Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników
31 marca 2019
Tutaj prezentujemy protokół użycia oranżu tiazolowego do wykrywania DNA w eksperymentach z elektroforezą żelową. Zastosowanie oranżu tiazolowego pozwala na eliminację bromku etydyny, a detekcję fluorescencji można osiągnąć za pomocą światła UV lub niebieskiego.
Protokół ten jest łatwą i niedrogą alternatywą dla stosowania bromku etydyny do wykrywania DNA podczas elektroforezy. Usuwając bromek etydyny, do wykrywania można użyć światła UV lub światła niebieskiego. Niebieskie światło nie jest szkodliwe dla DNA, co zwiększa szansę na sukces w dalszych eksperymentach.
Naprawdę łatwo to wypróbować. Musisz tylko zastąpić bromek etydyny w swoich żelach pomarańczą tiazolową. Na początek przygotuj 1% mini-żele, mieszając około 0,7 grama agarozy w 70 mililitrach tris-acetate-EDTA lub tris-boranów.
Następnie rozpuść oranż tiazolowy w DMSO, aby uzyskać 10 000-krotny roztwór podstawowy. Chociaż nie jest szczególnie wrażliwy na światło, przechowuj oranż tiazolowy w ciemności, gdy nie jest używany. Do długotrwałego przechowywania przygotuj porcje mieszaniny oranżu tiazolowego i DMSO i zamroź je.
Następnie dodaj oranż tiazolowy do końcowego stężenia 1,3 mikrograma na mililitr i podgrzej w kuchence mikrofalowej mieszaninę buforu agarozy i oranżu tiazolowego, aby rozpuścić agarozę przez około 60 sekund. Wlać mieszaninę agarozy do aparatu do odlewania żelu zawierającego odpowiedni grzebień i pozostawić roztwór agarozy do zestalenia się w żel. Aby załadować żel, najpierw umieść żel w aparacie do elektroforezy, jeśli nie jest jeszcze obecny.
Następnie dodaj bufor do biegania TAE lub TBE, aby pokryć powierzchnię żelu. Następnie za pomocą barwnika ładującego załaduj 10 mikrolitrów próbki DNA. Dołącz drabinkę do wymiarowania DNA w celach informacyjnych.
Załóż osłonę i elektrody, a następnie uruchom mini-żel pod napięciem 100 woltów, aż obciążający barwnik przesunie się o około cztery do siedmiu centymetrów w przypadku mini-żelu. Jeżeli oranż tiazolowy nie został nałożony przed odlaniem żelu, należy wybarwić żel, zanurzając go w buforze zawierającym oranż tiazolowy z delikatnym mieszaniem na około 20 minut lub do momentu całkowitego wykrycia pasm. Aby zobrazować żel za pomocą transiluminatora UV, należy usunąć żel z aparatu do elektroforezy i umieścić go na transiluminatorze UV.
Aby zobrazować żel za pomocą transiluminatora światła niebieskiego lub latarki, umieść żel na transiluminatorze światła niebieskiego lub skieruj latarkę niebieskiej diody LED na żel od góry lub od dołu. Użyj bursztynowego filtra emisyjnego, aby odfiltrować niebieskie światło, umożliwiając wizualizację fluorescencji z kompleksów DNA tiazolowo-pomarańczowych i chronić barwniki. W celu dalszego trawienia lub podwiązania należy wyciąć pożądane pasma DNA z żelu i przystąpić do ekstrakcji DNA za pomocą łatwo dostępnego zestawu lub protokołu.
Dobrać odpowiednie ustawienia wzbudzenia i emisji w żelowym aparacie do obrazowania. W przypadku braku systemu obrazowania z odpowiednimi filtrami, umieść filtr bursztynowy między kamerą a żelowym źródłem wzbudzenia światła niebieskiego. Granice wykrywalności są podobne w przypadku bromku etydyny, oranżu tiazolowego i powszechnego komercyjnego barwnika DNA wykrywalnego w świetle niebieskim, przy czym granica wykrywalności dla wszystkich trzech barwników wynosi od jednego do dwóch nanogramów na linię w miniżelu.
Tiazolowy żel agarozowy o trawieniu restrykcyjnym jest wykrywalny, gdy jest wzbudzany za pomocą transiluminatora UV lub światła niebieskiego lub latarki światła niebieskiego. Chociaż oranż tiazolowy wydaje się być mniej niebezpieczny niż bromek etydyny, nadal należy nosić standardowe środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i gogle.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia prostą i niedrogą alternatywę dla bromku etydyny w detekcji DNA w elektroforezie żelowej. Dzięki zastosowaniu pomarańczowej tiazoli badacze mogą wykorzystać światło UV lub niebieskie do detekcji fluorescencyjnej, co zwiększa bezpieczeństwo DNA podczas przeprowadzania eksperymentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Techniki elektroforezy
Wstęp
- Bromek etydyny jest powszechnie stosowanym barwnikiem do DNA, lecz stwarza ryzyko uszkodzenia integralności DNA.
- Pomarańczowy tiazol stanowi bezpieczniejszą alternatywę dla wizualizacji DNA.
- Detekcję fluorescencji można przeprowadzić przy użyciu nieuszkadzającego niebieskiego światła.
- Metoda ta jest ekonomiczna i łatwa w implementacji.
Cel badania
- Przedstawienie protokołu wykrywania DNA bez użycia bromku etydyny.
- Zademonstrowanie skuteczności pomarańczowego tiazolu w elektroforezie żelowej.
- Wskazanie zalet stosowania światła niebieskiego do wizualizacji DNA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie 1% mini-żeli z wykorzystaniem agarozy i odpowiednich buforów.
- Zastąpienie bromku etydyny pomarańczowym tiazolem w żelach.
- Detekcja fluorescencyjna przy użyciu światła UV lub niebieskiego.
- Ocena integralności DNA po elektroforezie.
Główne wyniki
- Pomarańczowy tiazol skutecznie barwi DNA w elektroforezie żelowej.
- Detekcję można bezpiecznie przeprowadzić przy użyciu światła niebieskiego.
- Protokół jest prosty i powtarzalny.
- Kolejne etapy eksperymentów wykazują wyższy odsetek sukcesów dzięki zredukowaniu uszkodzeń DNA.
Wnioski
- Pomarańczowy Tiazol stanowi odpowiednią alternatywę dla bromku etydium.
- Zastosowanie światła niebieskiego minimalizuje uszkodzenia DNA podczas detekcji.
- Metoda ta zwiększa wiarygodność późniejszych eksperymentów z zakresu biologii molekularnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Elektroforeza żelowa DNA pozostaje podstawową procedurą w walidacji celów i opracowywaniu testów, gdzie integralność próbki bezpośrednio wpływa na wiarygodność późniejszych etapów analizy. Zastąpienie bromku etydyny tiazolem pomarańczowym zmniejsza ryzyko genotoksyczności przy zachowaniu czułości detekcji, co wspiera bezpieczniejsze procesy przesiewania związków i identyfikacji wiodących cząsteczek. Pozwala to zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym na zachowanie jakości DNA do klonowania, sekwencjonowania lub testów funkcjonalnych bez ograniczania wydajności ani efektywności kosztowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez analizę fragmentów DNA bez wprowadzania artefaktów wywołanych barwieniem, które mogłyby zakłócić potwierdzenie celu.
- Wartość operacyjna: Kompatybilny z istniejącą infrastrukturą obrazowania UV lub światłem niebieskim, nie wymagając zmiany protokołu w laboratoriach obecnie stosujących bromek etydyny.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia ilościowe określanie wielkości DNA z granicą detekcji 1-2 ng/ścieżkę, co umożliwia precyzyjną analizę fragmentów przy ocenie wydajności klonowania lub walidacji produktów PCR.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność obchodzenia się z odpadami niebezpiecznymi oraz specjalne wymogi dotyczące utylizacji związane z bromkiem etydium, co usprawnia przestrzeganie zasad bezpieczeństwa w laboratorium.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje integralność DNA dla późniejszych zastosowań, takich jak ligacja, transformacja lub transfekcja, co zwiększa skuteczność generowania konstruktów dla modeli przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wizualizację w świetle niebieskim, co ogranicza uszkodzenia próbek wywołane promieniowaniem UV i zwiększa powtarzalność w eksperymentach powtórzonych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w schemat prac nad biologią odkrywczą, w którym analiza DNA służy do walidacji celów, identyfikacji związków wiodących oraz przedklinicznego opracowania konstruktów, szczególnie podczas oceny modyfikacji genetycznych lub wyników przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera dokładną separację i wyznaczanie wielkości fragmentów DNA, umożliwiając wiarygodną ocenę edycji genów, integralności plazmidów lub amplikonów PCR podczas potwierdzania celu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną, ilościową wizualizację prążków, niezbędną do oceny różnorodności biblioteki lub potwierdzania trafień w analizach opartych na kwasach nukleinowych.
- Analityka: Generuje porównywalne dane dotyczące intensywności fluorescencji w różnych próbkach, co pozwala na spójne porównanie wydajności lub czystości DNA w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Zachowuje funkcjonalność DNA do zastosowań w transfekcji komórek ssaków lub produkcji wektorów wirusowych, co jest kluczowe dla przejścia kandydatów do testów przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi bezpośredni zamiennik odczynnika, który może być standaryzowany w różnych zespołach i ośrodkach bez konieczności ponownej kwalifikacji sprzętu lub oprogramowania do elektroforezy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez minimalizację uszkodzeń DNA indukowanych barwnikiem, zwiększając wiarygodność danych biologii molekularnej wykorzystywanych do oceny celu.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje niedrogi, bezpieczny pomarańczowy tiazol z prostymi warunkami przechowywania (alikwoty w zamrożonym DMSO), co obniża koszty odczynników i wydatki związane z bezpieczeństwem.
- Wartość strategiczna: Zwiększa niezawodność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zachowanie integralności próbek do późniejszego sekwencjonowania, klonowania lub testów funkcjonalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów prac z uwzględnieniem ryzyka, zapewniając, że jakość danych opartych na DNA spełnia kryteria optymalizacji wiodących związków oraz wyboru kandydata przedklinicznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w zakresie biologii molekularnej w przygotowywaniu żeli agarozowych i przeprowadzaniu elektroforezy.
- Standardowy aparat do elektroforezy z transiluminatorem UV lub światłem niebieskim oraz bursztynowym filtrem emisyjnym do detekcji.
- Konsekwentne rozmrażanie i mieszanie zamrożonych aliquotów pomarańczowej tiazoli w DMSO w celu zapewnienia jednorodnego barwienia.
- Walidacja wydajności barwienia w systemach modelowych (np. plazmid, DNA genomiczne) podczas adaptacji do nowych typów próbek.
- Ograniczenie: Wymaga optymalizacji czasu barwienia (20 min) w przypadku zastosowania barwienia po elektroforezie, co dodaje dodatkowy krok w porównaniu do metod z żelami odlewanymi wcześniej.
