Name: Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 s
Description: Poznaj szybką strategię przesiewową związków wpływających na wzrost komórek ssaków przy użyciu dwóch równoległych testów. Ta metoda pozwala identyfikować związki cytotoksyczne oraz te hamujące lub wspierające proliferację komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NINDS Intramural Research Program.

1. Kultura NSC
UWAGA: Manipulacja ludzką linią NSC zostanie opisana poniżej, ale dowolna linia komórkowa może być użyta do tego protokołu. Wszystkie prace związane z hodowlą komórkową wykonywane są w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Pokryj 96-dołkową płytkę błoną podstawną/macierzą zewnątrzkomórkową (ECM).
	<ol>
		<li>Rozmrozić podwielokrotność ECM (Tabela Materiałów), która ułatwi mocowanie NSC, na lodzie. Rozcieńczyć ECM do odpowiedniego stężenia (zwykle 1:100) w 10 ml pożywki bazowej (tabela materiałów) i dodać 50 μl na studzienkę do każdego z 60 dołków wewnętrznych płytki 96-dołkowej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). Używaj tylko wewnętrznych 60 studzienek, aby uniknąć artefaktów, które mogą wynikać z efektu krawędzi16.</li>
		<li>Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) przez co najmniej 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja i płytka nerwowych komórek macierzystych. 
	UWAGA: Komórki do użycia w tej metodzie powinny być hodowane do co najmniej 80% konfluencji w kolbie T75.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek w kolbie T75 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce NSC, która składa się z pożywki zasadowej, B27, aminokwasów endogennych, 2 mM glutaminy i 10 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGFb lub FGF2).</li>
		<li>Wyjmij komórki z inkubatora, gdy osiągną 80% zbieżności i odessaj pożywkę NSC. Dodać odpowiednią ilość odczynnika do dysocjacji komórek (3 ml dla kolby T75; Tabela materiałów) i inkubować przez 5 minut w inkubatorze.</li>
		<li>Po inkubacji dodać 7 ml pożywki NSC do kolby T75 i energicznie pipetować, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączą. Przenieść zdysocjowany roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 200 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki NSC i zliczyć komórki.</li>
		<li>Dostosuj koncentrację komórek do 200 000 komórek/ml za pomocą pożywki NSC. Upewnij się, że komórki są całkowicie ponownie zawieszone w celu jednorodnego posiewu w studzienkach.</li>
		<li>Płytka 100 μl mieszaniny komórek (20 000 komórek) w 60 studzienkach wewnętrznych trzech 96-dołkowych płytek, które zostały pokryte zgodnie z opisem w sekcji 1.1. Użyj sześciu z ośmiu szczelin 8-kanałowego pipetora wielokanałowego, aby płytkować komórki kolumna po kolumnie.</li>
		<li>Dodać 100 μl pożywki zasadowej lub pożywki NSC do wszystkich studzienek bez komórek, aby zminimalizować potencjalne parowanie z najbardziej zewnętrznych studzienek.</li>
		<li>Pod mikroskopem hodowli komórkowej sprawdź wzrokowo co najmniej 10 dołków na każdej z trzech 96-dołkowych płytek, aby potwierdzić, że komórki są wysiewane w oczekiwanej gęstości. Nie należy przystępować do testu, jeśli komórki są posiane z gęstością zbyt rzadką lub zbyt gęstą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Leczenie komórek związkami
UWAGA: Domowa biblioteka testowana w tej demonstracji zawiera związki, które modulują szlaki sygnałowe bezskrzydłe/zintegrowane (Wnt), kwas retinowy, transformujący czynnik wzrostu-beta (TGF-β) i soniczny jeż, a także różne kinazy tyrozynowe.
<ol>
	<li>Pierwotne badanie eksploracyjne pod kątem toksyczności/liczby komórek
	<ol>
		<li>Podwielokrotność 50−100 μl maksymalnie 57 badanych związków (tabela uzupełniająca 1) przy stężeniu 10 mM w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do wewnętrznych 60 dołków 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, V lub okrągłodennym z trzema studzienkami DMSO jako kontrolą (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 1 dla mapy płyty). Będzie to służyć jako główna płytka złożona z 25 μl mieszanki, którą można kilkakrotnie zamrażać i rozmrażać. 
		UWAGA: Nie należy używać płytek z płaskim dnem, ponieważ trudniej będzie zassać z nich małe objętości związków za pomocą pipetora stołowego.</li>
		<li>Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora 16-24 godziny po podzieleniu, jak opisano w sekcji 1, i odessać pożywkę NSC kolumna po kolumnie za pomocą 8-kanałowego pipetora wielodołkowego, używając tylko sześciu z ośmiu szczelin wielodołkowych. Dodać 95 μl świeżej pożywki NSC do komórek na każdej z trzech płytek repliki i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze do momentu zakończenia kroku 2.1.4 poniżej.</li>
		<li>Dodać 49 μl pożywki NSC do każdej z 60 wewnętrznych studzienek pustej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, V lub okrągłodennej z 8-kanałowym pipetem wielodołkowym. Rozszczelnić płytkę wzorcową i za pomocą pipety stołowej lub równoważnego przyrządu odpipetować 1 μl związku z płytki wzorcowej do 49 μl pożywki NSC w każdym z 60 wewnętrznych studzienek.</li>
		<li>Wymieszaj rozcieńczony związek 3x z pipetorem stołowym.</li>
		<li>Wyjąć z inkubatora trzy 96-dołkowe płytki NSC, odpipetować 15 μl każdego rozcieńczonego związku za pomocą pipetora stołowego i dozować 5 μl podwielokrotności związku do każdej z trzech płytek. 
		UWAGA: To rozcieńczenie związku w stosunku 1:20 do komórek w połączeniu z początkowym rozcieńczeniem 1:50 w kroku 2.1.3 daje rozcieńczenie 1:1000 takie, że końcowe stężenie związków na NSC wyniesie 10 μM przy stężeniu DMSO 0,1%, a końcowe stężenie dla kontroli DMSO wyniesie 0,1%.</li>
		<li>Inkubować komórki ze związkiem przez 72 godziny i przystąpić do testów cytotoksyczności. Można stosować krótsze odstępy czasu, ale 72-godzinny okres inkubacji powinien maksymalizować potencjalne efekty cytotoksyczne badanych związków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test dawka-odpowiedź 
	UWAGA: Konfiguracja dla 96-dołka używanego do odpowiedzi na dawkę jest wyświetlana w Rysunek 2.
	<ol>
		<li>Użyć kolumny 2 dla sześciu kontrprób kontrolnych DMSO i przeprowadzić potrójne próby maksymalnie trzech różnych związków w dwukrotnych seryjnych rozcieńczeniach przy sześciu dawkach, zaczynając od wysokiej dawki 10 μM.</li>
		<li>Rozcieńczyć 4 μl DMSO lub badanego związku w DMSO w 196 μl pożywki NSC w 1,5 ml probówce do mikrowirówki. Dodać 25 μl DMSO do kolumny studzienek z B2-G2 i 50 μl badanych związków do rzędu z B3-B11 z trzema badanymi związkami w 10 mM triplikatach w rzędach B3-B5, B6-B8 i B9-B11.</li>
		<li>Odpipetować 25 μl pożywki NSC do pozostałych pustych kolumn w wewnętrznej części płytki 96-dołkowej. Usunąć 25 μl związku z dołków B3-B11 za pomocą pipetora wielokanałowego, dodać do studzienek C3-C11 i wymieszać co najmniej pięć razy. Powtórzyć proces dla pozostałych rzędów, aby wytworzyć potrójne roztwory w dwukrotnych rozcieńczeniach, co daje w sumie sześć dawek dla każdego ze związków.</li>
		<li>Generować NSC dla odpowiedzi na dawkę dokładnie tak, jak opisano dla pierwotnego badania przesiewowego w punkcie 2.1. Związki odpowiedzialne za reakcję na dawkę są dodawane do komórek i inkubowane na nich dokładnie tak, jak opisano w krokach 2.1.5 i 2.1.6. 
		UWAGA: Trzy powtórzenia biologiczne testu dawka-odpowiedź przeprowadza się poprzez powtórzenie testu na NSC przy różnych pasażach w różnych dniach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie komórek na czytniku płytek
<ol>
	<li>Po inkubacji komórek ze związkami przez wyznaczony czas, zobrazuj komórki na czytniku płytkowym, aby określić liczbę komórek przed poddaniem działaniu substancji na studzienkę. 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące obrazowania komórek są specyficzne dla czytnika, ale generalnie mają podobną strategię. Poniższe wskazówki dotyczą czytnika użytego w tej demonstracji (Spis materiałów).</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie imagera, aby skonfigurować pliki protokołu i eksperymentu dla badania. Przejdź do trybu ręcznego Imager w Menedżerze zadań i kliknij Przechwyć teraz....</li>
	<li>Wybierz płytkę 96-dołkową jako typ naczynia, wybierz 10x dla powiększenia i czerwone białko fluorescencyjne (RFP) 531 i 593 do obrazowania tdTomato. Wybierz dołek, a następnie kliknij Autofokus, aby ustawić ostrość obrazu, i Auto Naświetlanie, aby uzyskać odpowiedni czas ekspozycji. W razie potrzeby ręcznie dostosuj ostrość i ekspozycję.</li>
	<li>Po uzyskaniu właściwej ostrości i ekspozycji kliknij ikonę aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie kliknij PROCESS/ANALZYE nad obrazem, aby kontynuować budowanie protokołu i wybierz zakładkę ANALIZA.</li>
	<li>Kliknij opcję Cellular Analysis (Analiza komórkowa) w obszarze ADD ANALYSIS STEP (KROK DODAWANIA ANALIZY) po prawej stronie obrazu, a następnie kliknij przycisk START (START). Obraz pokaże podświetlone komórki, aby wskazać każdą pojedynczą komórkę. Wybór opcji można kliknąć, aby zmienić parametry, aby lepiej wybrać komórki na podstawie progu fluorescencji lub rozmiaru komórki. Jeśli imager prawidłowo zlicza komórki, kliknij DODAJ KROK u dołu ekranu.</li>
	<li>Kliknij ikonę u góry ekranu, aby utworzyć eksperyment z zestawu obrazów, co spowoduje otwarcie okna z eksperymentem. Po otwarciu kliknij Procedura na karcie Protokół iw nowym oknie, które się otworzy, wybierz Odczyt, a następnie w nowym oknie kliknij pełną płytę, aby wybrać tylko 60 dołków zawierających komórki (B2... G11). Kliknij przycisk OK, aby zapisać zmiany, a następnie kliknij przycisk OK w oknie Procedura.</li>
	<li>Płytka może być teraz zobrazowana za pomocą tego protokołu, a plik eksperymentalny może zostać zapisany. Kliknij ikonę odtwarzania, aby uruchomić płytę. Po zobrazowaniu pierwszej płyty zobrazuj dwie pozostałe płyty. Po zakończeniu obrazowania pobierz dane dotyczące liczby komórek do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Rób wszystkie zdjęcia w 10-krotnym powiększeniu.</li>
</ol>
4. Test cytotoksyczności terminalnej MTT
UWAGA: Rozpocznij test MTT w ciągu dwóch godzin od zakończenia obrazowania tdTomato.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy MTT o stężeniu 5 mg/ml, odważając 25 mg MTT i ponownie umieszczając go w 5 ml pożywki NSC. Wiruj roztwór, aż nie będzie widocznych osadów MTT, co może potrwać kilka minut.</li>
	<li>Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć MTT w stosunku 1:10 w pożywce do hodowli komórkowych i dodać 100 μl MTT do każdej studzienki komórek.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Fioletowy osad powinien być widoczny mniej więcej proporcjonalnie do liczby komórek w studzience. Albo odessać roztwór MTT z płytek, albo szybko odwrócić płytkę, aby wytrzepać roztwór z płytki.</li>
	<li>Dodaj 50 μl 100% DMSO do każdej studzienki i potrząsaj płytkami w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 400 obr./min. Odczytaj absorbancję każdej studzienki przy długości fali 595 nm w czytniku płytek i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wykonaj analizę liczby komórek i absorbancji tdTomato za pomocą odpowiedniego oprogramowania (komercyjny arkusz kalkulacyjny, R). Obliczyć średnie absorbancji lub liczby komórek trzech kontrprób DMSO na każdej płytce do celów normalizacji, a następnie podzielić wartość liczby komórek lub absorbancji dla każdego dołka na płytce przez tę średnią i przeliczyć na wartość procentową. W ten sposób uzyskuje się znormalizowaną liczbę komórek lub absorbancję w stosunku do kontroli DMSO dla każdej płytki.</li>
	<li>Obliczyć średnią znormalizowaną liczbę lub absorbancję i odchylenie standardowe dla studzienek replikowanych na trzech płytkach. 
	UWAGA: W tym momencie powinny istnieć cztery różne zestawy znormalizowanych wartości: po jednym dla każdej z płytek i jedna średnia dla trzech powtórzonych płytek.</li>
	<li>Zachowaj ostrożność i użyj znormalizowanej wartości na poziomie lub poniżej 25% dla średniej z trzech powtórzonych płytek, aby sklasyfikować związek jako toksyczny. Ponadto, ponieważ na każdej płytce wykonuje się tylko jeden zabieg na związek, tylko związki, które spadają poniżej tego progu na wszystkich trzech płytkach repliki, oznaczaj jako toksyczne. Zbadaj obrazy fluorescencyjne wszystkich związków, które ta analiza filtruje jako toksyczne, aby wizualnie potwierdzić toksyczność. 
	UWAGA: Identyfikacja związków o działaniu hamującym wzrost lub zwiększającym wzrost jest trudniejsza do oceny w teście eksploracyjnym tego typu ze względu na brak kontrprób na każdej płytce. Jednak poniżej znajduje się szybki sposób identyfikacji związków, które mogą spowolnić lub wzmocnić wzrost komórek.</li>
	<li>Obliczyć odchylenie standardowe dla trzech kontrprób kontrolnych DMSO na każdej płytce, a następnie przefiltrować pod kątem wszelkich związków, których średnie wartości są co najmniej dwa odchylenia standardowe powyżej lub poniżej kontrolki DMSO. Związki, które wypadają z tego filtra na każdej z trzech płytek, mogą wymagać dalszych badań.</li>
	<li>Dla odpowiedzi na dawkę należy stosować tę samą strategię analizy, co w przypadku badania przesiewowego toksyczności pierwotnej. Obliczyć średnie dla kontroli DMSO dla każdej kontrpróby biologicznej i wykorzystać te wartości do normalizacji procentu żywych komórek lub procentu absorbancji dla każdej kombinacji związek/dawka. Obliczyć średnie i błąd standardowy średnich dla wszystkich kombinacji związek/dawka dla trzech kontrprób biologicznych.</li>
	<li>Przekształć stężenie do jego wartości logarytmicznej, wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź dla logarytmu stężenia w funkcji znormalizowanej żywotności i dopasuj krzywą do analizy regresji nieliniowej (analizę można przeprowadzić w R lub różnych komercyjnych pakietach statystycznych). Z równania tej krzywej należy obliczyć dawkę śmiertelną 50 (lub technicznie w tym przypadku dawkę żywotną 50) lub stężenie związku, które powoduje 50% toksyczności. Wiele pakietów oprogramowania automatycznie oblicza tę liczbę.</li>
</ol>

<ol><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academies Press. Washington DC. (2007).</li>
<li>Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+tools+for+preventing+neurotoxicity%3A+to+Test%2C+to+predict%2C+and+how+to+do+it%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it.</a> Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Ciofani, G., Danti, S., D'Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cytotoxicity+of+boron+nitride+nanotubes%3A+interference+with+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+trypan+blue+technique+for+determination+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.</a> Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).</li>
<li>Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-release+assay+for+natural+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An enzyme-release assay for natural cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+nonradioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).</li>
<li>Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein-acetyoxymethyl+cytotoxicity+assay%3A+Standardization+of+a+method+allowing+additional+analyses+on+recovered+effector+cells+and+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).</li>
<li>Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ATP+bioluminescence+as+a+measure+of+cell+proliferation+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.</a> Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+new+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Malik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+with+species+and+cell+type+specific+toxicity+identified+in+a+2000+compound+drug+screen+of+neural+stem+cells+and+rat+mixed+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons.</a> Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Cerbini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+activator-like+effector+nuclease+%28TALEN%29-mediated+CLYBL+targeting+enables+enhanced+transgene+expression+and+one-step+generation+of+dual+reporter+human+induced+pluriopotent+stem+cell+%28iPSC%29+and+neural+stem+cell+%28NSC%29+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines.</a> PLoS One. 10 (1), 0116032(2015).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Qie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+depletion+and+glucose+depletion+trigger+growth+inhibition+via+distinctive+gene+expression+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming.</a> Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).</li>
<li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3029(2018).</li>
<li>Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+tetrazolium-based+semiautomated+colorimetric+assay%3A+assessment+of+chemosensitivity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing.</a> Cancer Research. 47 (4), 936-942 (1987).</li>
<li>Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+MTT+assay+to+human+prostate+cancer+cell+lines+in+vitro%3A+establishment+of+test+conditions+and+assessment+of+hormone-stimulated+growth+and+drug-induced+cytostatic+and+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects.</a> Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).</li>
<li>Jo, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unreliability+of+MTT+assay+in+the+cytotoxic+test+of+primary+cultured+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells.</a> Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).</li>
<li>Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+test+based+on+human+cells+labeled+with+fluorescent+proteins%3A+photography%2C+and+scanning+for+high-throughput+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay.</a> Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem tego artykułu było opisanie strategii, która mogłaby skutecznie i niedrogo zidentyfikować związki wpływające na wzrost komórek w badaniach przesiewowych o niskiej lub umiarkowanej przepustowości. Do oceny liczby komórek wykorzystano dwie techniki ortogonalne, aby zwiększyć zaufanie do wniosków i zaoferować dodatkowe informacje, które nie byłyby dostępne, gdyby zastosowano tylko jeden test. W jednym z testów wykorzystano fluorescencyjny obrazownik komórek do bezpośredniego zliczania komórek tdTomato-dodatnic...

Jedną z najważniejszych cech, które należy określić dla związku chemicznego o potencjale terapeutycznym, jest jego toksyczność dla komórek zwierzęcych. Ta cecha określi, czy lek jest dobrym kandydatem do bardziej obszernych badań. W większości przypadków poszukuje się związków o minimalnej toksyczności, ale zdarzają się sytuacje, w których interesujący jest związek mający zdolność do zabijania określonych typów komórek, np. leki przeciwnowotworowe. Chociaż całe zwierzęta są najlepszymi systemami modelowymi do określania toksyczności ogólnoustrojowej, związane z tym koszty i praca są zaporowe, gdy trzeba przetestować więcej niż kilka związków. W związku z tym hodowla komórek ssaków jest zwykle stosowana jako najbardziej efektywna alternatywa1,2. Badania przesiewowe leków o małej i średniej przepustowości są ważną metodą, za pomocą której można ocenić toksyczność w hodowli komórkowej. Ekrany te mogą być używane do przeszukiwania bibliotek z adnotacjami ukierunkowanych na poszczególne ścieżki sygnałowe. Ogólny format takiego badania przesiewowego polega na wstępnym przetestowaniu wszystkich związków w bibliotece przy pojedynczej dawce (zwykle 10 μM) w eksploracyjnym badaniu przesiewowym toksyczności pierwotnej, a następnie przeprowadzeniu dogłębnego badania przesiewowego odpowiedzi na dawkę wtórną, aby w pełni scharakteryzować profil toksyczności trafień z pierwotnego badania. Metody wdrażania tej strategii zostaną opisane tutaj i zapewnią szybki, skuteczny i niedrogi sposób identyfikacji i charakterystyki związków toksycznych.
Opracowano wiele metod oceny cytotoksyczności małych związków i nanomateriałów w komórkach ssaków3,4. Należy zauważyć, że niektóre materiały mogą wchodzić w interakcje z testem, dostarczając mylących wyników, a takie interakcje powinny być testowane podczas charakteryzowania trafień z ekranów toksyczności4. Testy cytotoksyczności obejmują wykluczenie błękitu trypanowego5, test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH)6, test niebieskiego Alamar7, ester acetoksymetylowy kalcienu (AM)8, oraz test ATP9. Wszystkie te testy mierzą różne aspekty metabolizmu komórkowego, które mogą służyć jako wskaźnik zastępczy dla liczby komórek. Chociaż wszystkie oferują korzyści, testy na bazie soli tetrazoliowych, takie jak bromek 3-(4,5-dimetylotizol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium (MTT), 2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofeny)-2H-tetrazolium-5-karboksyjanilid sole wewnętrznej (XTT)-1 i 4-(3-[4-jodofenylo]-2-[4-nitrofenylo]-2H-5-tetrazolio)-1,3-disulfonian benzenu (WST-1)10,11 zapewniają dobrą dokładność i łatwość użycia przy niskich kosztach. MTT, który zostanie wykorzystany w tej demonstracji, jest redukowany do nierozpuszczalnego formazanu przez reduktazę mitochondrialną, a szybkość tej konwersji jest silnie skorelowana z liczbą komórek. Test ten jest rutynowo stosowany zarówno na małą skalę, jak i do bibliotek przesiewowych zawierających do 2,000 związków12. Bezpośrednie liczenie komórek za pomocą znakowanego markera oferuje inną metodę oceny liczby komórek i w przeciwieństwie do testu MTT może dostarczyć dodatkowych informacji na temat dynamiki wzrostu komórek. Dostępnych jest kilka publicznie dostępnych algorytmów do wykonywania automatycznych analiz zliczania komórek, a także zastrzeżone algorytmy, które są częścią pakietów oprogramowania do czytników obrazowania13,14. W tym opisie metody, linia ludzkich nerwowych komórek macierzystych (NSC), która została genetycznie zmodyfikowana w celu konstytutywnej ekspresji tdTomato15, posłuży jako linia testowa do porównania wyników żywotności komórek między testem MTT a testem automatycznego zliczania komórek w badaniu przesiewowym oceniającym toksyczność 57 badanych związków. Chociaż głównym celem tej strategii była identyfikacja i scharakteryzowanie związków toksycznych, ma ona dodatkową zaletę w postaci potencjalnej identyfikacji związków hamujących i stymulujących wzrost, a tym samym zapewnia skuteczną metodę identyfikacji leków, które mogą modulować wzrost komórek.

<table><tbody><tr><td>B-27 (50X)</td><td>ThermoFisher Scientific 17504001</td><td></td><td>Składnik pożywki dla nerwowych komórek macierzystych.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Piper laboratoryjny</td><td>Sorenson Bioscience</td><td>73990</td><td>Umożliwia pipetowanie biblioteki związków chemicznych do płytki 96-dołkowej za jednym razem.</td></tr><tr><td>BioLite 96-dołkowa wielotalerzowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td>Każda 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej będzie działać.&nbsp; Wykorzystujemy je w naszej pracy.</td></tr><tr><td>Mikroskop do hodowli komórkowych</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Oględziny komórek w celu zapewnienia odpowiedniej gęstości.</td></tr><tr><td>Cytat 5/ Czytnik obrazowania</td><td>BioTek</td><td>CYT3MFV</td><td>Służy do obrazowania komórek i odczytów absorbancji.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>610420010</td><td>Rozpuszczalnik do związków stosowanych w sitach. Rozpuszcza osady MTT, aby ułatwić pomiary absorbancji.</td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Składnik z neuronalnymi komórkami macierzystymi.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>GelTrex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Macierz błony podstawnej nerwowych komórek macierzystych.&nbsp; Umożliwia komórkom przyczepianie się do płytek do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Gen5 3.04</td><td>Oprogramowanie BioTek</td><td></td><td>Analysis do określania liczby komórek wykazujących ekspresję tdTomato.</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Składnik pożywki dla nerwowych komórek macierzystych.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Microtest U-Bottom</td><td>Becton Dickinson</td><td>3077</td><td>Przechowywanie bibliotek złożonych.</td></tr><tr><td>MTT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M6494</td><td>Aktywny odczynnik testowy do określania żywotności komórek.</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa</td><td>Rainin</td><td>E8-1200</td><td>Dodawanie kolumna po kolumnie pożywki do hodowli komórkowych, MTT lub DMSO.</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Pożywka na bazie nerwowych komórek macierzystych.</td></tr><tr><td>Kostka filtra RFP</td><td>BioTek</td><td>1225103</td><td>Filter w Cytation 5 służy do obrazowania komórek eksprymujących tdTomato.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605036</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek.</td></tr></tbody></table>

strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Cytotoksyczność to krytyczny parametr, który musi być określony ilościowo podczas badania leków, które mogą mieć korzyści terapeutyczne. Z tego powodu wiele testów przesiewowych leków wykorzystuje cytotoksyczność jako jedną z krytycznych cech, które należy profilować dla poszczególnych związków. Komórki w hodowli są użytecznym modelem do oceny cytotoksyczności przed przystąpieniem do obserwacji obiecujących związków ołowiu w bardziej kosztownych i pracochłonnych modelach zwierzęcych. Opisujemy strategię identyfikacji związków, które wpływają na wzrost komórek w linii tdTomato z ekspresją ludzkich nerwowych komórek macierzystych (NSC). Strategia wykorzystuje dwa uzupełniające się testy do oceny liczby komórek. Jeden test działa poprzez redukcję bromku 3-(4,5-dimetylotizolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT) do formazanu jako wskaźnika zastępczego liczby komórek, a drugi bezpośrednio zlicza tdPomidor wyrażający NSC. Te dwa testy można wykonać jednocześnie w jednym eksperymencie i nie są pracochłonne, szybkie i niedrogie. W ramach strategii opisanej w tej demonstracji przetestowano 57 związków w eksploracyjnym pierwotnym badaniu przesiewowym pod kątem toksyczności na 96-dołkowej płytce. Trzy z trafień zostały dodatkowo scharakteryzowane w sześciopunktowej odpowiedzi na dawkę przy użyciu tej samej konfiguracji testu, co w pierwotnym badaniu przesiewowym. Oprócz zapewnienia doskonałego potwierdzenia toksyczności, porównanie wyników z tych dwóch testów może być skuteczne w identyfikacji związków wpływających na inne aspekty wzrostu komórek.

Automatyczne dane dotyczące zliczania komórek zidentyfikowały jedenaście związków o żywotności mniejszej niż 25% po znormalizowaniu do kontroli DMSO, podczas gdy dane MTT zidentyfikowały te same związki plus dwa dodatkowe (Tabela 1 i Tabela 2, zacieniowane na czerwono). Dwa związki, które okazały się toksyczne tylko w teście MTT (studzienki F3 i G10) miały odpowiednio 31% i 39%, liczba komórek tdPomidorowo-dodatnich jako kontrola i w kolejności rangi były kolejnymi dwoma najbardziej toks...

Często konieczne jest oszacowanie potencjalnej cytotoksyczności zestawu związków na hodowanych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię niezawodnego badania przesiewowego pod kątem toksycznych związków w formacie 96-dołkowym.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Protokół ten oferuje szybką i skuteczną strategię jednoczesnego wykorzystania dwóch testów do badania przesiewowego kilkuset związków pod kątem ich wpływu na wzrost komórek. Testy mogą dostarczyć nam informacji o tym, czy określone związki są cytotoksyczne, hamują wzrost komórek, czy też zwiększają wzrost komórek. Wykorzystując te dwa testy razem, jesteśmy w stanie zwiększyć dokładność i zidentyfikować związki cytotoksyczne.W przypadkach, gdy wyniki tych dwóch testów różnią się, strategia ta może pozwolić nam zidentyfikować związek o unikalnym wpływie na funkcję komórkową, który można dalej badać innymi metodami. Główną zaletą tej strategii jest to, że jest szybka, niedroga i niepracochłonna. Po opanowaniu pozwala naukowcom łatwo przeprowadzić podstawowe badanie przesiewowe do 200 związków w ciągu jednego tygodnia, a następnie wykonać wyczerpującą krzywą odpowiedzi na dawkę dla 10 do 15 związków w ciągu kolejnego tygodnia.Procedurę zademonstrujemy ja i Rohini Manickam, naukowiec i pracownik naukowy po maturze z laboratorium. Po pierwsze, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, hoduj komórki w kolbie T75 z pożywką NSC, tak aby na początku testu były zlewające się w co najmniej 80%. I umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i pięć procent dwutlenku węgla.Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, wyjmij kolbę z inkubatora i odessaj pożywkę NSC. Dodać trzy mililitry odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować przez pięć minut w inkubatorze. Po inkubacji dodać siedem mililitrów pożywki NSC do kolby i energicznie pipetować, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączą.Przenieś zdysocjowany roztwór komórek do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 200 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki NSC. Użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby policzyć komórki i dodaj pożywkę NSC do probówki, aby ponownie dostosować stężenie komórek do 200 000 komórek na mililitr.Następnie, używając sześciu z ośmiu szczelin ośmiokanałowego pipetora wielokanałowego, rozłóż 100 mikrolitrów mieszaniny komórek kolumna po kolumnie w 60 wewnętrznych dołkach trzech 96-dołkowych płytek, które zostały pokryte macierzą zewnątrzkomórkową. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki zasadowej lub pożywki NSC do wszystkich studzienek bez komórek, aby zminimalizować potencjalne parowanie z najbardziej zewnętrznych studzienek zawierających komórki. Pod mikroskopem hodowli komórkowej sprawdź wzrokowo co najmniej 10 dołków na każdej z trzech 96 płytek dołkowych, aby potwierdzić, że komórki są osadzone w oczekiwanej gęstości.Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora po 16 do 24 godzinach od rozszczepienia i odsysać pożywkę NSC kolumna po kolumnie za pomocą ośmiokanałowego pipetora wielodołkowego, używając tylko sześciu z ośmiu szczelin wielodołkowych. Dodać 95 mikrolitrów świeżej pożywki NSC do każdej studzienki z trzech powtórzonych płytek i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.Za pomocą ośmiokanałowego pipetora wielodołkowego dodaj 49 mikrolitrów pożywki NSC do każdej z wewnętrznych 60 studzienek pustej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, V lub okrągłodennym. Rozszczelnić przygotowaną płytkę wzorcową. Odpipetować jeden mikrolitr związku z płytki głównej do każdej z wewnętrznych 60 studzienek zawierających pożywkę NSC i trzykrotnie wymieszać rozcieńczony związek za pomocą pipetora stołowego.Następnie wyjmij trzy 96-dołkowe płytki NSC z inkubatora i dozuj pięć mikrolitrów rozcieńczonego związku do każdej studzienki z trzech płytek, które zawierają komórki, aby uzyskać rozcieńczenie od jednego do 1000 dla końcowego stężenia związku 10 mikromolów o stężeniu DMSO 0,1%Inkubuj komórki ze związkiem przez 72 godziny, i przystąp do testów cytotoksyczności. Aby wykonać test odpowiedzi na dawkę, należy założyć studzienkę 96. Użyć kolumny drugiej dla sześciu kontrprób kontrolnych DMSO i przeprowadzić potrójne testy maksymalnie trzech różnych związków w dwukrotnych seryjnych rozcieńczeniach, w sześciu dawkach, zaczynając od wysokiej dawki 10 mikromolowych.Rozcieńczyć cztery mikrolitry 100% DMSO lub związku testowego w DMSO na 196 mikrolitrów pożywki NSC w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 lub 1,5 mililitra. Dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonego DMSO do studzienek kontrolnych i 50 mikrolitrów rozcieńczonych związków testowych do odpowiednich studzienek. Odpipetować 25 mikrolitrów pożywki NSC do pozostałych pustych studzienek we wewnętrznej części płytki 96-dołkowej.Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 25 mikrolitrów związku z 10 dołków mikromolowych do pięciu dołków mikromolowych i wymieszaj co najmniej pięć razy. Wymień końcówki pipet i powtórz proces, mieszając pozostałe rzędy, aby uzyskać potrójne rozcieńczenia, co daje w sumie sześć dawek dla każdego ze związków. Przenieść pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia na nową płytkę z badanymi komórkami hodowlanymi.Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla. Po inkubacji komórek przez 72 godziny wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie imagera, aby skonfigurować pliki protokołu i eksperymentu dla badania.Przejdź do trybu ręcznego Imager w Menedżerze zadań i kliknij Przechwyć teraz. Wybierz płytkę 96-dołkową jako typ naczynia. Wybierz 10 razy dla powiększenia i czerwone białko fluorescencyjne 531 i 593 do obrazowania tdTomato.Kliknij na studnię. Następnie kliknij Autofokus, aby ustawić ostrość obrazu, i Auto naświetlanie, aby uzyskać prawidłowy czas ekspozycji. W razie potrzeby ręcznie dostosuj ostrość i ekspozycję.Kliknij ikonę aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie kliknij Process Analyze (Analiza procesu) nad obrazem, aby kontynuować tworzenie protokołu. I wybierz kartę Analiza.Po prawej stronie obrazu kliknij pozycję Analiza komórkowa w obszarze Dodaj krok analizy, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Na ilustracji przedstawiono wyróżnione komórki, aby wskazać każdą pojedynczą komórkę. Kliknij wybór Opcje, aby zmienić parametry, aby lepiej wybrać komórki na podstawie progu fluorescencji lub rozmiaru komórki.Jeśli imager prawidłowo zlicza komórki, kliknij przycisk Dodaj krok u dołu ekranu. Kliknij ikonę u góry ekranu, aby utworzyć eksperyment na podstawie zestawu obrazów. W otwartym oknie kliknij Procedura w zakładce Protokół.Następnie w nowym oknie, które zostanie otwarte, wybierz pozycję Odczyt. Kliknij opcję Pełna płyta, aby zaznaczyć tylko 60 studzienek zawierających komórki. Kliknij przycisk OK, aby zapisać zmiany.Następnie kliknij przycisk OK w oknie Procedura. Kliknij ikonę Odtwórz, aby uruchomić płytę. W monicie zapisz plik, a następnie w monicie Załaduj blachę kliknij przycisk OK. Po zakończeniu obrazowania pobierz dane dotyczące liczby komórek z oprogramowania imager do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.W ciągu dwóch godzin od zakończenia obrazowania tdTomato rozpocznij test MTT. Odważ 25 miligramów MTT i ponownie zawieś je w pięciu mililitrach podłoża NSC, aby uzyskać pięć miligramów na mililitr roztworu podstawowego MTT. Wirować roztwór przez kilka minut, aż nie będzie widocznych osadów MTT.Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć MTT od 1 do 10 w świeżej pożywce NSC i dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego MTT do każdej studzienki komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.Fioletowy osad jest widoczny mniej więcej proporcjonalnie do liczby komórek w studzience. Odessać roztwór MTT z płytek i dodać 50 mikrolitrów 100% DMSO do każdego dołka. Umieść płytki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 10 minut przy 400 obr./min.Następnie przenieś płytkę do czytnika płytek. Odczytaj absorbancję każdego dołka przy ustawionej długości fali 595 nanometrów i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy, dokładnie tak, jak w przypadku danych dotyczących liczby komórek. Badanie obrazów fluorescencji tdTomato ujawniło dwie studzienki niezgodne pod względem toksyczności między MTT a testem liczby komórek.W przypadku jednej studni dane dotyczące liczby komórek sugerowały brak toksyczności. Ale dane MTT już tak. Inna studnia zawyżyła liczbę komórek przez MTT w stosunku do liczby tdTomato i wydawała się mieć większe komórki, podczas gdy w studniach, w których MTT zaniżyła liczbę komórek w stosunku do tdTomato, komórki wydawały się być mniejsze.Podsumowując, test tdTomato sklasyfikował 11 związków jako toksyczne, 11 jako hamujące wzrost i jeden jako wzmacniający wzrost, przy czym 34 nie mają widocznego wpływu na wzrost komórek. Test MTT sklasyfikował 13 związków jako toksyczne, dwa jako hamujące wzrost i jeden jako wzmacniające wzrost, przy czym 41 nie miało widocznego wpływu na wzrost komórek. Wykres żywotnych komórek dla związku WP1066 pokazuje stosunkowo płaską krzywą bez toksyczności dla czterech najniższych stężeń.Krzywa gwałtownie spada przy dawce pięciu mikromolowych i spada do prawie pełnej toksyczności po 10 mikromolach, co prowadzi do dawki śmiertelnej 50 jako 4,4 i 6,0 mikromola dla testu tdPomidor i test MTT. Bardzo ważne jest, aby związki były odpowiednio rozcieńczone na ekranie odpowiedzi na dawkę, tak aby uzyskać prawidłową krzywą odpowiedzi na dawkę. Związki zidentyfikowane w tej procedurze jako wpływające na wzrost komórek można dodatkowo scharakteryzować za pomocą testów funkcjonalnych w celu zidentyfikowania potencjalnie nowych szlaków sygnałowych, które kontrolują wzrost komórek.Związki, które są toksyczne dla nerwowych komórek macierzystych, zostały przetestowane jako potencjalne środki terapeutyczne w przypadku nowotworów mózgu, takich jak glejak wielopostaciowy i nerwiak zarodkowy. Zawsze noś rękawice i fartuch laboratoryjny podczas pracy z komórkami ssaków, DMSO i MTT. Utylizować DMSO i MTT zgodnie z wytycznymi dotyczącymi odpadów chemicznych Twojej instytucji.

a-strategy-to-identify-compounds-that-affect-cell-growth-survival

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Tutaj dokumentujemy użycie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do testowania wpływu inhibitora enzymu deiminazy peptydyloargininowej (PADI), BB-Cl-amidyny, na rak piersi rak piersi w badaniach in vitro.

Wykorzystanie testu tworzenia kolonii miękkiego agaru do identyfikacji inhibitorów rakotwórczości w komórkach raka piersi

Oporność na leki celowane jest powszechna, a potrzeba identyfikacji mechanizmów oporności - przed lub po rozpoczęciu badań klinicznych - jest kluczowa dla kierowania alternatywnymi strategiami leczenia klinicznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół parowania wyprowadzenia linii lekoopornych in vitro z sekwencjonowaniem, aby przyspieszyć odkrycie tych mechanizmów.

Implementacja testów oporności na leki in vitro: maksymalizacja potencjału w zakresie odkrywania klinicznie istotnych mechanizmów oporności

Ten artykuł opisuje test o wysokiej przepustowości, który został z powodzeniem opracowany do badania dużych bibliotek małych cząsteczek pod kątem ich potencjalnej zdolności do manipulowania poziomami komórkowymi cyklicznego di-GMP u Pseudomonas aeruginosa, dostarczając nowego potężnego narzędzia do odkrywania leków przeciwbakteryjnych i testowania związków.

Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

W szerokim zakresie wskazań chorobowych, bardziej fizjologicznie istotne modele są opracowywane i wdrażane do programów odkrywania leków. Opisany tutaj nowy system modelowy pokazuje, w jaki sposób trójwymiarowe sferoidy nowotworowe mogą być hodowane i badane przesiewowo w wysokowydajnym systemie opartym na płytkach 1536-dołkowych w celu poszukiwania nowych leków onkologicznych.

Generowanie wysokoprzepustowych trójwymiarowych sferoid nowotworowych do badań przesiewowych leków

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Farmakologiczne celowanie w kanały jonowe jest obiecującym podejściem do leczenia guzów litych. Podano szczegółowe protokoły charakteryzujące funkcję kanałów jonowych w komórkach nowotworowych i oznaczające wpływ modulatorów kanałów jonowych na żywotność raka.

Badania przesiewowe kanałów jonowych w komórkach nowotworowych

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół użycia testu reporterowego opartego na lucyferazie w półautomatycznym, wysokoprzepustowym formacie przesiewowym.

Badania przesiewowe leków komórkowych w kierunku inhibitorów peptydazy cysteinowej 4B związanej z autofagią

Protokół ten wprowadza fluorometryczną metodologię przesiewania zoptymalizowaną do identyfikacji produktów naturalnych/inhibitorów małych cząsteczek syntezy białek. Jego praktyczność sprawia, że nadaje się zarówno do nauczania technik odkrywania leków na poziomie licencjackim, jak i do wdrażania w kampaniach chemii medycznej.

Protokół oparty na fluorescencji do wstępnego badania inhibitorów syntezy białek pochodzących z naturalnych źródeł

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj szybką strategię przesiewową związków wpływających na wzrost komórek ssaków przy użyciu dwóch równoległych testów. Ta metoda pozwala identyfikować związki cytotoksyczne oraz te hamujące lub wspierające proliferację komórek.

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości (Wideo) | JoVE Journal

Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Przeglądaj więcej filmów