Name: Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj metodę immunoprecypitacji Rev i spektrometrii masowej do identyfikacji czynników jąderkowych w replikacji HIV-1. Protokół umożliwia badanie czynników wirusowych i gospodarza w cyklu zakaźnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Barbarze K. Felber i dr George'owi N. Pavlakisowi za kulturę przylegającą do HLfB dostarczoną przez National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), NIH. Autorzy wymieniają również źródła finansowania zapewnione przez NIH, Granty AI042552 i AI029329.

<ol><li>Arizala, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+Localization+of+HIV-1+Rev+Is+Required%2C+Yet+Insufficient+for+Production+of+Infectious+Viral+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).</li>
<li>Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+B23+is+an+important+human+factor+for+the+nucleolar+localization+of+the+human+immunodeficiency+virus+protein+Tat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat.</a> Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).</li>
<li>Szebeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+protein+B23+stimulates+nuclear+import+of+the+HIV-1+Rev+protein+and+NLS-conjugated+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin.</a> Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).</li>
<li>Truant, R., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+arginine-rich+domains+present+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+Tat+and+Rev+function+as+direct+importin+beta-dependent+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).</li>
<li>Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+evolution+and+functional+diversification+in+the+members+of+the+nucleophosmin%2Fnucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Genetics. 173, 1835-1850 (2006).</li>
<li>Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+nucleophosmin%2Fnucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> BioEssays. 29, 49-59 (2007).</li>
<li>Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+nucleophosmin%2FB23%2C+a+nucleolar+acidic+protein%2C+as+a+histone+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone.</a> FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).</li>
<li>Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+protein+B23+has+molecular+chaperone+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities.</a> Protein Science. 8, 905-912 (1999).</li>
<li>Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+functional+domains+of+nucleolar+protein+B23%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the functional domains of nucleolar protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).</li>
<li>Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+nucleolar+proteins+shuttle+between+nucleus+and+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.</a> Cell. 56, 379-390 (1989).</li>
<li>Yun, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophosmin%2FB23+is+a+proliferate+shuttle+protein+associated+with+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).</li>
<li>Savkur, R. S., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+cleavage+in+pre-ribosomal+RNA+byprotein+B23+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).</li>
<li>Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribonuclease+activity+of+nucleolar+protein+B23%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The ribonuclease activity of nucleolar protein B23.</a> Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).</li>
<li>Grisendi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nucleophosmin+in+embryonic+development+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis.</a> Nature. 437, 147-153 (2005).</li>
<li>Itahana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+ARF+degrades+B23%2C+a+nucleolar+protein+involved+in+ribosome+biogenesis+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation.</a> Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).</li>
<li>Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophosmin%2FB23%2C+a+multifunctional+protein+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis.</a> Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).</li>
<li>Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+polyubiquitination+and+degradation+of+the+Arf+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor.</a> Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).</li>
<li>Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf-induced+turnover+of+the+nucleolar+nucleophosmin-associated+SUMO-2%2F3+protease+Senp3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3.</a> Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).</li>
<li>Horn, H. F., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer%3A+guarding+the+guardian%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer: guarding the guardian.</a> Nature. 427, 110-111 (2004).</li>
<li>Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophosmin+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nucleophosmin and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).</li>
<li>Dingwall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoplasmin+cDNA+sequence+reveals+polyglutamic+acid+tracts+and+a+cluster+of+sequences+homologous+to+putative+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals.</a> The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).</li>
<li>Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+complex+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+rev+and+nucleolar+B23+proteins%3A+dissociation+by+the+Rev+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element.</a> Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).</li>
<li>Valdez, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+of+the+protein+p120.+Interaction+with+translocation+protein+B23%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).</li>
<li>Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C23+interacts+with+B23%2C+a+putative+nucleolar-localization-signal-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%2FFEBS%22%5BJournal%5D)">C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein.</a> European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).</li>
<li>Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+targeting+signal+of+Rex+protein+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+I+specifically+binds+to+nucleolar+shuttle+protein+B-23%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).</li>
<li>Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nucleolar+protein+B23+with+peptides+related+to+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals.</a> Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).</li>
<li>Tsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+protein+B23+interacts+with+Japanese+encephalitis+virus+core+protein+and+participates+in+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication.</a> Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).</li>
<li>Ning, B., Shih, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+localization+of+human+hepatitis+B+virus+capsid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein.</a> Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).</li>
<li>Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+core+interacts+with+the+host+cell+nucleolar+protein%2C+nucleophosmin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1.</a> Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).</li>
<li>Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolar+phosphoprotein+B23+interacts+with+hepatitis+delta+antigens+and+modulates+the+hepatitis+delta+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).</li>
<li>Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-templated+replication+of+hepatitis+delta+virus%3A+genomic+and+antigenomic+RNAs+associate+with+different+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).</li>
<li>Yang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+nucleolin+and+its+identification+as+a+transcription+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).</li>
<li>Sarek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleophosmin+phosphorylation+by+v-cyclin-CDK6+controls+KSHV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000818(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Analizy spektrometrii mas porównujące mutacje Rev-NoLS i WT Rev w obecności HIV-1 oceniono w celu zrozumienia czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl replikacji wirusa. Pozwoliłoby to zidentyfikować składniki jąderkowe niezbędne do zakaźności wirusa. Jądro B23 ma wysokie powinowactwo do Rev-NoLS i działa w jąderkowej lokalizacji Rev3 i nukleocytoplazmatycznym transporcie mRNA HIV związanych z Rev22. Powinowactwo B23 z mutacjami Rev-NoLS, które zawierały pojedyncze lub w...

Jąderko jest postulowane jako miejsce interakcji różnych czynników komórkowych gospodarza i wirusa, niezbędnych do replikacji wirusa. Jąderko jest złożoną strukturą podzieloną na trzy różne przedziały: przedział fibrylarny, gęsty przedział fibrylarny i przedział ziarnisty. Białko HIV-1 Rev lokalizuje się specyficznie w przedziałach ziarnistych; Jednak przyczyna tego wzorca lokalizacji jest nieznana. W obecności mutacji jednopunktowych w sekwencji NoLS (mutacje Rev 4, 5 i 6), Rev utrzymuje wzór jąderkowy i wcześniej wykazano, że ratuje replikacjęHIV-1 HXB2, jednak ze zmniejszoną wydajnością w porównaniu do WT Rev1. Wszystkie mutacje jednopunktowe nie są w stanie utrzymać cyklu zakaźnegoHIV-1 NL4-3. W obecności wielu mutacji jednopunktowych w sekwencji NoLS (mutacje Rev-NoLS 2 i 9), zaobserwowano, że Rev rozprasza się w jądrze i cytoplazmie i nie był w stanie uratować replikacjiHIV-1 HXB21. Celem tego badania proteomicznego jest rozszyfrowanie jąderkowych i niejądrowych czynników komórkowych zaangażowanych w szlak zakaźny HIV-1 za pośrednictwem Rev. Warunki immunoprecypitacji Rev są optymalizowane poprzez interakcję z jąderkową fosfoproteiną B23, która, jak wykazano wcześniej, traci interakcję z Rev w obecności mutacji jąderkowych.
Rev czynniki komórkowe były intensywnie badane w przeszłości, jednak zostało to zrobione przy braku patogenezy wirusa. Jednym z białek, w szczególności scharakteryzowanym w tym badaniu poprzez interakcję Rev podczas replikacji HIV-1, jest jąderkowa fosfoproteina B23 - zwana również nukleofosminą (NPM), numatyną lub NO38 u2,3,4. B23 jest wyrażony jako trzy izoformy (NPM1, NPM2 i NPM3) - wszyscy członkowie rodziny nukleofosmin/nukleoplazminy opiekuńczych jądrowych5,6. Molekularny chaperon NPM1 funkcjonuje w prawidłowym składaniu nukleosomów, w tworzeniu kompleksów białko/kwas nukleinowych zaangażowanych w struktury chromatyny wyższego rzędu7,8, oraz w zapobieganiu agregacji i nieprawidłowemu fałdowaniu docelowych białek przez N-końcową domenę rdzeniową (reszty 1-120)9. Funkcjonalność NPM1 rozciąga się na genezę rybosomów poprzez transport cząstek prerybosomalnych między jądrem a cytoplazmą10,11, przetwarzanie prerybosomalnego RNA w wewnętrznej transkrybowanej sekwencji dystansowej12,13, oraz zatrzymanie jąderkowej agregacji białek podczas składania rybosomalnego14,15. NPM1 jest zaangażowany w hamowanie apoptozy16 oraz w stabilizację supresorów nowotworów ARF17,18 i p5319, ujawniając swoją podwójną rolę jako czynnika onkogennego i supresora nowotworu. NPM1 uczestniczy w czynnościach komórkowych związanych ze stabilnością genomu, replikacją centrosomów i transkrypcją. NPM1 znajduje się w jąderkach podczas interfazy cyklu komórkowego, wzdłuż obwodu chromosomów podczas mitozy oraz w ciałach przedjądrkowych (PNB) po zakończeniu mitozy. NPM2 i NPM3 nie są tak dobrze zbadane jak NPM1, który ulega zmienionym poziomom ekspresji podczas złośliwości20.
NPM1 jest udokumentowany w nukleocytoplazmatycznym przenoszeniu różnych białek jądrowych/jąderkowych przez wewnętrzny NES i NLS9,21 i wcześniej zgłoszono, że napędza import jądrowy białek HIV-1 Tat i Rev. W obecności białek fuzyjnych β-galaktozydazy wiążącej domenę B23, Tat nieprawidłowo lokalizuje się w cytoplazmie i traci aktywność transaktywacyjną; Świadczy to o silnym powinowactwie Tat do B232. W innym badaniu ustalono stabilny kompleks Rev/B23 przy braku mRNA zawierających RRE. W obecności mRNA RRE, Rev dysocjuje od B23 i wiąże się korzystnie z RRE HIV, co prowadzi do przemieszczenia B2322. Nie wiadomo, gdzie, na poziomie subjądrowym, zachodzi transaktywacja Tat i proces wymiany Rev witaminy B23 na mRNA wirusa HIV. Postuluje się, że oba białka dostają się do jąderka jednocześnie poprzez interakcję B23. Oczekuje się, że udział innych białek komórkowych gospodarza w szlaku jąderkowym HIV jest niebezpieczny. Metody opisane w tym badaniu proteomicznym pomogą wyjaśnić wzajemne oddziaływanie jąderka z czynnikami komórkowymi gospodarza zaangażowanymi w patogenezę HIV-1.
Badanie proteomiczne zostało zainicjowane poprzez ekspresję jednopunktowych mutacji Rev NoLS (M4, M5 i M6) oraz wielokrotnych podstawień argininy (M2 i M9) do produkcjiHIV-1 HXB2. W tym modelu linia komórkowa HeLa stabilnie eksprymująca HIV-1HXB2 z niedoborem Rev (HLfB) jest transfekowana mutacjami jąderkowymi WT Rev i Rev zawierającymi znacznik flagi na końcu 3'. Obecność WT Rev pozwoli na replikację wirusa w hodowli HLfB, w porównaniu z mutacjami Rev-NoLS, które nie ratują niedoboru Rev (M2 i M9) lub pozwalają na replikację wirusa, ale nie tak wydajnie jak WT Rev (M4, M5 i M6)1. Lizat komórkowy pobiera się 48 godzin później po proliferacji wirusa w obecności ekspresji Rev i poddaje immunoprecypitacji z buforem do lizy zoptymalizowanym pod kątem interakcji Rev / B23. Opisano optymalizację buforu lizy przy użyciu różnych stężeń soli, a metody elucji białek dla HIV-1 Rev są porównywane i analizowane w żelach SDS-PAGE barwionych srebrem lub Coomassie. Pierwsze podejście proteomiczne polega na bezpośredniej analizie eluowanej próbki z ekspresji WT Rev, M2, M6 i M9 za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Drugie podejście, w którym eluaty WT Rev, M4, M5 i M6 poddano procesowi ekstrakcji żelu, porównano z pierwszym podejściem. Analizowane jest powinowactwo peptydów do mutacji Rev-NoLS w porównaniu z WT Rev i wyświetlane jest prawdopodobieństwo identyfikacji białka. Podejścia te ujawniają potencjalne czynniki (jąderkowe i niejądrowe), które uczestniczą w transporcie mRNA HIV-1 i splicingu z Rev podczas replikacji HIV-1. Ogólnie rzecz biorąc, opisane warunki lizy komórek, IP i elucji mają zastosowanie do białek wirusowych będących przedmiotem zainteresowania w celu zrozumienia czynników komórkowych gospodarza, które aktywują i regulują szlaki zakaźne. Ma to również zastosowanie do badania czynników gospodarza komórkowego wymaganych do przetrwania różnych modeli choroby. W tym modelu proteomicznym HIV-1 Rev IP jest zoptymalizowany pod kątem interakcji B23 w celu wyjaśnienia czynników jąderkowych zaangażowanych w aktywność wahadłową nukleocytoplazmy i wiązanie mRNA HIV-1. Ponadto można opracować linie komórkowe ze stabilną ekspresją modeli chorób zakaźnych, które są niewystarczające dla kluczowych białek będących przedmiotem zainteresowania, podobnie jak w przypadku linii komórkowej HLfB, w celu zbadania interesujących szlaków zakaźnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid: bisakryloamid</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Fisher Chemical</td><td>A643-500</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Powinowactwo ANTI-Flag M2 żel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>mysi monoklonalny IgG przeciw Flag M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS film</td><td>Carestream</td><td>8294985</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad Koncentrat odczynnika do oznaczania białek Bio-Rad, 450 ml</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>B23 mysi monoklonalny IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-47725</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Goździk beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Nestle</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>179693PK</td><td></td></tr><tr><td>C18IonKey kolumna nanoTile</td><td>Wody</td><td>186003763</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100-mm naczynia hodowlane z powłoką TC</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-22</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Thermo Naukowe</td><td>J1539714</td><td></td></tr><tr><td>1 x DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CVRS</td><td></td></tr><tr><td>ECL Podłoże do bibułowania Estern</td><td>Pierce</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof</td><td>Fisher Chemical</td><td>A409-4</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Odczynnik</td> do niebieskiej plamy Fisher Chemical <td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GelCode</td><td>ThermoFisher</td><td>24590</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Chemical</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>kozio-anty-mysie IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>ACROS Organics</td><td>122270050</td><td></td></tr><tr><td>KimWipe delikatna wycieraczka do zadań</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoAcuity UPLC</td><td>Waters</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>24600df</td><td></td></tr><tr><td>15-mL Polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF&nbsp; Membrana Western blotting</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>10 x TBS</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>1610880edu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 roztwór detergentu</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>źródło trizaiku</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-051-CIS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Spektrometr masowy BioRad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>Synapt G2</td><td>Wody</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Tisch</td><td>Scientific 10427813</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji hiv-1 poprzez immunoprecypitację rev i spektrometrię mas

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Cykl zakaźny HIV-1 wymaga interakcji białka wirusa z czynnikami gospodarza, aby ułatwić replikację, pakowanie i uwalnianie wirusa. Cykl infekcyjny wymaga ponadto tworzenia kompleksów białkowych wirus/gospodarz z RNA HIV-1 w celu regulacji splicingu i umożliwienia transportu nukleocytoplazmatycznego. Białko HIV-1 Rev realizuje eksport jądrowy mRNA HIV-1 poprzez multimeryzację z intronicznymi celami cis-działającymi - elementem odpowiedzi Rev (RRE). Sygnał lokalizacji jąderkowej (NoLS) istnieje w końcu COOH motywu bogatego w argininę Rev (ARM), umożliwiając akumulację kompleksów Rev / RRE w jąderku. Spekuluje się, że czynniki jąderkowe wspierają cykl zakaźny HIV-1 poprzez różne inne funkcje, oprócz pośredniczenia w niezależnym od mRNA eksporcie jądrowym i splicingu. Opisano metodę immunoprecypitacji Rev typu dzikiego (WT) w porównaniu z mutacjami jąderkowymi Rev (delecja i jednopunktowe mutacje Rev-NoLS) w obecności replikacji HIV-1 do spektrometrii mas. Czynniki jąderkowe biorące udział w transporcie nukleocytoplazmatycznym (nukleofosmina B23 i nukleolina C23), a także komórkowe czynniki splicingowe, tracą interakcję z Rev w obecności mutacji Rev-NoLS. Stwierdzono, że różne inne czynniki jąderkowe, takie jak snoRNA C/D box 58, tracą interakcję z mutacjami Rev, ale ich funkcja w cyklu replikacji HIV-1 pozostaje nieznana. Przedstawione tutaj wyniki pokazują zastosowanie tego podejścia do identyfikacji czynników jąderkowych wirusa/gospodarza, które utrzymują cykl zakaźny HIV-1. Koncepcje stosowane w tym podejściu mają zastosowanie do innych modeli wirusowych i chorobowych wymagających charakterystyki niedostatecznie zbadanych szlaków.

Jedno- i wielopunktowe mutacje argininy Rev-NoLS, odpowiadające różnorodnym wzorcom lokalizacji subkomórkowej, zostały zbadane pod kątem ich zdolności do interakcji z czynnikami gospodarza komórkowego w porównaniu z WT Rev. Flaga WT Rev-3 i wektor flagi pcDNA uległy ekspresji w hodowli HLfB. Kompleksy białkowe przetworzono z całkowitego lizatu komórkowego i wybarwiono odczynnikiem do barwienia srebrem. Flaga Rev-NoLS-3 jest wykrywalna (około 18 kDa) w trzech różnych warunkach bufora lizy zawierających różne stęż...

Tutaj opisujemy immunoprecypitację Rev w obecności replikacji HIV-1 dla spektrometrii mas. Opisane metody mogą być stosowane do identyfikacji czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl zakaźny HIV-1 i mają zastosowanie do innych modeli chorób w celu scharakteryzowania niedostatecznie zbadanych szlaków.

Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Nasz protokół zapewnia alternatywne metody identyfikacji i charakterystyki wirusowych, jąderkowych i niejąderkowych czynników gospodarza, które utrzymują cykl zakaźny HIV-1. Koncepcje stosowane w tym podejściu mają zastosowanie do innych modeli wirusowych i chorobowych wymagających charakterystyki niedostatecznie zbadanych szlaków. Opisano techniki rozwiązywania problemów dotyczące modyfikacji innych modeli białek.Procedurę zademonstrują Haitang Li i Pritsana Chomchan, naukowcy z Wydziału Biologii Molekularnej i Komórkowej w Instytucie Badawczym Beckmana w City of Hope, oraz Roger Moore, członkowie City of Hope Proteomics Core i Department of Molecular Immunology. Zacznij od wyhodowania hodowli linii komórkowej HLfB ze stabilną ekspresją HeLa na trzech 100-milimetrowych płytkach hodowlanych do gęstości od dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr. Gdy komórki osiągną odpowiednie stężenie, wymieszaj 20 mikrogramów plazmidu zawierającego mutację jądra Rev sygnalizującą mutację trójelementową flagi z 1,76 mililitra TE 79/10 w 15-mililitrowej probówce, a następnie dodaj 240 mikrolitrów dwumolowego chlorku wapnia, dokładnie mieszając.Następnie przenieś zawartość probówki kroplami do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry 2x HBS, a następnie wymieszaj na maszynie wirowej. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej odwiruj opady. Dodaj kroplami jeden mililitr zawiesiny do każdej z trzech 100-milimetrowych płytek hodowlanych HLfB, delikatnie obracając pożywkę.Po sześciogodzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp mieszaninę transfekcji 10 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i włóż komórki z powrotem do inkubatora na kolejne 42 godziny. 48 godzin po transfekcji umieść każdą płytkę na podłożu lodowym w kapturze do hodowli tkankowej poziomu zagrożenia biologicznego. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i delikatnie przepłucz komórki 10 mililitrami wstępnie schłodzonego PBS, nie naruszając warstw komórkowych.Wyrzuć PBS po wypłukaniu komórek. Następnie potraktuj komórki jednym mililitrem buforu do lizy, uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy, na płytkę. Przechylając płytki, aby zebrać komórki w kałużę, użyj skrobaka do komórek, aby ręcznie rozbić warstwy.Używając mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, połącz lizat z każdej płytki we wstępnie schłodzonej, 15-mililitrowej probówce na 15-minutową inkubację na lodzie, z wirowaniem co pięć minut. Pod koniec inkubacji porcjować lizaty do trzech 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek i zbierać lizaty przez odwirowanie. Przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki i uzyskaj stężenie lizatu białka wirusa, jak opisano w manuskrypcie.W celu koimmunoprecypitacji sygnału lokalizacji jąderka Rev flagi three-prime, należy trzykrotnie przepłukać 25 mikrolitrów kulek żelowych powinowactwa M2 500 mikrolitrami świeżego buforu do lizy, uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy, na jedno pranie. Wykonaj te czynności w chłodni lub z odczynnikami na lodzie. Po ostatnim płukaniu dodaj stężenie jednego miligrama na mililitr lizatu białka wirusa do wypłukanych kulek w końcowej objętości pięciu mililitrów buforu do lizy.Inkubować reakcję przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją. Pod koniec inkubacji osadzać kulki sprzężone z lizatem białka wirusa przez odwirowanie. Zebrać supernatant do pomiaru stężenia białka lizatu po immunoprecypitacji.Zapoznaj się z rękopisem, aby uzyskać instrukcje dotyczące przechowywania próbek. Dodaj 750 mikrolitrów buforu do lizy wirusa sprzężonego z lizatem, przenieś kulki do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i myj kulki na rotatorze przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz kulki przez odwirowanie, aby uzyskać dodatkowe dwa płukania na rotatorze, jak pokazano poniżej.Po ostatnim praniu użyj ściśniętej, długiej, żelowej końcówki, aby usunąć wszelkie ślady buforu do lizy z kompleksu kulkowo-koimmunoprecypitacyjnego. Ponownie zawieś kulki w 55 mikrolitrach 2x bufora ładującego. Następnie gotuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.Załaduj 25 mikrolitrów eluatu na jeden żel Western blot i jeden żel barwiący Coomassie SDS-PAGE. Po zakończeniu elektroforezy żelowej SDS-PAGE należy trzykrotnie spłukać żel w 25 mililitrach ultraczystej wody przez 15 minut. Po ostatnim praniu dodaj 100 mililitrów odczynnika do barwienia Coomassie na żel.Zobacz rękopis, aby zapoznać się z pełnym protokołem barwienia. Do trawienia opasek żelowych najpierw użyj czystej żyletki, aby pociąć opaski żelu z całego pasa żelu, reprezentującego każdą mutację, na około pięciomilimetrowe kostki. Umieść każdą pasmo w czystej, 0,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.Przykryj pasma dwukrotnie 100-milimolowym wodorowęglanem amonu w roztworze acetonitrylu do wody jeden do jednego w temperaturze pokojowej przez 15 minut na pranie. Następnie susz kawałki żelu przez pięć minut w wirówce próżniowej. Aby zredukować białka, przykryj wysuszone kawałki żelu 10-milimolowym ditiotreitolem w 100-milimolowym wodorowęglanie amonu na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 56 stopni Celsjusza, a następnie alkilowanie w 100-milimolowym jodoacetamidu w wodzie przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.Następnie obkurcz i ponownie spęczniaj kawałki żelu dwa razy acetonitrylem, a następnie 100-milimolowym wodorowęglanem amonu, oba delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po drugim pęcznieniu suszyć kawałki żelu przez pięć minut w wirówce próżniowej. Spęcznić kawałki żelu 50 nanogramami na mikrolitr zmodyfikowanej trypsyny klasy sekwencjonowania w 100-milimolowym wodorowęglanie amonu.Po pięciu minutach przykryj kawałki żelu 100-milimolowym wodorowęglanem amonu i pozwól im całkowicie spęcznieć, dodając dodatkowy 100-milimolowy wodorowęglan amonu, aby spuchnięte kawałki żelu zostały całkowicie pokryte. Następnie inkubować kawałki żelu przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując reakcję z 1/10 objętości próbek z 10% kwasem mrówkowym w wodzie następnego ranka i zebrać supernatant z każdej probówki. Sygnał lokalizacji jądra Rev flaga trzyprymaryczna jest wykrywalna w trzech różnych warunkach bufora lizy zawierającego różne stężenia chlorku sodu.B23 jest również wykrywalna w buforze do lizy zawierającym niższe stężenie soli, ledwo wykrywalna w buforze do lizy zawierającym średnie stężenie soli i niewykrywalna w buforze do lizy zawierającym wysokie stężenie soli. Detekcja B23 jest optymalna w buforze do lizy zawierającym chlorek sodu o niskim stężeniu z flagą trójpierwszorzędną Rev typu dzikiego i traci powinowactwo do sygnału lokalizacji jądra Rev M1 flagi trójliczbowej. Powinowactwo B23 do flagi trzech liczb pierwszych typu dzikiego Rev również zmniejsza się wraz z wyższym stężeniem soli, a kontrola negatywna pcDNA nie daje nieswoistej immunodetekcji po immunoprecypitacji w obu warunkach bufora lizy.Sygnał lokalizacji jądra Rev z trzema liczbami pierwszymi jest najbardziej wykrywalny po elucji poprzez gotowanie w buforze ładującym 2x próbkę, podczas gdy B23 jest wykrywalny zarówno w warunkach inkubacji bufora próbki 37, jak i 95 stopni Celsjusza. Po immunoprecypitacji i barwieniu srebrem, jak wykazano, sygnały lokalizacji jąderka Rev i Rev typu dzikiego M2, M6 i M9 są wykrywalne przy 18 kilodaltonach. Pasma odpowiadające białku B23 obserwuje się również na markerze 37 kilodaltonów.Barwienie odczynnikiem Coomassie dodatkowo demonstruje wykrywalność flagi trzech liczb pierwszych w przypadku obecności i braku mutacji przy 18 kilodaltonach. Użyj tylu kontrol, zarówno pozytywnych, jak i negatywnych, ile jest to konieczne w przypadku odniesień, które odnoszą się do Twojego modelu choroby podczas procesu rozwiązywania problemów i badań przesiewowych pod kątem potencjalnych czynników wiążących. Wszystkie mutacje delecyjne i jednopunktowe można zbadać pod kątem aktywności dominująco-ujemnej poprzez multimeryzację z Rev typu dzikiego i wykorzystać do zatrzymania replikacji HIV-1.

identification-nucleolar-factors-during-hiv-1-replication-through-rev

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Odsłonięcie (uncoating) jest kluczowym etapem wczesnej fazy cyklu życiowego HIV-1 i definiuje się je jako rozpad otoczki kapsydu oraz uwolnienie wirusowego kompleksu rybonukleoproteinowego (vRNP). W niniejszej pracy prezentujemy techniki izolacji nienaruszonych rdzeni z wirionów HIV-1 oraz metody ilościowego oznaczania ich odsłaniania in vitro.

In vitro rozpakowywanie rdzeni HIV-1

Opracowano metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wizualnej detekcji wirusowego RNA genomowego przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Przygotowano sondę specyficzną dla wirusowego RNA, która może być następnie identyfikowana za pomocą kombinacji technik hybrydyzacji i immunofluorescencji. Technika ta daje możliwość określenia lokalizacji wirusowego RNA lub DNA w stanie stacjonarnym, dostarczając informacji o kontroli procesów wewnątrzkomórkowego transportu wirusa.

Wykrywanie wirusowego RNA za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH)

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Ten protokół opisuje NAZWĘ, test, który pozwala na szybką identyfikację cząsteczek zdolnych do hamowania in vitro aktywności opiekuńczej białka nukleokapsydu HIV-1.

Test elektroforezy za pośrednictwem wyżarzania nukleokapsydu (NAME) umożliwia szybką identyfikację inhibitorów nukleokapsydu HIV-1

Konkurencja wzrostu między prawie izogenicznymi wirusami dostarcza czułego pomiaru do określenia względnej zdolności replikacji. Opisane tutaj protokoły obejmują budowę rekombinowanych klonów HIV-1, rozmnażanie wirusa i konkurencję wzrostu oraz metody analizy zoptymalizowane w celu uzyskania czułych i spójnych wyników.

Test konkurencji wzrostu parami do określania zdolności replikacji ludzkich wirusów niedoboru odporności

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Protokół o wysokiej przepustowości do oceny funkcjonalnej skutecznej reaktywacji i usuwania utajonych prowirusów HIV jest opisany i stosowany poprzez testowanie wpływu interwencji na transkrypcję i splicing HIV. Przedstawiono reprezentatywne wyniki wpływu czynników odwracających opóźnienia na transkrypcję i splicing sterowany przez LTR.

Wysokoprzepustowa ocena in vitro czynników odwracających opóźnienia w transkrypcji i splicingu HIV

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj opisujemy kilka sprawdzonych metod określania stresu retikulum endoplazmatycznego (ER) i aktywacji odpowiedzi na nieswojone białko (UPR), ze szczególnym naciskiem na zakażenie HIV-1. W artykule opisano również zestaw protokołów do badania wpływu stresu ER/UPR na replikację HIV-1 i zakaźność wirionu.

Pomiar stresu retikulum endoplazmatycznego i odpowiedzi na niesfałdowane białko w limfocytach T zakażonych HIV-1 i analiza jego roli w replikacji HIV-1

Poznaj metodę immunoprecypitacji Rev i spektrometrii masowej do identyfikacji czynników jąderkowych w replikacji HIV-1. Protokół umożliwia badanie czynników wirusowych i gospodarza w cyklu zakaźnym.

Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

Przeglądaj więcej filmów