Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Protokół ten jest istotny z dwóch głównych powodów. Po pierwsze, pozwala użytkownikowi określić stany cyklu komórkowego komórek skóry, które zostały wyizolowane z modelu zwierzęcego. Pozwala nam również analizować ekspresję białek w dyskretnych fazach cyklu komórkowego.

W porównaniu z poprzednimi metodami określania proliferacji komórek, nasza metoda pozwala na bardziej precyzyjne określenie różnych faz cyklu komórkowego, a także możemy analizować ponad 40 różnych markerów na różnych etapach podziału komórki. To znacznie zwiększa zastosowanie i wszechstronność metody. Protokół ten może być stosowany w badaniach nad rakiem i w każdym innym rodzaju choroby, w której istnieje potrzeba określenia wzorców ekspresji białek specyficznych dla cyklu komórkowego.

Ponadto protokół ten może być modyfikowany do innych typów komórek i innych organizmów modelowych. Pierwszy raz użytkownik powinien skupić się na uzyskaniu jak najlepszej jakości przygotowania komórek. Wymaga to terminowego przetworzenia eksperymentalnej skóry przy użyciu świeżych odczynników, minimalnego czasu trawienia tkanek i starannego usunięcia supernatantu po odwirowaniu w celu zachowania integralności i ilości komórek.

Aby rozpocząć, zaprojektuj panel przeciwciał ze znacznikiem metalu, korzystając z bezpłatnego oprogramowania do projektowania paneli online, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie przygotuj roztwór podstawowy IdU, rozpuszczając proszek IdU w ilości 10 miligramów na mililitr w 0,1 normalnego wodorotlenku sodu w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po podaniu roztworu podstawowego IdU do probówek do mikrowirówek, zamrozić je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.

Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować pH roztworu IdU do 7,5 za pomocą 12 normalnych kwasów solnych i przeprowadzić próbę za pomocą paska pH na podwielokrotności odrzutu, aby upewnić się, że roztwór ma pH 7,5. Aby przygotować dwa x roztwór utrwalający paraformaldehyd, połącz pięć mililitrów 10 x PBS i jeden mililitr 16% PFA z 44 mililitrami czystej wody destylowanej o jakości molekularnej. Aby przygotować 100 milimolowy roztwór podstawowy cisplatyny, rozpuść 300,5 miligrama cisplatyny w proszku w 10 mililitrach DMSO.

W przypadku eksperymentów, które mają być stosowane w ciągu jednego dnia, należy przygotować 10-milimolowy roztwór roboczy cisplatyny. Zważ myszy, a następnie określ dawkę na 0,1 miligrama IdU na gram masy ciała. Obliczoną dawkę IDU należy podać we wstrzyknięciu dootrzewnowym i odczekać dwie godziny przed pobraniem komórek.

Użyj nożyczek chirurgicznych, aby chirurgicznie usunąć ucho umieszczonej po uśpieniu myszy, której wcześniej wstrzyknięto IdU u podstawy ucha. Umieść ucho na suchej 100-milimetrowej szalce Petriego. Ostrożnie oddziel skórę przednią od tylnej, używając cienkich kleszczy, aby utworzyć kieszeń pośrodku lub na krawędzi obszaru cięcia, a następnie rozsuń dwa płaty skóry i postępuj zarówno ze skórą przednią, jak i tylną.

Ostrożnie umieścić przednią i tylną skórę jednego ucha w jednym dołku 12-dołkowej płytki hodowlanej, wypełnionej jednym mililitrem świeżo przygotowanego roztworu dyspazy/kolagenazy, tak aby strona skóry właściwej dotykała roztworu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby strawić skórę. Umieść strawione ucho lub skórę noworodka na czystej szalce Petriego tak, aby strona naskórka dotykała powierzchni naczynia.

Za pomocą kleszczy spłaszcz skórę i delikatnie zsuń skórę właściwą z naskórka, pracując od środka do krawędzi w okrężny wzór. Za pomocą kleszczy chwyć naskórek za krawędzie i delikatnie go unieś, odklejając go od powierzchni szalki Petriego. Ostrożnie umieść naskórek na wstępnie podgrzanym roztworze do odrywania komórek w jednym dołku płytki.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyj sterylnych kleszczy, aby chwycić naskórek i wyszoruj, przeciągając naskórek po dnie naczynia, aby zdysocjować komórki. Dodać jeden mililitr DMEM zawierającego 1% FBS i przepuścić przez sito komórkowe o wielkości 40 mikrometrów do probówki zbiorczej.

Dobrze spłucz dodatkowymi dwoma mililitrami DMEM i dodaj do zawiesiny komórek. Po odwirowaniu w ilości 120 razy g przez pięć minut, ostrożnie zassać supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym do dwóch mililitrów DMEM zawierającym 1% FBS i ponownie zagnieździć ogniwa, tak jak poprzednio.

Aby oznaczyć komórki w celu określenia żywych i martwych komórek, ponownie zawieś od jednego do trzech milionów komórek w jednym mililitrze DMEM zawierającym 25 mikromolowych cisplatyny i inkubuj przez jedną minutę. Ugasić przez pipetowanie z równą objętością FBS. Po odwirowaniu w ilości 120 razy g przez pięć minut, zdekantować supernatant do zlewki zawierającej rozcieńczony wybielacz i odwrócić probówki, aby odsączyć pozostały roztwór na ręcznik papierowy.

Ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach PBS wolnego od kationów baru i ponownie je odwirować, jak opisano wcześniej. Aby utrwalić komórki, ponownie zawieś osad komórek w jednym mililitrze PBS wolnego od kationów baru. Wiruj komórki pod ciągłą niską mocą i dodaj kroplami jeden mililitr dwóch utrwalających PFA.

Umieść na bujanej platformie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu w ilości 500 g przez pięć minut, ostrożnie zdekantować supernatant. Umyć komórki dwoma mililitrami PBS wolnego od kationu baru, ponownie odwirować w tych samych warunkach i powtórzyć etap mycia.

Na koniec ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach PBS wolnego od kationów baru. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez pięć minut i ostrożnie zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze jednego buforu utrwalającego x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i powtórzyć wirowanie.

Aby umyć komórki, dodaj jeden mililitr buforu do przepuszczalności kodów kreskowych. Podczas wirowania komórek w temperaturze 500 razy g przez pięć minut przygotuj kody kreskowe, dodając do nich 100 mikrolitrów buforu przepuszczalności kodów kreskowych i natychmiast wymieszaj. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 800 mikrolitrach bufora przepuszczalności kodów kreskowych.

Dodaj roztwór kodu kreskowego do komórek, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wirować 500 razy g przez pięć minut. Umyj komórki w dwóch mililitrach buforu do barwienia komórek i ponownie odwiruj.

Następnie ponownie zawieś od jednego do trzech milionów komórek w jednym mililitrze roztworu roboczego buforu do barwienia antygenów jądrowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po odwirowaniu w ilości 500 g przez pięć minut, ostrożnie zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu permeabilizacji barwienia antygenu jądrowego i ponownie odwirować.

Po ponownym zawieszeniu i odwirowaniu, ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałej objętości z delikatnym wirowaniem. Dodaj 50 mikrolitrów wewnątrzkomórkowego koktajlu przeciwciał, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Dodaj dwa mililitry buforu do barwienia komórek.

Odwirować ponownie w tych samych warunkach, co w poprzednim kroku, i usunąć supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach buforu do barwienia komórek, odwirować przy 500 razy g przez pięć minut i powtórzyć ponowne zawieszanie i wirowanie. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze roztworu interkalacyjnego i przechowywać przez jeden do trzech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po ponownym odwirowaniu komórek przemyć osad dwoma mililitrami buforu do barwienia komórek, odwirować w tych samych warunkach i wykonać dwa dodatkowe płukania dwoma mililitrami wody, przy tym samym odwirowaniu. Zawiesić osad komórkowy w stężeniu miliona komórek na mililitr za pomocą rozcieńczonego roztworu kulek EQ, a następnie uruchomić próbki na cytometrze masowym. Określa się oczekiwaną wydajność i żywotność komórek z ucha dorosłej myszy i skóry noworodka.

Przybliżona wydajność zależy od powierzchni skóry. Skóra noworodków jest lepszym wyborem w przypadku eksperymentów, które wymagają większej liczby komórek. Przedstawiono podstawową strategię bramkowania w celu wybrania nienaruszonych, pojedynczych i żywotnych komórek, po normalizacji i dekonwolucji danych cytometrii masowej z kodami kreskowymi.

Odsetek komórek żywotnych może wskazywać na jakość lub stan komórek przed barwieniem. Wykazano również różnice w żywotności między hodowanymi komórkami raka a izolowanymi komórkami ucha myszy. Żywe komórki bramkowano na podstawie długości zdarzenia w porównaniu z CD45, aby wykluczyć komórki krwiotwórcze

Włączenie markerów liniowych pozwala na wybór interesujących populacji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Podstawowy profil cyklu komórkowego uzyskuje się przez detekcję BrdU w stosunku do PI w fluorescencyjnej cytometrii przepływowej. Jednak włączenie innych markerów proliferacji do cytometrii masowej pozwala na bardziej precyzyjną identyfikację faz cyklu komórkowego.

Zgodnie z tym podejściem profile cyklu komórkowego mogą być konstruowane dla różnych typów komórek lub warunków eksperymentalnych, takich jak profile dla komórek CD45 ujemnych i CD45 dodatnich z tego samego eksperymentu. W innym przykładzie analiza markerów, które definiują szlaki sygnałowe EGFR i mTOR PI3K w fazie G-one, ujawniła podobne profile ekspresji w komórkach CD45 ujemnych, pokazanych na pomarańczowo, i komórkach CD45-dodatnich, pokazanych na niebiesko. Cytometria masowa wymaga dużej ilości komórek wysokiej jakości.

Jeśli użytkownik jest zainteresowany rzadką populacją komórek, może być potrzebna większa liczba komórek. Wyizolowane żywe komórki mogą być używane do analizy DNA lub RNA, badań biochemicznych lub mogą być używane w hodowli tkankowej przed utrwaleniem i barwieniem do cytometrii masowej. Podczas pracy z paraformaldehydem, kwasem solnym lub wodorotlenkiem sodu użytkownik powinien w razie potrzeby korzystać ze środków ochrony osobistej i szafy bezpieczeństwa.