Name: Zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3D w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną tomografię optyczną koherentną do monitorowania morfogenezy biofilmu na dużych skalach przestrzennych. To nieinwazyjne narzędzie umożliwia precyzyjne badanie struktur mikroorganizmów w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mauricio Aguirre Moralesowi za jego wkład w rozwój tego systemu. Wsparcie finansowe przyszło od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki dla T.J.B.

1. Konfiguracja urządzenia pozycjonującego
<ol>
	<li>Podłącz urządzenie pozycjonujące do płytki mikrokontrolera zgodnie z instrukcją pod adresem https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.</li>
	<li>Podłącz mikrokontroler do komputera jednopłytkowego z dostępem do internetu za pomocą kabla USB i zainstaluj serwer GRBL, jak opisano pod adresem https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Teraz urządzenie pozycjonujące powinno być możliwe do sterowania za pośrednictwem strony internetowej hostowanej pod adresem http://IP:5020/. Alternatywnie, urządzenie pozycjonujące można sterować za pomocą skryptu w języku Python, jak pokazano w pierwszej części przykładowego pliku ImagesAcquisition.ipynb (Supplementary File 2).</li>
</ol>
2. Konfiguracja OCT
<ol>
	<li>Zamocuj sondę OCT w urządzeniu pozycjonującym za pomocą kompatybilnego uchwytu typu gołąbki. W razie potrzeby załóż adapter zanurzeniowy na obiektyw.</li>
	<li>Umieść komputer i jednostkę bazową OCT na stanowisku obok eksperymentu (np. urządzeń mikroprzepływowych, komór przepływowych, flum, systemów filtracji). Upewnij się, że przewód optyczny (maksymalna długość ok. 1,8 m) może swobodnie się poruszać, jest wystarczająco długi, aby dosięgnąć wszystkich zamierzonych miejsc, oraz nie przeszkadza w układzie eksperymentalnym.</li>
	<li>Zainstaluj system OCT razem z dostępnym oprogramowaniem zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zainstaluj pakiety oprogramowania do automatycznego pozyskiwania skanów OCT, zgodnie z opisem pod adresem https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie obrazów
<ol>
	<li>Włącz system OCT i urządzenie pozycjonujące. Upewnij się, że urządzenie może się swobodnie poruszać.</li>
	<li>Otwórz plik config.json w edytorze tekstu. Edytuj plik config.json, aby dostosować domyślne parametry pozyskiwania obrazu (Tabela 2), takie jak współczynnik załamania (1,33 dla wody w 20 °C, 1,00 dla powietrza) oraz folder docelowy dla pozyskanych danych i metadanych.</li>
	<li>W pliku config.json zdefiniuj wielkość pola widzenia (FOV) oraz liczbę skanów A na skan B. 
	UWAGA: Te dwa parametry decydują o rozmiarze wokseli końcowego zestawu danych i wielkości pliku wyjściowego oraz powinny odpowiadać rozdzielczości optycznej sondy (rozmiar wokseli w kierunkach x-y nie powinien być mniejszy niż połowa rozdzielczości optycznej). Liczba skanów A i B wpływa na zakres przestrzenny do objęcia, co wiąże się z kompromisem między dostępną przestrzenią dyskową a mocą obliczeniową.</li>
	<li>W pliku config.json zdefiniuj granice sygnału wyjściowego skanu OCT. Zależą one od typu próbki. Zaleca się zatem ustalenie tych parametrów na podstawie histogramów intensywności serii wstępnych skanów. Zapisz zmiany w pliku config.json.</li>
	<li>Przesuń sondę OCT do interesującego obszaru. Skoncentruj obraz próbki i dostosuj długość ramienia odniesienia oraz intensywność źródła światła w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu. Powtórz tę procedurę dla kilku pozycji i zanotuj współrzędne. 
	UWAGA: Umożliwi to późniejsze automatyczne pozyskiwanie skanów OCT wokół tych punktów odniesienia. Należy pamiętać, że długość ramienia odniesienia oraz intensywność nie mogą być zmieniane w trakcie automatycznego pozyskiwania obrazu.</li>
	<li>Otwórz plik ImageAcquisition.ipynb (Plik uzupełniający 2) w Jupyter Notebook. Każda komórka zawiera kod realizujący określone zadania i może być uruchamiana osobno poprzez naciśnięcie Cell | Run lub Ctrl + Enter albo Shift + Enter.
	<ol>
		<li>Ustaw ścieżkę do wymaganych bibliotek oraz domyślne parametry konfiguracji. Alternatywnie, zdefiniuj nowy zestaw tymczasowych parametrów.</li>
		<li>Połącz się z urządzeniem pozycjonującym i zainicjuj system OCT.</li>
		<li>Wykalibruj urządzenie pozycjonujące (tj., wykonaj „homing”).</li>
		<li>Pozyskaj zestawy danych obejmujące obszary zainteresowania w trybie pojedynczego skanu lub w układzie mozaikowym, określając liczbę i nakładanie się sąsiednich płytek (np., 30%). 
		UWAGA: Pamięć jest alokowana przed rozpoczęciem skanowania, co optymalizuje wykorzystanie zasobów komputera. Dane są zapisywane w formacie 8-bitowym *.raw w celu oszczędzania miejsca na dysku, do folderu docelowego zdefiniowanego w pliku config.json, zgodnie z konwencją nazewnictwa opartą na znaczniku czasu i pozycji (tj. %Y%m%d_%H%M%S_&lt;position&gt;). Metadane, w tym ustawienia OCT i współrzędne, są zapisywane w tym samym folderze w pliku *.srm zgodnie z tą samą konwencją nazewnictwa. W zależności od ustawień, takich jak FOV i rozdzielczość, wielkość pliku może osiągnąć nawet 1,5 GB na jeden skan OCT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uniknąć przerwania pozyskiwania danych, upewnij się, że istnieje wystarczająca ilość wolnej przestrzeni na dysku lub stale przenoś zestawy danych OCT na zewnętrzne dyski twarde.</li>
</ol>
4. Korekcja i wyświetlanie obrazu
<ol>
	<li>Otwórz notatnik Jupyter ImageProcessing.ipynb (Supplementary File 1), aby zapoznać się z przykładowym przetwarzaniem obrazów OCT (korekcja zniekształceń, odejmowanie tła, obliczanie map wysokości, łączenie map wysokości).</li>
	<li>W razie potrzeby przyciąć skany OCT, aby wykluczyć fałszywe sygnały i ponownie ułożyć zestaw danych (biofilm powinien znajdować się nad substratem).</li>
	<li>Skoryguj aberrację sferyczną. Realizuje się to za pomocą algorytmu korekcyjnego, który wykorzystuje wysoce odbijającą się powierzchnię odniesienia o znanej płaskiej geometrii (np. dno kanału, substrat). Algorytm najpierw definiuje siatkę 20×20 pionowych linii równomiernie rozmieszczonych na płaszczyźnie xy skanu OCT. Następnie wybiera okrągłe obszary wokół każdego punktu i uśrednia intensywności sygnału wzdłuż profilu pionowego (Rysunek 2B). Profile pionowe są przetwarzane za pomocą zmodyfikowanego filtra Gaussa: 
	<img alt="Równanie funkcji Gaussa ω(x)=e^(1/2)(x/σ)^2 + C; wzór matematyczny; materiał edukacyjny." src="/files/ftp_upload/59356/59356eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie x to sygnał wejściowy, a σ to jego odchylenie standardowe, natomiast C jest wyznaczane tak, że: 
	<img alt="Równanie całkowe ∫ od -a do a z ω(x)dx=0, analiza funkcji symetrycznych, ilustracja wzoru." src="/files/ftp_upload/59356/59356eq2.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
	Powierzchnia odniesienia jest lokalizowana jako maksima lokalne w każdym z tych profili. Punkty błędnie zidentyfikowane są filtrowane na podstawie położeń ich sąsiadów w trzech wymiarach (Rysunek 2C). Ostatecznie dopasowuje się powierzchnię wielomianową 2go rzędu odzwierciedlającą zniekształcenia wprowadzone przez soczewkę skanującą, na podstawie tych punktów (Rysunek 2C). Dopasowaną powierzchnię wykorzystuje się następnie do przesunięcia każdego piksela w kierunku z, uzyskując w ten sposób spłaszczony obraz. Parametry tego algorytmu należy dostosować do charakterystyki skanu OCT.</li>
	<li>Skoryguj szum tła. Zidentyfikuj pusty obszar obrazu (zazwyczaj powyżej biofilmu) i użyj algorytmu korekcyjnego do odjęcia średniej intensywności tła od wartości intensywności obrazu, uzyskując ostateczny skorygowany obraz OCT (Rysunek 2D).</li>
	<li>Oblicz mapę wysokości na podstawie trójwymiarowego zestawu danych OCT. W tym kroku zdefiniuj powierzchnię odniesienia istotną dla danego eksperymentu (np. substrat) oraz odpowiedni próg intensywności. Następnie użyj algorytmu obliczania map wysokości, aby wyznaczyć grubość biofilmu dla każdej współrzędnej (x,y) maski binarnej i przypisać ją do nowej macierzy dwuwymiarowej (Rysunek 3A). Wartości grubości są następnie przypisywane do macierzy 2D o rozmiarze odpowiadającym oryginalnemu obrazowi w kierunkach x i y. Generowany jest obraz, w którym wysokość powierzchni jest przedstawiona jako wartość w skali szarości (Rysunek 3B).</li>
	<li>W przypadku, gdy wykonano kilka skanów OCT w układzie mozaikowym, zdefiniuj liczbę wierszy i kolumn oraz połącz odpowiednie mapy wysokości. Rysunek 5 przedstawia przykłady scalonych map wysokości, obejmujących szeroki zakres skal przestrzennych i rozdzielczości osiągalnych przy użyciu opisanego zestawu.</li>
</ol>

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature reviews. Microbiology. 14, 563(2016).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillation+characteristics+of+biofilm+streamers+in+turbulent+flowing+water+as+related+to+drag+and+pressure+drop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop.</a> Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+migratory+ripples+in+a+mixed+species+bacterial+biofilm+growing+in+turbulent+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow.</a> Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).</li>
<li>Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Natural+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).</li>
<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Microbiology. 14, 251-263 (2016).</li>
<li>Battin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+landscapes%3A+new+paths+to+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial landscapes: new paths to biofilm research.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).</li>
<li>Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+coherence+microscopy+for+the+in+situ+investigation+of+the+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm.</a> J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002(2016).</li>
<li>Wagner, M., Horn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+in+biofilm+research%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li>
<li>Haisch, C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+transient+processes+in+biofilms+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography.</a> Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).</li>
<li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+W+%22Optical+Coherence+Tomography%3A+Technology+and+Applications%22">Optical Coherence Tomography: Technology and Applications</a>. , Springer Verlag. (2008).</li>
<li>Fercher, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+%E2%80%93+development%2C+principles%2C+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Medizinische+Physik%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography – development, principles, applications.</a> Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).</li>
<li>Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+speed+spectral-domain+optical+coherence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy.</a> Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).</li>
<li>Fortunato, L., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+biofouling+assessment+in+spacer+filled+channels+using+optical+coherence+tomography+%28OCT%29%3A+3D+biofilm+thickness+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping.</a> Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
<li>Roche, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benthic+biofilm+controls+on+fine+particle+dynamics+in+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams.</a> Water Resources. 53, 222-236 (2016).</li>
<li>Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approach+to+characterize+fouling+on+a+flat+sheet+membrane+gravity+driven+submerged+membrane+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor.</a> Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).</li>
<li>Morgenroth, E., Milferstedt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+engineering%3A+linking+biofilm+development+at+different+length+and+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Environmental+Science+and+Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales.</a> Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).</li>
</ol>

Sebastian Schäfer jest zatrudniony w Thorlabs Inc.

Obrazowanie OCT dobrze nadaje się do rozpoznawania struktur w zakresie mikrometrów o polu widzenia kilku milimetrów kwadratowych. Jest to zatem potężne narzędzie do badań nad biofilmem10,18. Jednak OCT jest obecnie ograniczony do maksymalnego obszaru skanowania wynoszącego 100 - 256 mm2 , podczas gdy wzorce strukturalne biofilmu często przekraczają tę skalę przestrzenną19, zwłaszcza gdy zróżnicowanie morfologiczne jest napędzane...

Biofilmy są bardzo udaną adaptacją mikroorganizmów do stylu życia, a te powiązane z interfazami i zamknięte w matrycy społeczności mikroorganizmów dominują w życiu mikrobiologicznym w środowisku naturalnym i przemysłowym1,2. Tam biofilmy tworzą złożone architektury, takie jak wydłużone serpentyny3, ripples4 lub grzybopodobne czapki5 z ważnymi konsekwencjami dla wzrostu biofilmu, stabilności strukturalnej i odporności na stres6. Podczas gdy wiele na temat różnicowania strukturalnego biofilmu dowiedzieliśmy się z prac nad kulturami monogatunkowymi hodowanymi w miniaturowych komorach przepływowych, większość biofilmów to bardzo złożone zbiorowiska, często obejmujące członków wszystkich domen życia6. Docenianie tych złożonych biofilmów jako krajobrazów mikrobiologicznych7 oraz zrozumienie, w jaki sposób struktura i funkcja biofilmu oddziałują na siebie w złożonych społecznościach, jest zatem w czołówce badań nad biofilmem.
Mechanistyczne zrozumienie morfogenezy złożonych biofilmów w odpowiedzi na sygnały środowiskowe wymaga starannie zaprojektowanych eksperymentów w połączeniu z przestrzennie i czasowo rozwiązanymi obserwacjami struktury fizycznej biofilmu w odpowiednich skalach8. Jednak nieniszcząca obserwacja wzrostu biofilmu w systemach eksperymentalnych została poważnie ograniczona przez ograniczenia logistyczne, takie jak konieczność przenoszenia próbek (np. do mikroskopu), które często uszkadzały delikatną strukturę biofilmu.
Przedstawiony tutaj protokół wprowadza w pełni zautomatyzowany system oparty na optycznej koherentnej tomografii (OCT), który pozwala na in-situ, nieinwazyjne monitorowanie morfogenezy biofilmu w mezoskali (zakres mm). OCT to nowa technika obrazowania w badaniach nad biofilmem z zastosowaniami w badaniach nad uzdatnianiem wody i biofoulingiem, medicine9 i stream ecology10. W KTZ źródło światła o niskiej koherencji jest dzielone na próbkę i ramię odniesienia; Analizowana jest interferencja światła odbitego i rozproszonego przez biofilm (ramię próbki) oraz światło ramienia referencyjnego. Seria profili intensywności osiowej (A-skany), która zawiera informacje strukturalne o rozdzielczości głębokościowej, jest pozyskiwana i łączona w B-scan (przekrój poprzeczny). Seria sąsiadujących ze sobą B-skanów składa się na końcowy skan woluminu 3D10. OCT zapewnia boczną rozdzielczość optyczną w zakresie około 10 μm i dlatego dobrze nadaje się do badania mezoskopowego zróżnicowania strukturalnego biofilmów10,12. Bardziej szczegółowy opis OCT można znaleźć w artykułach Drexler i Fujimoto13oraz Fercher and associate14. Chociaż pole widzenia pojedynczego skanu xy OCT sięga nawet setek mikrometrów kwadratowych, wzorce na większą skalę nie mogą być określone ilościowo za pomocą OCT w jednym skanie. W odniesieniu do biofilmów w naturalnych siedliskach, takich jak strumienie i rzeki, ogranicza to obecnie naszą zdolność do oceny morfogenezy biofilmu w skali odpowiadającej fizycznemu i hydraulicznemu szablonowi siedliska.
Aby przekroczyć te limity przestrzenne i automatycznie uzyskać skany OCT, na 3-osiowym systemie pozycjonowania zamontowano sondę do obrazowania OCT w domenie spektralnej. Instalacja pozwala na akwizycję kilku skanów OCT w nakładającym się wzorze mozaiki (skan płytek), skutecznie uzyskując obrazowanie tomograficzne powierzchni do 100cm2. Co więcej, wysoka precyzja pozycjonowania tego systemu umożliwia niezawodne monitorowanie wzrostu i rozwoju cech biofilmu w określonych miejscach podczas długotrwałych eksperymentów. System jest modułowy, a poszczególne elementy (tj. urządzenie pozycjonujące i OCT) instalacji mogą być stosowane jako samodzielne rozwiązania lub elastycznie łączone. Rysunek 1 przedstawia przegląd komponentów sprzętowych i programowych instalacji.
System został przetestowany za pomocą dostępnego na rynku urządzenia do pozycjonowania CNC sterowanego przez GRBL (Tabela Materiałów). Odległości robocze tej specyficznej platformy pozycjonującej wynoszą 600×840×140 mm, z dokładnością wskazaną przez producenta +/- 0,05 mm i programowalną rozdzielczością 0,005 mm. GRBL to open-source (licencja GPLv3), wysokowydajne sterowanie ruchem dla urządzeń CNC. Dlatego każde urządzenie pozycjonujące oparte na GRBL (wersja > 1.1) powinno być zgodne z przedstawionymi tutaj wytycznymi i pakietami oprogramowania. Co więcej, oprogramowanie można dostosować do innych sterowników silników krokowych z typem wejścia STEP-DIR z niewielkimi modyfikacjami.
Urządzenie OCT używane do oceny wydajności systemu (Tabela Materiałów) posiada źródło światła o niskiej koherencji z centralną długością fali 930 nm (szerokość pasma = 160 nm) i regulowaną długością ramienia referencyjnego oraz intensywnością. W przedstawionym przykładzie zastosowano również adapter zanurzeniowy do zanurzania sondy OCT w płynącej wodzie (Tabela Materiałów). Opracowany tutaj pakiet oprogramowania do automatycznego pozyskiwania skanów OCT zależy krytycznie od SDK dostarczonego wraz z konkretnym systemem OCT, jednak systemy OCT tego samego producenta z różnymi soczewkami skanującymi i centralnymi długościami fal powinny być łatwo kompatybilne.
Urządzenie GRBL jest kontrolowane przez serwer WWW zainstalowany na komputerze jednopłytkowym (Rysunek 1). Zapewnia to zdalną kontrolę nad urządzeniem z dowolnego komputera z siecią lokalną lub dostępem do Internetu. Urządzenie OCT jest sterowane przez oddzielny komputer, co pozwala na działanie systemu OCT niezależnie od zautomatyzowanej konfiguracji eksperymentalnej. Wreszcie, pakiety oprogramowania zawierają biblioteki do synchronizacji pozycjonowania sondy OCT i akwizycji skanów OCT (tj. do automatycznego pozyskiwania zestawów danych obrazowania 3D w układzie mozaiki lub w zestawie zdefiniowanych pozycji).Zdefiniowanie położenia sondy OCT w 3D pozwala skutecznie dostosować płaszczyznę ogniskowej specjalnie dla (regionalnych) zestawów skanów. W szczególności na nierównych powierzchniach dla każdego skanowania OCT można określić różne płaszczyzny ogniskowe (tj. różne pozycje w kierunku z).
Zestaw pakietów oprogramowania został opracowany do przetwarzania surowych skanów OCT (Tabela 1). Nawigacja po urządzeniu pozycjonującym, akwizycja skanów OCT i przetwarzanie zestawów danych odbywa się za pomocą kodowanych w języku Python notebooków Jupyter, które zapewniają niezwykłą elastyczność w tworzeniu i optymalizacji oprogramowania. W https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git dostępne są dwa opracowane i opatrzone adnotacjami przykłady takich notatników (odpowiednio do pozyskiwania i przetwarzania obrazów) Mają one służyć jako punkty wyjścia do dostosowywania metody. Notes Jupyter to aplikacja oparta na przeglądarce internetowej, która zawiera komórki z adnotacjami w kodzie języka Python. Każdy krok jest zawarty w komórce notesu, którą można wykonać osobno. Ze względu na różną długość drogi światła przez soczewkę skanującą (aberracja sferyczna)15, surowe skany OCT wydają się zniekształcone (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Opracowaliśmy algorytm do automatycznej korekcji tego zniekształcenia w pozyskanych skanach OCT (zawartym w ImageProcessing.ipynb, Plik uzupełniający 1). Co więcej, morfologia biofilmu może być wizualizowana jako mapa wysokościowa 2D, jak to było wcześniej używane w systemach membranowych16, a my ilustrujemy, jak można zszyć mapy wysokości uzyskane ze skanów wykonanych w układzie kafelków.
Na koniec, funkcjonalność opisanej instalacji laboratoryjnej jest zilustrowana za pomocą eksperymentu z kanałem, w którym biofilm strumienia fototroficznego jest wystawiony na działanie gradientu prędkości przepływu.

<table><tbody><tr><td>Sonda OCT</td><td>Thorlabs</td><td>GAN210C1</td><td>Urządzenie do obrazowania</td></tr><tr><td>OCT Soczewka skanowania OCT</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>Adapter zanurzeniowy</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-IMM3-SP1</td><td></td></tr><tr><td>Stepcraft 840 CK</td><td>STEPCRAFT</td><td>NA mikrokontroler</td> urządzenia <td>pozycjonującego</td></tr><tr><td></td><td>Arduino Uno R3</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Komputer jednopłytkowy</td><td>Raspberry PI</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>kamera</td><td>Canon EOS 7D Mark II</td> NA obiektyw aparatu <td>Canon</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MACRO EFS 35 mm</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3d w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biofilmy są najbardziej udanym stylem życia mikroorganizmów i dominują w wielu środowiskach i środowiskach inżynieryjnych. Zrozumienie morfogenezy biofilmu, czyli strukturalnego zróżnicowania biofilmów podczas gromadzenia się społeczności, stanowi niezwykłe wyzwanie w skali przestrzennej i czasowej. W niniejszym artykule przedstawiamy zautomatyzowany system obrazowania biofilmu oparty na optycznej koherentnej tomografii (OCT). OCT to nowa technika obrazowania w badaniach nad biofilmem. Jednak ilość danych, które obecnie można pozyskać i przetworzyć, utrudnia statystyczne wnioskowanie o wielkoskalowych wzorcach morfologii biofilmu. Zautomatyzowany system obrazowania OCT pozwala na pokrycie dużych skal przestrzennych i rozszerzonych czasowo wzrostu biofilmu. Łączy w sobie dostępny na rynku system OCT z robotyczną platformą pozycjonowania i pakietem rozwiązań programowych do sterowania położeniem sondy skanującej OCT, a także akwizycji i przetwarzania zestawów danych obrazowania biofilmu 3D. Konfiguracja ta umożliwia automatyczne monitorowanie rozwoju biofilmu in situ i nieinwazyjne i może być dalej rozwijana w celu połączenia obrazowania OCT z makrofotografią i profilowaniem mikrosensorów.

Prezentujemy funkcjonalność zautomatyzowanego systemu obrazowania OCT za pomocą eksperymentu przepływowego zaprojektowanego w celu zbadania morfogenezy przestrzenno-czasowej fototroficznych biofilmów strumieniowych. Stopniowe zwężenie geometrii kanałów spowodowało powstanie gradientów prędkości przepływu wzdłuż środka kanału (zobacz odniesienie17). Rozwój biofilmu w czasie oraz jego różnicowanie strukturalne monitorowano przez 18 dni, w celu lepszego zrozumienia wpływu warunków hydrodynamicznych na ...

Biofilmy mikrobiologiczne tworzą złożone architektury na skrzyżowaniach i rozwijają się w wysoce zależne od skali wzorce przestrzenne. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalny system (sprzętowy i programowy) do automatycznego pozyskiwania zestawów danych optycznej tomografii koherentnej (OCT) 3D. Ten zestaw narzędzi pozwala na nieinwazyjną i wieloskalową charakterystykę morfogenezy biofilmu w przestrzeni i czasie.

Zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3D w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Poniżej przedstawiamy zautomatyzowany system oparty na optycznej koherentnej tomografii lub OCT. Dzięki temu możemy monitorować strukturę biofilmów w dużych skalach przestrzennych lub w dłuższych okresach czasu. Obrazowanie OCT dobrze nadaje się do rozpoznawania struktur w zakresie mikrometrów, jednak obecnie jest ograniczone do maksymalnego obszaru około 250 milimetrów kwadratowych.Biofilmy często przekraczają tę skalę, zwłaszcza gdy zróżnicowanie jest napędzane przez gradienty środowiskowe na dużą skalę. Konfiguracja eksperymentalna pozwala nam monitorować trójwymiarową morfogenezę biofilmów w dużych skalach przestrzennych i długich okresach czasu. System jest szybki, precyzyjny i działa autonomicznie.Badaliśmy morfogenezę biofilmów w strumieniach, w których napędzają one ważne procesy ekosystemowe. System może być jednak wykorzystywany do badania biofilmów w innych systemach naturalnych lub środowiskach inżynieryjnych. Oprogramowanie do pozycjonowania, akwizycji i analizy obrazu jest napisane w języku Python.Są one dostępne za pośrednictwem notesów Jupyter Notebooks. Są to rozwiązania przyjazne dla użytkownika, ogólnodostępne i elastyczne. Wierzymy, że wizualna reprezentacja instalacji pomaga innym użytkownikom odtworzyć instalację i lepiej zrozumieć oprogramowanie.Mamy nadzieję, że zainspiruje to innych badaczy do przyjęcia podobnych podejść. Oto przegląd instalacji. System składa się z precyzyjnego urządzenia pozycjonującego, sondy OCT i jest zamontowany wokół kanału z pleksiglasu.Zacznij od okablowania urządzenia pozycjonującego, postępując zgodnie z instrukcjami opublikowanymi na GitHub. Po nawiązaniu połączenia zainstaluj serwer GRBL zgodnie z opisem na osobnej stronie GitLab. System pozycjonowania może być teraz sterowany za pośrednictwem tej strony internetowej; alternatywnie można go kontrolować za pomocą skryptu Pythona, jak pokazano w działającym przykładzie.Umieść komputer i jednostkę bazową OCT na stole obok zestawu eksperymentalnego zawierającego urządzenia mikroprzepływowe, komory przepływowe, kanały lub systemy filtracji. Jeśli system OCT nie jest jeszcze zainstalowany, zainstaluj go wraz z dostępnym oprogramowaniem zgodnie z opisem producenta. Następnie zainstaluj pakiety oprogramowania do automatycznego pozyskiwania skanów OCT zgodnie z opisem w dokumentach GitLab, do których link znajduje się tutaj.Aby rozpocząć akwizycję obrazu, zamontuj sondę optycznej koherentnej tomografii do urządzenia pozycjonującego za pomocą kompatybilnego uchwytu na jaskółczy ogon. W razie potrzeby zainstaluj adapter zanurzeniowy na soczewce obiektywu, a następnie włącz system OCT i urządzenie pozycjonujące. Otwórz komercyjne oprogramowanie OCT, zlokalizuj interesujące Cię miejsce, skoncentruj się na próbce i dostosuj ramię referencyjne oraz intensywność źródła światła, aby uzyskać optymalną jakość obrazu.Zanotuj współrzędne i powtórz tę procedurę dla wielu pozycji, zachowując tę samą długość ramienia odniesienia i intensywność. Otwórz plik ImageAcquisition. ipynb znajduje się w pliku uzupełniającym 2 tego artykułu w Jupyter Notebook.Każda komórka zawiera kod do wykonywania określonych zadań i może być uruchamiana osobno, naciskając Komórka, a następnie Uruchom lub Control i Enter lub Shift i Enter. Postępuj zgodnie z działającym przykładem, aby ustawić ścieżkę do wymaganych bibliotek w celu podłączenia urządzenia pozycjonującego w celu skalibrowania urządzenia pozycjonującego w celu zainicjowania skanera OCT. Następnie dostosuj parametry akwizycji, w tym współczynnik załamania światła, wielkość pola widzenia i liczbę skanów A na skan B.Ponadto ustaw granice sygnału skanowania OCT w oparciu o histogramy intensywności wstępnych skanów i folder docelowy dla pozyskanych danych i metadanych. W zależności od pola widzenia i rozdzielczości rozmiar pliku może sięgać nawet 1,5 gigabajta na skan OCT. Te dwa parametry określają rozmiar wokseli w końcowym zestawie danych oraz rozmiar pliku wyjściowego.Powinny one pasować do rozdzielczości optycznej sondy OCT. Jak podkreślono w roboczym przykładzie, możesz uzyskać pojedynczy skan OCT z parametrami domyślnymi lub uzyskać pojedynczy skan określający inny zestaw parametrów. Możesz również podać określone współrzędne, aby przesunąć urządzenie pozycjonujące i uzyskać pojedynczy skan OCT.Ta funkcja pozwala na wielokrotny powrót do dokładnie tej samej pozycji w eksperymencie z dużą dokładnością przestrzenną. Dane są zapisywane w formacie 8bit. Format RAW, aby zaoszczędzić miejsce na dysku.Metadane, w tym ustawienia i współrzędne OCT, są zapisywane w tym samym folderze w pliku json z tą samą konwencją nazewnictwa. Alternatywnie określ listę interesujących pozycji i automatycznie uzyskaj odpowiednie skany OCT. Aby scharakteryzować struktury morfologiczne biofilmu w dużych gradientach środowiskowych, należy pobrać skany w postaci mozaiki.W tym celu określ liczbę sąsiednich kafelków z domyślnym nakładaniem się 30%Surowe skany OCT są zniekształcone. Wynika to z różnic w długości drogi przez układ optyczny. Opracowaliśmy algorytm, który koryguje to zniekształcenie, jak pokazano w opracowanych przykładach.Aby rozpocząć korekcję obrazu, otwórz notes Jupyter ImageProcessing.ipynb. Podążając za tym przykładem, najpierw przytnij skany OCT, aby wykluczyć fałszywe sygnały i zmienić orientację zestawu danych tak, aby biofilm pojawił się nad podłożem. Następnie popraw aberrację sferyczną.Aby to osiągnąć, algorytm lokalizuje wysoce odblaskową płaską powierzchnię w skanie OCT i wykorzystuje ją jako odniesienie do spłaszczenia skanów. Na siatce 20 na 20 algorytm identyfikuje lokalne maksima intensywności sygnału, aby zlokalizować powierzchnię odniesienia. Następnie w poprzek tych punktów dopasowywana jest powierzchnia wielomianu drugiego rzędu i służy do przesunięcia każdego piksela skanu OCT w kierunku Z.Parametry tego algorytmu powinny być dostosowane do charakterystyki skanowania OCT. Ta korekcja umożliwia uzyskanie jednorodnej powierzchni odniesienia na wielu obrazach, a tym samym ułatwia łączenie obrazów o dużej skali. Po spłaszczeniu obrazu obrazy są korygowane pod kątem szumu tła poprzez zidentyfikowanie pustego obszaru obrazu nad biofilmem i odjęcie średniej intensywności tła.Następnie oblicz mapę wysokości na podstawie zestawu danych 3D OCT. W tym celu należy zdefiniować powierzchnię odniesienia, taką jak podłoże, i wybrać odpowiedni próg natężenia. Następnie renderowana jest mapa wysokości z wysokością biofilmu podawaną jako wartość w skali szarości.Jeśli obrazy zostały uzyskane w formie mozaiki, zszyj odpowiednie mapy wysokości, stosując algorytm łączenia. Korzystając z automatycznego obrazowania OCT, zbadano czasoprzestrzenną morfogenezę biofilmów strumienia fototroficznego za pomocą eksperymentów z kanałami. Koryta wykonane są z pleksi i stopniowo rozszerzają się od wlotu do odpływu.Powoduje to gradient prędkości przepływu. Oto mapa wysokości biofilmu rosnącego wzdłuż całego gradientu prędkości przepływu. Co ważne, zautomatyzowany system obrazowania OCT umożliwia ciągły pomiar parametrów strukturalnych, takich jak grubość biofilmu, chropowatość i bioobjętość, w różnych warunkach przepływu, od niskiej prędkości przepływu do warunków wysokiej prędkości przepływu.Wraz ze zmianami morfologicznymi średnia bioobjętość znacznie się zmniejszyła w funkcji odległości od wlotu w korycie. Jakość skanów OCT zależy krytycznie od długości ramienia referencyjnego i odległości ogniskowania. Podczas eksperymentów może być konieczne ponowne dostosowanie tego parametru.Aby zapewnić dokładność urządzenia pozycjonującego, należy pamiętać o regularnym wykonywaniu operacji naprowadzania. To zautomatyzowane urządzenie do obrazowania można łatwo połączyć z profilowaniem mikrosensorycznym w celu funkcjonalnej charakterystyki biofilmów. OCT jest nową techniką obrazowania i przewidujemy, że prezentowany tutaj system będzie stymulował badania nad strukturą biofilmu.Może to mieć znaczenie dla technologii takich jak uzdatnianie wody pitnej lub bioprocesowanie.

automated-3d-optical-coherence-tomography-to-elucidate-biofilm

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Huang, Y. et. al., Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej tomografii koherentnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie koherencji optycznej tomografia (OCT) do monitorowania sferoid guza w płytce wielodołkowej poprzez przechwytywanie obrazów przekroju poprzecznego o wysokiej rozdzielczości. Analizując odbicia światła od struktur komórkowych, OCT konstruuje modele 3D w celu oceny cech morfologicznych,...

Monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii 

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Ten artykuł pokazuje oryginalną metodologię opartą na zdalnym uruchamianiu cząstek magnetycznych osadzonych w biofilmie bakteryjnym oraz rozwoju dedykowanych pęset magnetycznych do pomiaru in situ lokalnych właściwości mechanicznych złożonego żywego materiału zbudowanego przez mikroorganizmy na granicy faz.

Zdalne uruchamianie magnetyczne sond mikrometrycznych do mapowania 3D in situ właściwości fizycznych biofilmu bakteryjnego

Celem tego artykułu jest opisanie użycia systemu mikroprzepływowego do tworzenia wielogatunkowych biofilmów, które zawierają gatunki typowo identyfikowane w ludzkiej naddziąsłowej płytce nazębnej. Podkreślono metody opisu architektury biofilmu, żywotności biofilmu oraz podejścia do zbierania biofilmu do analiz zależnych od kultury lub niezależnych od kultury.

Zastosowanie wysokowydajnego systemu mikroprzepływowego in vitro do tworzenia wielogatunkowych biofilmów w jamie ustnej

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Ten artykuł podkreśla skuteczność techniki optycznej elastografii koherentnej (OCE) w szybkim i nieniszczącym charakteryzowaniu elastycznych właściwości biofilmu. Wyjaśniamy krytyczne procedury wdrażania OCE w celu uzyskania dokładnych pomiarów i przedstawiamy wartości modułu Younga dla dwóch ziarnistych biofilmów.

Kwantyfikacja właściwości elastycznych biofilmów środowiskowych za pomocą optycznej elastografii koherentnej

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Poznaj zautomatyzowaną tomografię optyczną koherentną do monitorowania morfogenezy biofilmu na dużych skalach przestrzennych. To nieinwazyjne narzędzie umożliwia precyzyjne badanie struktur mikroorganizmów w czasie.

Zautomatyzowana optyczna tomografia koherentna 3D w celu wyjaśnienia morfogenezy biofilmu w dużych skalach przestrzennych

Przeglądaj więcej filmów