CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu

Protokół ten demonstruje nowatorską metodę multipleksowej edycji genomu Saccharomyces cerevisiae poprzez wprowadzenie wielu kaset ekspresyjnych na różnych loci w jednym kroku transformacji. To podejście do klonowania swobodnego składania plazmidu w celu ekspresji pojedynczej macierzy crRNA prowadzi do szybkiego, wydajnego i elastycznego protokołu edycji genomu. Będziemy konstruować komórki drożdży typu dzikiego, aby wytwarzały karotenoidy poprzez wprowadzenie wolnych genów heterologicznych do wolnych loci genomowych.

Pojedyncza macierz crRNA składa się z wolnych pojedynczych crRNA wyrażonych z promotora wolnego od polimerazy RNA. Cas12a przetwarza in vivo macierz crRNA na pojedyncze crRNA. CrRNA kierują Cas12a do docelowych loci w genomowym DNA, gdzie Cas12a wprowadza podwójne pęknięcia nici.

Fragmenty DNA skierowane w dół rekombinują w celu rekombinacji in vivo i integrują się z genomowym DNA. Protokół zademonstruje doktorantka Klaudia Ciurkot. Jeffery van Wijk, naukowiec nadzwyczajny.

I Brenda Vonk, starszy pracownik naukowy z naszego laboratorium. Po uzyskaniu pojedynczej macierzy crRNA do eksperymentów z multipleksową edycją genomu syntetycznego DNA, przygotuj mieszankę amplifikacyjną PCR i załaduj macierz do termocyklera w celu amplifikacji. Aby przeanalizować produkty PCR za pomocą elektroforezy, należy umieścić próbki w 0,8% żelu agarozowym przy 5 V/cm przez 40 minut.

Załaduj drabinkę DNA fragmentami DNA w zakresie od 100 do 10000 par zasad, a następnie oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przemiany drożdży należy rozpocząć od wstępnej hodowli drożdży typu dzikiego w kolbie o pojemności 100 ml zawierającej 20 ml ekstraktu drożdżowego, dekstrozy peptonowej lub pożywki YEPD. Do inkubacji przez noc, w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 250 obrotów na minutę Następnego ranka zaszczepij 20 ml świeżej pożywki YEPD obliczoną objętością drożdży wstępnych z nocnej hodowli.

Umieść kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 1,0, mierzonej przy 600 nanometrach. Zbierz komórki drożdży przez odwirowanie. Umyj osad komórek drożdży w 20 ml wody demineralizowanej o temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj dodatkowe odwirowanie.

Zawiesić osad w 100 mikrolitrach roztworu octanu litu Tris-EDTA i przenieść drożdże do probówki mikrowirówkowej. Wymieszaj pięć mikrolitrów jednoniciowego nośnego DNA i jeden mikrogram plazmidu pCSN067 z zawiesiną komórek drożdży. Następnie wymieszać 600 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego LiAc-TE z próbką.

Inkubuj komórki drożdży i plazmid przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 450 prm w bloku grzewczym na stole. Pod koniec inkubacji zmieszać 70 ml sulfotlenku dimetylu z roztworem transformacyjnym. Szok cieplny mieszaniny przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza.

Przenieść mieszaninę do probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml YEPD do probówki do inkubacji przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 250 obr./min. Następnego ranka zbierz przekształcone komórki przez odwirowanie i odessaj wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu.

Zawiesić przekształcony osad komórek drożdży w pozostałym supernatancie. Płytkę 150 mikrolitrów mieszanki transformacyjnej i 150 mikrolitrów 20-krotnego rozcieńczenia pozostałych 50 mikrolitrów mieszaniny transformacyjnej w YEPD, na płytkach agarowych YEPD, uzupełnionych 0,2 grama na litr G418. Po 48 do 72 godzinach w temperaturze 30 stopni Celsjusza wybierz pojedynczy transformator do ponownego narysowania smug na nowej płytce agarowej YEPD uzupełnionej 0,2 g/l G418.

W przypadku drugiej transformacji należy wyhodować kulturę do gęstości optycznej 1,0 przy 600 nanometrach, jak właśnie pokazano. I dodaj 20 mikrolitrów komórek do probówki mikrowirówkowej. Po odwirowaniu ponownie zawieś osad komórkowy w 100 mikrolitrach roztworu LiAc-TE i dodaj ssDNA.

W osobnej probówce połącz jeden mikrogram pojedynczej matrycy crRNA, jeden mikrogram zlinearyzowanego plazmidu biorcy dla macierzy crRNA, jeden mikrogram DNA każdego dawcy i jeden mikrogram każdego regionu flankującego. Następnie przenieś mieszaninę DNA do probówki z kompetentnymi komórkami drożdży i zakończ drugą transformację, jak pokazano dla pierwszej transformacji. Następnego ranka zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w małej porcji supernatantu.

Następnie rozłóż 150 mikrolitrów mieszanki transformacyjnej i 150 mikrolitrów 20-krotnego rozcieńczenia mieszaniny transformacyjnej w pożywce YEPD, na płytkach agarowych YEPD uzupełnionych 0,2 g / L G418 i 0,2 g / L nourseotrycyny Po 48 do 72 godzinach, w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wybierz jednokolorowy transformant do ponownego smugowania na nowej płytce YEPD, aby uzyskać jednokolorowe kolonie. Aby określić wydajność edycji genomu, policz liczbę kolorowych i białych kolonii na płytkach transformacyjnych i podziel liczbę kolorowych kolonii przez całkowitą liczbę kolonii. Aby stworzyć drożdżową grafikę pikselową, zaszczepij pojedyncze kolby do wstrząsania o pojemności 500 ml zawierające 100 ml pożywki YEPD trzema różnokolorowymi szczepami S.cerevisiae wytwarzającymi karotenoidy i CEN typu dzikiego.

Szczep PK113-7D. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 250 obr./min. Przenieś 0,5 ml każdej nocnej kultury do pojedynczych probówek zawierających 0,5 ml sterylnego podłoża o niejonowym gradiencie gęstości na probówkę i krótko wymieszaj roztwory przez wirowanie.

Przenieś zawiesiny komórek do indywidualnego, kwalifikowanego zbiornika 2 na 3 dołki. Użyj pliku csv z ustawieniem kalibracji płynu 6RES_AQ_GPSA2 na akustycznym urządzeniu do obsługi cieczy, aby wykryć 25 nanolitrów każdego szczepu S.cerevisiae z odpowiedniej kwalifikowanej płytki źródłowej zbiornika na mikropłytce docelowej 6144 dołka zawierającej 50 ml agaru YEPD. Po wykryciu wszystkich studzienek inkubować mikropłytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Aby zintensyfikować kolory szczepów, przechowuj płytki agarowe w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez co najmniej 72 godziny. Na talerzu pojawiło się zdjęcie Rosalind Franklin. Jak wykazano, promotor, otwarta ramka odczytu, terminator i dwie ciągłe sekwencje łączników 50 pz można złożyć w kasetę ekspresji za pomocą reakcji klonowania Golden Gate i zweryfikować za pomocą PCR.

Po amplifikacji pojedynczej macierzy crRNA metodą PCR, plazmid biorcy dla pojedynczej macierzy crRNA jest linearyzowany, co potwierdza elektroforeza. Skuteczność Multiplex Genome Editing można obliczyć na podstawie procentu kolorowych kolonii po transformacji oraz na podstawie wyników analiz PCR, które potwierdzają integrację DNA dawcy w zamierzonych lokalizacjach genomowego DNA. Na przykład, zaczynając od czarno-białego zdjęcia Rosalind Franklin, stworzono czterokolorowy obraz i listę plam, które następnie wykorzystano do wykrycia czterech różnych szczepów drożdży na mikropłytce agarowej za pomocą akustycznego urządzenia do obsługi cieczy, jak pokazano, co zaowocowało namalowaniem drożdży w wysokiej rozdzielczości.

Do tej przemiany użyj świeżo przygotowanych roztworów i fragmentów DNA wysokiej jakości. Metoda ta może być również stosowana do multipleksowego wprowadzania zdefiniowanych delecji i mutacji punktowych do genomowego DNA. Ponadto można przeprowadzać eksperymenty z regulacją CRISPR.

Metodę tę można zmodyfikować, aby wprowadzić więcej niż wolne crRNA do macierzy, aby zwiększyć liczbę jednoczesnych modyfikacji, które można wykonać.