń ścisłych, podczas gdy znakowana...

Lokalizacja fluorescencyjna białek połączeń ścisłych i włókien stresowych w komórkach śródbłonka

Nasz raport opisuje unikalną metodę wizualizacji i analizy interakcji CTC/EC w raku prostaty w warunkach fizjologicznego przepływu.

Metody in vitro Metoda obserwacji interakcji za pośrednictwem selektyny E między krążącymi komórkami nowotworowymi prostaty pochodzącymi od pacjentów a ludzkimi komórkami śródbłonka

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Opisano procedurę przygotowania en face tętnicy szyjnej i aorty myszy. Takie preparaty, po immunofluorescencyjnym wybarwieniu specyficznymi przeciwciałami, umożliwiają badanie lokalizacji białek i identyfikację typów komórek w obrębie całej ściany naczyniowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

En Face Przygotowanie naczyń krwionośnych myszy

Poznaj technikę barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka mysiej aorty. Ta metoda umożliwia analizę fenotypu komórkowego pod wpływem różnych warunków ścinania.

Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych

Przeglądaj więcej filmów