Strategia identyfikacji związków, które wpływają na wzrost i przeżycie komórek w hodowanych komórkach ssaków przy niskiej lub umiarkowanej przepustowości

Protokół ten oferuje szybką i skuteczną strategię jednoczesnego wykorzystania dwóch testów do badania przesiewowego kilkuset związków pod kątem ich wpływu na wzrost komórek. Testy mogą dostarczyć nam informacji o tym, czy określone związki są cytotoksyczne, hamują wzrost komórek, czy też zwiększają wzrost komórek. Wykorzystując te dwa testy razem, jesteśmy w stanie zwiększyć dokładność i zidentyfikować związki cytotoksyczne.

W przypadkach, gdy wyniki tych dwóch testów różnią się, strategia ta może pozwolić nam zidentyfikować związek o unikalnym wpływie na funkcję komórkową, który można dalej badać innymi metodami. Główną zaletą tej strategii jest to, że jest szybka, niedroga i niepracochłonna. Po opanowaniu pozwala naukowcom łatwo przeprowadzić podstawowe badanie przesiewowe do 200 związków w ciągu jednego tygodnia, a następnie wykonać wyczerpującą krzywą odpowiedzi na dawkę dla 10 do 15 związków w ciągu kolejnego tygodnia.

Procedurę zademonstrujemy ja i Rohini Manickam, naukowiec i pracownik naukowy po maturze z laboratorium. Po pierwsze, w komorze bezpieczeństwa biologicznego, hoduj komórki w kolbie T75 z pożywką NSC, tak aby na początku testu były zlewające się w co najmniej 80%. I umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych ustawionym na 37 stopni Celsjusza i pięć procent dwutlenku węgla.

Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, wyjmij kolbę z inkubatora i odessaj pożywkę NSC. Dodać trzy mililitry odczynnika do dysocjacji komórek i inkubować przez pięć minut w inkubatorze. Po inkubacji dodać siedem mililitrów pożywki NSC do kolby i energicznie pipetować, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączą.

Przenieś zdysocjowany roztwór komórek do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 200 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki NSC. Użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby policzyć komórki i dodaj pożywkę NSC do probówki, aby ponownie dostosować stężenie komórek do 200 000 komórek na mililitr.

Następnie, używając sześciu z ośmiu szczelin ośmiokanałowego pipetora wielokanałowego, rozłóż 100 mikrolitrów mieszaniny komórek kolumna po kolumnie w 60 wewnętrznych dołkach trzech 96-dołkowych płytek, które zostały pokryte macierzą zewnątrzkomórkową. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki zasadowej lub pożywki NSC do wszystkich studzienek bez komórek, aby zminimalizować potencjalne parowanie z najbardziej zewnętrznych studzienek zawierających komórki. Pod mikroskopem hodowli komórkowej sprawdź wzrokowo co najmniej 10 dołków na każdej z trzech 96 płytek dołkowych, aby potwierdzić, że komórki są osadzone w oczekiwanej gęstości.

Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora po 16 do 24 godzinach od rozszczepienia i odsysać pożywkę NSC kolumna po kolumnie za pomocą ośmiokanałowego pipetora wielodołkowego, używając tylko sześciu z ośmiu szczelin wielodołkowych. Dodać 95 mikrolitrów świeżej pożywki NSC do każdej studzienki z trzech powtórzonych płytek i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze.

Za pomocą ośmiokanałowego pipetora wielodołkowego dodaj 49 mikrolitrów pożywki NSC do każdej z wewnętrznych 60 studzienek pustej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, V lub okrągłodennym. Rozszczelnić przygotowaną płytkę wzorcową. Odpipetować jeden mikrolitr związku z płytki głównej do każdej z wewnętrznych 60 studzienek zawierających pożywkę NSC i trzykrotnie wymieszać rozcieńczony związek za pomocą pipetora stołowego.

Następnie wyjmij trzy 96-dołkowe płytki NSC z inkubatora i dozuj pięć mikrolitrów rozcieńczonego związku do każdej studzienki z trzech płytek, które zawierają komórki, aby uzyskać rozcieńczenie od jednego do 1000 dla końcowego stężenia związku 10 mikromolów o stężeniu DMSO 0,1%Inkubuj komórki ze związkiem przez 72 godziny, i przystąp do testów cytotoksyczności. Aby wykonać test odpowiedzi na dawkę, należy założyć studzienkę 96. Użyć kolumny drugiej dla sześciu kontrprób kontrolnych DMSO i przeprowadzić potrójne testy maksymalnie trzech różnych związków w dwukrotnych seryjnych rozcieńczeniach, w sześciu dawkach, zaczynając od wysokiej dawki 10 mikromolowych.

Rozcieńczyć cztery mikrolitry 100% DMSO lub związku testowego w DMSO na 196 mikrolitrów pożywki NSC w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 lub 1,5 mililitra. Dodać 25 mikrolitrów rozcieńczonego DMSO do studzienek kontrolnych i 50 mikrolitrów rozcieńczonych związków testowych do odpowiednich studzienek. Odpipetować 25 mikrolitrów pożywki NSC do pozostałych pustych studzienek we wewnętrznej części płytki 96-dołkowej.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 25 mikrolitrów związku z 10 dołków mikromolowych do pięciu dołków mikromolowych i wymieszaj co najmniej pięć razy. Wymień końcówki pipet i powtórz proces, mieszając pozostałe rzędy, aby uzyskać potrójne rozcieńczenia, co daje w sumie sześć dawek dla każdego ze związków. Przenieść pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia na nową płytkę z badanymi komórkami hodowlanymi.

Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla. Po inkubacji komórek przez 72 godziny wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w czytniku płytek. Otwórz oprogramowanie imagera, aby skonfigurować pliki protokołu i eksperymentu dla badania.

Przejdź do trybu ręcznego Imager w Menedżerze zadań i kliknij Przechwyć teraz. Wybierz płytkę 96-dołkową jako typ naczynia. Wybierz 10 razy dla powiększenia i czerwone białko fluorescencyjne 531 i 593 do obrazowania tdTomato.

Kliknij na studnię. Następnie kliknij Autofokus, aby ustawić ostrość obrazu, i Auto naświetlanie, aby uzyskać prawidłowy czas ekspozycji. W razie potrzeby ręcznie dostosuj ostrość i ekspozycję.

Kliknij ikonę aparatu, aby zrobić zdjęcie. Następnie kliknij Process Analyze (Analiza procesu) nad obrazem, aby kontynuować tworzenie protokołu. I wybierz kartę Analiza.

Po prawej stronie obrazu kliknij pozycję Analiza komórkowa w obszarze Dodaj krok analizy, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Na ilustracji przedstawiono wyróżnione komórki, aby wskazać każdą pojedynczą komórkę. Kliknij wybór Opcje, aby zmienić parametry, aby lepiej wybrać komórki na podstawie progu fluorescencji lub rozmiaru komórki.

Jeśli imager prawidłowo zlicza komórki, kliknij przycisk Dodaj krok u dołu ekranu. Kliknij ikonę u góry ekranu, aby utworzyć eksperyment na podstawie zestawu obrazów. W otwartym oknie kliknij Procedura w zakładce Protokół.

Następnie w nowym oknie, które zostanie otwarte, wybierz pozycję Odczyt. Kliknij opcję Pełna płyta, aby zaznaczyć tylko 60 studzienek zawierających komórki. Kliknij przycisk OK, aby zapisać zmiany.

Następnie kliknij przycisk OK w oknie Procedura. Kliknij ikonę Odtwórz, aby uruchomić płytę. W monicie zapisz plik, a następnie w monicie Załaduj blachę kliknij przycisk OK. Po zakończeniu obrazowania pobierz dane dotyczące liczby komórek z oprogramowania imager do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy.

W ciągu dwóch godzin od zakończenia obrazowania tdTomato rozpocznij test MTT. Odważ 25 miligramów MTT i ponownie zawieś je w pięciu mililitrach podłoża NSC, aby uzyskać pięć miligramów na mililitr roztworu podstawowego MTT. Wirować roztwór przez kilka minut, aż nie będzie widocznych osadów MTT.

Wyjąć płytki do hodowli komórkowych z inkubatora i odessać pożywkę do hodowli komórkowych. Rozcieńczyć MTT od 1 do 10 w świeżej pożywce NSC i dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego MTT do każdej studzienki komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Fioletowy osad jest widoczny mniej więcej proporcjonalnie do liczby komórek w studzience. Odessać roztwór MTT z płytek i dodać 50 mikrolitrów 100% DMSO do każdego dołka. Umieść płytki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 10 minut przy 400 obr./min.

Następnie przenieś płytkę do czytnika płytek. Odczytaj absorbancję każdego dołka przy ustawionej długości fali 595 nanometrów i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy, dokładnie tak, jak w przypadku danych dotyczących liczby komórek. Badanie obrazów fluorescencji tdTomato ujawniło dwie studzienki niezgodne pod względem toksyczności między MTT a testem liczby komórek.

W przypadku jednej studni dane dotyczące liczby komórek sugerowały brak toksyczności. Ale dane MTT już tak. Inna studnia zawyżyła liczbę komórek przez MTT w stosunku do liczby tdTomato i wydawała się mieć większe komórki, podczas gdy w studniach, w których MTT zaniżyła liczbę komórek w stosunku do tdTomato, komórki wydawały się być mniejsze.

Podsumowując, test tdTomato sklasyfikował 11 związków jako toksyczne, 11 jako hamujące wzrost i jeden jako wzmacniający wzrost, przy czym 34 nie mają widocznego wpływu na wzrost komórek. Test MTT sklasyfikował 13 związków jako toksyczne, dwa jako hamujące wzrost i jeden jako wzmacniające wzrost, przy czym 41 nie miało widocznego wpływu na wzrost komórek. Wykres żywotnych komórek dla związku WP1066 pokazuje stosunkowo płaską krzywą bez toksyczności dla czterech najniższych stężeń.

Krzywa gwałtownie spada przy dawce pięciu mikromolowych i spada do prawie pełnej toksyczności po 10 mikromolach, co prowadzi do dawki śmiertelnej 50 jako 4,4 i 6,0 mikromola dla testu tdPomidor i test MTT. Bardzo ważne jest, aby związki były odpowiednio rozcieńczone na ekranie odpowiedzi na dawkę, tak aby uzyskać prawidłową krzywą odpowiedzi na dawkę. Związki zidentyfikowane w tej procedurze jako wpływające na wzrost komórek można dodatkowo scharakteryzować za pomocą testów funkcjonalnych w celu zidentyfikowania potencjalnie nowych szlaków sygnałowych, które kontrolują wzrost komórek.

Związki, które są toksyczne dla nerwowych komórek macierzystych, zostały przetestowane jako potencjalne środki terapeutyczne w przypadku nowotworów mózgu, takich jak glejak wielopostaciowy i nerwiak zarodkowy. Zawsze noś rękawice i fartuch laboratoryjny podczas pracy z komórkami ssaków, DMSO i MTT. Utylizować DMSO i MTT zgodnie z wytycznymi dotyczącymi odpadów chemicznych Twojej instytucji.