Name: CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę multipleksowej edycji genomu Saccharomyces cerevisiae przy użyciu systemu CRISPR/Cas12a z pojedynczą macierzą crRNA. Protokół umożliwia szybkie modyfikacje wielu loci genomowych i tworzenie szczepów drożdży produkujących karotenoidy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 686070 (DD-DeCaf) i 764591 (SynCrop) oraz z programu badawczego Building Blocks of Life o numerze projektu 737.016.005 przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO). T.E.G. był wspierany przez Royal Society (grant UF160357) i BrisSynBio, Centrum Badawcze Biologii Syntetycznej BBSRC/EPSRC (grant BB/L01386X/1). Dziękujemy Zi Di i Jeffreyowi van Wijkowi za ich wkład w eksperymenty z plamkami drożdży w celu stworzenia drożdżowej grafiki pikselowej.

<ol><li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li>
<li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688(2017).</li>
<li>Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li>
<li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li>
<li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
<li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601(2018).</li>
<li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+CRISPR%2FCas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li>
<li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+versus+Cas12a%2FCpf1%3A+Structure%E2%80%93function+comparisons+and+implications+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481(2018).</li>
<li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li>
<li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li>
<li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li>
<li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li>
<li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647(2008).</li>
<li>Yeast Art project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.yeastart.org">http://www.yeastart.org</a> (2018).</li>
<li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li>
<li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li>
<li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li>
<li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries%2C+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li>
<li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoubos%2C+JA+%22Cloning+Method%22">Cloning Method</a>. , WO2013144257 (2013).</li>
<li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li>
<li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+and+Microbial+Technology%22%5BJournal%5D)">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc%2FSS-DNA%2FPEG+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li>
<li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791(1991).</li>
<li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li>
<li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li>
<li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FnCpf1%3A+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li>
<li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li>
<li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+%28SBOL+Visual%29+Version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że istnieje konflikt interesów. Autorzy złożyli wniosek o własność intelektualną związaną z prezentowanymi metodami.

Dostarczony protokół opisuje multipleksową edycję genomu S. cerevisiae przy użyciu Cas12a z bakterii Lachnospiraceae ND2006 w połączeniu z pojedynczą macierzą crRNA i DNA dawcy. Szczegółowo wyjaśniono budowę pojedynczej macierzy crRNA i DNA dawcy. W przeciwieństwie do dobrze znanego systemu CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12a ma unikalną dodatkową zdolność przetwarzania wielu crRNA wyrażonych z jednej macierzy crRNA13,33. Dzięki tej funkcji jednoczesna edycja wielu celów jest łatwiejsza do skonfigurowania i może być osiągnięta w jednej transformacji. To podejście z pojedynczą macierzą crRNA zostało już wcześniej zademonstrowane przez Zetsche i wsp. 34 którzy jednocześnie edytowali do czterech genów w komórkach ssaków za pomocą AsCas12a oraz przez Swiat i wsp. 35 osób, które wprowadziły cztery fragmenty DNA do genomu drożdży za pomocą FnCas12a. O ile nam wiadomo, nie zgłoszono większej liczby jednoczesnych modyfikacji genomu przy użyciu systemu Cas12a, a maksymalny limit celów dla pojedynczej macierzy dla Cas12a nie został jeszcze określony. Dalsze badania z wykorzystaniem pojedynczych macierzy crRNA w połączeniu z Cas12a obejmują multipleksową regulację transkrypcji w szerokim zakresie organizmów 33,36,37.
W przedstawionym protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Starannie zaprojektuj wszystkie sekwencje DNA, które są zaangażowane w eksperyment edycji genomu Cas12a, zwłaszcza w przypadku wprowadzania nowych sekwencji DNA. Określ funkcjonalność nowych sekwencji dystansowych będących częścią crRNA, na przykład za pomocą eksperymentu z edycją genomu singleplex, jak opisano przez Verwaal i wsp. 19 przed połączeniem ich w pojedynczą macierz crRNA. Postępuj zgodnie z zaleceniami dotyczącymi przygotowania roztworów transformacyjnych stosowanych w eksperymencie edycyjnym Cas12a, aby osiągnąć dobrą wydajność przemiany drożdży.
Istnieje kilka opcjonalnych modyfikacji techniki. Zaleca się użycie 1 μg każdego DNA dawcy, zlinearyzowanej kasety ekspresyjnej pRN1120 lub pojedynczej kasety ekspresji macierzy crRNA w transformacji, chociaż oczekuje się, że użycie mniejszej ilości DNA również spowoduje zadowalającą wydajność transformacji. Wykonaj transformację testową, aby określić, czy można użyć niższych ilości DNA. Transformacja S. cerevisiae może być przeprowadzona przy użyciu innej metody niż opisana w tym protokole, na przykład protokołu opisanego przez Gietza i in. (2007)38. Plazmid pRN1120 biorcy przewodnika RNA jest odpowiedni do ekspresji pojedynczego crRNA i pojedynczej macierzy crRNA różnych wariantów Cas12a (np. z Acidaminococcus spp. BV3L6 lub Francisella novicida U112), a także do ekspresji sgRNA w połączeniu z Cas919. DNA dawcy nie musi być ograniczone do kaset ekspresji genów karotenoidów i regionów flankujących, które kierują DNA dawcy do opisanych miejsc INT1, INT2 i INT3 w genomowym DNA. Dowolne DNA będące przedmiotem zainteresowania może zostać wprowadzone, w sposób multipleksowy, do genomowego DNA gospodarza zgodnie z zasadami projektowania opisanymi w niniejszym protokole, lub alternatywnie DNA dawcy może być użyte do usunięcia DNA z genomu gospodarza. Modułowa budowa pojedynczej macierzy crRNA ułatwia łatwą regulację sekwencji dystansowych i bezpośrednich powtórzeń. Modyfikacja sekwencji dystansowych pozwala na zmianę zamierzonego locus integracji, który może być zaprojektowany przez jedno z narzędzi do identyfikacji genomowego miejsca docelowego, np. oprogramowanie GuideScan 1.039. Zamiast używać dużych sekwencji flankujących, które zawierają sekwencje łączników, 50-bp regionu flankującego można włączyć do sekwencji DNA dawcy poprzez włączenie tych 50-pz sekwencji regionu flankującego do starterów stosowanych w PCR. W tym przypadku do udanego eksperymentu z multipleksową edycją genomu potrzebne są tylko trzy zamiast dziewięciu fragmentów DNA dawcy.
Podsumowując, protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku, jak przeprowadzić multipleksową edycję genomu u S. cerevisiae przy użyciu Cas12a w połączeniu z podejściem z pojedynczą macierzą crRNA. Protokół zademonstrowano poprzez multipleksową edycję genomu przy użyciu 9 fragmentów DNA dawcy i pojedynczej macierzy crRNA kodującej trzy gRNA. Wykazujemy wysoką ogólną częstotliwość edycji od 50% do 94% dla trzech opisanych tutaj projektów szczepów. Podsumowując, unikalną cechą Cas12a jest zdolność do przetwarzania pojedynczej macierzy crRNA na pojedyncze crRNA w komórce, co sprawia, że Cas12a jest doskonałym narzędziem umożliwiającym multipleksową edycję genomu i opracowywanie modułów regulacji transkrypcji ukierunkowanych na wiele kaset ekspresyjnych za jednym razem. Ostatecznie uzyskano trzy szczepy produkujące karotenoidy na różnym poziomie i barwach w odcieniach od żółtego do pomarańczowego. Dzięki tym szczepom i szczepowi typu dzikiego pokazaliśmy, w jaki sposób można w prosty sposób wykorzystać płyn akustyczny do tworzenia pikselowej sztuki drożdży – na cześć Rosalind Franklin, która przyczyniła się do odkrycia struktury DNA 65 lat temu za pomocą swojego słynnego zdjęcia 5123.

Enzymy CRISPR/Cas niewątpliwie zrewolucjonizowały biologię molekularną i zostały szeroko przyjęte jako narzędzia do inżynierii genomów z prędkością, która wcześniej była nieosiągalna1. Pierwsza modyfikacja genomu Saccharomyces cerevisiae za pomocą systemu edycji genomu CRISPR/Cas9 została opisana przez DiCarlo i wsp.2, demonstrując udane nokautowanie genów i dokonywanie mutacji punktowych przy użyciu zewnętrznie wprowadzonych oligonukleotydów. Dalsze osiągnięcia w zakresie zestawu narzędzi CRISPR dla drożdży obejmowały: regulację transkrypcji poprzez fuzję katalitycznie nieaktywnego martwego Cas9 (dCas9) z transkrypcyjnymi domenami efektorowymi w celu umożliwienia aktywacji i wyciszenia transkrypcji3, zastosowanie zarówno do edycji genomu, jak i funkcji regulacyjnych do inżynierii szlaków metabolicznych poprzez jednoczesną aktywację, represję i delecję4, delecja dużych fragmentów z genomu S. cerevisiae5, oraz fuzje wielu chromosomów6.
Systemy edycji genomu CRISPR/Cas wywodzą się z adaptacyjnych układów odpornościowych bakterii i archeonów, a systemy te zostały zaadaptowane przez biologów molekularnych do edycji genomu. Ich funkcjonalność opiera się na regionach DNA CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) kodujących RNA odpowiedzialne za rozpoznawanie obcego DNA lub RNA oraz genów związanych z CRISPR (Cas), które kodują endonukleazy sterowane RNA1,7,8,9. Na podstawie niedawnej analizy genomu systemów CRISPR/Cas zaproponowano podzielenie systemów CRISPR/Cas na dwie klasy, pięć typów i 16 podtypów10. Obie klasy rozróżnia się na podstawie organizacji kompleksów efektorowych zaangażowanych w docelowe rozszczepienie. Zazwyczaj systemy CRISPR/Cas z organizacją wielopodjednostkową są klasyfikowane jako klasa 1, podczas gdy kompleksy efektorowe z pojedynczą podjednostką należą do klasy 210,11. W tym artykule przyjrzymy się klasie 2 typu V Cas12a, wcześniej nazywanej Cpf110,12, która jest alternatywą dla klasy 2 typu II Cas9. Chociaż Cas9 jest dobrze scharakteryzowany i szeroko stosowany w badaniach, Cas12a oferuje dodatkowe funkcje12. Po pierwsze, Cas12a tworzy kompleks z CRISPR RNA (crRNA) składający się z 42 do 44 nukleotydów bez konieczności dodatkowego transaktywującego CRISPR RNA (tracrRNA). W związku z tym krótszy przewodnik RNA może być wykorzystany w edycji genomu za pomocą systemów CRISPR/Cas12a w porównaniu z CRISPR/Cas9. Po drugie, unikalna aktywność endonukleazy i endorybonukleazy Cas12a umożliwia dojrzewanie jego pre-crRNA13. Ta aktywność RNazy pozwala na kodowanie wielu crRNA na jednej tablicy crRNA CRISPR, podczas gdy Cas9 wymaga oddzielnej ekspresji każdego tak zwanego jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA) lub alternatywnie na przykład ekspresji dodatkowej endonukleazy (np. Csy4) w połączeniu z motywami rozpoznawania dla Csy4 otaczającymi każdy sgRNA14,15. Po trzecie, rozpoznanie miejsca docelowego Cas12a wymaga motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) na końcu 5' od celu i rozszczepia się po pozycji +18/+23 od swojego PAM, co skutkuje rozszczepionym DNA z lepkimi końcami, podczas gdy Cas9 wymaga PAM zlokalizowanego na końcu 3' od celu i rozszczepia się po pozycji -3, tworząc nacięcia na końcu w klasie DNA<sup="xref">12. Po czwarte, zgodna sekwencja nukleotydowa PAM różni się między Cas12a ((T)TTV) i Cas9 (NGG), co sprawia, że Cas12a jest obiecującym kandydatem do celowania w bogate w T sekwencje promotora i terminatora16. Wreszcie, niedawne badanie wykazało większą swoistość docelową dla Cas12a niż dla natywnej klasy Cas9<sup="xref">17.
Przedstawiamy protokół korzystania z systemu CRISPR/Cas12a do edycji genomu S. cerevisiae, ze szczególnym naciskiem na wprowadzenie wielu kaset ekspresji DNA do niezależnych loci genomowych jednocześnie (edycja genomu multipleksowego) przy użyciu pojedynczej macierzy crRNA. Kluczowe kroki protokołu są przedstawione w Rysunek 1. Jako dowód słuszności koncepcji, system CRISPR/Cas12a został zastosowany do wprowadzenia trzech kaset ekspresyjnych do genomu S. cerevisiae, które umożliwiają produkcję β-karotenu18, jak schematycznie pokazano w Rysunek 2. Produkcja β-karotenu wpływa na fenotyp S. cerevisiae: tj. po pomyślnym wprowadzeniu wszystkich trzech heterologicznych genów wymaganych do biosyntezy karotenoidów, białe komórki S. cerevisiae zmieniają kolor na żółty lub pomarańczowy, w zależności od siły ekspresji promotora każdego genu. Ze względu na prosty wizualny odczyt tej ścieżki, została ona wprowadzona w celu opracowania zaawansowanych systemów i metod edycji genomu opartych na CRISPR19,20. W niniejszej pracy kasety ekspresyjne kodujące geny karotenoidowe crtE, crtYB i crtI zostały skonstruowane przy użyciu podejścia klonowania Golden Gate (GGC) 21 z heterologicznymi promotorami i homologicznymi terminatorami używanymi do kierowania ekspresją genów. Kasety ekspresyjne są otoczone unikalnymi sekwencjami 50 par zasad (bp), zwanymi łącznikami, które umożliwiają montaż in vivo z integracyjnymi sekwencjami DNA po bokach (regiony flankujące) z tymi samymi sekwencjami 50 pz, a następnie integrację z genomowym DNA drożdży w pozycji określonej przez regiony flankujące. Dzięki zastosowaniu różnych mocy promotorów uzyskano szczepy o różnym poziomie produkcji karotenoidów, co spowodowało różnice w kolorze komórek. Szczepy te - zainspirowane "Yeast Art Project"22 - zostały użyte w konfiguracji do wykrywania z akustycznym płynem do stworzenia 4-kolorowej "fotografii drożdży" Rosalind Franklin o wysokiej rozdzielczości. Franklin (1920-1958) była angielską chemiczką i krystalografem rentgenowskim, dobrze znaną ze swojego wkładu w odkrycie struktury DNA przez Zdjęcie 5123,24,25.

<table><tbody><tr><td>Chemicals specyficzne dla protokołu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td>Elektroforeza</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9518</td><td>Wybór transformantów E. coli</td></tr><tr><td>BsaI-HF (20 U/&micro; l)</td> <td>New England BioLabs</td><td>R353L</td><td>Golden Gate Roztwór</td></tr><tr><td>do lizy komórek klonujących (z zestawu Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td> <td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae</td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td>Linearyzacja soli</td></tr><tr><td>sodowej kwasu dezoksyrybonukleinowego pRN1120 z jąder łososia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1626</td><td>Transfromacja S. cerevisiae (nośnik DNA)</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>Linearyzacja pRN1120</td></tr><tr><td>Absolut etanolu do analizy</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiamino-tetraoctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>Transformacja S. cerevisiae</td></tr><tr><td>G418 sól dwusiarczanowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td>Wybór transformantów S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158&nbsp;</td><td>Drożdżowa sztuka pikselowa</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Merck</td><td>100993</td><td>Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Octan litu dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6883</td><td>Transformacja S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Nancy-520 Barwnik żelowy DNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1494</td><td>Elektroforeza</td></tr><tr><td>NEB10 kompetentne komórki E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3019H</td><td>Transformacja E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB102</td><td>Wybór transformantów S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Bufor Phusion</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 4000</td><td>Merck</td><td>7490</td><td>Transformacja S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Roztwór do wytrącania białek (10 M NH4AC) (z zestawu Puregene Drożdże/Bact. Zestaw B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td><td>Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Fioletowy barwnik ładujący</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td>Elektroforeza</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Oczyszczanie plazmidów</td></tr><tr><td>Mieszanka enzymów koktajlowych RNazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2286</td><td>Izolacja genomowego DNA z</td></tr><tr><td>bufora ligazy DNA S</td>. cerevisiae T4 <td>Invitrogen</td><td>46300-018</td><td>Golden Gate Klonowanie</td></tr><tr><td>Ligazy DNA T4 (1 U/&mikro; l)</td> <td>Invitrogen</td><td>1705218</td><td>Golden Gate Klonowanie</td></tr><tr><td>UltraPure Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Kreator elektroforezy</td></tr><tr><td>SV Żel i zestaw systemu czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Oczyszczanie produktów PCR i linearyzowanych pRN1120</td></tr><tr><td>Xhol</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td> Linearyzacja zymoliazy <td>pRN1120</td></tr><tr><td>50 mg / ml (5 jednostek/&mikro; L)</td> <td>Zymo Research</td><td>E1006</td><td>Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae (enzym lizy drożdży)</td></tr> <tr><td>Bufor do przechowywania zymoliazy</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-B</td><td>Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae (niezbędna do przygotowania enzymu do lizy drożdży)</td></tr><tr><td><silny>Chemikalia ogólnego zastosowania</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2*Ekstrakt peptonowo-drożdżowy (PY) Płyta agarowa</td><td></td><td></td><td> wzrost pożywki</td></tr><tr><td></td><td></td> E. coli<td>2*PY</td><td>Uprawa E. coli</td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td> demineralizowana <td>Przemiana buforu</td></tr><tr><td></td><td></td> S. cerevisiae<td>ELFO</td><td>Elektroforeza</td></tr><tr><td>MQ</td><td></td><td></td><td>Wiele etapów</td></tr><tr><td>Fizjologiczny roztwór</td><td></td><td></td> soli <td>Przemiana S. cerevisiae</td></tr><tr><td>TE </td><td></td><td></td> bufor <td>Przechowywanie DNA, transformacja S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YEPD; 2% glukozy) podłoże</td><td></td><td></td><td>Uprawa agaru</td></tr><tr><td></td><td></td> S. cerevisiae<td>YEPD (2% glukozy)</td><td>Wzrost płytki S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Sokoła (50 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka 96 dołków szalki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Petriego</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 0,5 - 10 i mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 10 - 200 i mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 100 - 1000 i mikro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolby wstrząsające (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne filtry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (probówki Falcon)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> akustyczny Echo 525 do obsługi <td></td><td></td><td></td>cieczy</tr><tr><td>Zestaw NanoDrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>do elektroforezy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa (probówki Eppendorfa)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCSN067</td><td>Addgene</td><td>ID 101748</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr> <tr><td>pRN1120</td><td>Addgene</td><td>ID 101750</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr><tr><td>szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae szczep CEN. Kolekcja PK113-7D</td><td>EUROSCARF</td><td>http://www.euroscarf.de</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas12a: multipleksowa edycja genomu saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

Wysoka wydajność, łatwość użycia i wszechstronność systemu zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych/białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ułatwiły zaawansowaną modyfikację genetyczną Saccharomyces cerevisiae, organizmu modelowego i konia roboczego w biotechnologii przemysłowej. W pracy tej zastosowano białko 12a związane z CRISPR (Cas12a), endonukleazę sterowaną RNA o cechach odróżniających się od Cas9, co jeszcze bardziej rozszerza molekularny zestaw narzędzi do celów edycji genomu. Zaletą systemu CRISPR/Cas12a jest to, że może on być stosowany w multipleksowej edycji genomu z wieloma przewodnikowymi RNA wyrażonymi z jednej jednostki transkrypcyjnej (pojedynczej macierzy CRISPR RNA (crRNA)). Przedstawiamy protokół multipleksowej integracji wielu heterologicznych genów w niezależne loci genomu S. cerevisiae przy użyciu systemu CRISPR/Cas12a z wieloma crRNA ulegającymi ekspresji z jednego konstruktu macierzy crRNA. Proponowana metoda wykorzystuje zdolność S. cerevisiae do przeprowadzania rekombinacji fragmentów DNA in vivo w celu złożenia pojedynczej macierzy crRNA w plazmid, który można wykorzystać do selekcji transformantów, a także do składania sekwencji DNA dawcy, które integrują się z genomem w zamierzonych pozycjach. Cas12a ulega wstępnej ekspresji konstytutywnej, ułatwiając rozszczepienie genomu S. cerevisiae w zamierzonych pozycjach po ekspresji pojedynczej macierzy crRNA. Protokół obejmuje zaprojektowanie i budowę pojedynczej macierzy crRNA i kaset ekspresji DNA dawcy oraz wykorzystuje podejście integracyjne wykorzystujące unikalne sekwencje łączników DNA 50 pz i oddzielne sekwencje DNA z boku integracji, co upraszcza projektowanie eksperymentów poprzez standaryzację i modularyzację oraz rozszerza zakres zastosowań. Na koniec demonstrujemy prostą technikę tworzenia pikselowej grafiki drożdży za pomocą akustycznej obsługi płynów przy użyciu różnokolorowych szczepów drożdży wytwarzających karotenoidy, które zostały skonstruowane.

System CRISPR/Cas12a w połączeniu z pojedynczą matrycą crRNA umożliwia efektywną multipleksową edycję genomu S. cerevisiae w wielu loci jednocześnie. Wykazano to, konstruując szczepy drożdży wytwarzające karotenoidy, które są następnie wykorzystywane do tworzenia drożdżowej grafiki pikselowej.

CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Protokół ten demonstruje nowatorską metodę multipleksowej edycji genomu Saccharomyces cerevisiae poprzez wprowadzenie wielu kaset ekspresyjnych na różnych loci w jednym kroku transformacji. To podejście do klonowania swobodnego składania plazmidu w celu ekspresji pojedynczej macierzy crRNA prowadzi do szybkiego, wydajnego i elastycznego protokołu edycji genomu. Będziemy konstruować komórki drożdży typu dzikiego, aby wytwarzały karotenoidy poprzez wprowadzenie wolnych genów heterologicznych do wolnych loci genomowych.Pojedyncza macierz crRNA składa się z wolnych pojedynczych crRNA wyrażonych z promotora wolnego od polimerazy RNA. Cas12a przetwarza in vivo macierz crRNA na pojedyncze crRNA. CrRNA kierują Cas12a do docelowych loci w genomowym DNA, gdzie Cas12a wprowadza podwójne pęknięcia nici.Fragmenty DNA skierowane w dół rekombinują w celu rekombinacji in vivo i integrują się z genomowym DNA. Protokół zademonstruje doktorantka Klaudia Ciurkot. Jeffery van Wijk, naukowiec nadzwyczajny.I Brenda Vonk, starszy pracownik naukowy z naszego laboratorium. Po uzyskaniu pojedynczej macierzy crRNA do eksperymentów z multipleksową edycją genomu syntetycznego DNA, przygotuj mieszankę amplifikacyjną PCR i załaduj macierz do termocyklera w celu amplifikacji. Aby przeanalizować produkty PCR za pomocą elektroforezy, należy umieścić próbki w 0,8% żelu agarozowym przy 5 V/cm przez 40 minut.Załaduj drabinkę DNA fragmentami DNA w zakresie od 100 do 10000 par zasad, a następnie oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przemiany drożdży należy rozpocząć od wstępnej hodowli drożdży typu dzikiego w kolbie o pojemności 100 ml zawierającej 20 ml ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej lub pożywki YEPD. Do inkubacji przez noc, w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 250 obrotów na minutę Następnego ranka zaszczepij 20 ml świeżej pożywki YEPD obliczoną objętością drożdży wstępnych z nocnej hodowli.Umieść kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0, mierzonej przy 600 nanometrach. Zbierz komórki drożdży przez odwirowanie. Umyj osad komórek drożdży w 20 ml wody demineralizowanej o temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dodatkowe odwirowanie.Zawiesić osad w 100 mikrolitrach roztworu octanu litu Tris-EDTA i przenieść drożdże do probówki mikrowirówkowej. Wymieszaj pięć mikrolitrów jednoniciowego nośnego DNA i jeden mikrogram plazmidu pCSN067 z zawiesiną komórek drożdży. Następnie wymieszać 600 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego LiAc-TE z próbką.Inkubuj komórki drożdży i plazmid przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 450 prm w bloku grzewczym na stole. Pod koniec inkubacji zmieszać 70 ml sulfotlenku dimetylu z roztworem transformacyjnym. Szok cieplny mieszaniny przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.Przenieść mieszaninę do probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml YEPD do probówki do inkubacji przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 250 obr./min. Następnego ranka zbierz przekształcone komórki przez odwirowanie i odessaj wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu.Zawiesić przekształcony osad komórek drożdży w pozostałym supernatancie. Płytkę 150 mikrolitrów mieszanki transformacyjnej i 150 mikrolitrów 20-krotnego rozcieńczenia pozostałych 50 mikrolitrów mieszaniny transformacyjnej w YEPD, na płytkach agarowych YEPD, uzupełnionych 0,2 grama na litr G418. Po 48 do 72 godzinach w temperaturze 30 stopni Celsjusza wybierz pojedynczy transformator do ponownego narysowania smug na nowej płytce agarowej YEPD uzupełnionej 0,2 g/l G418.W przypadku drugiej transformacji należy wyhodować kulturę do gęstości optycznej 1,0 przy 600 nanometrach, jak właśnie pokazano. I dodaj 20 mikrolitrów komórek do probówki mikrowirówkowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach roztworu LiAc-TE i dodaj ssDNA.W osobnej probówce połącz jeden mikrogram pojedynczej matrycy crRNA, jeden mikrogram zlinearyzowanego plazmidu biorcy dla macierzy crRNA, jeden mikrogram DNA każdego dawcy i jeden mikrogram każdego regionu flankującego. Następnie przenieś mieszaninę DNA do probówki z kompetentnymi komórkami drożdży i zakończ drugą transformację, jak pokazano dla pierwszej transformacji. Następnego ranka zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w małej porcji supernatantu.Następnie rozłóż 150 mikrolitrów mieszanki transformacyjnej i 150 mikrolitrów 20-krotnego rozcieńczenia mieszaniny transformacyjnej w pożywce YEPD, na płytkach agarowych YEPD uzupełnionych 0,2 g / L G418 i 0,2 g / L nourseotrycyny Po 48 do 72 godzinach, w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wybierz jednokolorowy transformant do ponownego smugowania na nowej płytce YEPD, aby uzyskać jednokolorowe kolonie. Aby określić wydajność edycji genomu, policz liczbę kolorowych i białych kolonii na płytkach transformacyjnych i podziel liczbę kolorowych kolonii przez całkowitą liczbę kolonii. Aby stworzyć drożdżową grafikę pikselową, zaszczepij pojedyncze kolby do wstrząsania o pojemności 500 ml zawierające 100 ml pożywki YEPD trzema różnokolorowymi szczepami S.cerevisiae wytwarzającymi karotenoidy i CEN typu dzikiego.Szczep PK113-7D. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min. Przenieś 0,5 ml każdej nocnej kultury do pojedynczych probówek zawierających 0,5 ml sterylnego podłoża o niejonowym gradiencie gęstości na probówkę i krótko wymieszaj roztwory przez wirowanie.Przenieś zawiesiny komórek do indywidualnego, kwalifikowanego zbiornika 2 na 3 dołki. Użyj pliku csv z ustawieniem kalibracji płynu 6RES_AQ_GPSA2 na akustycznym urządzeniu do obsługi cieczy, aby wykryć 25 nanolitrów każdego szczepu S.cerevisiae z odpowiedniej kwalifikowanej płytki źródłowej zbiornika na mikropłytce docelowej 6144 dołka zawierającej 50 ml agaru YEPD. Po wykryciu wszystkich studzienek inkubować mikropłytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Aby zintensyfikować kolory szczepów, przechowuj płytki agarowe w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez co najmniej 72 godziny. Na talerzu pojawiło się zdjęcie Rosalind Franklin. Jak wykazano, promotor, otwarta ramka odczytu, terminator i dwie ciągłe sekwencje łączników 50 pz można złożyć w kasetę ekspresji za pomocą reakcji klonowania Golden Gate i zweryfikować za pomocą PCR.Po amplifikacji pojedynczej macierzy crRNA metodą PCR, plazmid biorcy dla pojedynczej macierzy crRNA jest linearyzowany, co potwierdza elektroforeza. Skuteczność Multiplex Genome Editing można obliczyć na podstawie procentu kolorowych kolonii po transformacji oraz na podstawie wyników analiz PCR, które potwierdzają integrację DNA dawcy w zamierzonych lokalizacjach genomowego DNA. Na przykład, zaczynając od czarno-białego zdjęcia Rosalind Franklin, stworzono czterokolorowy obraz i listę plam, które następnie wykorzystano do wykrycia czterech różnych szczepów drożdży na mikropłytce agarowej za pomocą akustycznego urządzenia do obsługi cieczy, jak pokazano, co zaowocowało namalowaniem drożdży w wysokiej rozdzielczości.Do tej przemiany użyj świeżo przygotowanych roztworów i fragmentów DNA wysokiej jakości. Metoda ta może być również stosowana do multipleksowego wprowadzania zdefiniowanych delecji i mutacji punktowych do genomowego DNA. Ponadto można przeprowadzać eksperymenty z regulacją CRISPR.Metodę tę można zmodyfikować, aby wprowadzić więcej niż wolne crRNA do macierzy, aby zwiększyć liczbę jednoczesnych modyfikacji, które można wykonać.

crisprcas12a-multiplex-genome-editing-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metoda Green Monster umożliwia szybkie tworzenie wielokrotnych delecji oznakowanych genem reporterowym kodującym zielone białko fluorescencyjne. Metoda ta opiera się na przeprowadzaniu szczepów drożdży przez powtarzalne cykle seksualnego sortowania delecji oraz wzbogacania komórek posiadających więcej delekcji na podstawie fluorescencji.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Efektywna inżynieria genomu Candida albicans jest kluczowa dla zrozumienia patogenezy i rozwoju terapii. Tutaj opisaliśmy protokół szybkiej i dokładnej edycji genomu C. albicans za pomocą CRISPR. Protokół pozwala badaczom na wprowadzenie szerokiej gamy modyfikacji genetycznych, w tym mutacji punktowych, insercji i delecji.

Edycja genomu ludzkiego patogenu grzybowego Candida albicans za pośrednictwem CRISPR

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

System edycji genomu CRISPR-Cas9 to łatwy w użyciu edytor genomu, który był używany w gatunkach modelowych i niemodelowych. Tutaj prezentujemy białkową wersję tego systemu, która została wykorzystana do wprowadzenia przedwczesnego kodonu stop do genu kojarzenia niemodelowego nitkowatego grzyba workowca.

Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 u nitkowatego workowca Huntiella omanensis

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Poznaj metodę multipleksowej edycji genomu Saccharomyces cerevisiae przy użyciu systemu CRISPR/Cas12a z pojedynczą macierzą crRNA. Protokół umożliwia szybkie modyfikacje wielu loci genomowych i tworzenie szczepów drożdży produkujących karotenoidy.

CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu

Przeglądaj więcej filmów