Stosowanie barwienia immunofluorescencyjnego en face do bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych
20 sierpnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół barwienia immunofluorescencyjnego, aby bezpośrednio obserwować komórki śródbłonka aorty myszy. Technika ta jest przydatna podczas badania fenotypu komórkowego i molekularnego komórek śródbłonka w różnych wzorcach przepływu oraz w rozwoju miażdżycy.
Protokół ten pomaga ludziom analizować morfologię komórek śródbłonka i ekspresję cząsteczek w regionach pod wpływem różnych naprężeń ścinających płyn. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia bezpośrednią ocenę komórek śródbłonka naczyń krwionośnych pod wpływem różnych naprężeń ścinających płyn. Podczas wykonywania tej procedury kluczowymi krokami są użycie świeżo przygotowanego paraformaldehydu i wykonanie dobrej perfuzji.
Procedurę tę należy rozpocząć od znieczulenia 12-tygodniowej myszy C57BL/6, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc ogon. Przyklej łapki myszy do stosu ręczników papierowych za pomocą taśmy klejącej.
Przytrzymaj skórę myszy kleszczami i przetnij skórę nożyczkami od brzucha do górnej części klatki piersiowej. Otwórz jamę brzuszną, poniżej klatki piersiowej, ostrymi nożyczkami. Podnieś mostek za pomocą kleszczy i przetnij przeponę.
Następnie odetnij klatkę piersiową, aby odsłonić klatkę piersiową. Odetnij nożyczkami żyłę główną tuż nad wątrobą. Ciśnienie przenikać do drzewa tętniczego przez pięć minut, za pomocą wstępnie schłodzonej normalnej soli fizjologicznej zawierającej 40 jednostek na mililitr heparyny, przez lewą komorę, aż płuca i wątroba staną się blade.
Następnie perfuzjuj wstępnie schłodzonym 4% paraformaldehydem w PBS przez cztery minuty. Usuń wszystkie mięśnie, narządy i tłuszcz, aż aorta zostanie odsłonięta. Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.
Użyj delikatnych kleszczyków i delikatnych nożyczek, aby wyraźnie odsłonić aortę pod mikroskopem preparacyjnym i usunąć tkankę łączną wzdłuż aorty, tak czysto, jak to możliwe. Wypreparuj aortę piersiową od serca do pnia trzewnej za pomocą delikatnych nożyczek. Umieść aortę w sześciocentymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej z PBS.
Rozetnij aortę wzdłużnie, najpierw wzdłuż mniejszej krzywej, a następnie użyj mikronożyczek, aby rozciąć trzy gałęzie łuku aorty, w tym bezimienną, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową wzdłuż większej krzywej, aż do spotkania z odcinkiem prostym. Przepuszczalność aorty za pomocą 1% eteru polioksyetylenowooktylofenylowego w PBS przez 10 minut. Następnie zablokuj aortę 10% normalną surowicą kozią w tris-buforowanym roztworze soli fizjologicznej zawierającym 2,5% polisorbatu 20 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, na 12-dołkowej płytce do hodowli komórek.
Następnie inkubuj aortę w buforze blokującym zawierającym pięć gramów na mililitr królika anty-VCAM1 i pięć gramów na mililitr anty-VE-Kadheryny szczura, przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzykrotnym przepłukaniu próbki roztworem myjącym, nakładać sprzężone z fluorescencją przeciwciała drugorzędowe na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, trzymając w ciemnym miejscu. Spłucz kolejne trzy razy w roztworze myjącym.
Przeciwbarwić aortę DAPI przez 10 minut, trzymając w ciemnym miejscu. Następnie przepłukać poplamioną aortę trzykrotnie w roztworze myjącym. Umieść aortę na szkiełku nakrywkowym powierzchnią światła skierowaną w dół i powoli przesuwaj ją do roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu, który został wcześniej upuszczony na szkiełko nakrywkowe.
Delikatnie rozciągnij aortę, aby próbka była płaska. Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść je na szkiełku podstawowym. Uważaj, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza między próbką a szkłem.
Zbadaj aortę za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Analizuj intensywność kolorów różnych kanałów z żądanego obszaru na obrazach en face za pomocą oprogramowania Image-Pro Plus. Pokazano obrazy barwienia immunofluorescencyjnego en face komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z aorty myszy.
Immunofluorescencja en face białka adhezyjnego komórek naczyniowych i ekspresja z VE-kadheryną jako markerem śródbłonka są pokazane przy różnych wzorcach przepływu z różnych obszarów aorty myszy. DAPI poddano również barwieniu przeciwstawnemu, aby pokazać jądra komórkowe w celu lepszej wizualizacji. Patrząc przez stosy Z pod mikroskopem, komórki śródbłonka i mięśni gładkich można łatwo odróżnić na podstawie morfologii jąder komórkowych.
Jądra komórek śródbłonka mają owalny kształt i są większe niż wrzecionowate jądra komórek mięśni gładkich. Ekspresja VCAM-1 była bardziej obfita w regionach o zaburzonym przepływie, przy mniejszej krzywiźnie łuku aorty w porównaniu z regionami o stałym przepływie, przy większej krzywiźnie łuku aorty i w aorcie piersiowej. Tutaj obszary o mniejszej krzywiźnie aorty myszy są wskazane jako obszary przepływu d, a większa krzywizna i klatka piersiowa.
Przy odpowiedniej modyfikacji technika ta może być również stosowana do analizy przepuszczalności naczyń krwionośnych i położenia makrocząsteczek w błonie wewnętrznej komórki śródbłonka.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu bezpośredniej obserwacji komórek śródbłonka aorty mysiej. Technika ta jest skuteczna w analizie fenotypu komórkowego i molekularnego tych komórek w różnych warunkach naprężenia ścinającego płynu, w szczególności w kontekście rozwoju miażdżycy.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórek śródbłonka
- Badania nad miażdżycą
- Techniki immunofluorescencji
Wstęp
- Znaczenie komórek śródbłonka w biologii naczyniowej
- Rola naprężenia ścinającego w funkcji śródbłonka
- Związek między wzorcami przepływu a rozwojem miażdżycy
Zastosowane metody
- Protokół barwienia immunofluorescencyjnego
- Model mysi (C57BL/6)
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania
Główne wyniki
- Bezpośrednia ocena komórek śródbłonka z wykorzystaniem markerów fluorescencyjnych
- Zwiększona ekspresja VCAM-1 w obszarach zaburzonego przepływu
- Wyraźne rozróżnienie morfologii jąder komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza niezawodnej metody badania reakcji komórek śródbłonka na siły hemodynamiczne.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla zrozumienia biologii naczyń krwionośnych oraz mechanizmów leżących u podstaw miażdżycy.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Bezpośrednia wizualizacja nienaruszonych単warstw komórek śródbłonka pod wpływem fizjologicznego naprężenia ścinającego umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad celami naczyniowymi w miażdżycy. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez powiązanie sił hemodynamicznych z fenotypami molekularnymi in situ. Zapewnia ono system istotny z punktu widzenia choroby, pozwalający na wczesne zrozumienie patofizjologii bez konieczności stosowania manipulacji genetycznych lub perturbacji farmakologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację zaburzonych wzorców przepływu z nadekspresją VCAM-1 jako wczesnego markera stanu zapalnego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia niezawodną i powtarzalną metodę funkcjonalnej walidacji celu przy użyciu endogennych markerów śródbłonka, takich jak VE-Cadherin.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację odpowiedzi molekularnych poprzedzających powstanie zmian w przedklinicznych modelach miażdżycy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje standaryzowane, ilościowe wyniki immunofluorescencji odpowiednie do wysokotreściowej analizy fenotypów śródbłonkowych.
- Skalowalność: Umożliwia równoległą ocenę wielu obszarów aorty w określonych warunkach przepływu, co pozwala na badania porównawcze.
- Standaryzacja analizy: Wykorzystuje spójne protokoły perfuzji, blokowania i barwienia w celu zminimalizowania zmienności między eksperymentami i laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w chorobie: Bezpośrednio modeluje wczesną podatność na miażdżycę poprzez badanie odpowiedzi śródbłonka w obszarach podatnych na inicjację blaszki miażdżycowej.
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanobiologię hemodynamiczną z odczytami molekularnymi istotnymi dla ludzkiej patologii naczyniowej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka dla celów terapeutycznych poprzez walidację ich regulacji w warunkach patofizjologicznego naprężenia ścinającego przed testowaniem skuteczności in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celów, przez badania fenotypowe, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w programach koncentrujących się na naczyniach krwionośnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając bezpośrednią obserwację stanów aktywacji śródbłonka pod kontrolowanym naprężeniem ścinającym.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, multipleksowe odczyty (np. VCAM-1, VE-Cadherin, morfologia jądra) w celu porównania efektów związków chemicznych lub modyfikacji genetycznych w fenotypie śródbłonka.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na intensywności z rozdzielczością przestrzenną, co pozwala na statystyczne porównanie ekspresji molekularnej w różnych obszarach aorty.
- Badania translacyjne: Łączy modele przepływu in vitro z odpowiedziami śródbłonka typu in vivo, zwiększając wartość prognostyczną badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnie wykorzystywalną platformę fenotypowania naczyniowego, którą można zastosować w wielu projektach dotyczących miażdżycy, nadciśnienia lub stanu zapalnego naczyń.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie sił hemodynamicznych ze specyficznymi fenotypami molekularnymi śródbłonka w nienaruszonej tkance.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym etapom perfuzji, fiksacji i barwienia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez walidację oddziaływania na cel w warunkach istotnych patofizjologicznie bodźców mechanicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich regulację w wczesnych fenotypach śródbłonka miażdżycowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrodysekcji naczyń mysich, technik perfuzji oraz mikroskopii konfokalnej.
- Zależy od dostępu do sprzętu do perfuzji, mikroskopów stereoskopowych oraz konfokalnych systemów skanowania laserowego z funkcją rozplatania widmowego (spectral unmixing).
- Wymaga standaryzacji ciśnienia perfuzji, temperatury utrwalacza oraz miareczkowania przeciwciał pomiędzy różnymi użytkownikami i ośrodkami.
- Adaptacja do innych łożysk naczyniowych (np. tętnic szyjnych, tętnic wieńcowych) może wymagać optymalizacji etapów dysekcji i permeabilizacji.
- Ograniczona do analizy końcowej; nie umożliwia obrazowania dynamicznego w czasie rzeczywistym odpowiedzi śródbłonka w warunkach przepływu.
