Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

Nasz protokół zapewnia alternatywne metody identyfikacji i charakterystyki wirusowych, jąderkowych i niejąderkowych czynników gospodarza, które utrzymują cykl zakaźny HIV-1. Koncepcje stosowane w tym podejściu mają zastosowanie do innych modeli wirusowych i chorobowych wymagających charakterystyki niedostatecznie zbadanych szlaków. Opisano techniki rozwiązywania problemów dotyczące modyfikacji innych modeli białek.

Procedurę zademonstrują Haitang Li i Pritsana Chomchan, naukowcy z Wydziału Biologii Molekularnej i Komórkowej w Instytucie Badawczym Beckmana w City of Hope, oraz Roger Moore, członkowie City of Hope Proteomics Core i Department of Molecular Immunology. Zacznij od wyhodowania hodowli linii komórkowej HLfB ze stabilną ekspresją HeLa na trzech 100-milimetrowych płytkach hodowlanych do gęstości od dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr. Gdy komórki osiągną odpowiednie stężenie, wymieszaj 20 mikrogramów plazmidu zawierającego mutację jądra Rev sygnalizującą mutację trójelementową flagi z 1,76 mililitra TE 79/10 w 15-mililitrowej probówce, a następnie dodaj 240 mikrolitrów dwumolowego chlorku wapnia, dokładnie mieszając.

Następnie przenieś zawartość probówki kroplami do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry 2x HBS, a następnie wymieszaj na maszynie wirowej. Po 30 minutach w temperaturze pokojowej odwiruj opady. Dodaj kroplami jeden mililitr zawiesiny do każdej z trzech 100-milimetrowych płytek hodowlanych HLfB, delikatnie obracając pożywkę.

Po sześciogodzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych zastąp mieszaninę transfekcji 10 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i włóż komórki z powrotem do inkubatora na kolejne 42 godziny. 48 godzin po transfekcji umieść każdą płytkę na podłożu lodowym w kapturze do hodowli tkankowej poziomu zagrożenia biologicznego. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych i delikatnie przepłucz komórki 10 mililitrami wstępnie schłodzonego PBS, nie naruszając warstw komórkowych.

Wyrzuć PBS po wypłukaniu komórek. Następnie potraktuj komórki jednym mililitrem buforu do lizy, uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy, na płytkę. Przechylając płytki, aby zebrać komórki w kałużę, użyj skrobaka do komórek, aby ręcznie rozbić warstwy.

Używając mikropipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, połącz lizat z każdej płytki we wstępnie schłodzonej, 15-mililitrowej probówce na 15-minutową inkubację na lodzie, z wirowaniem co pięć minut. Pod koniec inkubacji porcjować lizaty do trzech 1,5-mililitrowych probówek do mikrowirówek i zbierać lizaty przez odwirowanie. Przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki i uzyskaj stężenie lizatu białka wirusa, jak opisano w manuskrypcie.

W celu koimmunoprecypitacji sygnału lokalizacji jąderka Rev flagi three-prime, należy trzykrotnie przepłukać 25 mikrolitrów kulek żelowych powinowactwa M2 500 mikrolitrami świeżego buforu do lizy, uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy, na jedno pranie. Wykonaj te czynności w chłodni lub z odczynnikami na lodzie. Po ostatnim płukaniu dodaj stężenie jednego miligrama na mililitr lizatu białka wirusa do wypłukanych kulek w końcowej objętości pięciu mililitrów buforu do lizy

Inkubować reakcję przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją. Pod koniec inkubacji osadzać kulki sprzężone z lizatem białka wirusa przez odwirowanie. Zebrać supernatant do pomiaru stężenia białka lizatu po immunoprecypitacji.

Zapoznaj się z rękopisem, aby uzyskać instrukcje dotyczące przechowywania próbek. Dodaj 750 mikrolitrów buforu do lizy wirusa sprzężonego z lizatem, przenieś kulki do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki i myj kulki na rotatorze przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz kulki przez odwirowanie, aby uzyskać dodatkowe dwa płukania na rotatorze, jak pokazano poniżej.

Po ostatnim praniu użyj ściśniętej, długiej, żelowej końcówki, aby usunąć wszelkie ślady buforu do lizy z kompleksu kulkowo-koimmunoprecypitacyjnego. Ponownie zawieś kulki w 55 mikrolitrach 2x bufora ładującego. Następnie gotuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Załaduj 25 mikrolitrów eluatu na jeden żel Western blot i jeden żel barwiący Coomassie SDS-PAGE. Po zakończeniu elektroforezy żelowej SDS-PAGE należy trzykrotnie spłukać żel w 25 mililitrach ultraczystej wody przez 15 minut. Po ostatnim praniu dodaj 100 mililitrów odczynnika do barwienia Coomassie na żel.

Zobacz rękopis, aby zapoznać się z pełnym protokołem barwienia. Do trawienia opasek żelowych najpierw użyj czystej żyletki, aby pociąć opaski żelu z całego pasa żelu, reprezentującego każdą mutację, na około pięciomilimetrowe kostki. Umieść każdą pasmo w czystej, 0,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Przykryj pasma dwukrotnie 100-milimolowym wodorowęglanem amonu w roztworze acetonitrylu do wody jeden do jednego w temperaturze pokojowej przez 15 minut na pranie. Następnie susz kawałki żelu przez pięć minut w wirówce próżniowej. Aby zredukować białka, przykryj wysuszone kawałki żelu 10-milimolowym ditiotreitolem w 100-milimolowym wodorowęglanie amonu na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 56 stopni Celsjusza, a następnie alkilowanie w 100-milimolowym jodoacetamidu w wodzie przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Następnie obkurcz i ponownie spęczniaj kawałki żelu dwa razy acetonitrylem, a następnie 100-milimolowym wodorowęglanem amonu, oba delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po drugim pęcznieniu suszyć kawałki żelu przez pięć minut w wirówce próżniowej. Spęcznić kawałki żelu 50 nanogramami na mikrolitr zmodyfikowanej trypsyny klasy sekwencjonowania w 100-milimolowym wodorowęglanie amonu.

Po pięciu minutach przykryj kawałki żelu 100-milimolowym wodorowęglanem amonu i pozwól im całkowicie spęcznieć, dodając dodatkowy 100-milimolowy wodorowęglan amonu, aby spuchnięte kawałki żelu zostały całkowicie pokryte. Następnie inkubować kawałki żelu przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zatrzymując reakcję z 1/10 objętości próbek z 10% kwasem mrówkowym w wodzie następnego ranka i zebrać supernatant z każdej probówki. Sygnał lokalizacji jądra Rev flaga trzyprymaryczna jest wykrywalna w trzech różnych warunkach bufora lizy zawierającego różne stężenia chlorku sodu.

B23 jest również wykrywalna w buforze do lizy zawierającym niższe stężenie soli, ledwo wykrywalna w buforze do lizy zawierającym średnie stężenie soli i niewykrywalna w buforze do lizy zawierającym wysokie stężenie soli. Detekcja B23 jest optymalna w buforze do lizy zawierającym chlorek sodu o niskim stężeniu z flagą trójpierwszorzędną Rev typu dzikiego i traci powinowactwo do sygnału lokalizacji jądra Rev M1 flagi trójliczbowej. Powinowactwo B23 do flagi trzech liczb pierwszych typu dzikiego Rev również zmniejsza się wraz z wyższym stężeniem soli, a kontrola negatywna pcDNA nie daje nieswoistej immunodetekcji po immunoprecypitacji w obu warunkach bufora lizy.

Sygnał lokalizacji jądra Rev z trzema liczbami pierwszymi jest najbardziej wykrywalny po elucji poprzez gotowanie w buforze ładującym 2x próbkę, podczas gdy B23 jest wykrywalny zarówno w warunkach inkubacji bufora próbki 37, jak i 95 stopni Celsjusza. Po immunoprecypitacji i barwieniu srebrem, jak wykazano, sygnały lokalizacji jąderka Rev i Rev typu dzikiego M2, M6 i M9 są wykrywalne przy 18 kilodaltonach. Pasma odpowiadające białku B23 obserwuje się również na markerze 37 kilodaltonów.

Barwienie odczynnikiem Coomassie dodatkowo demonstruje wykrywalność flagi trzech liczb pierwszych w przypadku obecności i braku mutacji przy 18 kilodaltonach. Użyj tylu kontrol, zarówno pozytywnych, jak i negatywnych, ile jest to konieczne w przypadku odniesień, które odnoszą się do Twojego modelu choroby podczas procesu rozwiązywania problemów i badań przesiewowych pod kątem potencjalnych czynników wiążących. Wszystkie mutacje delecyjne i jednopunktowe można zbadać pod kątem aktywności dominująco-ujemnej poprzez multimeryzację z Rev typu dzikiego i wykorzystać do zatrzymania replikacji HIV-1.