Name: Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj protokół biosyntezy flawonoli z flawanonów w układzie jednodoniczkowym. Ta metoda jest oszczędna czasowo i kosztowo, łatwa do kontroli, z dużym potencjałem przemysłowym w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była finansowana przez Fundusze Start-up Uniwersytetu Yangzhou, Fundusze Start-up Specjalnie Profesora Jiangsu, Projekt Six Talent Peaks w prowincji Jiangsu (Grant nr 2014-SWYY-016) oraz projekt finansowany przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (Medycyna Weterynaryjna). Dziękujemy Centrum Badawczemu Uniwersytetu w Yangzhou za analizy flawonoidów metodą HPLC i MS.

<ol><li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoids%3A+biosynthesis%2C+biological+functions%2C+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).</li>
<li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+%28L.%29+sweet+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents%3A+Design%2C+synthesis%2C+and+evaluation+in+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+%28Aesculus+turbinata+BLUME%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li>
<li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li>
<li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li>
<li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+determination+of+flavonoids%2C+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+%28L.%29+by+HPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li>
<li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition%2C+Antioxidant%2C+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li>
<li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li>
<li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Synthetic+Methods+of+Flavones%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li>
<li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Yao+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li>
<li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li>
<li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li>
<li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li>
<li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li>
<li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li>
<li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).</li>
<li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics%2C+biochemistry%2C+cell+biology%2C+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).</li>
<li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li>
<li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1%3A+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cloning+into+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2%2B+Absorption+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li>
<li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Sporo badań koncentruje się na pochodnym flawonoli ze względu na ich potencjalne zastosowanie w ochronie zdrowia i przemyśle spożywczym. Jednak tradycyjna ekstrakcja roślin przy użyciu rozpuszczalników organicznych i synteza chemiczna mają nieodłączne wady, które ograniczają ich zastosowanie w produkcji flawonoli. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę wytwarzania flawonolu z flawanonu w jednym doniczce poprzez ustanowienie bienzymatycznej kaskady in vitro. Kluczowymi etapami tego protokołu są: 1) otrzymanie czys...

Flawonole są główną podklasą flawonoidów roślinnych i biorą udział w rozwoju i pigmentacji roślin1,2,3. Co ważniejsze, związki te mają szeroki zakres korzystnych dla zdrowia działań, takich jak przeciwnowotworowe4,5, przeciwutleniające6, przeciwzapalne7, przeciwotyłość8, przeciwnadciśnieniowe9 i właściwości przywoływania pamięci10, co doprowadziło do przeprowadzenia wielu badań nad tymi metabolitami wtórnymi pochodzenia roślinnego. Tradycyjnie związki te pochodzą głównie z ekstrakcji roślinnej przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Jednak ze względu na ich bardzo niską zawartość w roślinach11,12,13, koszt produkcji większości flawonoli pozostaje wysoki, co nakłada duże ograniczenia na ich zastosowanie w służbie zdrowia i przemyśle spożywczym.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci naukowcy opracowali wiele metod pozyskiwania flawonoidów14,15. Jednak synteza chemiczna tych skomplikowanych cząsteczek ma wiele wewnętrznych wad16. Wymaga to nie tylko toksycznych odczynników i ekstremalnych warunków reakcji, ale także wielu kroków do wytworzenia docelowego związku flawonoidowego14,17. Co więcej, kolejnym ważnym wyzwaniem w tej strategii jest chiralna synteza aktywnych cząsteczek flawonoidów. W związku z tym nie jest to idealna strategia produkcji flawonoidów na skalę komercyjną poprzez syntezę chemiczną16,17.
Ostatnio naukowcy opracowali obiecującą alternatywną strategię wytwarzania tych skomplikowanych naturalnych związków poprzez inżynierię mikrobów ze ścieżką biosyntezy flawonoidów18,19,20,21,22, która została pomyślnie rozszyfrowana w roślinach23. Na przykład Duan i wsp. wprowadzili szlak biosyntezy do pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu produkcji kemferolu (KMF)24. Malla i wsp. wyprodukowali astragalinę, glikozylowany flawonol, wprowadzając3-hydroksylazę flawanonu (f3h), syntazę flawonolu (fls1) i UDP-glukozę: 3-O-glukozylotransferazę flawonoidową UGT78K1 do Escherichia coliBL21(DE3)17. Mimo że istnieje wiele paradygmatów, nie wszystkie genetycznie modyfikowane mikroorganizmy wytwarzają interesujące je produkty ze względu na złożoność platformy komórkowej, niezgodność między sztucznie zsyntetyzowanymi elementami genetycznymi a gospodarzami, hamujący wpływ produktów docelowych na komórki gospodarza oraz niestabilność samego zmodyfikowanego systemu komórkowego16.
Inną obiecującą alternatywną strategią produkcji flawonoidów jest ustanowienie kaskady multienzymatycznej in vitro. Cheng i wsp. stwierdzili, że poliketydy enterocyny mogą być z powodzeniem syntetyzowane poprzez złożenie kompletnego szlaku enzymatycznego w jednym garnku25. Ta bezkomórkowa strategia syntezy omija ograniczenia fabryki produkcji mikroorganizmów, a zatem jest możliwa do produkcji niektórych flawonoidów w dużych ilościach16.
Ostatnio udało nam się opracować system syntezy bienzymów do przekształcania naringeniny (NRN) w KMF w jednym garnku16. Tutaj bardzo szczegółowo opisujemy ten system i metody związane z analizą produktów. Przedstawiamy również dwa przykłady, które wykorzystują ten system do produkcji KMF z KSOW i kwercetyny (QRC) z eriodictyolu (ERD). Ponadto omówiono kluczowe etapy tej metody i przyszłe kierunki badań w biosyntezie flawonoidów.

<table><tbody><tr><td>2 razy; Pfu MasterMix</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0717A</td><td>amplifikację genów metodą PCR z wysoką wiernością</td></tr><tr><td>System Agilent 1200 Series RRLC z systemem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>urządzenie do analizy flawonoidów metodą HPLC/MS</td></tr><tr><td>Stacja robocza Agilent MassHunter (wersja B.03.01)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do zbierania danych z systemu Agilent 1200 Series RRLC z systemem Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS</td></tr><tr><td>dihydrokaemferol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>91216</td><td>produkt pośredni do wytwarzania kemferolu z naringeniny</td></tr>, <tr><td>dihydrokwercetyny</td>, <td>Syczuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td><td>PCS0371</td><td>produkt pośredni do produkcji kwercetyny z eriodictyolu</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia DNA</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2301</td><td>oczyszczanie eriodictyolu DNA amplifikowanego PCR lub oczyszczonego żelem</td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td><td>B21160</td><td>substrat do produkcji kwercetyny</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3)</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0809</td><td>szczep bakterii do ekspresji docelowych genów</td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0808</td><td>szczep bakterii do proliferacji plazmidu</td></tr><tr><td>FreeZone 1 litrowy laboratoryjny system liofilizacji</td><td>Labconco Corporation</td><td>7740020</td><td>urządzenie do liofilizacji flawonoidów rozpuszczonych w rozpuszczalniku organicznym Zestaw do ekstrakcji</td></tr><tr><td>żelu</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2302</td><td>oczyszczanie pasma DNA z żelu agarozowego</td></tr><tr><td>System</td> <td>obrazowania żeluNauka i nauka o tanonie w Szanghaju Technologia Co., Sp. z o.o.</td><td>Tanon- 2500</td><td>urządzenie do wizualizacji pasma DNA na żelu agarozowym lub plamce flawonoidowej na płytce poliamidowej TLC</td></tr><tr><td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC</td><td>PLN350-1KT</td><td>minipreparat plazmidów</td></tr><tr><td>kemferol</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC</td><td>60010</td><td>produkt końcowej reakcji i substancja wzorcowa</td></tr><tr><td>Analiza Quanlitative MassHunter (wersja B.01.04)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do analizy danych HPLC/LC/MS NanoDrop</td></tr><tr><td>Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>urządzenie do oznaczania stężenia DNA/RNA</td></tr><tr><td>naringenina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>N5893</td><td>Podłoże do produkcji kemferolu</td></tr><tr><td>Ni-IDA Żywica agarozowa</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0010</td><td>oczyszczanie białek fuzyjnych znakowanych His</td></tr>: <tr><td>plazmid pET-32a(+)</td><td>Novagen</td><td>69015-3</td><td>do klonowania i ekspresji genów docelowych,</td></tr><tr><td>sekwencjonowanie plazmidów,</td><td>GENEWIZ Suzhou</td>, <td>nie dotyczy</td><td>sekwencjonowanie rekombinowanych plazmidów,</td></tr><tr><td>synteza starterów</td>, <td>GENEWIZ Suzhou</td>, <td>N/A</td><td>, synteza starterów PCR</td></tr>, <tr><td>kwercetyna</td><td>, Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>Q111273</td><td>końcowy produkt reakcji i substancja wzorcowa</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA SuperRT</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0741</td><td>synteza pierwszej nici cDNA z całkowitej</td></tr><tr><td>ligazy DNA RNA T4</td><td>Ligaza Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0016</td><td>ligacja insertu do zlinearyzowanego wektora DNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Naukowa</td><td>izolacja całkowitego RNA</td> <td>15596018</td></tr><tr><td>Vector NTI Advance</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605099</td><td>oprogramowanie do projektowania starterów PCR i analizy sekwencji DNA</td></tr><tr><td>Xcalibur v2.0.7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>oprogramowanie do analizy danych HPLC</td></tr></tbody></table>

biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Flawonole to główna podklasa flawonoidów o różnorodnych działaniach biologicznych i farmakologicznych. W tym miejscu przedstawiamy metodę enzymatycznej syntezy flawonolu in vitro. W tej metodzie Atf3h i Atfls1, dwa kluczowe geny w szlaku biosyntezy flawonoli, są klonowane i nadmiernie eksprymowane w Escherichia coli. Rekombinowane enzymy są oczyszczane przez kolumnę powinowactwa, a następnie w określonym buforze syntetycznym tworzy się kaskada bienzymatyczna. Dwa flawonole są syntetyzowane w tym systemie jako przykłady i oznaczane za pomocą analiz TLC i HPLC/LC/MS. Metoda ta wykazuje oczywistą przewagę w otrzymywaniu flawonoli w porównaniu z innymi podejściami. Oszczędza czas i pracę oraz jest wysoce opłacalny. Reakcja jest łatwa do dokładnego kontrolowania, a tym samym skalowania do masowej produkcji. Docelowy produkt można łatwo oczyścić dzięki prostym komponentom systemu. Jednak system ten jest zwykle ograniczony do produkcji flawonolu z flawanonu.

F3H i FLS1 to dwa ważne kluczowe enzymy w przemianie flawanonu w flawonol u roślin, jak pokazano na Rysunku 1. W celu opracowania in vitro systemu biosyntetycznego do produkcji flawonolu z flawanonu, geny Atf3h (numer dostępu GenBank NM_114983.3) i Atfls1 (numer dostępu GenBank NM_120951.3) zostały sklonowane z siewek 4-tygodniowych roślin A. thaliana do prokariotycznego wektora ekspresyjnego pET-32a(+). Rekombinowane plazmidy wprow...

Pochodzenie flawonolu jest kluczowe dla jego zastosowania w opiece zdrowotnej i przemyśle spożywczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół biosyntezy flawonolu z flawanonu i omawiamy kluczowe etapy i jego zalety w porównaniu z innymi podejściami.

Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Korzystając z tego protokołu, możemy z łatwością wyprodukować całkiem sporą ilość flawonoli z flawanonów w jednym doniczce. Technika ta oszczędza czas i pracę, jest wysoce opłacalna i łatwa do kontrolowania, dzięki czemu ma ogromny potencjał uprzemysłowienia. Tak, metoda ta może dostarczyć informacji na temat ekonomicznej produkcji innych metabolitów wtórnych, ale wymaga pewnych modyfikacji, gdy jest do niej stosowana.Zwykle nie uzyska nic lub uzyska bardzo niską wydajność. Radzę obchodzić się z rekombinowanymi enzymami na lodzie i dodawać 10% glicerynę do podstawowego roztworu enzymów. Dzieje się tak dlatego, że tylko poprzez wizualną demonstrację nowa ręka może zrozumieć ważne szczegóły i prawdę wpływające na pomyślne przeprowadzenie eksperymentu.Najpierw przygotuj. Wykonaj dwukrotny bufor syntetyczny, rozpuszczając odpowiednią ilość zasady TRIS, askorbinianu sodu, kwasu alfa ketoglutarowego w wodzie dejonizowanej i odmierzając pipetą odpowiednią ilość glicerolu do roztworu. Za pomocą pipety dodaj kwas solny, aby dostosować pH do 7,2 i dostosuj objętość, dodając wodę dejonizowaną.Przechowuj dwukrotny bufor syntetyczny w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Następnie przygotuj 100-krotny roztwór podstawowy, rozpuszczając siedmiowodny siarczan żelazawy w wodzie dejonizowanej. Przygotować roztwór podstawowy 25-milimolowego flawonoidu, rozpuszczając flawonoid w metanolu i przechowywać roztwór w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Najważniejszym krokiem jest skonfigurowanie systemu syntetycznego. Aby skonfigurować system syntetyczny do produkcji flawanolu z flawanonu, najpierw przygotuj system syntetyczny w dwumililitrowej probówce zgodnie z odczynnikami wymienionymi w tej tabeli. Umieść otwartą rurkę w trzęsącym bloku grzewczym w temperaturze 40 stopni Celsjusza, przy 600 obr./min przez czterdzieści minut.Następnie zakończ reakcję, dodając 10 mikrolitrów kwasu octowego i 100 mikrolitrów octanu etylu. Dwie godziny później za pomocą pipety przenieś górną fazę organiczną do probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówkę w kapturze do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić analizę TLC, najpierw wyjmij probówki z kaptura i ponownie rozpuść proszek flawonoidowy w 160 mikrolitrach metanolu w probówce.Przygotować autentyczne próbki flawonoidów o stężeniach seryjnych, rozcieńczając 25-milimolowy roztwór podstawowy flawonoidów w metanolu. Załadować jeden mikrolitr ponownie rozpuszczonej próbki reakcyjnej i jeden mikrolitr autentycznej próbki flawonoidów na płytkę poliamidową. To samo należy zrobić z innymi stężeniami autentycznych flawonoidów na tej samej płytce.Następnie umieścić płytkę z próbką załadowaną próbką w cylindrze chromatograficznym wypełnionym systemem rozpuszczalnikowym. Przymocuj płytkę do dolnej części cylindra i uruchom płytkę w systemie rozpuszczalnika na 20 minut. Wysuszyć talerze na powietrzu w temperaturze pokojowej.Za pomocą butelki z rozpylaczem spryskaj płytki 1% etanolowym roztworem chlorku glinu, a następnie ponownie susz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wizualizuj plamy na płytkach pod światłem UV o długości 254 nanometrów i rób zdjęcia, a następnie na komputerze otwórz oprogramowanie ImageJ. Kliknij plik, otwórz, aby otworzyć obraz do analizy.Kliknij prostokątne narzędzie zaznaczania po lewej stronie w interfejsie użytkownika ImageJ. Obrysuj ROI na obrazie za pomocą myszy i naciśnij jeden, aby oznaczyć pierwszy ROI. Przesuń prostokątne zaznaczenie myszą w prawo do następnego ROI i naciśnij dwa, aby oznaczyć drugi ROI.Powtórz tę czynność, aby oznaczyć wszystkie inne ROI, naciskając dwa. Naciśnij trzy, aby wygenerować wykresy profilu dla wszystkich ROI w wyskakującym okienku. Następnie użyj narzędzia do zaznaczania linii prostych, aby upuścić linie bazowe, aby zdefiniować zamknięty obszar dla każdego interesującego szczytu.Aktywuj narzędzie różdżki, klikając odpowiednią ikonę w interfejsie użytkownika ImageJ. Kliknij wewnątrz szczytu, aby wyświetlić wyniki dla wszystkich szczytów w wyskakującym okienku. Następnie w programie Excel wykreśl szare wartości z wyskakującego okienka w stosunku do odpowiednich stężeń flawonoidów, aby utworzyć krzywą standardową opartą na TLC autentycznego flawonoidu.Następnie oblicz wydajność flawonoidu będącego przedmiotem zainteresowania wyprodukowanego w tym protokole, zgodnie z otrzymanym wzorem. Za pomocą strzykawki przetworzyć każdą próbkę sekwencyjnie przez filtry 0,45 mikrometra i 0,22 mikrometra. Załaduj próbki do systemu HPLC-MS przez dyszę ssącą i oddziel próbki w temperaturze 30 stopni Celsjusza za pomocą kolumny C18.Eluować kolumnę z prędkością jednego mililitra na minutę przez gradient od 10 do 85 procent objętości acetylu nitrylu w wodzie i monitorować absorbancję eluatu od 200 do 800 nanometrów. Wykonaj analizę LC-MS w trybie jonów ujemnych, z przepływem suszącego azotu 10 litrów na minutę w temperaturze 300 stopni Celsjusza, w osłonie przepływu gazu siedem litrów na minutę w temperaturze 250 stopni Celsjusza i zbierz dane za pomocą wbudowanego oprogramowania. Aby wyodrębnić chromatografy o pojedynczej długości fali, otwórz program do analizy jakościowej i kliknij plik, otwórz plik danych.Wybierz plik do analizy w oknie otwierania pliku danych i kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć plik. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie wyników chromatogramu, a następnie wyodrębnij chromatogramy w menu podręcznym. Na liście typów kliknij inne chromatogramy.W polu kombi detektora wybierz DAD1, a następnie kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki HPLC w oknie wyników chromatogramu. Kliknij ikonę integracji ręcznej zadokowaną w górnej części okna wyników chromatogramu. Narysuj linię bazową dla wartości szczytowej wymaganej do ręcznej analizy integracji za pomocą myszy.Kliknij pozycję Widok, lista szczytów integracji, aby wyświetlić wyniki. Skopiuj wyniki obszarów pików do programu Excel i wykreśl krzywą wzorcową autentycznego flawonoidu opartą na HPLC w stosunku do odpowiednich stężeń flawonoidów, a następnie oblicz wydajność flawonoidu będącego przedmiotem zainteresowania wytworzonego w tym protokole zgodnie z otrzymanym wzorem. Następnie powtórz te same procedury, aby wyodrębnić chromatogramy o pojedynczej długości fali w celu przeanalizowania danych MS pod kątem dokładnej masy związków flawonoidowych.Kliknij ikonę wyboru zakresu na pasku narzędzi wyników chromatogramu. Wybierz szczyt zainteresowania. Kliknij prawym przyciskiem myszy wybrany zakres, a następnie kliknij wyodrębnij widmo MS w menu podręcznym, aby wyświetlić wyniki w oknie wyników widma MS.Aby ustalić, czy ten system in vitro może być wykorzystany do konwersji flawanonu we flawonol, do systemu dodano NRN. Na płytce z poliamidu TLC pojawiły się dwie nowe plamki. W jednym miejscu widać było podobną odległość migracji jak w przypadku DHK, a w pozostałych podobną do odległości KMF.Dalsza analiza za pomocą HPLC i LC-MS wykazała, że nowa substancja chemiczna wykazała czas retencji wynoszący odpowiednio 12 minut i 20 minut w quasi-molekularnym piku jonowym M nad Z przy 287 i 285, które były identyczne z tymi dla DHK i KMF. Aby ustalić, czy system może być używany do przekształcania innych flawanonów w odpowiadające im flawonole, do systemu dodano ERD. Dwa nowe miejsca na poliamidowej płytce TLC wykazywały odległość migracji podobną do odległości odpowiednio DHQ i QRC.Analizy HPLC i LC-MS wykazały, że te nowe substancje chemiczne wykazały czas retencji wynoszący odpowiednio 10 minut i 16 minut oraz quasi-molekularny pik jonów M powyżej Z przy 303 i 301, co dokładnie odpowiadało pikom DHQ i QRC. Przygotowując system syntetyczny, należy dodać enzym na końcu, a siarczan żelazawy na przedostatnim. Tak, stanowi wskazówkę dla ekonomicznej produkcji innych metabolitów wtórnych.

biosynthesis-flavonol-from-flavanone-establishing-one-pot-bienzymatic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Synteza asymetrycznych gatunków ferrocenu jest wyzwaniem przy użyciu technik rozwiązań.  Niniejszy raport koncentruje się na metodach przeprowadzonych w celu wytworzenia biokoniugatu ferrocen-biotyna przy użyciu łatwych i czystych reakcji przeprowadzanych w drodze syntezy w fazie stałej.  Wykazano, że włączenie ugrupowania tiolanowego nadaje zdolność do unieruchamiania na powierzchniach złota.

Metodologia syntezy asymetrycznych układów biosprzężonych pochodzących z ferrocenu za pomocą metodologii opartej na żywicy w fazie stałej

Ciecze jonowe (IL) zapewniają szybki, prosty i tani dostęp do 1,6-ketoestrów o wysokiej diastereoselektywności i dobrych plonach. Protokół reakcji jest solidny, a 1,6-ketoestry można uzyskać w skali gramowej po prostym protokole filtracji. Co więcej, 1,6-ketoestry są silnymi żelatorami w rozpuszczalnikach węglowodorowych.

Wysoce stereoselektywna synteza 1,6-ketoestrów za pośrednictwem cieczy jonowych: trójskładnikowa reakcja umożliwiająca szybki dostęp do nowej klasy żelatorów o niskiej masie cząsteczkowej

Chiralne aminoalkohole są wszechstronnymi cząsteczkami do wykorzystania jako rusztowania w syntezie organicznej. Zaczynając od L-lizyny, syntetyzujemy aminoalkohole w enzymatycznej reakcji kaskadowej łączącej diastereoselektywne utlenianie C-H katalizowane przez dioksygenazę, a następnie rozszczepienie ugrupowania kwasu karboksylowego odpowiedniego aminokwasu hydroksylowego przez dekarboksylazę.

Enzymatyczne reakcje kaskadowe do syntezy chiralnych aminoalkoholi z L-lizyny

Enancjomerycznie wzbogacone szkielety bispiro[γ-butyrolakton-pirolidyn-4,4'-pirazolon] są asymetrycznie syntetyzowane przez prostą organokatalityczną reakcję cykloaddycji 1,3-dipolarnej.

Wydajna budowa lekopodobnych rusztowań bispirocyklicznych poprzez cykloaddycje organokatalityczne α-imino γ-laktonów i alkilolidenopirazlonów

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Przemiany CO2 są przeprowadzane w jednoetapowej procedurze syntezy złożonych cząsteczek. Selektywna redukcja CO 2 przez 4 eza pomocą reduktora hydroboranu daje reaktywny i wszechstronny produkt pośredni bis(borylo)acetalu, który jest następnie zaangażowany w reakcję kondensacji lub wytwarzanie sprzężenia C-C za pośrednictwem karbenu.

Wszechstronne przekształcanie emisji CO2 w produkty złożone: jednoetapowa strategia

Opracowano nowe metody syntezy heterocykli zawierających azot, wykorzystujące cerkosporynę jako fotokatalizator bez użycia metalu.

Fotokatalizowane cerkosporyną [4+1]- i [4+2]-anulacje azoalkenów w łagodnych warunkach

Reakcja kondensacji Claisena-Schmidta jest ważną metodologią generowania sprzężonych z metyną bicyklicznych związków aromatycznych. Dzięki wykorzystaniu wariantu reakcji aldolowej, w którym pośredniczy zasada, można uzyskać dostęp do szeregu cząsteczek fluorescencyjnych i/lub biologicznie istotnych za pomocą ogólnie niedrogiego i prostego w obsłudze podejścia do syntezy.

Synteza zależnych od pH pirazoli, imidazolu i izoindolonu dipirynonu przy użyciu podejścia kondensacyjnego Claisena-Schmidta

Opisujemy nowatorskie, proste metodologie syntezy i charakterystyki biokompatybilnych mikro- i submikronowych cząsteczek ligniny. Preparaty te zapewniają łatwe podejście do wykorzystania heteropolimeru, a także alternatywę dla racjonalnego projektowania wielofunkcyjnych matryc nośnikowych z potencjalnymi zastosowaniami w biomedycynie, technologii farmaceutycznej i przemyśle spożywczym.

Zielona synteza, charakterystyka, enkapsulacja i pomiar potencjału uwalniania nowych mikro-/submikronowych cząstek alkaliów ligniny

W niniejszej pracy wyjaśniamy zieloną syntezę cieczy jonowej (IL) na bazie chinoliny, a mianowicie bromku 1-heksadecylochinolino-1-ium {[C16quin]Br} poprzez zmieszanie chinoliny z nadmiarem 1-bromoheksadekanu, wraz z jej szczegółową charakterystyką za pomocą pomiarów magnetycznego rezonansu jądrowego i spektroskopowego podczerwieni.

Zielona synteza cieczy jonowej na bazie chinoliny

Poznaj protokół biosyntezy flawonoli z flawanonów w układzie jednodoniczkowym. Ta metoda jest oszczędna czasowo i kosztowo, łatwa do kontroli, z dużym potencjałem przemysłowym w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym.

Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Przeglądaj więcej filmów