Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Nasz protokół umożliwia unikalny wgląd w molekularne i masowe mechanizmy unaczynienia na poziomie tkanki, które mogą pomóc w inżynierii funkcjonalnego naczynia krwionośnego do terapii chorób sercowo-naczyniowych w modelowaniu. Protokół ten umożliwia tworzenie solidnych, trójwymiarowych sieci naczyniowych do oceny potencjału naczyniowego różnych platform, a także zapewnia bezpłatny potok obliczeniowy typu open source do analizy końcowej topologii sieci. Rozpocząć od dodania 250 mikrolitrów roztworu oddzielającego komórki do dołka zróżnicowanej hodowli komórkowej D5D6 przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji użyj końcówki pipety P1000, aby zdysocjować komórki na zawiesiny pojedynczych komórek. Zbierz roztwory komórkowe w jednej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów do odwirowania. Zawieszamy osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu sortującego i znakujemy komórki pięcioma mikrolitrami skoncentrowanego przeciwciała CD34 sprzężonego z fluorescencją na 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji przemyć komórki w pięciu mililitrach lodowatego buforu sortującego. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do pięciomililitrowej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS. Przed uruchomieniem próbki należy posortować jedną dziesiątą czwartej nieznakowanej komórki na fluocytometrze, bramkując obszar o wysokiej intensywności fluorescencji, który nie zawiera żadnej z nieznakowanych komórek, które mogłyby służyć jako kontrola ujemna.

Następnie posortuj oznakowaną próbkę, która zawiera śródbłonkowe komórki progenitorowe pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w oparciu o ich wysoką ekspresję CD34. Pod koniec sortowania przenieś śródbłonkowe komórki progenitorowe do probówki mikrowirówkowej w celu odwirowania. W celu kapsułkowania hydrożelu kolagenowego komórek progenitorowych zawieszamy posortowane osady komórkowe w 200 mikrolitrach pożywki do wzrostu śródbłonka 2, uzupełnionej 10 mikromililitrami inhibitora ROCK Y-27632.

Dodaj komórki do 400 mikrolitrów podłoża wysiewającego w 1,8 mililitrowej probówce wirówkowej na lodzie. Wymieszaj 350 mikrolitrów kolagenu z zawiesiną komórkową. Roztwór stanie się bladożółty

Następnie wymieszaj dziesięć mikrolitrów wodorotlenku sodu 1-Mullera z roztworem kolagenu i komórek. Roztwór stanie się teraz jasnoróżowy. Odpipetować 56 mikrolitrów tego zneutralizowanego roztworu komórek kolagenowych do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki do hodowli komórek w kształcie litery U o bardzo niskim przyłączeniu na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zbadaj studzienki pod mikroskopem jasnego pola, aby sprawdzić, czy komórki zostały równomiernie rozmieszczone. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego podłoża do wzrostu śródbłonka 2, uzupełnionego inhibitorem ROCK i czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego do każdej studzienki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po tygodniu hodowli dodać 250 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do jednego dołka z 48-dołkową płytką na hydrożel i usunąć pożywkę z hydrożeli.

Następnie użyj pęsety z cienką końcówką, aby przenieść hydrożele do studzienek zawierających paraformaldehyd. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej szybko przemyj hydrożele PBS i przepuszczaj kultury 3D za pomocą 250 mikrolitrów 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przemyć hydrożele dwoma pięciominutowymi płukaniami w temperaturze pokojowej z 250 mikrolitrami PBS, uzupełnionymi 300 mililitrami glicyny na pranie, a następnie zanurzyć każdy hydrożel w 250 mikrolitrach buforu blokującego na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Oznaczyć komórki odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w buforze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie dwukrotnie przepłukać 0,5% odczynnikiem emulgującym i PBS firmy Dulbecco. Po drugim przemyciu oznaczyć komórki odpowiednim specyficznym dla gatunku przeciwciałem drugorzędowym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem, a następnie dwukrotnie umyć kultury 3D w 0,5% odczynniku emulgującym i PBS firmy Dulbecco, jak pokazano. Aby uwidocznić jądra komórkowe, dodaj DAPI, rozcieńczony w stężeniu od jednego do 10000 w PBS do próbek na dwie minuty inkubacji w temperaturze pokojowej, a następnie dwa przemycia 0,5% odczynnikiem emulgującym i PBS firmy Dulbecco.

Następnie użyj pęsety z cienką końcówką, aby przenieść każdą próbkę do odpowiedniego naczynia do oglądania. Po różnicowaniu, sortowaniu i enkapsulacji w hydrożelach kolagenowych, komórki zazwyczaj pozostają zaokrąglone przez 24 godziny, zanim zaczną migrować i tworzyć początkowe światła. Po około sześciu dniach hodowli prymitywny splot kapilarny będzie widoczny w hydrożelu, gdy będzie oglądany pod mikroskopem jasnego pola.

Po zobrazowaniu utrwalonych, barwionych, obciążonych komórkami hydrożeli pod mikroskopem konfokalnym, wstępnie przetworzone obrazy są przekształcane w szkielet, który umożliwia analizę całkowitej długości i łączności sieci. Konieczne jest dodanie antybiotyków po FACS, ponieważ sterylizacja wnętrza tego instrumentu jest trudna, a usunięcie antybiotyków 24 godziny po enkapsulacji komórek. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie określić, które cechy fizyczne i chemiczne biomateriałów naśladujących macierz zewnątrzkomórkową regulują potencjał naczyniowy komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z iPSC.