Name: Badanie interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj metodę badania interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni. Technika ta pozwala na szczegółowe zbadanie roli grzybów mikoryzowych w ekologii roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dwóm anonimowym recenzentom za ich sugestie. Dziękujemy również licznym studentom, którzy pomogli w budowie doniczek, mikrokosmosów i pojemników szczelinowych oraz którzy pomagali w utrzymaniu i zbieraniu eksperymentów. Dziękujemy również North Central College za fundusze na rozpoczęcie działalności (dla JW) i bieżące zaplecze, a także Ashley Wojciechowski za uzyskanie grantu Richter Grant North Central College wspierającego eksperyment z wykorzystaniem tych metod. Część tych prac została sfinansowana z grantu National Science Foundation Doctoral Dissertation Improvement Grant (DEB-1401677).

1. Konstrukcja i montaż rdzeni obrotowych
<ol>
	<li>Zmodyfikować komercyjne rurkowe pojemniki do siewek (zwane dalej „pojemnikami”; Tabela materiałów), aby posiadały otwory o szerokości 19 mm i długości 48 cm.
	<ol>
		<li>Używając wiertarki stołowej z otwornicą 19 mm bez centralnego wiertła prowadzącego, wyciąć dwa otwory, jeden nad drugim, w ściankach pojemnika (średnica 2,5 cm x długość 12,1 cm) w taki sposób, aby otwory były oddalone od siebie o około 1 cm. Przytrzymać pojemnik przy prowadnicy wiertarki stołowej, stosując ogranicznik z krótkim kołkiem pasującym do wnętrza pojemnika, aby pomóc w jego stabilizacji podczas wiercenia. Użyć pojemnika z elastycznego tworzywa, aby zapobiec pękaniu.</li>
		<li>Wyciąć pozostały cienki pasek tworzywa między otworami za pomocą nożyczek, obcinaczek do drutu lub nożyc do blachy (w przypadku sztywnego tworzywa użyć wyrzynarki), aby stworzyć jeden wydłużony otwór o szerokości około 2 cm i długości 5 cm.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.1.1 – 1.1.2 po przeciwnej stronie pojemnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakryć szczeliny siatką nylonową i/lub membraną hydrofobową (Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Wyciąć z siatki nylonowej o porach 40 μm kawałki o wymiarach 9,5 cm x 8,5 cm. Wyciąć tyle kawałków, ile jest pojemników.</li>
		<li>Przykleić siatkę nylonową zewnętrznie do pojemników, aby zakryć oba otwory z lekkim zakładaniem materiału, używając mocnego, przemysłowego kleju na gorąco.</li>
		<li>Jeśli konieczne jest zapobieganie przemieszczaniu się wody, na przykład przy stosowaniu składników odżywczych rozpuszczalnych w wodzie lub stabilnych izotopów, przykryć warstwę siatki nylonowej membraną hydrofobową31,32 (Tabela materiałów), która umożliwia przenikanie strzępek grzybów AM, ale dopuszcza jedynie ruch pary wodnej, a nie wody w stanie ciekłym.</li>
		<li>Nanieść klej na gorąco wokół otworów w pojemniku oraz wzdłuż długich krawędzi siatki nylonowej. Przetoczyć pojemnik na materiale, aby uniknąć poparzenia palców. Dodać warstwę kleju wzdłuż krawędzi tkaniny w miejscu, gdzie krawędzie siatki się nakładają. Docisnąć krawędź do kawałka tektury, aby szczelnie ją zamknąć. Zawsze rolować konsekwentnie w jednym kierunku, który będzie zgodny z kierunkiem obrotu gotowych pojemników w doniczkach lub mikrokosmosach, aby nałożona krawędź siatki nie została przesunięta, co mogłoby spowodować jej wbijanie się w podłoże.</li>
		<li>Po ostygnięciu kleju, przymocować górną i dolną krawędź tkaniny do pojemnika za pomocą elastycznej taśmy, np. taśmy izolacyjnej, aby zapobiec odklejaniu się krawędzi i rozdarciom.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając tej samej taśmy co w kroku 1.2.5, zakryć małe otwory po bokach stożkowego końca (nie otwór na samym dnie) każdego pojemnika, aby zapobiec wyrastaniu korzeni z pojemnika do pozostałej części doniczki/mikrokosmosu.</li>
	<li>Aby zapobiec utracie gleby przy jednoczesnym zapewnieniu drenażu, umieścić szklaną kulkę na dnie każdego pojemnika.</li>
	<li>W przypadku próby kontrolnej, która nie zakłada możliwości utworzenia CMN między roślinami, użyć pełnych, niemodyfikowanych pojemników (Rysunek 1A).</li>
</ol>
2. Montaż doniczek lub mikrokosmosów dopasowanych do stożkowych końców pojemników
<ol>
	<li>Aby zapewnić stabilne, pionowe ustawienie pojemników oraz właściwy drenaż, należy odwrócić doniczkę dnem do góry. Za pomocą wyrzynarki należy wyciąć dno doniczki, pozostawiając niewielki kołnierz dla wsparcia.</li>
	<li>Przygotowanie pianki polistyrenowej
	<ol>
		<li>Za pomocą piły taśmowej z przyrządem do cięcia okrągłego należy wyciąć piankę polistyrenową o grubości około 36 mm o średnicy odpowiadającej dnu doniczki.</li>
		<li>W piance należy wywiercić otwory za pomocą wiertarki stołowej i otwornicy 19 mm (bez wiertła centrującego) zgodnie z układem, w którym zostaną rozmieszczone pojemniki.</li>
		<li>W przypadku eksperymentu z rośliną docelową należy wywiercić otwór centralny oraz równomiernie rozmieszczone otwory dla osobników sąsiadujących wokół niego. Dla doniczki o średnicy 15,5 cm należy rozmieścić sześć otworów w odstępach 12 mm wzdłuż obwodu okręgu o średnicy 11 cm (Rysunek 1B).</li>
		<li>W przypadku eksperymentu w mikrokosmosie otwory należy rozmieścić w układzie sześciokątnym lub kwadratowym (Rysunek 1C, D).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wypełnianie pojemników i doniczek mieszankami gleby i piasku
<ol>
	<li>Wybrać odpowiednią mieszankę glebową i dodać do niej inokulum grzybów AM pobrane z terenu lub wyhodowane w doniczkach, dokładnie i równomiernie mieszając posiekane fragmenty korzeni (o długości 1 – 2 cm) z glebą. Wybraną glebę zmieszać z jałowym piaskiem kwarcowym lub kuleczkami szklanymi, aby zmniejszyć stężenie składników mineralnych dostępnych dla roślin.</li>
	<li>Umieścić wypełnione pojemniki w nawierconej piance lub w dnie mikrokosmosu, a wolne przestrzenie między nimi wypełnić jałowym podłożem.</li>
	<li>Wypełnić przestrzeń między pojemnikami ubogą w składniki odżywcze mieszanką piasku kwarcowego, używając lejka, aby ułatwić wypełnianie małych szczelin. Aby zapewnić odpowiedni drenaż i odwzorować teksturę gleby, zmieszać w betoniarce piasek o średniej wielkości ziaren, np. frakcji 6-20, z piaskiem o małej wielkości ziaren, np. frakcji 30-65.</li>
</ol>
4. Ustanowienie sieci grzybniowych (CMNs) w doniczkach/mikrokosmosach
<ol>
	<li>W każdym pojemniku zasadź rośliny „pielęgnacyjne” (nurse plants) pożądanego gatunku w celu podtrzymania grzybów AM, aby mogły one rozprzestrzenić się między pojemnikami i utworzyć CMN.</li>
	<li>Gdy we wszystkich pojemnikach wyrosną siewki, usuń nadmiar pędów poprzez przycięcie, tak aby w każdym pojemniku pozostała tylko jedna roślina.</li>
	<li>Pozostaw rośliny na 2-3 miesiące w celu ich wzrostu i uformowania się CMN.</li>
</ol>
5. Przygotowanie roślin eksperymentalnych i zastosowanie zabiegów
<ol>
	<li>Wysiej rośliny doświadczalne poprzez siew bezpośredni lub przesadzenie do pojemników. W przypadku siewu należy poczekać, aż we wszystkich pojemnikach wykiełkują siewki, a następnie usunąć rośliny opiekuńcze stosowane w przedtraktowaniu poprzez odcięcie ich pędów. W przypadku przesadzania należy odciąć wszystkie rośliny z etapu przedtraktowania przed przesadzeniem siewek doświadczalnych, aby zapobiec niezamierzonej konkurencji.</li>
	<li>Ustanowienie traktowania CMN polega albo na pozostawieniu pojemników w niezmienionej pozycji przez cały czas trwania eksperymentu (nienaruszone CMN), albo na ich cotygodniowym obracaniu w celu fizycznego przerwania strzępek rozprzestrzeniających się między zmodyfikowanymi pojemnikami (przerwane CMN; Rysunek 1A). Podczas przerywania CMN należy obrócić każdy pojemnik o pełny obrót, aby uniknąć niezamierzonej zmiany interakcji nadziemnych, szczególnie w przypadku roślin heliotropowych.</li>
	<li>Niezwłocznie po obrocie należy obficie podlać wszystkie doniczki lub mikrokosmosy, aby przywrócić kontakt między podłożem szczelinowym a ściankami pojemników.</li>
</ol>
6. Śledzenie przemieszczania się składników mineralnych w sieciach CMN
<ol>
	<li>Nawozić sąsiednie rośliny 0,5% KNO3 i NH4Cl wzbogaconymi w 15N.</li>
	<li>Nawozić badaną roślinę nawozem zawierającym 14N o takim samym stężeniu.</li>
</ol>
7. Monitorowanie i konserwacja eksperymentu
<ol>
	<li>Regularnie (co najmniej raz w miesiącu) zmieniaj losowo rozmieszczenie doniczek lub mikrokosmosów w trakcie trwania eksperymentu.</li>
	<li>Co tydzień mierz wzrost, np. wysokość lub długość najdłuższego liścia (w przypadku traw), aby monitorować moment spowolnienia wzrostu, ponieważ ważne jest przeprowadzenie zbiorów przed zapleceniem się korzeni roślin w doniczkach.</li>
</ol>
8. Zbiór materiału z eksperymentu
<ol>
	<li>Odetnij całą tkankę nadziemną i umieść poszczególne rośliny w opisanych kopertach z zaznaczeniem rodzaju zabiegu, doniczki lub mikrokosmosu oraz pozycji.</li>
	<li>Wysusz tkanki nadziemne w temperaturze 60 °C do uzyskania stałej masy. Zmierz suchą masę tkanek każdej rośliny.</li>
	<li>Pozostaw glebę do wyschnięcia przed wyjęciem pojemników i zbiorem korzeni.</li>
	<li>Ostrożnie usuń pędzlem jak najwięcej gleby z systemów korzeniowych, a następnie wypłucz je w kuwecie z wodą lub pod łagodnym strumieniem wody na sicie o rozmiarze oczek 250 micron.</li>
	<li>Pozostaw korzenie do wyschnięcia na powietrzu i zważ cały system korzeniowy.</li>
	<li>Losowo pocięty system korzeniowy przechowuj w postaci fragmentów w 50% etanolu. Po ich zabarwieniu33, wykorzystaj te fragmenty do ilościowego określenia kolonizacji korzeni za pomocą metody przecięć linii siatki34.</li>
	<li>Ponownie zważ pozostałą część systemu korzeniowego i przechowuj ją w opisanej papierowej kopercie do wysuszenia w temperaturze 60 °C w celu oceny suchej masy. Do obliczenia masy całego systemu korzeniowego zastosuj poniższe równanie:</li>
</ol>
<img alt="Wzór na obliczanie całkowitej suchej masy; równanie do analizy biomasy i wyników badań roślin." src="/files/ftp_upload/59338/59338eq1v2.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">
9. Analizy składników mineralnych i izotopów trwałych
<ol>
	<li>Pogrupuj siewki według biomasy na „decyle” (10 grup), „oktyle” (8 grup), „kwartyle” (4 grupy) itd., po uszeregowaniu ich według wagi, jeżeli ilość tkanki jest zbyt mała, aby spełnić minimalne wymagania dotyczące mineralizacji w celu oznaczenia stężeń składników mineralnych.</li>
	<li>Przekaż próbki liści do zakontraktowanego laboratorium w celu przeprowadzenia analiz składników mineralnych i stabilnych izotopów (Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Opisz obfitość izotopową, korzystając z następującego utartego wyrażenia: 
		<img alt="Wzór na stosunek izotopów azotu, obliczanie δ15N, równania dla analizy izotopowej." src="/files/ftp_upload/59338/59338eq2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie R oznacza stosunek 15N/14N w próbce lub w standardzie, którym jest azot atmosferyczny.</li>
		<li>Użyj wariantu z niemodyfikowanym, stałym pojemnikiem jako kontroli dla tła stosunków 15N w poniższym równaniu bilansu masy podczas ilościowego oznaczania ilości 15N pobranego przez roślinę docelową w wariantach CMN przerwanych lub nienaruszonych: 
		<img alt="Równanie izotopowe azotu; równowaga statyczna; wzór; analiza badawcza; δ15N; badanie środowiskowe." src="/files/ftp_upload/59338/59338eq3v2.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie δ15N reprezentuje obfitość izotopową roślin docelowych, sąsiednich oraz roślin docelowych w wariancie bez CMN, a x reprezentuje (jako ułamek dziesiętny) procent azotu pobranego przez roślinę docelową z pojemników sąsiednich, do których dodano znacznik. Wartości dla δ15NNeighbors są uzyskiwane dla zbiorczych próbek sąsiadów każdej rośliny docelowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+hundred-million-year-old+vesicular+arbuscular+mycorrhizae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (25), 11841-11843 (1994).</li>
<li>Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+SE+%22Mycorrhizal+Symbiosis%22">Mycorrhizal Symbiosis</a>. , 3 edn, Academic Press. (2008).</li>
<li>Giovannetti, M., Avio, L., Sbrana, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiovannetti%2C+M+%22Mycorrhizal+Networks%22">Mycorrhizal Networks</a>. , Springer. 41-67 (2015).</li>
<li>Giovannetti, M., Sbrana, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGiovannetti%2C+M+%22Cell+Biology+of+Plant+and+Fungal+Tip+Growth.+Vol.+328.+Nato+Science+Series%2C+Sub-Series+I%3A+Life+and+Behavioural+Sciences%22">Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Vol. 328. Nato Science Series, Sub-Series I: Life and Behavioural Sciences</a>. Cresti, A., Heath, M., Geitmann, I. B. , 221-231 (2001).</li>
<li>Giovannetti, M., Sbrana, C., Avio, L., Strani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+below-ground+plant+interconnections+established+by+means+of+arbuscular+mycorrhizal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Patterns of below-ground plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks.</a> New Phytologist. 164 (1), 175-181 (2004).</li>
<li>Avio, L., Pellegrino, E., Bonari, E., Giovannetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+arbuscular+mycorrhizal+fungal+isolates+in+relation+to+extraradical+mycelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of arbuscular mycorrhizal fungal isolates in relation to extraradical mycelial networks.</a> New Phytologist. 172 (2), 347-357 (2006).</li>
<li>Giovannetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+root+of+the+wood+wide+web%3A+self+recognition+and+nonself+incompatibility+in+mycorrhizal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signaling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks.</a> Plant Signaling & Behavior. 1 (1), 1-5 (2006).</li>
<li>Miller, R., Kling, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+integration+and+scale+in+the+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">The importance of integration and scale in the arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant and Soil. 226 (2), 295-309 (2000).</li>
<li>Miller, R., Jastrow, J., Reinhardt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+hyphal+production+of+vesicular-arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+pasture+and+tallgrass+prairie+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie communities.</a> Oecologia. 103 (1), 17-23 (1995).</li>
<li>Weremijewicz, J., Sternberg, L. dS. L. O., Janos, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mycorrhizal+networks+amplify+competition+by+preferential+mineral+nutrient+allocation+to+large+host+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Common mycorrhizal networks amplify competition by preferential mineral nutrient allocation to large host plants.</a> New Phytologist. , (2016).</li>
<li>Fellbaum, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+nutrient+allocation+in+common+mycorrhizal+networks+is+regulated+by+the+carbon+source+strength+of+individual+host+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Fungal nutrient allocation in common mycorrhizal networks is regulated by the carbon source strength of individual host plants.</a> New Phytologist. 203 (2), 646-656 (2014).</li>
<li>Lekberg, Y., Hammer, E. C., Olsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plants+as+resource+islands+and+storage+units--adopting+the+mycocentric+view+of+arbuscular+mycorrhizal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Plants as resource islands and storage units--adopting the mycocentric view of arbuscular mycorrhizal networks.</a> FEMS Microbiol Ecol. 74 (2), 336-345 (2010).</li>
<li>Jakobsen, I., Hammer, E. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJakobsen%2C+I+%22Mycorrhizal+Networks%22">Mycorrhizal Networks</a>. , Springer. 91-131 (2015).</li>
<li>Jakobsen, I., Rosendahl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+flow+into+soil+and+external+hyphae+from+roots+of+mycorrhizal+cucumber+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants.</a> New Phytologist. 115 (1), 77-83 (1990).</li>
<li>Kiers, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+rewards+stabilize+cooperation+in+the+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis.</a> Science. 333 (6044), 880-882 (2011).</li>
<li>Hartnett, D. C., Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycorrhizal+influence+on+intra-+and+interspecific+neighbour+interactions+among+co-occuring+prairie+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mycorrhizal influence on intra- and interspecific neighbour interactions among co-occuring prairie grasses.</a> Journal of Ecology. 81 (4), 787-795 (1993).</li>
<li>Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T., Todd, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+C3+and+C4+grasses+to+mycorrhizal+symbiosis%2C+phosphorus+fertilization%2C+and+soil+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Differential responses of C3 and C4 grasses to mycorrhizal symbiosis, phosphorus fertilization, and soil microorganisms.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (3), 461-467 (1990).</li>
<li>Johnson, D., Leake, J. R., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in-growth+core+system+enables+functional+studies+of+grassland+mycorrhizal+mycelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Novel in-growth core system enables functional studies of grassland mycorrhizal mycelial networks.</a> New Phytologist. 152 (3), 555-562 (2001).</li>
<li>Leake, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Networks+of+power+and+influence%3A+the+role+of+mycorrhizal+mycelium+in+controlling+plant+communities+and+agroecosystem+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany-Revue+Canadienne+De+Botanique%22%5BJournal%5D)">Networks of power and influence: the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning.</a> Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 82 (8), 1016-1045 (2004).</li>
<li>Babikova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underground+signals+carried+through+common+mycelial+networks+warn+neighbouring+plants+of+aphid+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Underground signals carried through common mycelial networks warn neighbouring plants of aphid attack.</a> Ecology Letters. 16 (7), 835-843 (2013).</li>
<li>Schüepp, H., Miller, D. D., Bodmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+monitoring+hyphal+growth+of+vesicular-arbuscular+mycorrhizal+fungi+through+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+British+Mycological+Society%22%5BJournal%5D)">A new technique for monitoring hyphal growth of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi through soil.</a> Transactions of the British Mycological Society. 89 (4), 429-435 (1987).</li>
<li>Miller, D. D., Bodmer, M., Schüepp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+endomycorrhizal+colonization+and+effects+on+growth+of+apple+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Spread of endomycorrhizal colonization and effects on growth of apple seedlings.</a> New Phytologist. 111 (1), 51-59 (1989).</li>
<li>Jakobsen, I., Gazey, C., Abbott, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate+transport+by+communities+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi+in+intact+soil+cores%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Phosphate transport by communities of arbuscular mycorrhizal fungi in intact soil cores.</a> New Phytologist. 149 (1), 95-103 (2001).</li>
<li>Johnson, D., Leake, J., Ostle, N., Ineson, P., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+13CO2+pulse%E2%80%90labelling+of+upland+grassland+demonstrates+a+rapid+pathway+of+carbon+flux+from+arbuscular+mycorrhizal+mycelia+to+the+soil%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">In situ 13CO2 pulse‐labelling of upland grassland demonstrates a rapid pathway of carbon flux from arbuscular mycorrhizal mycelia to the soil.</a> New Phytologist. 153 (2), 327-334 (2002).</li>
<li>Johnson, D., Leake, J., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+recent+photosynthate+into+mycorrhizal+mycelium+of+an+upland+grassland%3A+short-term+respiratory+losses+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22of+14C.+Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transfer of recent photosynthate into mycorrhizal mycelium of an upland grassland: short-term respiratory losses and accumulation.</a> of 14C. Soil Biology and Biochemistry. 34 (10), 1521-1524 (2002).</li>
<li>Walder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycorrhizal+networks%3A+Common+goods+of+plants+shared+under+unequal+terms+of+trade%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mycorrhizal networks: Common goods of plants shared under unequal terms of trade.</a> Plant Physiology. 159 (June 2012), 789-797 (2012).</li>
<li>Song, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplant+communication+of+tomato+tlants+through+underground+common+mycorrhizal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Interplant communication of tomato tlants through underground common mycorrhizal networks.</a> Plos One. 5 (10), e13324(2010).</li>
<li>Merrild, M. P., Ambus, P., Rosendahl, S., Jakobsen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+arbuscular+mycorrhizal+networks+amplify+competition+for+phosphorus+between+seedlings+and+established+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Common arbuscular mycorrhizal networks amplify competition for phosphorus between seedlings and established plants.</a> New Phytologist. 200 (1), 229-240 (2013).</li>
<li>Janos, D. P., Scott, J., Aristizábal, C., Bowman, D. M. J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbuscular-mycorrhizal+networks+inhibit+Eucalyptus+tetrodonta+seedlings+in+rain+forest+soil+microcosms%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Arbuscular-mycorrhizal networks inhibit Eucalyptus tetrodonta seedlings in rain forest soil microcosms.</a> Plos One. 8 (2), e57716(2013).</li>
<li>Wyss Lozano Hoyos, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyss+Lozano+Hoyos%2C+T+%22Pinus+elliottii+var.+densa+Seedling+Performance+Reflects+Ectomycorrhizas%2C+Soil+Nutrient+Availability+and+Root+Competition%22">Pinus elliottii var. densa Seedling Performance Reflects Ectomycorrhizas, Soil Nutrient Availability and Root Competition</a>. , (2010).</li>
<li>Mäder, P., Vierheilig, H., Alt, M., Wiemken, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundries+between+soil+compartments+formed+by+microporous+hydrophobic+membranes+%28GORE-TEX%29+can+be+crossed+by+vesicular-arbuscular+mycorrhizal+fungi+but+not+by+ions+in+the+soil+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Boundries between soil compartments formed by microporous hydrophobic membranes (GORE-TEX) can be crossed by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi but not by ions in the soil solution.</a> Plant and Soil. 152, 201-206 (1993).</li>
<li>Mäder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+15N+from+a+soil+compartment+separated+by+a+polytetrafluoroethylene+membrane+to+plant+roots+via+the+hyphae+of+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Transport of 15N from a soil compartment separated by a polytetrafluoroethylene membrane to plant roots via the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi.</a> New Phytologist. 146 (1), 155-161 (2000).</li>
<li>Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrundrett%2C+M+%22Working+with+Mycorrhizas+in+Forestry+and+Agriculture%22">Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture</a>. , (1996).</li>
<li>McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+which+gives+an+objective-measure+of+colonization+of+roots+by+vesicular+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A new method which gives an objective-measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi.</a> New Phytologist. 115 (3), 495-501 (1990).</li>
<li>Weremijewicz, J., Janos, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mycorrhizal+networks+amplify+size+inequality+in+Andropogon+gerardii+monocultures%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Common mycorrhizal networks amplify size inequality in Andropogon gerardii monocultures.</a> New Phytologist. 198 (1), 203-213 (2013).</li>
<li>Weremijewicz, J., O’Reilly, L. dS. L., Janos, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbuscular+common+mycorrhizal+networks+mediate+intra-and+interspecific+interactions+of+two+prairie+grasses%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Arbuscular common mycorrhizal networks mediate intra-and interspecific interactions of two prairie grasses.</a> Mycorrhiza. , 1-13 (2017).</li>
<li>Weiner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+competition+in+plant+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Tree%22%5BJournal%5D)">Asymmetric competition in plant populations.</a> Tree. 5 (11), 360-364 (1990).</li>
<li>Damgaard, C., Weiner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Describing+inequality+in+plant+size+or+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Describing inequality in plant size or fecundity.</a> Ecology. 81 (4), 1139-1142 (2000).</li>
<li>Johnson, C. R., Joiner, J. N., Crews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+N%2C+K%2C+and+Mg+on+growth+and+leaf+nutrient+composition+of+3+container+grown+woody+ornamentals+inoculated+with+mycorrhizae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of N, K, and Mg on growth and leaf nutrient composition of 3 container grown woody ornamentals inoculated with mycorrhizae.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 105 (2), 286-288 (1980).</li>
<li>Estrada-Luna, A. A., Davies, F. T., Egilla, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycorrhizal+fungi+enhancement+of+growth+and+gas+exchange+of+micropropagated+guava+plantlets+%28Psidium+guajava+L.%29+during+ex+vitro+acclimatization+and+plant+establishment%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Mycorrhizal fungi enhancement of growth and gas exchange of micropropagated guava plantlets (Psidium guajava L.) during ex vitro acclimatization and plant establishment.</a> Mycorrhiza. 10 (1), 1-8 (2000).</li>
<li>Hurlbert, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoreplication+and+the+design+of+ecological+field+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Monographs%22%5BJournal%5D)">Pseudoreplication and the design of ecological field experiments.</a> Ecological Monographs. 54 (2), 187-211 (1984).</li>
<li>Argüello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+of+partners+improve+carbon+for+phosphorus+trade+in+the+arbuscular+mycorrhizal+mutualism%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Options of partners improve carbon for phosphorus trade in the arbuscular mycorrhizal mutualism.</a> Ecology Letters. 19 (6), 648-656 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasze wyniki potwierdzają, że nasza metoda z rdzeniem rotacyjnym może skupić się na roli CMN w podziemnych interakcjach roślin. W protokole jest jednak kilka krytycznych etapów, które, jeśli zostaną zmienione, mogą potencjalnie wpłynąć na zdolność do wykrywania efektów CMN. Bardzo ważne jest, aby wypełnić obszar śródmiąższowy otaczający pojemniki podłożem ubogim w składniki odżywcze. W naszym nieudanym eksperymencie z rośliną docelową z rotacyjnym rdzeniem z siewkami drzewa guawy, chociaż nastąpiło wyraźne zmniejszenie w...

Grzyby mikoryzowe (AM) pomagały roślinom w kolonizacji lądu 460 milionów lat temu1 a dziś są wszechobecnymi symbiontami większości roślin2, dostarczając im niezbędnych składników mineralnych do wzrostu. Cienkie, nitkowate strzępki grzybów AM żerują na mineralnych składnikach odżywczych poza strefami zubożenia składników odżywczych w pobliżu korzeni, często napotykając i kolonizując systemy korzeniowe sąsiednich roślin w "wspólnej sieci mikoryzowej" (CMN). Wspólne sieci mikoryzowe mogą również powstawać, gdy zarazki grzybów dołączają do istniejących sieci3, lub gdy strzępki AM łączą się (anastomoza) ze strzępkami współgatunkowymi4,5,6,7. Zasięg tych zewnątrzrodnikowych strzępek w glebie jest ogromny, przy czym strzępki pozarodnikowe stanowią od 20% do 30% całkowitej biomasy mikrobiologicznej gleby na glebach preriowych i pastwiskowych8 i rozciągają się na 111 m·cm-3 na niezakłóconych użytkach zielonych9.
Powszechne sieci mikoryzowe rozdzielają mineralne składniki odżywcze między połączone ze sobą sąsiednie rośliny10,11,12,13. Rośliny mogą otrzymywać do 80% swojego fosforu i 25% swojego zapotrzebowania na azot od grzybów AM, dostarczając w zamian do 20% całkowitego związanego węgla do grzybów14. Niedawne badania in vitro nad hodowlą narządów korzeniowych wykazały, że CMN preferencyjnie wymieniają mineralne składniki odżywcze z korzeniami gospodarza, które dostarczają grzybom najwięcej węgla11,12. Co więcej, różne gatunki grzybów AM mogą różnić się jakością jako partnerzy symbiotyczni, przy czym niektóre grzyby wymieniają więcej fosforu za mniej węgla niż inne15. Chociaż hodowle narządów korzeniowych są korzystnymi modelami do badania symbiozy AM, ponieważ prezentują starannie kontrolowane środowisko i możliwość bezpośredniej obserwacji wzajemnych połączeń strzępkowych, nie obejmują pędów fotosyntetyzujących, które wpływają na ważne procesy fizjologiczne, takie jak fotosynteza, transpiracja i zmiany dobowe, a także stanowią pochłaniacze węgla i składników mineralnych.
W naturze, siewki najprawdopodobniej korzystają z już istniejących CMN. Do niedawna jednak naukowcy badali wpływ grzybów AM na odżywianie roślin tylko poprzez uprawę roślin z grzybami AM i bez nich, często z jednym gatunkiem grzyba AM. Chociaż praca ta była niezwykle pouczająca dla naszego zrozumienia mikoryzy arbuskularnej, metoda ta przeoczyła potencjalnie kluczową rolę, jaką CMN mogą odgrywać w interakcjach między połączonymi roślinami żywicielskimi. W szczególności rośliny, które są w dużym stopniu zależne od grzybów AM pod względem wzrostu, oddziałują minimalnie bez grzybów AM16,17, co może zakłócić naszą interpretację interakcji za pośrednictwem grzyba AM, gdy są używane jako "kontrole" dla odniesienia do punktu odniesienia.
Proponujemy podejście oparte na rotowanym rdzeniu do badania roli CMN w interakcjach roślinnych i strukturyzacji populacji. Nasze podejście naśladuje składniki symbiozy AM w naturze, ponieważ całe rośliny dołączają do ustalonych CMN, a wszystkie rośliny są uprawiane z grzybami AM. Usuwając interakcje korzeniowe, nasza metodologia koncentruje się w szczególności na interakcjach, w których pośredniczą grzyby AM, jednocześnie śledząc ruch mineralnych składników odżywczych w CMN. Nasze podejście opiera się na wcześniejszych pracach, w których wykorzystano obrócone rdzenie zarówno w terenie, jak i w szklarni, aby zrozumieć realistyczne funkcjonowanie AM.
Metoda rotowanego rdzenia została uznana w literaturze jako metoda manipulowania strzępkami pozarodnikowymi18,19,20,21, i w ciągu ostatnich dwóch dekad doczekała się kilku reinkarnacji w zależności od swojego przeznaczenia. Początkowo worki siatkowe lub bariery umożliwiające wrastanie strzępek były używane do zapewnienia przedziałów wolnych od korzeni w celu ilościowego określenia ilości arbuskularnych strzępek mikoryzowych w glebie22,23. Następnie rozwinęły się cylindryczne rdzenie gleby zamknięte w sztywnych rurach wodociągowych lub plastikowych rurkach ze szczelinami pokrytymi nylonową siatką, przez którą przenikały strzępki, ale nie korzenie. Można je łatwo obrócić, aby zakłócić działanie grzybni pozarodnikowej18,24,25. Obrócone rdzenie umieszczono między roślinami, a długości strzępek gleby na gram gleby18, 13strumieni C do grzybni pozarodnikowej24, lub określono ilościowo pobór fosforu z rdzeni wolnych od roślin18. Innym zastosowaniem takich rdzeni było hodowanie w nich roślin na polu, aby zmniejszyć kolonizację korzeni przez grzyby AM poprzez częste zakłócanie strzępek jako alternatywę dla sterylizacji lub stosowania fungicydów, z których oba mają pośredni wpływ na materię organiczną gleby i inne drobnoustroje18.
Podejście oparte na barierze z siatki strzępkowej zostało użyte do zbadania podziału składników odżywczych i interakcji roślin między CMN, ale w prostokątnych mikrokosmosach, a nie z obróconymi rdzeniami. Walder et al.26 badali interakcje między Linum usitatissimum (len) a Sorghum bicolor (sorgo), śledząc mineralne składniki odżywcze do wymiany węgla przy użyciu izotopów w CMN jednego z grzybów AM Rhizophagus irregularis lub Funneliformis mosseae26. Mikrokosmosy w ich badaniu składały się z przedziałów roślinnych oddzielonych barierami siatkowymi, przedziałów strzępek dostępnych tylko dla strzępek mikoryzowych oraz oznakowanych przedziałów strzępkowych, które zawierały radioaktywne i stabilne izotopy. Jako grupę kontrolną w badaniu zastosowano zabiegi bez grzybów mikoryzowych. Song et al.27 zastosowali podobne podejście, aby odkryć, że sygnały roślinne mogą być przenoszone tylko wśród ustalonych CMN F. mosseae, gdy jedna roślina została zainfekowana patogenem grzybowym. Ponadto, podobnie jak Walder et al.26, Merrild et al.28 hodowali rośliny w indywidualnych przedziałach oddzielonych siatką, aby zbadać wydajność roślin siewek Solanum lycopersicum (pomidora) połączonych CMN z dużą rośliną Cucumis sativus (ogórek), która stanowiła obfite źródło węgla. Zastosowali również zabiegi bez grzybów mikoryzowych zamiast odcinania CMNs28. W drugim, powiązanym eksperymencie, węgiel do wymiany fosforu został zbadany przy użyciu worków siatkowych oznaczonych 32P. Mikrokosmosy z barierami z siatki strzępkowej i odcinanie CMN jako leczenie zostały użyte przez Janos et al.29, którzy badali konkurencyjne interakcje między siewkami gatunku drzewa sawanny Eucalyptus tetrodonta a przeszczepami drzewa lasu deszczowego, Litsea glutinosa. W tym badaniu Janos i in.29 podnieśli przedziały zawierające sadzonki o kilka centymetrów, przesuwając warstwy siatki względem siebie, aby przerwać połączenia strzępkowe29.
Ostatnim krokiem w ewolucji metody obracanego rdzenia było hodowanie roślin wewnątrz rdzeni, które znajdują się w doniczkach lub mikrokosmosach20,30. Wyss30 użył obróconych rdzeni, aby ustalić, czy pozarodnikowa grzybnia AM może skolonizować siewki Pinus elliottii podczas rozprzestrzeniania się z dawcy lub "pielęgniarki" rośliny żywicielskiej AM, Tamarindus indica, i jak pozarodnikowa grzybnia grzybów ektomikoryzowych wpływa na wydajność siewek. Duże komercyjne rurowe pojemniki na sadzonki (Tabela materiałów) w mikrokosmosach były albo z litego tworzywa sztucznego (bez CMN), albo ze szczelinami i pokryte hydrofobową membraną. Pojemniki na sadzonki ze szczelinami albo nie były obracane (nienaruszone CMN), albo obracane w celu przecięcia ustalonych CMN. Obrócone rdzenie z różnymi rozmiarami barier siatkowych zostały użyte przez Babikova et al.20 do zbadania sygnalizacji podziemnej przez CMN wśród roślin Vicia faba (fasola). W ich badaniach centralna roślina dawcza w mezokosmosach o średnicy 30 cm była ze sobą połączona albo za pomocą korzeni i strzępek (bez bariery), albo tylko za pomocą CMN ustanowionych za pomocą siatki 40 μm. Centralne rośliny zostały odcięte od interakcji z sąsiednimi roślinami poprzez rotację rdzeni otoczonych siatką, lub CMN były zapobiegane przez drobną siatkę 0,5 μm otaczającą rdzeń.
Tutaj prezentujemy metodę, która łączy aspekty wcześniejszych podejść z rdzeniem rotacyjnym w celu zbadania wpływu CMN na bezpośrednie interakcje roślinne w połączeniu ze śledzeniem stabilnych izotopów. Nasza metoda wykorzystuje podejście "rośliny docelowej", w którym centralna roślina będąca przedmiotem zainteresowania jest otoczona przez sąsiednie rośliny. Rośliny są uprawiane w obrotowych pojemnikach na sadzonki, które są szczelinowe i pokryte nylonową siatką sitodrukową, membraną hydrofobową lub są wykonane z niemodyfikowanego litego tworzywa sztucznego. Wspólne sieci mikoryzowe są przerywane raz w tygodniu lub utrzymywane w stanie nienaruszonym, a stabilne izotopy 15N śledzą ruch azotu z obróconych rdzeni sąsiadów do centralnej rośliny docelowej. Porównując wielkość rośliny z mineralnymi składnikami odżywczymi i stabilnym pobieraniem izotopów, oceniamy, które rośliny mogą czerpać korzyści lub cierpieć z powodu CMN w interakcjach między roślinami żywicielskimi.

<table><tbody><tr><td>Komercyjny pojemnik na sadzonki rurkowe (zwany w manuskrypcie "pojemnikami")</td> <td>Stuewe and Sons, Inc</td><td>Ray Leach Cone-tainer & trade;</td><td>Zobacz materiał RLC3U</td></tr><tr><td>Kurs koraliki szklane</td><td>Industrial Supply, Inc.</td><td>Sito 12/20</td><td>Rozmiar #1</td></tr><tr><td>Kurs piasek kwarcowy</td><td>Floryda Piasek kwarcowy</td><td>6/20 Worki 50lb</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Drobne koraliki szklane</td><td>Black Beauty</td><td>Black Beauty FINE Ścierniwo z kruszonego szkła (50 funtów)</td><td>BB-Glass-Fine</td></tr><tr><td>Membrana hydrofobowa</td><td>Gore-tex</td><td>Brak</td><td></td></tr><tr><td>Duże komercyjne pojemniki na sadzonki rurkowe</td><td>Stuewe and Sons, Inc.</td><td>Deepot i handel;</td><td>D16L</td></tr><tr><td>Średni piasek kwarcowy</td><td>Florida Piasek krzemionkowy</td><td>30/65 Worki 50 funtów</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Siatka nylonowa</td><td>Tube Lite Company, Inc.</td><td>Sitodruk</td><td>LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLIESTER</td></tr><tr><td>Urządzenie do analizy gleby i składników odżywczych w</td><td>liściach Laboratorium badania gleby Uniwersytetu Stanowego Kansas</td><td>Brak</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Zakład rdzenia stabilnych izotopów</td><td>Uniwersytet w Miami</td><td>Brak</td><td>Brak</td></tr></tbody></table>

badanie interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni

Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores

Grzyby mikoryzowe (AM) wpływają na pobieranie i wzrost mineralnych składników odżywczych roślin, a zatem mają potencjał do wpływania na interakcje roślin. Siła ich wpływu tkwi w grzybni pozarodnikowej, która rozprzestrzenia się poza strefy zubożenia składników odżywczych znajdujące się w pobliżu korzeni, aby ostatecznie połączyć osobniki we wspólnej sieci mikoryzowej (CMN). Większość eksperymentów badała jednak rolę grzybów AM w interakcjach z roślinami poprzez uprawę roślin z grzybami mikoryzowymi i bez nich, metoda, która nie odnosi się wyraźnie do roli CMN. W tym miejscu proponujemy metodę, która manipuluje CMN w celu zbadania ich roli w interakcjach roślinnych. Nasza metoda wykorzystuje zmodyfikowane pojemniki ze stożkowym dnem z siatką nylonową i/lub materiałem hydrofobowym zakrywającym szczelinowe otwory, nawóz 15N i ubogi w składniki odżywcze piasek śródmiąższowy. CMN pozostają nienaruszone między wchodzącymi w interakcję osobnikami, są odcinane przez obracanie pojemników lub uniemożliwia ich tworzenie się przez solidną barierę. Nasze odkrycia sugerują, że pojemniki rotacyjne są wystarczające, aby zakłócić CMN i zapobiec ich wpływowi na interakcje roślin między CMN. Nasze podejście jest korzystne, ponieważ naśladuje aspekty natury, takie jak siewki wykorzystujące już ustalone CMN i wykorzystanie zestawu grzybów AM, które mogą zapewnić różnorodne korzyści. Chociaż nasz eksperyment ogranicza się do badania roślin na etapie siewki, interakcje między roślinami między CMN można wykryć za pomocą naszego podejścia, które dzięki temu może być zastosowane do badania biologicznych pytań dotyczących funkcjonowania CMN w ekosystemach.

Aby określić, w jaki sposób CMN mogą wpływać na kondycję roślin poprzez podział składników odżywczych, wyhodowano Andropogon gerardii Vitman, dominującą trawę preriową, w eksperymencie z rośliną docelową, w otoczeniu 6 równomiernie rozmieszczonych sąsiadów oraz z nienaruszonymi, przeciętymi lub brakiem CMN. Stwierdzono, że przecięcie lub uniemożliwienie powstania CMN zmniejszyło nadziemną suchą masę roślin docelowych (Rycina 2), co sugeruje, że niena...

Większość roślin w społecznościach prawdopodobnie jest połączona przez arbuskularne grzyby mikoryzowe (AM), ale mediacja interakcji między roślinami przez nie była badana głównie przez uprawę roślin z mikoryzą i bez niej. Przedstawiamy metodę manipulowania powszechnymi sieciami mikoryzowymi wśród roślin mikoryzowych w celu zbadania ich konsekwencji dla interakcji roślin.

Badanie interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni

Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi influence plant mineral nutrient uptake and growth, hence, they have the potential to influence plant interactions. The ...

Większość roślin w naturze jest prawdopodobnie połączona przez symbiotyczne grzyby zasiedlające korzenie, zwane grzybami mikoryzowymi. Metoda ta wyraźnie bada, w jaki sposób powszechne sieci mikoryzowe wpływają na interakcje między roślinami i wynikające z nich konsekwencje ekologiczne. Dzięki tej metodzie możemy jednoznacznie zbadać rolę powszechnych sieci mikoryzowych, jednocześnie pozwalając na kolonizację wszystkich roślin przez grzyby, w przeciwieństwie do wykluczania grzybów, co skutkuje słabym wzrostem roślin.Aby rozpocząć modyfikację komercyjnych rurowych pojemników na sadzonki za pomocą elastycznego tworzywa sztucznego, użyj prasy wiertarskiej i przytrzymaj pojemnik o ogrodzenie na wiertarce i umieść ogranicznik z krótkim kołkiem, który pasuje do pojemnika, aby pomóc utrzymać go na miejscu podczas wiercenia. Następnie wywierć dwa otwory, jeden nad drugim, po bokach pojemnika, tak aby otwory były oddalone od siebie o około jeden centymetr. Wytnij pozostały cienki kawałek plastiku między otworami, aby utworzyć jeden wydłużony otwór o szerokości około dwóch centymetrów i długości pięciu centymetrów.Powtórz wycinanie tych wydłużonych otworów po przeciwnej stronie pojemnika. Aby przykryć szczeliny siatką nylonową, pokrój siatkę porów o grubości 40 mikrometrów na tyle kawałków o wymiarach 9.5 cm na 8.5 centymetra, ile jest pojemników. Następnie, za pomocą gorącego kleju przemysłowego o wysokiej wytrzymałości, przymocuj nylonową siatkę zewnętrznie do pojemników, aby zakryć oba otwory, z lekkim zachodzeniem na siebie tkaniny.Nałóż gorący klej wokół otworów w pojemniku i wzdłuż długich krawędzi nylonowej siatki, a następnie zwiń pojemnik na nylonową siatkę i membranę hydrofobową, jeśli jest używana, aby uniknąć poparzenia palców. Dodaj warstwę kleju wzdłuż krawędzi tkaniny w miejscu, w którym krawędzie siatki zachodzą na siebie, i dociśnij krawędź do kartonu, aby mocno ją uszczelnić. Gdy klej ostygnie, użyj elastycznej taśmy, aby przymocować górny i dolny koniec tkaniny do pojemnika, aby zapobiec luźnym krawędziom i rozdarciu.Za pomocą tej samej taśmy zakryj małe otwory po bokach stożkowego końca każdego pojemnika, aby zapobiec wyrastaniu korzeni z pojemnika do reszty doniczki. Umieść szklaną kulkę na dnie każdego pojemnika, aby zapobiec utracie gleby, zapewniając drenaż, a następnie złóż doniczki zgodnie z opisem w manuskrypcie. Do zabiegu kontrolnego należy używać stałych, niezmodyfikowanych pojemników, które nie wiążą się z możliwością tworzenia się CMN między roślinami.Dodaj inokulum grzyba AM do gleby, równomiernie mieszając 1,2-centymetrowe posiekane kawałki korzeni dokładnie z glebą. Wybierz żądaną glebę zmieszaną z nieurodzajnym piaskiem kwarcowym lub szklanymi kulkami, aby zmniejszyć stężenie mineralnych składników odżywczych dostępnych dla roślin. Napełnione pojemniki należy umieścić we wcześniej skonstruowanej wywierconej piance w doniczkach.Aby uzyskać ubogą w składniki odżywcze mieszankę piasku kwarcowego o odpowiednim drenażu, wymieszaj piasek o średniej wielkości cząstek z piaskiem o małych cząstkach w betoniarce. Wypełnij przestrzeń śródmiąższową tą mieszanką za pomocą lejka, aby pomóc w wypełnieniu małych przestrzeni. Następnie przeszczep wstępną obróbkę lub tak zwane rośliny pielęgniarskie pożądanych gatunków do każdego pojemnika, aby utrzymać grzyby AM, które rozprzestrzenią się między pojemnikami i utworzą wspólne sieci mikoryzowe.Uprawiaj rośliny przez dwa do trzech miesięcy w temperaturze około 24 stopni Celsjusza w szklarni, aby umożliwić założenie CMN. Zszyj rośliny eksperymentalne, wysiewając je do pojemników. Poczekaj, aż wszystkie pojemniki wykiełkują sadzonki, zanim usuniesz rośliny szkółkarskie poddane zabiegowi wstępnemu, przycinając ich pędy.Aby ustalić leczenie CMN, pozostaw niektóre pojemniki nieporuszane na czas trwania eksperymentu. Aby fizycznie odciąć strzępki rozciągające się między zmodyfikowanymi pojemnikami, obracaj niektóre z nich co tydzień, upewniając się, że robisz to przez jeden pełny obrót, aby uniknąć niezamierzonej zmiany interakcji nad ziemią. Natychmiast po obróceniu mocno podlej wszystkie doniczki, aby przywrócić kontakt między podłożem śródmiąższowym a ściankami pojemników.Moczenie wszystkich doniczek w wodzie po przecięciu wspólnych sieci mikoryzowych ma kluczowe znaczenie dla przywrócenia kontaktu między pojemnikiem a podłożem śródmiąższowym, zapobiegając w ten sposób niezamierzonemu napowietrzeniu pojemników. Sąsiednie rośliny nawozić azotanem potasu wzbogaconym w 0,5% azotem 15 i chlorkiem amonu. Osobnik docelowy nawozić nawozem Nitrogen 14 o równym stężeniu.Ponownie losowo dobieraj pozycje doniczek w trakcie eksperymentu, co najmniej raz w miesiącu. Mierz wzrost co tydzień, mierząc długość najdłuższych liści, aby monitorować, kiedy wzrost zaczyna zwalniać, upewniając się, że zbierasz plony, zanim rośliny zostaną związane z korzeniami. Aby zebrać, przytnij całą tkankę nadziemną i umieść poszczególne rośliny w kopertach oznaczonych ich zabiegiem, doniczką i pozycją.Następnie wysuszyć tkanki nadziemne w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piecu do suszenia z wymuszonym obiegiem powietrza, do stałej masy, a następnie zmierzyć suchą masę każdej tkanki roślinnej. Pozostaw glebę do wyschnięcia na dwa do trzech dni przed wyjęciem pojemników i zbraniem korzeni. Po zbiorach delikatnie zetrzyj jak najwięcej ziemi z systemów korzeniowych.Umyj korzenie na sicie o wielkości porów 250 mikronów, aby uniknąć utraty korzeni. Po pozostawieniu korzeni do wyschnięcia na powietrzu zważ cały system korzeniowy. Przytnij losowo system korzeniowy i umieść fragmenty w 50% etanolu.Ponownie zważ pozostały system korzeniowy i przechowuj go w papierowej kopercie z etykietą do wyschnięcia w temperaturze 60 stopni Celsjusza w celu oceny suchej masy. Podczas uprawy Andropogon gerardii Vitman w eksperymencie na roślinie docelowej, odcięcie lub zapobieganie CMN zmniejszyło suchą masę nad ziemią celu, co sugeruje, że nienaruszone CMN sprzyjały wzrostowi roślin. Rośliny z odciętymi CMN i bez CMN zareagowały podobnie na swoje zabiegi.Konkurencja, w której wzrost jednego osobnika hamuje wzrost innego pobliskiego osobnika, została wykryta w nienaruszonym leczeniu CMN, ale nie w przypadku przerwanego leczenia CMN lub bez niego. Dokładne porównania różnych stężeń mineralnych składników odżywczych w tkankach liści w porównaniu ze stężeniami manganu tylko dla wielkości roślin, były pozytywnie związane z suchą masą roślin docelowych nad ziemią we wszystkich zabiegach. Docelowa tkanka roślinna została oceniona pod kątem azotu 15 w tkankach liści w porównaniu z wielkością rośliny, po dodaniu etykiety azotu 15 tylko do pojemników sąsiadów.Rośliny docelowe z nienaruszonymi CMN miały wyższe stężenie azotu 15 w porównaniu z obydwoma innymi zabiegami. Nienaruszone CMN miały silnie dodatnie, istotnie różniące się nachylenie ilości azotu od tego, które miało miejsce w przypadku leczenia odciętymi CMN, co sugeruje, że duże rośliny uzyskały więcej azotu z CMN docierających do sąsiednich pojemników niż małe osobniki docelowe. W eksperymencie terenowym z użyciem obróconych rdzeni wykonanych z rury PVC, pozarodnikowa grzybnia poza rurami miała niewielki wpływ na wzrost mydnicy lekarskiej podczas 13-miesięcznego eksperymentu.Jednak przecięcie go przez obracanie rur zmniejszyło stężenie azotu, fosforu i miedzi w liściach, co znacznie wykazano w roślinach chlorotycznych. Obróć pojemniki w tym samym kierunku, w którym tkanina jest przyklejona do każdego pojemnika, aby uniknąć rozdarcia tkaniny, i obróć o 360 stopni, aby zmniejszyć zmiany nad ziemią roślin. Procedura ta może być stosowana w terenie ze zmodyfikowanymi rurami PVC wypełnionymi sterylną glebą w celu zbadania roli grzybni pozarodnikowej w kolonizacji korzeni i jej wpływu na pobieranie składników odżywczych.Technika ta pozwala na porównanie roślin o powszechnych sieciach mikoryzowych z roślinami mikoryzowymi, które nie są ze sobą połączone sieciami, a nie z małymi roślinami bez mikoryz, jak to się najczęściej robi.

investigation-plant-interactions-across-common-mycorrhizal-networks

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisany system kouprawy hydroponicznej wspiera nienaruszone rośliny za pomocą metalowych siatek i współhoduje je z bakteriami. Tkanki roślinne, bakterie i wydzielane cząsteczki mogą być następnie oddzielnie zbierane do dalszych analiz, co jednocześnie pozwala na zbadanie odpowiedzi molekularnych zarówno gospodarzy roślinnych, jak i oddziałujących na siebie mikroorganizmów lub mikrobiomów.

Hydroponiczny system wspólnej uprawy do jednoczesnej i systematycznej analizy interakcji molekularnych między roślinami a mikroorganizmami oraz sygnalizacji

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Analiza sieci została zastosowana do oceny związku różnych ekologicznych zbiorowisk mikroorganizmów, takich jak gleba, woda i ryzosfera. Przedstawiono protokół dotyczący wykorzystania algorytmu WGCNA do analizy różnych sieci współwystępowania, które mogą wystąpić w zbiorowiskach mikroorganizmów ze względu na różne środowiska ekologiczne.

Dywergencja mikrobioty korzeni w różnych siedliskach w oparciu o ważone sieci korelacji

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Protokół tutaj opisuje metody oceny wzorców i strategii kolonizacji mikoryzowej w korzeniach dla dwóch gatunków: Zea mays i Festuca rubra. Zastosowanie metody MycoPatt pozwala na obliczanie parametrów, konwersję struktur mikoryzowych na dane cyfrowe oraz odwzorowanie ich rzeczywistego położenia w korzeniach.

Mapy mikoryzowe jako narzędzie do badania wzorców kolonizacji i strategii grzybów w korzeniach Festuca rubra i Zea mays

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Tutaj opisujemy prostą i tanią technikę inokulacji i obserwacji arbuskularnych grzybów mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych opartych na polimerach.

Inokulacja i obserwacja arbuskularnych kultur mikoryzowych w superchłonnych systemach autotroficznych na bazie polimerów

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę badania interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni. Technika ta pozwala na szczegółowe zbadanie roli grzybów mikoryzowych w ekologii roślin.

Badanie interakcji roślin w powszechnych sieciach mikoryzowych przy użyciu obróconych rdzeni

Przeglądaj więcej filmów