Name: Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Poznaj metodę elektroforezy DNA z oranżem tiazolowym jako bezpieczną alternatywą dla bromku etydyny. Protokół umożliwia wizualizację DNA przy użyciu światła niebieskiego, co zmniejsza uszkodzenia DNA i poprawia wyniki kolejnych eksperymentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe dla TDG z Christopher Newport University.

1. Przygotowanie żelu
UWAGA: Ogólne protokoły elektroforezy żelowej można znaleźć także w P.Y. Lee, et al. 14. 
<ol>
	<li>Wymieszaj agarozę (~1% w/v, zawartość procentowa może być różna dla poszczególnych rozmiarów) w buforze (około 70 ml dla mini-żelu (8 x 7 cm)). to zwykle TAE (tris-octan-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM octan, 1 mM EDTA, pH około 8,6) lub TBE (tris-boran-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boran, 2 mM EDTA, pH około 8,3)).</li>
	<li>Dodać oranż tiazolowy do końcowego stężenia 1,3 μg/ml.
	<ol>
		<li>Rozpuść oranż tiazolowy w DMSO, aby uzyskać 10 000 x roztwór podstawowy (13 mg / ml). Chociaż nie jest szczególnie wrażliwy na światło, przechowuj TO w ciemności, gdy nie jest używany. To rozwiązanie jest stabilne w temperaturze pokojowej przez ~ miesiące; długotrwałe przechowywanie można osiągnąć poprzez zamrożenie porcji (DMSO zamrozi się w standardowej lodówce). Pamiętaj, aby całkowicie stopić i ponownie zawiesić zamrożony roztwór przed użyciem. 
		UWAGA: Żel można również zabarwić TO po elektroforezie (patrz krok 2.6). Chociaż TO ma lepszy profil bezpieczeństwa w porównaniu z bromkiem etydyny, należy utrzymać standardowe laboratoryjne środki ostrożności w zakresie biologii molekularnej. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszaninę agarozy, buforu i oranżu tiazolowego należy podgrzać w kuchence mikrofalowej w celu rozpuszczenia agarozy (około 60 s). Ten etap jest powszechnie określany jako "topnienie". Zawirować (5 s), aby w razie potrzeby wspomóc rozpuszczenie. 
	UWAGA: TO można również dodać po podgrzaniu w kuchence mikrofalowej, jeśli wolisz.</li>
	<li>Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia na krótko przed wlaniem do aparatu do odlewania żelu zawierającego odpowiedni grzebień.</li>
	<li>Poczekaj, aż roztwór agarozy zestali się w żel. </li>
</ol>
2. Ładowanie i uruchamianie żelu
<ol>
	<li>Umieść żel w aparacie do elektroforezy, jeśli nie jest jeszcze obecny.</li>
	<li>Dodać bufor do biegania (TAE lub TBE jak powyżej), aby pokryć powierzchnię żelu.</li>
	<li>Załaduj próbki DNA (zwykle 10 μl) za pomocą barwnika ładującego. Dołącz drabinkę do wymiarowania DNA w celach informacyjnych.</li>
	<li>Załóż pokrywę i elektrody (żel powinien być prowadzony w kierunku czerwonej anody (dodatniej)).</li>
	<li>Przyłóż napięcie (zwykle ~100 V dla mini-żelu, chociaż rozmiar żelu może wymagać zmodyfikowanego napięcia, aby zapobiec uszkodzeniu żelu), aż ładowanie barwnika przebędzie odpowiednią odległość (około 4-7 cm w przypadku mini-żelu, chociaż odległość może się różnić w zależności od precyzyjnej aplikacji). 
	UWAGA: Podobnie jak bromek etydyny i wiele innych barwników wiążących DNA, oranż tiazolowy jest naładowany dodatnio. W konsekwencji barwniki te będą migrować w kierunku przeciwnym do elektroforezacji DNA. W przypadku próbek, które są spływane daleko w dół żelu w celu lepszej separacji, w końcu barwnik oddzieli się od mniejszych fragmentów DNA, co spowoduje słabe barwienie. W takich przypadkach żel należy zabarwić jak w kroku 2.6. Ta sytuacja nie jest wyjątkowa dla TO, każdy dodatnio naładowany barwnik, który odwracalnie oddziałuje z DNA, będzie wykazywał takie zachowanie (w tym bromek etydyny, TO i inne).</li>
	<li>Jeśli TO nie zostało dodane przed odlaniem żelu (krok 1.2), wybarwić przez zanurzenie żelu w buforze zawierającym oranż tiazolowy.
	<ol>
		<li>Przygotować wystarczającą ilość buforu (TAE lub TBE) zawierającego 1,3 μg/ml oranżu tiazolowego, aby całkowicie pokryć żel i namoczyć żel delikatnym mieszaniem, aż pasma zostaną w pełni wykryte (około 20 min).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wizualizacja tiazolowo-pomarańczowego żelu agarozowego (transilluminator UV)
<ol>
	<li>Usuń żel z aparatu do elektroforezy i umieść go na transiluminatorze UV. 
	UWAGA: Światło UV jest szkodliwe dla skóry i oczu. Pamiętaj, aby nosić odpowiednią ochronę oczu (gogle) i twarzy (osłona twarzy). Ręce powinny być w rękawiczkach i należy nosić długie rękawy.</li>
	<li>W razie potrzeby wytnij z żelu pożądane pasma DNA (na przykład w celu dalszego trawienia lub podwiązania). Wystaw żel na działanie światła UV tak krótko, jak to możliwe podczas wycinania. Światło UV (niezależnie od barwnika DNA) uszkadza DNA. </li>
	<li>Wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą łatwo dostępnego zestawu lub protokołu15.</li>
</ol>
4. Wizualizacja tiazolowego żelu agarozowego pomarańczowego (transiluminator światła niebieskiego lub latarka)
<ol>
	<li>Usuń żel z aparatu do elektroforezy i umieść na transiluminatorze światła niebieskiego (maksymalna długość fali emisji ~470 nm). Alternatywnie na żel można skierować niebieską latarkę LED (~470 nm) (zarówno od góry, jak i od dołu). 
	UWAGA: Podczas gdy czułość jest niższa przy użyciu transiluminatora światła niebieskiego z bromkiem etydyny, DNA barwione bromkiem etydyny można wykryć za pomocą tego protokołu światła niebieskiego.</li>
	<li>Użyj bursztynowego filtra emisyjnego (~560 nm długiego przepustu, gogle lub kwadrat) do filtrowania niebieskiego światła, umożliwiając wizualizację fluorescencji z kompleksów DNA:tiazol pomarańczowy. 
	UWAGA: Bez bursztynowego filtra emisyjnego bardzo trudno jest wykryć prążki DNA ze względu na intensywność źródła wzbudzenia światła niebieskiego. 
	UWAGA: Chociaż niebieskie światło nie ma zdolności do ostrego uszkadzania tkanek (kontrastujące promieniowanie UV), długotrwała ekspozycja na intensywne niebieskie światło może uszkodzić oczy i należy używać bursztynowych okularów emisyjnych lub filtra.</li>
	<li>W razie potrzeby wytnij z żelu pożądane pasma DNA do dalszych zastosowań. 
	UWAGA: Ponieważ niebieskie światło nie uszkadza DNA, nie jest konieczne szybkie wycinanie prążków (tak jak w przypadku stosowania wzbudzenia UV w kroku 3.2).</li>
	<li>Wyekstrahuj DNA z wycinka żelu za pomocą łatwo dostępnego zestawu lub protokołu15.</li>
</ol>
5. Przechwytywanie obrazu
<ol>
	<li>Dobierz odpowiednie ustawienia wzbudzenia i emisji w aparaturze do obrazowania żelowego. Wzbudzenie i emisja oranżu tiazolowego (λex,max = 510 nm (488 nm i 470 nm wykazują również silne wzbudzenie, oprócz silnego wzbudzenia przy długościach fal UV); λem = 527 nm) są prawie identyczne z powszechnie dostępnymi barwnikami komercyjnymi wykrywającymi światło niebieskie, więc instrumenty mogą mieć wstępnie ustawione ustawienia filtra, które można zastosować. 
UWAGA: Niektóre ustawienia filtrów dla barwników komercyjnych wykrywalnych przez światło niebieskie w rzeczywistości wykorzystują szkodliwe światło UV do wzbudzenia, dlatego należy zachować ostrożność podczas obrazowania przed wycięciem pasm. Jeśli to możliwe, użyj źródła wzbudzenia światłem niebieskim, gdy prążki DNA zostaną wycięte po obrazowaniu.</li>
	<li>W przypadku braku systemu obrazowania z odpowiednimi filtrami, należy umieścić filtr bursztynowy między kamerą a źródłem wzbudzenia światła żelowego/niebieskiego.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bromek etydyny od dawna jest standardowym narzędziem w laboratorium biologii molekularnej, pomimo znanej toksyczności. Cierpi również z powodu wymagania światła UV, które uszkadza DNA podczas wykrywania. Oranż tiazolowy stanowi niedrogą alternatywę dla bromku etydyny, a także przydatnych, ale drogich barwników komercyjnych.
Korzyści płynące z oranżu tiazolowego są zatem dwojakie. Po pierwsze, oranż tiazolowy może być po prostu stosowany jako zamiennik bromku etydyny. Żele można przygotować ide...

Celem tej metody jest identyfikacja DNA w żelach agarozowych za pomocą oranżu tiazolowego (TO) do wykrywania fluorescencji. Ze względu na niski koszt i korzystny profil bezpieczeństwa, oranż tiazolowy może być szczególnie korzystny w laboratoriach dydaktycznych i laboratoriach badawczych wykonujących biologię molekularną, zwłaszcza ligacje i klonowanie.
Bromek etydyny pozostaje najpowszechniejszym barwnikiem do wykrywania DNA w żelach agarozowych. Dzieje się tak przede wszystkim dlatego, że można go uzyskać bardzo tanio, a do wykrycia wymaga jedynie wzbudzenia światłem UV. Zarówno bromek etydyny, jak i oranż tiazolowy są niedrogie, z niskimi granicami wykrywalności (1-2 ng/tor)1. Istnieją jednak dwie główne wady bromku etydyny, które oranż tiazolowy poprawia. 
Po pierwsze, bromek etydyny jest mutagenem2 o specjalnych wymaganiach dotyczących obsługi, wysyłki i utylizacji, podczas gdy oranż tiazolowy jest mniej mutagenny (3-4 razy mniej mutagenny w teście Amesa)3,4 i może być zazwyczaj utylizowany razem ze zwykłymi odpadami chemicznymi.
Po drugie, bromek etydyny wymaga światła UV do wykrywania. Oranż tiazolowy może w razie potrzeby podobnie wykorzystywać światło UV, ale może być również wykrywany za pomocą światła niebieskiego. Światło UV, choć powszechnie stosowane, ma kilka istotnych wad. Po pierwsze, jest szkodliwy dla ludzkiej skóry i oczu. Podczas gdy światło UV może być bezpiecznie używane przez przeszkolonych specjalistów, przypadkowe uszkodzenie skóry lub oczu (funkcjonalnie podobne do oparzeń słonecznych) spowodowane laboratoryjnym światłem UV nie jest rzadkością, szczególnie w przypadku niedoświadczonych naukowców. Po drugie, światło UV jest niezwykle szkodliwe dla próbek DNA5, co zmniejsza powodzenie dalszych eksperymentów (takich jak ligacja i transformacja)1,6,7. TO umożliwia detekcję światłem niebieskim (λex, max = 510 nm (488 nm i 470 nm również wykazują silne wzbudzenie)), które nie powoduje uszkodzenia skóry ani uszkodzenia DNA (chociaż każde intensywne światło może być nadal szkodliwe dla oczu), znacznie zmniejszając ryzyko zarówno dla naukowca, jak i próbki. 
TO nie jest jedyną alternatywą dla bromku etydyny jako barwnika fluorescencyjnego; jego zaletą jest koszt. TO został odkryty w latach osiemdziesiątych XX wieku jako barwnik retikulocytów8 i znalazł zastosowanie w wielu eksperymentach fluorescencyjnych opartych na DNA9,10,11,12,13. Obecnie jest sprzedawany przez wielu dostawców. TO jest związkiem macierzystym dodatkowych, droższych, wykrywalnych przez niebieskie światło barwników komercyjnych i zachowuje się podobnie podczas elektroforezy, wykorzystując UV lub niebieskie światło do wykrywania1. Ponadto, podczas gdy inne barwniki są bardziej wrażliwe na bardzo niskie stężenia DNA niż EtBr lub TO, w przypadku ogólnych eksperymentów elektroforetycznych takie barwniki są w wielu kontekstach zbyt drogie.

<table><tbody><tr><td>2-logarytmiczna drabinka DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (klasa analizy genetycznej)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Latarka ze światłem niebieskim</td><td>WAYLLSHINE (Amazonka)</td><td>WAYLLSHINE Skalowalna niebieska dioda LED</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>etydyna bromek</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Dla porównania, nie jest konieczny do protokołu</td></tr><tr><td>Aparat żelowy (Owl Easy Cast)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td> Qiagen Qiaquick Zestaw do ekstrakcji <td></td></tr><tr><td>żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczne okulary do oglądania</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>Niezbędny do korzystania z latarki ze światłem niebieskim.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (Nadajnik światła niebieskiego)</td><td>Latarka Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Niebieskie światło może być używana jako alternatywa</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Dla porównania, nie jest to konieczne dla protokołu</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Tiazole pomarańczowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Okulary są również dołączone do Invitrogen G6600</td></tr></tbody></table>

elektroforeza dna z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Elektroforeza żelowa DNA z użyciem agarozy jest powszechnym narzędziem w laboratoriach biologii molekularnej, umożliwiającym rozdzielanie fragmentów DNA według rozmiaru. Po oddzieleniu DNA jest wizualizowane przez barwienie. W tym artykule pokazano, jak używać oranżu tiazolowego do barwienia DNA. Oranż tiazolowy wypada korzystnie w porównaniu ze zwykłymi metodami barwienia, ponieważ jest wrażliwy, niedrogi, pobudliwy przy promieniowaniu UV lub niebieskim świetle (aby zapobiec uszkodzeniu próbki) i bezpieczniejszy niż bromek etydyny. Laboratoria już wyposażone do przeprowadzania eksperymentów z elektroforezą DNA przy użyciu bromku etydyny mogą na ogół zmieniać barwniki bez dodatkowych zmian w istniejących protokołach, wykorzystując światło UV do wykrywania. Wykrywanie niebieskiego światła w celu uniknięcia uszkodzenia próbki można dodatkowo osiągnąć za pomocą źródła światła niebieskiego i filtra emisyjnego. Laboratoria już wyposażone w wykrywanie światła niebieskiego mogą po prostu zmienić barwniki bez dodatkowych zmian w istniejących protokołach.

Pomarańczowy tiazol umożliwia detekcję DNA bez użycia bromku etydyny i bez stosowania uszkadzającego DNA światła UV. Bromek etydyny jest znany ze swojego działania mutagennego, dlatego jego wyeliminowanie z laboratorium może być korzystne. Światło UV uszkadza DNA i znacząco obniża wydajność transformacji, podczas gdy światło niebieskie nie uszkadza DNA. Granice detekcji są podobne dla bromku etydyny, pomarańczowego tiazolu oraz powszechnie stosowanego komercyjnego barwnika do DNA wykrywalnego w świetle niebieskim (<stron...

Tutaj prezentujemy protokół użycia oranżu tiazolowego do wykrywania DNA w eksperymentach z elektroforezą żelową. Zastosowanie oranżu tiazolowego pozwala na eliminację bromku etydyny, a detekcję fluorescencji można osiągnąć za pomocą światła UV lub niebieskiego.

Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Protokół ten jest łatwą i niedrogą alternatywą dla stosowania bromku etydyny do wykrywania DNA podczas elektroforezy. Usuwając bromek etydyny, do wykrywania można użyć światła UV lub światła niebieskiego. Niebieskie światło nie jest szkodliwe dla DNA, co zwiększa szansę na sukces w dalszych eksperymentach.Naprawdę łatwo to wypróbować. Musisz tylko zastąpić bromek etydyny w swoich żelach pomarańczą tiazolową. Na początek przygotuj 1% mini-żele, mieszając około 0,7 grama agarozy w 70 mililitrach tris-acetate-EDTA lub tris-boranów.Następnie rozpuść oranż tiazolowy w DMSO, aby uzyskać 10 000-krotny roztwór podstawowy. Chociaż nie jest szczególnie wrażliwy na światło, przechowuj oranż tiazolowy w ciemności, gdy nie jest używany. Do długotrwałego przechowywania przygotuj porcje mieszaniny oranżu tiazolowego i DMSO i zamroź je.Następnie dodaj oranż tiazolowy do końcowego stężenia 1,3 mikrograma na mililitr i podgrzej w kuchence mikrofalowej mieszaninę buforu agarozy i oranżu tiazolowego, aby rozpuścić agarozę przez około 60 sekund. Wlać mieszaninę agarozy do aparatu do odlewania żelu zawierającego odpowiedni grzebień i pozostawić roztwór agarozy do zestalenia się w żel. Aby załadować żel, najpierw umieść żel w aparacie do elektroforezy, jeśli nie jest jeszcze obecny.Następnie dodaj bufor do biegania TAE lub TBE, aby pokryć powierzchnię żelu. Następnie za pomocą barwnika ładującego załaduj 10 mikrolitrów próbki DNA. Dołącz drabinkę do wymiarowania DNA w celach informacyjnych.Załóż osłonę i elektrody, a następnie uruchom mini-żel pod napięciem 100 woltów, aż obciążający barwnik przesunie się o około cztery do siedmiu centymetrów w przypadku mini-żelu. Jeżeli oranż tiazolowy nie został nałożony przed odlaniem żelu, należy wybarwić żel, zanurzając go w buforze zawierającym oranż tiazolowy z delikatnym mieszaniem na około 20 minut lub do momentu całkowitego wykrycia pasm. Aby zobrazować żel za pomocą transiluminatora UV, należy usunąć żel z aparatu do elektroforezy i umieścić go na transiluminatorze UV.Aby zobrazować żel za pomocą transiluminatora światła niebieskiego lub latarki, umieść żel na transiluminatorze światła niebieskiego lub skieruj latarkę niebieskiej diody LED na żel od góry lub od dołu. Użyj bursztynowego filtra emisyjnego, aby odfiltrować niebieskie światło, umożliwiając wizualizację fluorescencji z kompleksów DNA tiazolowo-pomarańczowych i chronić barwniki. W celu dalszego trawienia lub podwiązania należy wyciąć pożądane pasma DNA z żelu i przystąpić do ekstrakcji DNA za pomocą łatwo dostępnego zestawu lub protokołu.Dobrać odpowiednie ustawienia wzbudzenia i emisji w żelowym aparacie do obrazowania. W przypadku braku systemu obrazowania z odpowiednimi filtrami, umieść filtr bursztynowy między kamerą a żelowym źródłem wzbudzenia światła niebieskiego. Granice wykrywalności są podobne w przypadku bromku etydyny, oranżu tiazolowego i powszechnego komercyjnego barwnika DNA wykrywalnego w świetle niebieskim, przy czym granica wykrywalności dla wszystkich trzech barwników wynosi od jednego do dwóch nanogramów na linię w miniżelu.Tiazolowy żel agarozowy o trawieniu restrykcyjnym jest wykrywalny, gdy jest wzbudzany za pomocą transiluminatora UV lub światła niebieskiego lub latarki światła niebieskiego. Chociaż oranż tiazolowy wydaje się być mniej niebezpieczny niż bromek etydyny, nadal należy nosić standardowe środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i gogle.

dna-electrophoresis-using-thiazole-orange-instead-ethidium-bromide-or

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano podstawowy protokół rozdzielania fragmentów DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu agarozowym do rozdziału fragmentów DNA

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

W tym filmie demonstrujemy test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania interakcji białko-DNA za pomocą sond DNA znakowanych fluorescencyjnie w podczerwieni. Kiedy białko wiąże się z sondą DNA, tworzy duży kompleks, który migruje powoli i pojawia się jako przesunięta prążek na żelu.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej do wykrywania kompleksów czynnik transkrypcyjny-DNA

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.

Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie

Barwienie cząsteczek DNA do mikroskopii fluorescencyjnej pozwala naukowcowi na ich oglądanie podczas eksperymentu. W przedstawionej tutaj metodzie cząsteczki DNA są wstępnie barwione barwnikami fluorescencyjnymi i trawione enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację i metylację.

Określanie, czy DNA barwione barwnikiem cyjaninowym może być trawione za pomocą enzymów restrykcyjnych

Tutaj prezentujemy czułą, szybką i dyskryminującą metodę barwienia po żelu do obrazowania RNA oznaczonych aptamerami RNA Mango I, II, III lub IV, przy użyciu natywnych lub denaturujących żeli do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Po uruchomieniu standardowych żeli PAGE, RNA znakowane mango można łatwo wybarwić TO1-Biotyną, a następnie przeanalizować za pomocą powszechnie dostępnych czytników fluorescencji.

Fluorescencyjna wizualizacja RNA znakowanego mango w żelach poliakrylamidowych metodą poststainingu

Poznaj metodę elektroforezy DNA z oranżem tiazolowym jako bezpieczną alternatywą dla bromku etydyny. Protokół umożliwia wizualizację DNA przy użyciu światła niebieskiego, co zmniejsza uszkodzenia DNA i poprawia wyniki kolejnych eksperymentów.

Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

Przeglądaj więcej filmów