Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Korzystając z tego protokołu, możemy z łatwością wyprodukować całkiem sporą ilość flawonoli z flawanonów w jednym doniczce. Technika ta oszczędza czas i pracę, jest wysoce opłacalna i łatwa do kontrolowania, dzięki czemu ma ogromny potencjał uprzemysłowienia. Tak, metoda ta może dostarczyć informacji na temat ekonomicznej produkcji innych metabolitów wtórnych, ale wymaga pewnych modyfikacji, gdy jest do niej stosowana.

Zwykle nie uzyska nic lub uzyska bardzo niską wydajność. Radzę obchodzić się z rekombinowanymi enzymami na lodzie i dodawać 10% glicerynę do podstawowego roztworu enzymów. Dzieje się tak dlatego, że tylko poprzez wizualną demonstrację nowa ręka może zrozumieć ważne szczegóły i prawdę wpływające na pomyślne przeprowadzenie eksperymentu.

Najpierw przygotuj. Wykonaj dwukrotny bufor syntetyczny, rozpuszczając odpowiednią ilość zasady TRIS, askorbinianu sodu, kwasu alfa ketoglutarowego w wodzie dejonizowanej i odmierzając pipetą odpowiednią ilość glicerolu do roztworu. Za pomocą pipety dodaj kwas solny, aby dostosować pH do 7,2 i dostosuj objętość, dodając wodę dejonizowaną.

Przechowuj dwukrotny bufor syntetyczny w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Następnie przygotuj 100-krotny roztwór podstawowy, rozpuszczając siedmiowodny siarczan żelazawy w wodzie dejonizowanej. Przygotować roztwór podstawowy 25-milimolowego flawonoidu, rozpuszczając flawonoid w metanolu i przechowywać roztwór w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Najważniejszym krokiem jest skonfigurowanie systemu syntetycznego. Aby skonfigurować system syntetyczny do produkcji flawanolu z flawanonu, najpierw przygotuj system syntetyczny w dwumililitrowej probówce zgodnie z odczynnikami wymienionymi w tej tabeli. Umieść otwartą rurkę w trzęsącym bloku grzewczym w temperaturze 40 stopni Celsjusza, przy 600 obr./min przez czterdzieści minut.

Następnie zakończ reakcję, dodając 10 mikrolitrów kwasu octowego i 100 mikrolitrów octanu etylu. Dwie godziny później za pomocą pipety przenieś górną fazę organiczną do probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść probówkę w kapturze do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Aby przeprowadzić analizę TLC, najpierw wyjmij probówki z kaptura i ponownie rozpuść proszek flawonoidowy w 160 mikrolitrach metanolu w probówce.

Przygotować autentyczne próbki flawonoidów o stężeniach seryjnych, rozcieńczając 25-milimolowy roztwór podstawowy flawonoidów w metanolu. Załadować jeden mikrolitr ponownie rozpuszczonej próbki reakcyjnej i jeden mikrolitr autentycznej próbki flawonoidów na płytkę poliamidową. To samo należy zrobić z innymi stężeniami autentycznych flawonoidów na tej samej płytce.

Następnie umieścić płytkę z próbką załadowaną próbką w cylindrze chromatograficznym wypełnionym systemem rozpuszczalnikowym. Przymocuj płytkę do dolnej części cylindra i uruchom płytkę w systemie rozpuszczalnika na 20 minut. Wysuszyć talerze na powietrzu w temperaturze pokojowej.

Za pomocą butelki z rozpylaczem spryskaj płytki 1% etanolowym roztworem chlorku glinu, a następnie ponownie susz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wizualizuj plamy na płytkach pod światłem UV o długości 254 nanometrów i rób zdjęcia, a następnie na komputerze otwórz oprogramowanie ImageJ. Kliknij plik, otwórz, aby otworzyć obraz do analizy.

Kliknij prostokątne narzędzie zaznaczania po lewej stronie w interfejsie użytkownika ImageJ. Obrysuj ROI na obrazie za pomocą myszy i naciśnij jeden, aby oznaczyć pierwszy ROI. Przesuń prostokątne zaznaczenie myszą w prawo do następnego ROI i naciśnij dwa, aby oznaczyć drugi ROI.

Powtórz tę czynność, aby oznaczyć wszystkie inne ROI, naciskając dwa. Naciśnij trzy, aby wygenerować wykresy profilu dla wszystkich ROI w wyskakującym okienku. Następnie użyj narzędzia do zaznaczania linii prostych, aby upuścić linie bazowe, aby zdefiniować zamknięty obszar dla każdego interesującego szczytu.

Aktywuj narzędzie różdżki, klikając odpowiednią ikonę w interfejsie użytkownika ImageJ. Kliknij wewnątrz szczytu, aby wyświetlić wyniki dla wszystkich szczytów w wyskakującym okienku. Następnie w programie Excel wykreśl szare wartości z wyskakującego okienka w stosunku do odpowiednich stężeń flawonoidów, aby utworzyć krzywą standardową opartą na TLC autentycznego flawonoidu.

Następnie oblicz wydajność flawonoidu będącego przedmiotem zainteresowania wyprodukowanego w tym protokole, zgodnie z otrzymanym wzorem. Za pomocą strzykawki przetworzyć każdą próbkę sekwencyjnie przez filtry 0,45 mikrometra i 0,22 mikrometra. Załaduj próbki do systemu HPLC-MS przez dyszę ssącą i oddziel próbki w temperaturze 30 stopni Celsjusza za pomocą kolumny C18.

Eluować kolumnę z prędkością jednego mililitra na minutę przez gradient od 10 do 85 procent objętości acetylu nitrylu w wodzie i monitorować absorbancję eluatu od 200 do 800 nanometrów. Wykonaj analizę LC-MS w trybie jonów ujemnych, z przepływem suszącego azotu 10 litrów na minutę w temperaturze 300 stopni Celsjusza, w osłonie przepływu gazu siedem litrów na minutę w temperaturze 250 stopni Celsjusza i zbierz dane za pomocą wbudowanego oprogramowania. Aby wyodrębnić chromatografy o pojedynczej długości fali, otwórz program do analizy jakościowej i kliknij plik, otwórz plik danych.

Wybierz plik do analizy w oknie otwierania pliku danych i kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć plik. Kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie wyników chromatogramu, a następnie wyodrębnij chromatogramy w menu podręcznym. Na liście typów kliknij inne chromatogramy.

W polu kombi detektora wybierz DAD1, a następnie kliknij przycisk OK, aby wyświetlić wyniki HPLC w oknie wyników chromatogramu. Kliknij ikonę integracji ręcznej zadokowaną w górnej części okna wyników chromatogramu. Narysuj linię bazową dla wartości szczytowej wymaganej do ręcznej analizy integracji za pomocą myszy.

Kliknij pozycję Widok, lista szczytów integracji, aby wyświetlić wyniki. Skopiuj wyniki obszarów pików do programu Excel i wykreśl krzywą wzorcową autentycznego flawonoidu opartą na HPLC w stosunku do odpowiednich stężeń flawonoidów, a następnie oblicz wydajność flawonoidu będącego przedmiotem zainteresowania wytworzonego w tym protokole zgodnie z otrzymanym wzorem. Następnie powtórz te same procedury, aby wyodrębnić chromatogramy o pojedynczej długości fali w celu przeanalizowania danych MS pod kątem dokładnej masy związków flawonoidowych.

Kliknij ikonę wyboru zakresu na pasku narzędzi wyników chromatogramu. Wybierz szczyt zainteresowania. Kliknij prawym przyciskiem myszy wybrany zakres, a następnie kliknij wyodrębnij widmo MS w menu podręcznym, aby wyświetlić wyniki w oknie wyników widma MS.

Aby ustalić, czy ten system in vitro może być wykorzystany do konwersji flawanonu we flawonol, do systemu dodano NRN. Na płytce z poliamidu TLC pojawiły się dwie nowe plamki. W jednym miejscu widać było podobną odległość migracji jak w przypadku DHK, a w pozostałych podobną do odległości KMF.

Dalsza analiza za pomocą HPLC i LC-MS wykazała, że nowa substancja chemiczna wykazała czas retencji wynoszący odpowiednio 12 minut i 20 minut w quasi-molekularnym piku jonowym M nad Z przy 287 i 285, które były identyczne z tymi dla DHK i KMF. Aby ustalić, czy system może być używany do przekształcania innych flawanonów w odpowiadające im flawonole, do systemu dodano ERD. Dwa nowe miejsca na poliamidowej płytce TLC wykazywały odległość migracji podobną do odległości odpowiednio DHQ i QRC.

Analizy HPLC i LC-MS wykazały, że te nowe substancje chemiczne wykazały czas retencji wynoszący odpowiednio 10 minut i 16 minut oraz quasi-molekularny pik jonów M powyżej Z przy 303 i 301, co dokładnie odpowiadało pikom DHQ i QRC. Przygotowując system syntetyczny, należy dodać enzym na końcu, a siarczan żelazawy na przedostatnim. Tak, stanowi wskazówkę dla ekonomicznej produkcji innych metabolitów wtórnych.