Name: Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Poznaj model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowej analizy potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC. Ta metoda umożliwia badanie tworzenia naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Heart Association (grant numer 15SDG25740035, przyznany J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) of the National Institutes of Health (grant numer EB007507, przyznany C.C.) oraz Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T, grant numer 1 P2C HD086843-01, przyznany J.Z.). Serdecznie dziękujemy prof. Jeanne Stachowiak (The University of Texas at Austin) za jej doradztwo techniczne w zakresie mikroskopii konfokalnej. Jesteśmy również wdzięczni za rozmowy z Samuelem Mihelicem (The University of Texas at Austin), dr Alicią Allen (The University of Texas at Austin), dr Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) i dr Leonem Bellanem (Vanderbilt University) za ich spostrzeżenia na temat analizy obliczeniowej sieci 3D. Na koniec dziękujemy dr Xiaoping Bao (Uniwersytet Kalifornijski w Berkeley) za jego porady dotyczące różnicowania iPSC na iPSC-EP.

<ol><li>Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+human+vascular+networks%3A+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li>
<li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li>
<li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20%3A+State+of+the+science+and+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li>
<li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671(2018).</li>
<li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li>
<li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061(2010).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li>
<li>Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li>
<li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li>
<li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li>
<li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li>
<li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li>
<li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li>
<li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li>
<li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Wnt+Signaling%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li>
<li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , In press (2019).</li>
<li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li>
<li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+world+of+osteocytes%3A+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li>
<li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , In press (2019).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li>
<li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li>
<li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li>
<li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten obejmuje długoterminową hodowlę komórek w trzech typach pożywek do hodowli komórkowych: E8, LaSR Basal i EGM-2. Dlatego należy dołożyć wszelkich starań, aby odpowiednio wysterylizować wszystkie materiały. Ponadto fartuchy laboratoryjne i rękawice oczyszczone etanolem powinny być zawsze noszone podczas pracy w kapturze z przepływem laminarnym laboratorium. Zaleca się częste przeprowadzanie testów na obecność zakażenia mykoplazmą; jeśli podczas hodowli iPSC zaobserwuje się dużą ilość zanieczyszczeń lub odnotuj...

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i inne pierwotne typy komórek śródbłonka są wykorzystywane od dwóch dekad do modelowania kiełkowania i rozwoju naczyń krwionośnych in vitro1. Takie platformy naczyniowe mogą rzucić światło na mechanizmy molekularne i tkankowe chorób sercowo-naczyniowych i mogą dostarczyć fizjologicznego wglądu w rozwój prymitywnych sieci naczyniowych2,3. Chociaż w dziedzinie modelowania naczyń krwionośnych poczyniono znaczne postępy, "złoty standard" testu, który może ilościowo modelować i oceniać fizjologiczny rozwój naczyń krwionośnych, pozostaje nieuchwytny. Większość opublikowanych protokołów nie podsumowuje odpowiednio niszy naczyniowej, aby zachęcić do tworzenia dojrzałych, funkcjonalnych naczyń krwionośnych lub nie posiada metody ilościowego porównania potencjału naczyniowego ocenianych typów komórek w trzech wymiarach (3D).
Wiele obecnych modeli naczyniowych ma ograniczoną zdolność do naśladowania fizjologicznej niszy naczyniowej. Jedną z najczęściej stosowanych platform in vitro jest test tworzenia probówek na bazie galaretowatej mieszaniny białek. Krótko mówiąc, HUVEC są wysiewane jako pojedyncze komórki na cienkiej warstwie żelu, który składa się z białek zebranych z macierzy zewnątrzkomórkowej mięsaka myszy (ECM); w ciągu jednego do dwóch dni HUVEC samoorganizują się w prymitywne tuby4. Jednak proces ten zachodzi w dwóch wymiarach (2D), a komórki śródbłonka (EC) wykorzystane w tym teście nie tworzą zamkniętych, pustych w środku światła, co ogranicza fizjologiczne znaczenie tych badań. Ostatnio EC i komórki wspomagające (np. mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i perycyty) były hodowane wspólnie w mikrośrodowiskach 3D, które symulują włóknistą architekturę natywnego ECM, takich jak hydrożele kolagenowe lub fibrynowe5. Do modelowania rozwoju naczyń krwionośnych w tym mikrośrodowisku zwykle stosuje się kulki polimerowe pokryte ECs6. Dodanie egzogennych czynników wzrostu i/lub czynników wzrostu wydzielanych przez inne komórki śródmiąższowo osadzone w hydrożelu może skłonić EC, pokrywające kulki polimerowe, do kiełkowania i tworzenia pojedynczego światła; Następnie można obliczyć liczbę i średnicę kiełków i naczyń. Jednak te kiełki są pojedyncze i nie tworzą zamkniętej, połączonej sieci, jak to widać w warunkach fizjologicznych, a zatem bardziej przypominają model unaczynienia guza. Urządzenia mikroprzepływowe zostały również wykorzystane do naśladowania niszy naczyniowej i promowania tworzenia naczyń krwionośnych w hydrożelach z obciążeniem EC7,8. Zazwyczaj gradient angiogennego czynnika wzrostu jest stosowany do pożywki do hodowli komórek krążących w celu wywołania migracji EC i kiełkowania. EC, które stanowią światło rozwiniętych naczyń, są wrażliwe na naprężenia ścinające wywołane zastosowaniem przepływu płynu przez urządzenie mikroprzepływowe; W ten sposób te urządzenia mikroprzepływowe wychwytują kluczowe parametry fizjologiczne, które nie są dostępne w modelach statycznych. Urządzenia te wymagają jednak kosztownych zdolności do mikrofabrykacji.
Najważniejsze, wszystkie trzy modele naczyniowe (2D, 3D, mikroprzepływowe) w przeważającej mierze wykorzystują pierwotne EC, jak również podstawowe typy komórek wspomagających. Komórki pierwotne nie mogą zostać rozwinięte w skuteczną terapię sercowo-naczyniową, ponieważ komórki wywołałyby odpowiedź immunologiczną po implantacji; ponadto HUVEC i podobne pierwotne typy komórek nie są specyficzne dla pacjenta i nie wychwytują nieprawidłowości naczyniowych, które występują u pacjentów z dyspozycjami genetycznymi lub wcześniej istniejącymi schorzeniami, np. cukrzycą. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pojawiły się w ciągu ostatniej dekady jako specyficzne dla pacjenta, proliferacyjne źródło komórek, które można różnicować we wszystkie komórki somatyczne w ludzkim ciele9. W szczególności opublikowano protokoły, które opisują generowanie i izolację komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z iPSC (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EP są bipotencjalne i dlatego mogą być dalej różnicowane w komórki śródbłonka i komórki/perycyty mięśni gładkich, elementy budulcowe dojrzałego, funkcjonalnego układu naczyniowego. Tylko jedno badanie przekonująco szczegółowo opisało rozwój pierwotnego splotu kapilarnego z iPSC-EP w mikrośrodowisku 3D12; Chociaż badanie to ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia składania i różnicowania iPSC-EP w naturalnych i syntetycznych hydrożelach, nie porównano ilościowo topologii sieci powstałego układu naczyniowego. W innym niedawnym badaniu wykorzystano model kulek polimerowych do porównania kiełkowania HUVEC i ECs5. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba dalszego wyjaśnienia fizycznych i chemicznych mechanizmów sygnalizacyjnych, które regulują waskulogenezę iPSC-EP w mikrośrodowiskach 3D oraz określenia, czy komórki te nadają się do terapii niedokrwiennej i modelowania chorób sercowo-naczyniowych.
W ciągu ostatniej dekady opracowano różne open-source'owe potoki obliczeniowe i algorytmy szkieletyzacji do ilościowego określania i porównywania długości sieci naczyniowej i łączności. Na przykład Charwat i wsp. opracowali potok oparty na Photoshopie w celu wyodrębnienia przefiltrowanego, binaryzowanego obrazu sieci naczyniowych pochodzących z kohodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i wyrosłych EC w matrycy fibryny13,14. Być może najczęściej używanym narzędziem do porównywania topologii jest AngioTool, program opublikowany online przez National Cancer Institute15; Pomimo powszechnego przyjęcia programu i dobrze udokumentowanej wierności, program ogranicza się do analizy struktur podobnych do naczyń w dwóch wymiarach, a inne programy, w tym AngioSys i Wimasis, mają to samo ograniczenie wymiarowości16. Potężne pakiety oprogramowania, takie jak Imaris, Lucis i Metamorph, zostały opracowane w celu analizy topologii sieci inżynieryjnego mikrokrążenia; Jednak te pakiety są zbyt kosztowne dla większości laboratoriów akademickich i ograniczają dostęp do kodu źródłowego, co może utrudnić użytkownikowi końcowemu dostosowanie algorytmu do konkretnej aplikacji. 3D Slicer, pakiet do obrazowania rezonansu magnetycznego / tomografii komputerowej o otwartym kodzie źródłowym, zawiera zestaw narzędzi do modelowania naczyniowego, który może skutecznie analizować topologię sieci naczyniowych 3D17; Analiza jest jednak zależna od ręcznego umieszczania przez użytkownika punktów końcowych sieci, co może stać się żmudne podczas analizy dużego zbioru danych i może być uzależnione od podświadomych uprzedzeń użytkownika. W tym manuskrypcie szczegółowo opisano potok obliczeniowy, który może określić ilościowo sieci naczyniowe 3D. Aby przezwyciężyć wyżej opisane ograniczenia, ten potok obliczeniowy typu open source wykorzystuje ImageJ do wstępnego przetwarzania pozyskanych obrazów konfokalnych w celu załadowania woluminu 3D do analizatora szkieletów. Analizator szkieletu wykorzystuje algorytm przerzedzania równoległej osi przyśrodkowej i został pierwotnie opracowany przez Kerschnitzki et al. do analizy długości i połączeń sieci osteocytów18; Algorytm ten może być skutecznie zastosowany do scharakteryzowania długości i połączeń zaprojektowanego mikrokrążenia.
Podsumowując, ten protokół opisuje tworzenie sieci mikronaczyniowych w mikrośrodowiskach 3D i zapewnia otwarty i wolny od uprzedzeń użytkowników potok obliczeniowy do łatwego porównywania potencjału naczyniowego iPSC-EP.

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide Angiogenesis</td><td>Ibidi</td><td>N/A</td><td>Płaska, szklana płytka do hodowli tkankowej ze ściankami bocznymi umożliwia łatwe obrazowanie konfokalne</td></tr><tr><td>96 dołków, okrągłe dno, mikropłytka o bardzo niskim mocowaniu, sterylna</td><td>Corning</td><td>7007</td><td>Zapobiega wiązaniu się hydrożeli kolagenowych obciążonych komórkami z naczyniem do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7920</td><td>Delikatny roztwór do odrywania komórek; nie degraduje epitopów zewnątrzkomórkowych niezbędnych dla FACS</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Scientific</td><td>12634010</td><td>Podłoże bazowe do różnicowania iPSC-EP.&nbsp;</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure xCAD Plus&nbsp;</td>System oczyszczania wody <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50136165</td><td>; inne można łatwo zastąpić</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 7,5% w DPBS, sterylnie filtrowany, BioXtra, odpowiedni do hodowli komórkowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>A8412</td><td>Aby zachować żywotność komórek podczas sortowania FAC</td></tr><tr><td>CD34-PE, człowiek (klon: AC136)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-140</td><td>Przeciwciało stosowane do izolacji FAC iPSC-EP</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>LC Laboratories</td><td>C-6556</td><td>Indukuje tworzenie mezodermy z pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Kolagen I Ogon szczura Wysoka zawartość białka 100 mg</td><td>VWR</td><td>354249</td><td>Główny składnik mikrośrodowiska 3D</td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe (15/50 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D/A</td><td>Służy do przechowywania i mieszania stosunkowo dużych ilości odczynników i pożywek</td></tr> <tr><td>do hodowli komórkowychDAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Do przeciwbarwienia i wizualizacji jąder komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320-082</td><td>Do rozcieńczania Matrigelu i rozmrażania pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>Do mycia kultur jednowarstwowych</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008</td><td>Do pasażowania pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych i zapobiegania agregacji komórek podczas sortowania FAC</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22011</td><td>Wspomaga żywotność i proliferację komórek śródbłonka</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001&nbsp; &nbsp;</td><td>Do utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Glicyna,BioUltra, do biologii molekularnej, >=99,0% (NT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Neutralizuje pozostały detergent</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat soli, >=95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>Składnik podłoża różnicującego iPSC-EP</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>1.8.0_152</td><td>Wieloparadygmatowe środowisko obliczeń numerycznych (bezpłatne dostępne w większości instytucji akademickich)</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 ml (galaretowata mieszanina białek)</td><td>Fisher Scientific</td><td>356231</td><td>Rozcieńczony w DMEM/F12 do powlekania płytek w celu różnicowania iPSC-EP</td></tr><tr><td>Medium-199 10X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1825015</td><td>Służy do równoważenia końcowej osmolarności hydrożelowej i pH</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Przechowuje małe ilości odczynników</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Główny składnik roztworów do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Antybiotyk stosowany po sortowaniu w celu usunięcia ewentualnego zanieczyszczenia z instrumentu FACS</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko VEGF 165 R</td><td>& D Systems</td><td>293-VE</td><td>Mitogen, który stymuluje proliferację komórek śródbłonka i tubuogenezę</td></tr><tr><td>Rodamina falloidyna</td><td>Themo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>Aby zidentyfikować osadzanie się F-aktyny, a tym samym nakreślić granice sieci naczyniowych</td></tr><tr><td>Triton X-100 (niejonowy środek powierzchniowo czynny)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>Detergent stosowany do delikatnej przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td>Tween-20 (odczynnik emulgujący)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>Zwiększa swoistość wiązania dodanych przeciwciał</td></tr><tr><td>VE-Cadherin (F-8)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9989&nbsp;</td><td>Identyfikacja światła śródbłonka 3D w hydrożelach kolagenowych</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>ThermoFisher</td><td>A14700</td><td>Do utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>Zachowuje żywotność pluripotencjalnych komórek macierzystych i iPSC-EP po dysocjacji i ponownym wysianiu</td></tr></tbody></table>

model 3d in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z ipsc

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są specyficznym dla pacjenta, proliferacyjnym źródłem komórek, które mogą różnicować się w dowolny typ komórek somatycznych. Bipotencjalne komórki progenitorowe śródbłonka (EP), które mogą różnicować się w typy komórek niezbędne do złożenia dojrzałego, funkcjonalnego układu naczyniowego, pochodzą zarówno z embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Jednak komórki te nie zostały rygorystycznie ocenione w środowiskach trójwymiarowych, a ilościowy pomiar ich potencjału naczyniowego pozostaje nieuchwytny. W tym miejscu najpierw przedstawiono wytwarzanie i izolację iPSC-EP poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjną, a następnie opisano enkapsulację i hodowlę iPSC-EP w hydrożelach kolagenowych. To mikrośrodowisko naśladujące macierz zewnątrzkomórkową (ECM) sprzyja silnej odpowiedzi naczyniowej; Sieci naczyniowe tworzą się po tygodniu hodowli. Opisano utworzenie potoku obliczeniowego, który wykorzystuje oprogramowanie typu open source do ilościowego określenia tej odpowiedzi naczyniowej. Ten potok został specjalnie zaprojektowany, aby zachować architekturę 3D splotu kapilarnego w celu niezawodnej identyfikacji liczby rozgałęzień, punktów rozgałęzień i całkowitej długości sieci przy minimalnym wkładzie użytkownika.

Po różnicowaniu (Rysunek 1), analizie FACS i enkapsulacji iPSC-EP w hydrożelach kolagenowych, komórki zazwyczaj pozostają okrągłe przez 24 h, zanim zaczną migrować i tworzyć pierwsze światła naczyń. Po około 6 dniach hodowli w hydrożelu widoczny będzie prymitywny splot kapilarny podczas obserwacji w mikroskopii pola jasnego (Rysunek 2). Po obrazowaniu utrwalonych i barwionych hydrożeli z komórkami za pomocą mikroskopu konfokalneg...

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Nasz protokół umożliwia unikalny wgląd w molekularne i masowe mechanizmy unaczynienia na poziomie tkanki, które mogą pomóc w inżynierii funkcjonalnego naczynia krwionośnego do terapii chorób sercowo-naczyniowych w modelowaniu. Protokół ten umożliwia tworzenie solidnych, trójwymiarowych sieci naczyniowych do oceny potencjału naczyniowego różnych platform, a także zapewnia bezpłatny potok obliczeniowy typu open source do analizy końcowej topologii sieci. Rozpocząć od dodania 250 mikrolitrów roztworu oddzielającego komórki do dołka zróżnicowanej hodowli komórkowej D5D6 przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji użyj końcówki pipety P1000, aby zdysocjować komórki na zawiesiny pojedynczych komórek. Zbierz roztwory komórkowe w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów do odwirowania. Zawieszamy osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego i znakujemy komórki pięcioma mikrolitrami skoncentrowanego przeciwciała CD34 sprzężonego z fluorescencją na 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji przemyć komórki w pięciu mililitrach lodowatego buforu sortującego. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do pięciomililitrowej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS. Przed uruchomieniem próbki należy posortować jedną dziesiątą czwartej nieznakowanej komórki na fluocytometrze, bramkując obszar o wysokiej intensywności fluorescencji, który nie zawiera żadnej z nieznakowanych komórek, które mogłyby służyć jako kontrola ujemna.Następnie posortuj oznakowaną próbkę, która zawiera śródbłonkowe komórki progenitorowe pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w oparciu o ich wysoką ekspresję CD34. Pod koniec sortowania przenieś śródbłonkowe komórki progenitorowe do probówki mikrowirówkowej w celu odwirowania. W celu kapsułkowania hydrożelu kolagenowego komórek progenitorowych zawieszamy posortowane osady komórkowe w 200 mikrolitrach pożywki do wzrostu śródbłonka 2, uzupełnionej 10 mikromililitrami inhibitora ROCK Y-27632.Dodaj komórki do 400 mikrolitrów podłoża wysiewającego w 1,8 mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Wymieszaj 350 mikrolitrów kolagenu z zawiesiną komórkową. Roztwór stanie się bladożółty.Następnie wymieszaj dziesięć mikrolitrów wodorotlenku sodu 1-Mullera z roztworem kolagenu i komórek. Roztwór stanie się teraz jasnoróżowy. Odpipetować 56 mikrolitrów tego zneutralizowanego roztworu komórek kolagenowych do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki do hodowli komórek w kształcie litery U o bardzo niskim przyłączeniu na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji zbadaj studzienki pod mikroskopem jasnego pola, aby sprawdzić, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego podłoża do wzrostu śródbłonka 2, uzupełnionego inhibitorem ROCK i czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego do każdej studzienki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po tygodniu hodowli dodać 250 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do jednego dołka z 48-dołkową płytką na hydrożel i usunąć pożywkę z hydrożeli.Następnie użyj pęsety z cienką końcówką, aby przenieść hydrożele do studzienek zawierających paraformaldehyd. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej szybko przemyj hydrożele PBS i przepuszczaj kultury 3D za pomocą 250 mikrolitrów 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przemyć hydrożele dwoma pięciominutowymi płukaniami w temperaturze pokojowej z 250 mikrolitrami PBS, uzupełnionymi 300 mililitrami glicyny na pranie, a następnie zanurzyć każdy hydrożel w 250 mikrolitrach buforu blokującego na 30 minut w temperaturze pokojowej.Oznaczyć komórki odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w buforze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dwukrotnie przepłukać 0,5% odczynnikiem emulgującym i PBS firmy Dulbecco. Po drugim przemyciu oznaczyć komórki odpowiednim specyficznym dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, a następnie dwukrotnie umyć kultury 3D w 0,5% odczynniku emulgującym i PBS firmy Dulbecco, jak pokazano. Aby uwidocznić jądra komórkowe, dodaj DAPI, rozcieńczony w stężeniu od jednego do 10000 w PBS do próbek na dwie minuty inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie dwa przemycia 0,5% odczynnikiem emulgującym i PBS firmy Dulbecco.Następnie użyj pęsety z cienką końcówką, aby przenieść każdą próbkę do odpowiedniego naczynia do oglądania. Po różnicowaniu, sortowaniu i enkapsulacji w hydrożelach kolagenowych, komórki zazwyczaj pozostają zaokrąglone przez 24 godziny, zanim zaczną migrować i tworzyć początkowe światła. Po około sześciu dniach hodowli prymitywny splot kapilarny będzie widoczny w hydrożelu, gdy będzie oglądany pod mikroskopem jasnego pola.Po zobrazowaniu utrwalonych, barwionych, obciążonych komórkami hydrożeli pod mikroskopem konfokalnym, wstępnie przetworzone obrazy są przekształcane w szkielet, który umożliwia analizę całkowitej długości i łączności sieci. Konieczne jest dodanie antybiotyków po FACS, ponieważ sterylizacja wnętrza tego instrumentu jest trudna, a usunięcie antybiotyków 24 godziny po enkapsulacji komórek. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie określić, które cechy fizyczne i chemiczne biomateriałów naśladujących macierz zewnątrzkomórkową regulują potencjał naczyniowy komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z iPSC.

an-vitro-3d-model-computational-pipeline-to-quantify-vasculogenic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania poklatkowego i analizy unaczynienia in vitro za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym w połączeniu z oprogramowaniem open source, Analiza Kinetyczna Waskulogenezy. Protokół ten można zastosować do ilościowej oceny potencjału naczyniowego wielu typów komórek lub warunków eksperymentalnych, które modelują chorobę naczyniową.

Analiza kinetyczna waskulogenezy określa ilościowo dynamikę waskulogenezy i angiogenezy in vitro

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Tutaj prezentujemy nowy protokół do badania i mapowania celowego osadzania nośników leków na komórkach śródbłonka w sfabrykowanych, rzeczywistych rozmiarach, trójwymiarowych modelach tętnic ludzkich pod przepływem fizjologicznym. Przedstawiona metoda może posłużyć jako nowa platforma do celowania w nosicieli leków w obrębie układu naczyniowego.

Modele tętnicze in vitro 3D z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Opisano tutaj prosty proces różnicowania komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, a następnie szczegółowy protokół ich mechanicznej stymulacji. Pozwala to na badanie mechanobiologii rozwojowej komórek śródbłonka. Podejście to jest kompatybilne z dalszymi testami żywych komórek pobranych z chipa hodowlanego po stymulacji mechanicznej.

In vitro Model płodu ludzkiego naczynia na chipie do badania mechanobiologii rozwojowej

Ten protokół przedstawia metodę generowania organoidów naczyniowych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie organoidów naczyniowych z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

Poznaj model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowej analizy potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC. Ta metoda umożliwia badanie tworzenia naczyń krwionośnych.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC (Wideo) | JoVE Journal

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Przeglądaj więcej filmów