Name: Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Poznaj izolację i barwienie keratynocytów skóry myszy do analizy ekspresji białek w cyklu komórkowym za pomocą cytometrii masowej. Metoda umożliwia precyzyjne określenie faz cyklu i analizę ponad 40 markerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie dla tej pracy pochodziło z Departamentu Dermatologii, Gates Center for Regenerative Medicine na University of Colorado oraz University of Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Autorzy dziękują UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and Support Grant (NCI P30 CA046934) na działanie cytometru masowego i są wdzięczni Karen Helm i Christine Childs za ich fachowe porady dotyczące technik cytometrii przepływowej i masowej.

Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolorado Anschutz Medical Campus' zatwierdził eksperymenty na zwierzętach opisane w tym protokole.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Zaprojektuj panel przeciwciał ze znacznikiem metalowym. Skorzystaj z bezpłatnego oprogramowania do projektowania paneli online12 i dołącz 127jododeoksyurydyny (IdU), 164Dy (dysproz) znakowane anty-CCNB1 (CYKLINA B1), 175Lu (lutet) fosfo(p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) i 150Nd (neodym)-pRETINOBLASTOMA białkoSer807/811 (pRB)13. Dodaj dodatkowe przeciwciała oznaczone metalem, które nie nakładają się na siebie w swoim kanale signal14.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy IdU. Rozpuścić proszek IdU w stężeniu 10 mg/ml w 0,1 N NaOH w temperaturze 60 °C. Podwielokrotny roztwór podstawowy IdU rozpuścić w probówkach do mikrowirówek i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować pH roztworu IdU do 7,5 za pomocą 12 N HCl. Przeprowadzić test za pomocą paska pH na podwielokrotności odrzutu, aby upewnić się, że roztwór ma pH 7,5, 
		UWAGA: Wydłużony czas (>5 min) IdU przy pH 7,5 spowoduje wytrącanie się i w takim przypadku potrzebna jest świeża porcja IdU.</li>
		<li>Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej (np. rękawic, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych) i pracuj w szafie bezpieczeństwa podczas pracy z roztworami NaOH lub HCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 2x roztwór utrwalający paraformaldehyd (PFA). Połącz 5 ml 10x PBS (pH 7,5) i 1 ml 16% PFA z 44 ml czystego dH2O o czystości molekularnej (3,2% stężenia końcowego). 
	UWAGA: Zapas PFA można przygotować zgodnie z wcześniejszymi publikacjami15 lub zakupić 16% zapasów wolnych od metali zanieczyszczających.
	<ol>
		<li>Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i pracuj w komorze bezpieczeństwa podczas pracy z proszkiem PFA i roztworami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1x PBS bez baru (Ba 2+), łącząc 5 ml 10 PBS bez metalu (pH 7,5) z 45 ml czystego dH2O. 
	UWAGA: Jakość PBS i innych odczynników jest bardzo ważna, aby uniknąć zanieczyszczenia metali, które mogą wprowadzać szum tła podczas analizy danych cytometrii masowej.</li>
	<li>Przygotować 100 mM roztwór podstawowy cisplatyny. Rozpuścić 300,5 mg cisplatyny w proszku w 10 ml DMSO. Przechowywać w porcjach w temperaturze -80 °C. Przygotować 10 mM roztwór roboczy cisplatyny do eksperymentów, które mają być użyte przez 1 dzień.</li>
	<li>Przygotuj roztwory do separacji naskórka/skóry właściwej. Przygotować 20-krotny roztwór podstawowy dypazy, rozpuszczając 30 mg w 1 ml HBSS lub PBS. Filtrować sterylizować przez filtr 0,22 μm i przechowywać w podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Przygotować 1x roztwór podstawowy kolagenazy typu IV o stężeniu 1 mg/ml w HBSS, przefiltrować, wysterylizować przez filtr 0,22 μm i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Etykietowanie fazy S przez inkorporację IdU
<ol>
	<li>Zważ myszy. Użyj nowonarodzonych szczeniąt P1-P3 lub dorosłych myszy w wieku 8-10 tygodni i użyj samców lub samic myszy z tła C57BL/6, FvB lub 129. Określić dawkę przy 0,1 mg IdU (pH 7,5)/g masy ciała. Na przykład mysz o wadze 25 g wymaga 0,25 ml IdU.</li>
	<li>Dawkę IdU należy podać we wstrzyknięciu dootrzewnowym i odczekać 2 godziny przed pobraniem komórek. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej należy wstrzykiwać nowonarodzone młode. 
	UWAGA: Dawkę 2 mg/ml IdU można stosować z komórkami hodowli tkankowej w 1 godzinnej inkubacji w temperaturze 37 °C przed pobraniem i znakowaniem do cytometrii masowej.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek do etykietowania
<ol>
	<li>Rozmrozić roztwory podstawowe dypazy i kolagenazy. Rozcieńczyć 20x roztwór podstawowy dispazy do 1x (1,5 mg/ml) w sterylnym HBSS lub PBS. Przechowywać na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.</li>
	<li>Połącz 2 objętości dypasy z 1 objętością kolagenazy w całkowitej objętości, która pozwala skórze swobodnie unosić się na wodzie. Na przykład, trawienie 5 nowonarodzonych skór myszy można unosić na 8 ml 1x dispazy z 4 ml kolagenazy na 100 mm szalce Petriego.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z zatwierdzonymi metodami eutanazji myszy eksperymentalnych (np. przedawkowanie izofluranu / kontrola szczypania palców u nóg lub wdychanie CO2 / zwichnięcie szyjki macicy). Oczyścić skórę ucha osoby dorosłej roztworem jodu (patrz tabela materiałów) i spłukać sterylną wodą, jeśli izolowane komórki mają być użyte do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Chirurgicznie usuń ucho u podstawy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Przepłukać uszy w sterylnym PBS, gdy izolowane komórki mają być użyte do hodowli tkankowej. Ułożyć na suchej szalce Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Ostrożnie oddziel skórę przednią od tylnej, początkowo tworząc kieszeń w środku lub na krawędzi obszaru cięcia za pomocą cienkich kleszczyków i rozsuwając dwa płaty skóry ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 1B-D). Postępuj zarówno z przednią, jak i tylną skórą. 
	UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące preparowania skóry noworodków myszy są dostarczane przez Litchi et al.16 Ponadto użycie lunety preparacyjnej może pomóc w oddzieleniu przedniej części skóry od tylnej i identyfikacji naskórka/stron skóry właściwej wypreparowanej skóry: włosy są widoczne po stronie naskórka, podczas gdy skóra właściwa będzie miała galaretowaty wygląd.</li>
	<li>Ostrożnie umieść przednią i tylną skórę ucha tak, aby strona skóry właściwej stykała się z roztworem dyspazy/kolagenazy ( <silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Użyj 1 ml zarówno na przednią, jak i tylną skórę pojedynczego ucha na dołek 12-dołkowej płytki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Alternatywnie, spławiać skórki na 1x roztworze dispazy w temperaturze 4 °C przez 16-18 h.3 
	UWAGA: Pracuj w kapturze do hodowli tkankowych z techniką sterylną, gdy komórki mają być hodowane.</li>
	<li>Ułóż strawioną skórę stroną naskórkową dotykającą powierzchni czystej szalki Petriego. Spłaszcz skórę i delikatnie zsuń skórę właściwą z naskórka, pracując od środka do krawędzi w okrągły wzór.</li>
	<li>Wyrzuć skórę właściwą lub traw ją dalej, aby uwolnić fibroblasty do hodowli tkankowej lub analizy16. 
	UWAGA: Skóra właściwa będzie ciemniejsza i będzie miała galaretowaty i lepki skład. Skóra właściwa powinna łatwo zejść. Niepowodzenie lub trudności w usunięciu skóry właściwej sugerują niewystarczające trawienie tkanek. Jednak przedłużona inkubacja w buforze trawiennym zmniejszy żywotność komórek. Naskórek pozostanie na szalce Petriego i będzie miał wybielony wygląd.</li>
	<li>Delikatnie unieś naskórek chwytając za krawędzie i oderwij go od powierzchni szalki Petriego. Ostrożnie umieścić naskórek na wstępnie podgrzanym roztworze do odwarstwiania komórek (patrz tabela materiałów) na 5 minut w temperaturze 37 °C lub 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyć 500 μl roztworu do odwarstwiania komórek na 2 naskórki ucha dorosłego na dołek 12-dołkowej płytki hodowlanej i użyć 750 μl roztworu do odwarstwiania komórek dla pojedynczego naskórka noworodka na studzienkę 6-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Chwyć naskórek za pomocą sterylnych kleszczy i wyszoruj, przeciągając naskórek po dnie naczynia, aby zdysocjować komórki. Dodać 1 ml DMEM zawierającego 1% FBS (0,01 ml) i przepuścić przez sito komórkowe 40 μm do probówki zbiorczej. Dobrze spłukać dodatkowymi 2 ml DMEM i dodać do zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Wirować przy 120 x g przez 5 min. Ostrożnie zassać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1-2 ml DMEM zawierającym 1% FBS. Określić liczbę komórek i % żywych komórek za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru lub automatycznego urządzenia zliczającego. Ogniwa osadkowe zgodnie z opisem w kroku 3.11. 
	UWAGA: Komórki można hodować w odpowiednich pożywkach do hodowli tkankowych po kroku 3.12. 17</li>
</ol>
4. Oznaczanie cisplatyny w celu określenia żywych/martwych komórek
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić 1-3 x 106 komórek na 1 ml DMEM zawierającego 25 μM cisplatyny (2,5 μl zapasu/ml). Inkubować przez 1 minutę i schłodzić pipetując równą objętość FBS (np. 1 ml).</li>
	<li>Wirować przy 120 x g przez 5 minut. Zdekantować supernatant do zlewki zawierającej rozcieńczony wybielacz i odwrócić probówki, aby odsączyć pozostały roztwór na ręcznik papierowy. Delikatnie postukać, aby uwolnić roztwór pozostały na osadach i ściankach bocznych probówki.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 2 ml PBS wolnego od Ba+2. Komórki osadkowe zgodnie z opisem w kroku 4.2. 
	UWAGA: Zaleca się naprawianie komórek, jeśli nie można ich natychmiast zabarwić.</li>
</ol>
5. Utrwalanie komórek znakowanych cisplatyną (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić 1-3 x 106 komórek znakowanych cisplatyną w 1 ml PBS wolnego od Ba+2. Wiruj komórki pod ciągłą niską mocą i dodaj kroplami 1 ml (1 objętość) buforu utrwalającego 2x PFA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut na kołyszącej się platformie.</li>
	<li>Osadzać komórki zgodnie z opisem w kroku 4.2, ale wirować przy 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Umyj komórki 2 ml PBS wolnego od Ba+2 i ogniwami osadkowymi, jak opisano w kroku 5.2. Powtórz krok 5.3 raz.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 ml PBS wolnego od Ba+2. Przechowywać w temperaturze 4°C przez <3 dni. Dodać FBS do 3% (np. 0,3 ml FBS/ml komórek) całkowitej objętości, jeśli przechowuje się dłużej >3 dni, a następnie wymieszać i zamrozić w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Fiksacja może wpływać na wykrywanie niektórych epitopów. Wpływ fiksacji na sygnał przeciwciała musi być określony empirycznie.</li>
</ol>
6. Kody kreskowe próbek (opcjonalne, ale zalecane)
<ol>
	<li>Komórki osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2, a następnie ponownie zawiesić 1-3 x 106 komórek w 1 ml 1x buforu utrwalającego (patrz tabela materiałów). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Ogniwa osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
	<li>Umyj komórki 1 ml buforu do przepuszczalności kodów kreskowych (patrz tabela materiałów). Ogniwa osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2. Powtórz krok 6.2 raz.</li>
	<li>Dodaj 100 μl buforu przepuszczalności kodów kreskowych do kodów kreskowych (patrz Tabela materiałów)18 i natychmiast wymieszaj, podczas gdy komórki z kroku 6.2 są granulowane.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w 800 μl buforu do przepuszczalności kodów kreskowych. Dodać roztwór kodu kreskowego do komórek, wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Ogniwa osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2. Umyj komórki w 2 ml buforu do barwienia komórek (patrz Tabela materiałów) i ponownie zdeponuj. 
	UWAGA: Do 20 próbek może być oznaczonych różnymi kombinacjami metali palladowych18. Inne strategie kodowania kreskowego są opisane w innym miejscu15.</li>
</ol>
7. Oznaczanie komórek do cytometrii masowej
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić 1-3 x 106 komórek w 1 ml roztworu roboczego buforu do barwienia antygenów jądrowych (patrz tabela materiałów). Połącz próbki w jedną probówkę w celu wykonania kolejnych etapów w przypadku korzystania z próbek oznaczonych kodami kreskowymi. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Osad zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 1-3 x 106 komórek w 2 ml buforu przepuszczalnego do barwienia antygenów jądrowych (patrz tabela materiałów). Skaluj zgodnie z potrzebami. Na przykład użyj 6 ml buforu na 10 połączonych próbek o liczbie komórek 9 x 106 komórek. Osad zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
	<li>Powtórz krok 7.2. Delikatnie wymieszać osad komórkowy w pozostałej objętości pozostałej w probówce.</li>
	<li>Dodaj 50 μl wewnątrzkomórkowego koktajlu przeciwciał na 1-3 x 106 komórek. Skaluj zgodnie z potrzebami. Na przykład użyj 150 μl koktajlu przeciwciał na 10 połączonych próbek o liczbie komórek 9 x 106 komórek. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Dodać 2 ml buforu do barwienia komórek i osadu zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
	<li>Ponownie zawiesić 1-3 x 106 komórek w 2 ml bufora do barwienia komórek. Ogniwa osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2. Powtórz krok 7.5 raz. 
	UWAGA: Inne roztwory buforowe mogą być używane do barwienia błony zewnątrzkomórkowej lub markerów cytoplazmatycznych, a eksperymentator może być zmuszony do optymalizacji barwienia, jeśli istnieje potrzeba wykrycia epitopów w różnych lokalizacjach komórkowych. Komórki można również utrwalić w PFA po kroku 7.5 w przypadku używania żywych komórek do barwienia.</li>
	<li>Zawiesić 1-3 x 106 komórek w 1 ml roztworu interkalacyjnego i przechowywać przez 1-3 dni w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C w DMSO zawierającym roztwór dla >3 d. Komórki osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2, jeśli komórki znajdują się w roztworze interkalacyjnym. Ponownie zawiesić osad (1-3 x 106 komórek) w 1 ml buforu do barwienia komórek i komórek osadu, jak opisano w kroku 5.2. Zawiesić osad w 1 ml 10% DMSO/90% FBS19, przenieść do kriowialu, umieścić w pojemniku do zamrażania izopropanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogniwa osadkowe zgodnie z opisem w kroku 5.2. Umyj 1-3 x 106 komórek 2 ml buforu do barwienia komórek, granulując zgodnie z opisem w kroku 5.2. Wykonaj dwa dodatkowe płukania 2 ml wody, granulując zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
	<li>Rozcieńczyć koraliki kalibracyjne EQ w stosunku 1:9 w wodzie (roztwór podstawowy o sile 3,3 x 105 kulek/ml).</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w stężeniu 1 x 106 komórek/ml rozcieńczonym roztworem kulek EQ. Przefiltruj komórki przez rurki przepływowe z filtrem siatkowym o średnicy 35 μm.</li>
	<li>Uruchom próbki na cytometrze masowym i uzyskaj dane. Dane zostaną zdeponowane w formacie pliku Flow Cytometry Standard (FCS).</li>
</ol>
8. Przetwarzanie i analiza plików danych cytometrii masowej
<ol>
	<li>Normalizowanie plików FCS. Skorzystaj z darmowego programu dostępnego pod adresem https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20</li>
	<li>Dekonwolucja plików FCS z kodami kreskowymi. Podziel zbiorczą populację kodów kreskowych na osobne pliki kodów kreskowych za pomocą bezpłatnego programu dostępnego pod adresem https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18</li>
	<li>Analizowanie znormalizowanych plików FCS. Użyj programów commercial21,22 lub freeware (patrz web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).</li>
</ol>

<ol><li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+proliferation+markers%3A+PCNA%2C+Ki-67%2C+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li>
<li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3%2C+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedCentral+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).</li>
<li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li>
<li>http://www.dvssciences.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.dvssciences.com">http://www.dvssciences.com</a> (2019).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465(2016).</li>
<li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li>
<li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>http://www.cytobank.org. , 
 <a target="_blank" href="http://www.cytobank.org">http://www.cytobank.org</a> (2019).</li>
<li>http://www.flowjo.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com">http://www.flowjo.com</a> (2019).</li>
<li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45%3A+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li>
<li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS%2FFLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid%2Ferythroid+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li>
<li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li>
<li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li>
<li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery%2C+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li>
<li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li>
<li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li>
<li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół opisany w tym artykule można wypełnić w ciągu około 8 godzin. Efektem końcowym jest zawiesina komórek wzbogacona w KC, która może być analizowana pod kątem ekspresji białek w sposób zależny od cyklu komórkowego. W kilku wcześniejszych badaniach przedstawiono metody izolowania KC ze skóry ludzkiej i mysiej 16,25. Badania te obejmują również protokoły izolacji KC do cytometrii przepływowej26. Jednak wcześniej nie opisano szczegółowe...

Korelacja ekspresji genów z etapami cyklu komórkowego pozostaje wyzwaniem w analizie zwierzęcych modeli chorób hiperplastycznych, takich jak rak. Częścią tego wyzwania jest jednoczesne wykrywanie białek będących przedmiotem zainteresowania (POI) z markerami proliferacji. Komórki proliferacyjne można znaleźć w różnych fazach cyklu komórkowego, w tym G1, S, G2 i M. Ki67 jest jednym z najczęściej stosowanych markerów proliferacji i ulega ekspresji we wszystkich fazach cyklu komórkowego. Jest szeroko stosowany w analizie tkanek zarówno ludzkich, jak i mysich1,2,3. Jednak, podobnie jak inne ogólne markery proliferacji, Ki67 nie rozróżnia poszczególnych faz cyklu komórkowego. Bardziej precyzyjne podejście wykorzystuje włączenie analogów nukleotydów tymidynowych, takich jak bromodeoksyurydyna (BrdU), do komórek, które aktywnie replikują swój genom (tj. Faza S)4,5. Jedną z wad stosowania analogów nukleotydów jest konieczność podawania ich żywym zwierzętom na kilka godzin przed analizą. Ki67 i BrdU są powszechnie wykrywane na utrwalonych skrawkach tkanek za pomocą przeciwciał. Jedną z zalet tego podejścia jest to, że lokalizację POI można ustalić w architekturze tkanki (np. w warstwie podstawnej naskórka skóry). Takie podejście nie wymaga również dysocjacji tkanek, która może prowadzić do zmian w ekspresji genów. Jedną z wad jest to, że utrwalanie tkanki lub przetwarzanie tkanki do zamrażania OCT lub cięcia parafiny może blokować cele przeciwciał (tj. antygeny). Pobieranie antygenów zazwyczaj wymaga ciepła lub trawienia tkankowego. Kwantyfikacja intensywności barwienia może być również trudna. Wynika to z różnic w barwieniu, grubości przekroju, wykrywaniu sygnału i stronniczości eksperymentatora. Co więcej, w większości typowych układów laboratoryjnych można wykryć jednocześnie ograniczoną liczbę markerów. Jednak nowsze podejścia do barwienia multipleksowego obiecują przezwyciężyć te ograniczenia; przykładami są obrazowanie cytometrii masowej i wzmocnienie sygnału tyramidu6,7.
Cytometria przepływowa to kolejna potężna technologia do wykrywania proliferujących komórek. Pozwala na multipleksowe wykrywanie markerów w tych samych komórkach, ale wymaga dysocjacji tkanek dla większości typów komórek niehematopoetycznych. Analiza proliferujących komórek jest rutynowo wykonywana przy użyciu barwników wiążących DNA (np. jodek propidyny (PI))8. Cytometria przepływowa pozwala również na bardziej precyzyjne określenie faz cyklu komórkowego w połączeniu z wykrywaniem inkorporacji BrdU9. Chociaż cytometria przepływowa BrdU/PI jest skutecznym podejściem, ma swoje wady. Nie jest w stanie rozpuścić faz G2/M i G0/G1 bez włączenia przeciwciał swoistych dla fazy. Jednak liczba przeciwciał, które można zastosować, jest ograniczona przez autofluorescencję komórkową, widmowe rozlanie emisji fluoroforów i stosowanie kontroli kompensacyjnych. To ograniczenie sprawia, że wspólne wykrywanie ekspresji markerów cyklu komórkowego z POI jest trudniejsze i bardziej pracochłonne. Bardziej prostym podejściem jest użycie cytometrii masowej10,11. Technologia ta wykorzystuje przeciwciała sprzężone z metalami, które mają węższe spektrum wykrywania. Po zabarwieniu komórek przeciwciałami znakowanymi metalem, są one odparowywane, a metale wykrywane za pomocą cytometrycznej spektrometrii mas czasu przelotu (CyTOF). Dzięki tym właściwościom cytometria masowa umożliwia multipleksowe wykrywanie >40 różnych markerów przy użyciu istniejących platform10,11. Ponadto możliwe jest kodowanie próbek kreskowych metalami, co skutkuje oszczędnością cennych przeciwciał przy jednoczesnym zmniejszeniu zmienności barwienia między próbkami. Z drugiej strony cytometria masowa ma kilka wad. Istnieje ograniczona liczba dostępnych na rynku przeciwciał znakowanych metalem dla komórek niepochodzących z krwi. Kwantyfikacja zawartości DNA jest mniej czuła w porównaniu ze stosowaniem fluorescencyjnych barwników DNA, a cytometria masowa ma zmniejszony zakres dynamiczny wykrywania sygnału w porównaniu z fluorescencyjną cytometrią przepływową.
Opisany tutaj protokół został zaprojektowany do analizy dynamiki cyklu komórkowego z nowo wyizolowanych keratynocytów (KC) ze skóry myszy i scharakteryzowania ekspresji białek specyficznych dla cyklu komórkowego w tych komórkach za pomocą cytometrii masowej. Protokół ten może być również stosowany z hodowanymi komórkami lub dostosowany do innych typów komórek.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Cell Treat</td><td>229512</td><td></td></tr><tr><td>Interkalator</td><td>roztwór Fluidigm</td><td>201192A</td><td>125 &micro; M - roztwór interkalatora Ir</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>30525-89-4</td><td>16 %&nbsp; PFA</td></tr><tr><td>Rurki przepływowe z nasadką sitową</td><td>Fisher/Corning</td><td>352235</td><td>35 &micro; m Wielkość porów&nbsp;</td></tr><tr><td>Sito komórkowe</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td>40 &mu; m Wielkość porów&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór do usuwania komórek</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-ACCUTASE-100</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>Jodowy roztwór</td><td>ThermoFisher/Purdue</td><td>67618-151-17</td><td>Betadine 7,5%-jodowy peeling chirurgiczny Bufor</td></tr><tr><td>permeabilizacji kodów kreskowych&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd Zestaw kodów kreskowych</td></tr><tr><td></td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Pd Zestaw kodów kreskowych</td></tr><tr><td>Paski pH</td><td>EMD</td><td>9590</td><td>colorpHast</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane</td></tr><tr><td>kleszcze</td> Eagle Media <td>Dumont & Fils</td><td>0109-5-PO</td><td>Dumostar #5</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze precyzyjne</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-7-PO</td><td>Dumostar #7</td></tr><tr><td>Koraliki kalibracyjne</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka</td></tr><tr><td></td><td>Woda Fisher</td><td>SH30538.03</td><td>Hyclon Biologia molekularna klasa woda</td></tr><tr><td>Jododeoksyurydyna</td><td>&nbsp; Fiolki Sigma</td><td>I7125</td><td>IdU</td></tr><tr><td>Cryo</td><td>ThermoFisher</td><td>366656PK</td><td>z gwintem wewnętrznym</td></tr><tr><td>Bufor do barwienia komórek</td><td>Fluidigm</td><td>201068</td><td>Maxpar Bufor do barwienia komórek</td></tr><tr><td>Fix & Bufor do trwałej ondulacji</td><td>Fluidigm</td><td>201067</td><td>Maxpar Fix & Bufor do trwałej ondulacji</td></tr><tr><td>Bufor Fix I</td><td>Fluidigm</td><td>201065</td><td>Maxpar Fix I</td></tr><tr><td>bufor Solanka buforowana fosforanami</td><td>Rockland</td><td>MB-008</td><td>Bez metalu 10x PBS</td></tr> pojemnik do <tr><td>zamrażania izopropanolu</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Mr.Frosty</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP359-500</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Kord-Valmark</td><td>2900</td><td>Dostarczone przez Genesee 32-107&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml stożkowy</td><td>Olympus/Genesee</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowy</td><td>Olympus/Genesee</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Cell Treat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>cisplatyna</td><td>Sigma</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma/Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie antygenu jądrowego&nbsp; bufor permeabilizacji</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia antygenu jądrowego</td><td>Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV&nbsp;</td><td>Worthington Bioscience</td><td>CLSS-4</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Celem tego protokołu jest wykrywanie i ilościowe określanie zmian ekspresji białek w sposób zależny od cyklu komórkowego przy użyciu pojedynczych komórek wyizolowanych z naskórka skóry myszy. Istnieje siedem ważnych etapów: oddzielenie naskórka od skóry właściwej, trawienie naskórka, barwienie populacji komórek naskórka cisplatyną, kodowanie kreskowe próbek, barwienie przeciwciałami znakowanymi metalem dla markerów cyklu komórkowego i białek będących przedmiotem zainteresowania, wykrywanie przeciwciał znakowanych metalem za pomocą cytometrii masowej oraz analiza ekspresji w różnych fazach cyklu komórkowego. Przewagą tego podejścia nad metodami histologicznymi jest możliwość oznaczenia wzorca ekspresji >40 różnych markerów w jednej komórce w różnych fazach cyklu komórkowego. Podejście to pozwala również na wielowymiarową analizę korelacji ekspresji białek, która jest bardziej kwantyfikowalna niż metody histologiczne/obrazowe. Wadą tego protokołu jest to, że konieczne jest zawieszenie pojedynczych komórek, co powoduje utratę informacji o lokalizacji dostarczanej przez barwienie skrawków tkanki. Podejście to może również wymagać włączenia dodatkowych markerów w celu identyfikacji różnych typów komórek w surowych zawiesinach komórkowych. Zastosowanie tego protokołu jest widoczne w analizie modeli hiperplastycznych chorób skóry. Co więcej, protokół ten można dostosować do analizy określonego podtypu komórek (np. komórek macierzystych) poprzez dodanie przeciwciał specyficznych dla linii. Protokół ten można również dostosować do analizy komórek skóry u innych gatunków doświadczalnych.

Tabela 1 przedstawia oczekiwaną liczbę uzyskanych komórek oraz ich żywotność z ucha dorosłej myszy (Rysunek 1) i skóry noworodka w warunkach niepatologicznych. Tabela zawiera również reprezentatywne dane od zwierząt o mieszanym tle genetycznym C57/126. Przewiduje się, że skóra innych szczepów pozwoli uzyskać podobną liczbę komórek i stopień ich żywotności. Przybliżona wydajność zależy od powierzchni skóry i wskazuje, że skóra noworodka byłaby...

Ten protokół opisuje, jak izolować keratynocyty skóry od modeli mysich, barwić przeciwciałami znakowanymi metalem oraz analizować barwione komórki za pomocą cytometrii masowej w celu profilowania wzorca ekspresji interesujących białek w różnych fazach cyklu komórkowego.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Protokół ten jest istotny z dwóch głównych powodów. Po pierwsze, pozwala użytkownikowi określić stany cyklu komórkowego komórek skóry, które zostały wyizolowane z modelu zwierzęcego. Pozwala nam również analizować ekspresję białek w dyskretnych fazach cyklu komórkowego.W porównaniu z poprzednimi metodami określania proliferacji komórek, nasza metoda pozwala na bardziej precyzyjne określenie różnych faz cyklu komórkowego, a także możemy analizować ponad 40 różnych markerów na różnych etapach podziału komórki. To znacznie zwiększa zastosowanie i wszechstronność metody. Protokół ten może być stosowany w badaniach nad rakiem i w każdym innym rodzaju choroby, w której istnieje potrzeba określenia wzorców ekspresji białek specyficznych dla cyklu komórkowego.Ponadto protokół ten może być modyfikowany do innych typów komórek i innych organizmów modelowych. Pierwszy raz użytkownik powinien skupić się na uzyskaniu jak najlepszej jakości przygotowania komórek. Wymaga to terminowego przetworzenia eksperymentalnej skóry przy użyciu świeżych odczynników, minimalnego czasu trawienia tkanek i starannego usunięcia supernatantu po odwirowaniu w celu zachowania integralności i ilości komórek.Aby rozpocząć, zaprojektuj panel przeciwciał ze znacznikiem metalu, korzystając z bezpłatnego oprogramowania do projektowania paneli online, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie przygotuj roztwór podstawowy IdU, rozpuszczając proszek IdU w ilości 10 miligramów na mililitr w 0,1 normalnego wodorotlenku sodu w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po podaniu roztworu podstawowego IdU do probówek do mikrowirówek, zamrozić je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.Bezpośrednio przed użyciem należy dostosować pH roztworu IdU do 7,5 za pomocą 12 normalnych kwasów solnych i przeprowadzić próbę za pomocą paska pH na podwielokrotności odrzutu, aby upewnić się, że roztwór ma pH 7,5. Aby przygotować dwa x roztwór utrwalający paraformaldehyd, połącz pięć mililitrów 10 x PBS i jeden mililitr 16% PFA z 44 mililitrami czystej wody destylowanej o jakości molekularnej. Aby przygotować 100 milimolowy roztwór podstawowy cisplatyny, rozpuść 300,5 miligrama cisplatyny w proszku w 10 mililitrach DMSO.W przypadku eksperymentów, które mają być stosowane w ciągu jednego dnia, należy przygotować 10-milimolowy roztwór roboczy cisplatyny. Zważ myszy, a następnie określ dawkę na 0,1 miligrama IdU na gram masy ciała. Obliczoną dawkę IDU należy podać we wstrzyknięciu dootrzewnowym i odczekać dwie godziny przed pobraniem komórek.Użyj nożyczek chirurgicznych, aby chirurgicznie usunąć ucho umieszczonej po uśpieniu myszy, której wcześniej wstrzyknięto IdU u podstawy ucha. Umieść ucho na suchej 100-milimetrowej szalce Petriego. Ostrożnie oddziel skórę przednią od tylnej, używając cienkich kleszczy, aby utworzyć kieszeń pośrodku lub na krawędzi obszaru cięcia, a następnie rozsuń dwa płaty skóry i postępuj zarówno ze skórą przednią, jak i tylną.Ostrożnie umieścić przednią i tylną skórę jednego ucha w jednym dołku 12-dołkowej płytki hodowlanej, wypełnionej jednym mililitrem świeżo przygotowanego roztworu dyspazy/kolagenazy, tak aby strona skóry właściwej dotykała roztworu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby strawić skórę. Umieść strawione ucho lub skórę noworodka na czystej szalce Petriego tak, aby strona naskórka dotykała powierzchni naczynia.Za pomocą kleszczy spłaszcz skórę i delikatnie zsuń skórę właściwą z naskórka, pracując od środka do krawędzi w okrężny wzór. Za pomocą kleszczy chwyć naskórek za krawędzie i delikatnie go unieś, odklejając go od powierzchni szalki Petriego. Ostrożnie umieść naskórek na wstępnie podgrzanym roztworze do odrywania komórek w jednym dołku płytki.Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub 20 minut w temperaturze pokojowej. Użyj sterylnych kleszczy, aby chwycić naskórek i wyszoruj, przeciągając naskórek po dnie naczynia, aby zdysocjować komórki. Dodać jeden mililitr DMEM zawierającego 1% FBS i przepuścić przez sito komórkowe o wielkości 40 mikrometrów do probówki zbiorczej.Dobrze spłucz dodatkowymi dwoma mililitrami DMEM i dodaj do zawiesiny komórek. Po odwirowaniu w ilości 120 razy g przez pięć minut, ostrożnie zassać supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym do dwóch mililitrów DMEM zawierającym 1% FBS i ponownie zagnieździć ogniwa, tak jak poprzednio.Aby oznaczyć komórki w celu określenia żywych i martwych komórek, ponownie zawieś od jednego do trzech milionów komórek w jednym mililitrze DMEM zawierającym 25 mikromolowych cisplatyny i inkubuj przez jedną minutę. Ugasić przez pipetowanie z równą objętością FBS. Po odwirowaniu w ilości 120 razy g przez pięć minut, zdekantować supernatant do zlewki zawierającej rozcieńczony wybielacz i odwrócić probówki, aby odsączyć pozostały roztwór na ręcznik papierowy.Ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach PBS wolnego od kationów baru i ponownie je odwirować, jak opisano wcześniej. Aby utrwalić komórki, ponownie zawieś osad komórek w jednym mililitrze PBS wolnego od kationów baru. Wiruj komórki pod ciągłą niską mocą i dodaj kroplami jeden mililitr dwóch utrwalających PFA.Umieść na bujanej platformie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu w ilości 500 g przez pięć minut, ostrożnie zdekantować supernatant. Umyć komórki dwoma mililitrami PBS wolnego od kationu baru, ponownie odwirować w tych samych warunkach i powtórzyć etap mycia.Na koniec ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach PBS wolnego od kationów baru. Odwirować komórki w temperaturze 500 razy g przez pięć minut i ostrożnie zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze jednego buforu utrwalającego x i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut i powtórzyć wirowanie.Aby umyć komórki, dodaj jeden mililitr buforu do przepuszczalności kodów kreskowych. Podczas wirowania komórek w temperaturze 500 razy g przez pięć minut przygotuj kody kreskowe, dodając do nich 100 mikrolitrów buforu przepuszczalności kodów kreskowych i natychmiast wymieszaj. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 800 mikrolitrach bufora przepuszczalności kodów kreskowych.Dodaj roztwór kodu kreskowego do komórek, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wirować 500 razy g przez pięć minut. Umyj komórki w dwóch mililitrach buforu do barwienia komórek i ponownie odwiruj.Następnie ponownie zawieś od jednego do trzech milionów komórek w jednym mililitrze roztworu roboczego buforu do barwienia antygenów jądrowych i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po odwirowaniu w ilości 500 g przez pięć minut, ostrożnie zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu permeabilizacji barwienia antygenu jądrowego i ponownie odwirować.Po ponownym zawieszeniu i odwirowaniu, ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałej objętości z delikatnym wirowaniem. Dodaj 50 mikrolitrów wewnątrzkomórkowego koktajlu przeciwciał, wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Dodaj dwa mililitry buforu do barwienia komórek.Odwirować ponownie w tych samych warunkach, co w poprzednim kroku, i usunąć supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach buforu do barwienia komórek, odwirować przy 500 razy g przez pięć minut i powtórzyć ponowne zawieszanie i wirowanie. Ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze roztworu interkalacyjnego i przechowywać przez jeden do trzech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po ponownym odwirowaniu komórek przemyć osad dwoma mililitrami buforu do barwienia komórek, odwirować w tych samych warunkach i wykonać dwa dodatkowe płukania dwoma mililitrami wody, przy tym samym odwirowaniu. Zawiesić osad komórkowy w stężeniu miliona komórek na mililitr za pomocą rozcieńczonego roztworu kulek EQ, a następnie uruchomić próbki na cytometrze masowym. Określa się oczekiwaną wydajność i żywotność komórek z ucha dorosłej myszy i skóry noworodka.Przybliżona wydajność zależy od powierzchni skóry. Skóra noworodków jest lepszym wyborem w przypadku eksperymentów, które wymagają większej liczby komórek. Przedstawiono podstawową strategię bramkowania w celu wybrania nienaruszonych, pojedynczych i żywotnych komórek, po normalizacji i dekonwolucji danych cytometrii masowej z kodami kreskowymi.Odsetek komórek żywotnych może wskazywać na jakość lub stan komórek przed barwieniem. Wykazano również różnice w żywotności między hodowanymi komórkami raka a izolowanymi komórkami ucha myszy. Żywe komórki bramkowano na podstawie długości zdarzenia w porównaniu z CD45, aby wykluczyć komórki krwiotwórcze.Włączenie markerów liniowych pozwala na wybór interesujących populacji komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Podstawowy profil cyklu komórkowego uzyskuje się przez detekcję BrdU w stosunku do PI w fluorescencyjnej cytometrii przepływowej. Jednak włączenie innych markerów proliferacji do cytometrii masowej pozwala na bardziej precyzyjną identyfikację faz cyklu komórkowego.Zgodnie z tym podejściem profile cyklu komórkowego mogą być konstruowane dla różnych typów komórek lub warunków eksperymentalnych, takich jak profile dla komórek CD45 ujemnych i CD45 dodatnich z tego samego eksperymentu. W innym przykładzie analiza markerów, które definiują szlaki sygnałowe EGFR i mTOR PI3K w fazie G-one, ujawniła podobne profile ekspresji w komórkach CD45 ujemnych, pokazanych na pomarańczowo, i komórkach CD45-dodatnich, pokazanych na niebiesko. Cytometria masowa wymaga dużej ilości komórek wysokiej jakości.Jeśli użytkownik jest zainteresowany rzadką populacją komórek, może być potrzebna większa liczba komórek. Wyizolowane żywe komórki mogą być używane do analizy DNA lub RNA, badań biochemicznych lub mogą być używane w hodowli tkankowej przed utrwaleniem i barwieniem do cytometrii masowej. Podczas pracy z paraformaldehydem, kwasem solnym lub wodorotlenkiem sodu użytkownik powinien w razie potrzeby korzystać ze środków ochrony osobistej i szafy bezpieczeństwa.

isolation-staining-mouse-skin-keratinocytes-for-cell-cycle-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Karcynogeneza to proces obejmujący interakcje między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem nowotworu. Aby przeanalizować zdarzenia molekularne, należy wyizolować różne populacje komórek na różnych etapach rozwoju raka. Korzystając z mysiego modelu raka podstawnokomórkowego, opisujemy protokół analizy komórek podczas kancerogenezy.

Analizy populacji komórek podczas kancerogenezy skóry

Skóra jest domem dla złożonej sieci komórek odpornościowych. Opisujemy skuteczną metodologię trawienia skóry myszy z różnych części ciała zwierzęcia w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej i analizy różnych populacji leukocytów znajdujących się w skórze za pomocą cytometrii przepływowej.

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych do analizy cytofluorymetrycznej z różnych obszarów skóry myszy

Ten protokół opisuje enzymatyczne trawienie skóry myszy w pożywce bogatej w składniki odżywcze, a następnie separację gradientową w celu wyizolowania leukocytów.  Uzyskane w ten sposób ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań końcowych. Jest to skuteczna, ekonomiczna i ulepszona alternatywa dla maszyn do dysocjacji tkanek i ostrzejszych protokołów trawienia tkanek opartych na trypsynie i dyspazie.

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten artykuł opisuje pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy metodą cytometrii masowej.

Przygotowanie próbki do analizy cytometrii masowej

Ten raport opisuje protokół CUBIC do wyjaśniania pełnej grubości biopsji skóry myszy i wizualizacji wzorców ekspresji białek, proliferujących komórek i sebocytów w rozdzielczości pojedynczej komórki w 3D. Metoda ta umożliwia dokładną ocenę anatomii i patologii skóry oraz nieprawidłowych fenotypów naskórka w genetycznie zmodyfikowanych liniach myszy.

Protokół CUBIC wizualizuje ekspresję białek w rozdzielczości pojedynczej komórki w preparatach skórnych z całego montażu

Keratynocyty naskórka tworzą funkcjonalną barierę skórną i są umieszczone na pierwszej linii obrony gospodarza przed zewnętrznymi zniewagami środowiskowymi. W tym miejscu opisano metody izolacji i pierwotnej hodowli keratynocytów naskórka ze skóry noworodków i dorosłych myszy oraz indukcji różnicowania końcowego i odpowiedzi zapalnej wywołanej promieniowaniem UVB przez keratynocyty.

Izolacja i hodowla pierwotnych keratynocytów myszy ze skóry noworodków i dorosłych myszy

Celem tego protokołu jest wyizolowanie keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry dorosłych myszy do różnych dalszych zastosowań, takich jak biologia molekularna, biochemia, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i podstawowe zastosowania in vitro (np. keratynocyty klonogenne).

Izolacja keratynocytów naskórka myszy i ich klonogenna hodowla in vitro

Ekspansja klonalna jest kluczową cechą odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu. Jednak cykl komórkowy limfocytów T reagujących na antygen został słabo zbadany, częściowo z powodu ograniczeń technicznych. Opisujemy metodę cytometrii przepływowej do analizy klonalnie rozszerzających się limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu w śledzionie i węzłach chłonnych szczepionych myszy.

Test cytometrii przepływowej oparty na DNA/Ki67 do analizy cyklu komórkowego specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 u zaszczepionych myszy

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Poznaj izolację i barwienie keratynocytów skóry myszy do analizy ekspresji białek w cyklu komórkowym za pomocą cytometrii masowej. Metoda umożliwia precyzyjne określenie faz cyklu i analizę ponad 40 markerów.

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i barwienie keratynocytów skóry myszy do specyficznej dla cyklu komórkowego analizy ekspresji białek komórkowych za pomocą cytometrii masowej

Przeglądaj więcej filmów