Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Indukcja pochodnych somitów z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jest kluczowym krokiem w wykorzystaniu pluripotencjalnych komórek macierzystych do terapii regeneracyjnej lub badań nad chorobami. Technika ta może być stosowana do różnicowania ludzkich komórek iPS na pochodne somitu, takie jak komórki miotomowe, dermatomowe, sklerotomowe i syndetomiczne w określonych chemicznie warunkach. Wykorzystując iPSC uzyskane od pacjenta cierpiącego na trudne do opanowania zaburzenie układu mięśniowo-szkieletowego, metoda ta może być wykorzystana do modelowania fenotypu choroby i testowania nowych terapii lekowych.

Metoda ta może być również zastosowana do pogłębienia naszego zrozumienia biologii i mechanizmów leżących u podstaw rozwoju mezodermy przyosiowej podczas embriogenezy człowieka. Cztery dni przed rozpoczęciem indukcji mezodermy presomitycznej pokryj 10-centymetrowe naczynie czterema mililitrami roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej do całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka zastąp roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej ośmioma mililitrami pożywki do hodowli komórkowych bez karmnika.

Aby rozpocząć hodowlę bez karmienia, umyj ludzką kulturę iPSC PBS i dodaj jeden mililitr roztworu CTK do naczynia hodowlanego. Kiedy komórki zaczną odłączać się od dna naczynia, umyj kulturę dwa razy świeżym PBS, aby całkowicie usunąć wszystkie komórki zasilające SNL przed dodaniem jednego mililitra pożywki do hodowli komórkowej bez podajnika do naczynia. Użyj skrobaka do komórek, aby ręcznie odłączyć komórki macierzyste i przenieść je do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Delikatnie odpipetować roztwór komórkowy trzy razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i przenieść komórki do naczynia hodowlanego pokrytego macierzą zewnątrzkomórkową. Następnie umieść komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na trzy dni. Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę do hodowli komórkowej bez karmienia ośmioma mililitrami pożywki do indukcji mezodermy presomitycznej i zainicjuj różnicowanie mezodermy presomitycznej w inkubatorze hodowli komórkowej przez następne cztery dni, zmieniając pożywkę w trzecim dniu.

Pod koniec inkubacji wyizolować dodatnie komórki białka delta 1 za pomocą cytometrii przepływowej i zebrać posortowane komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki do indukcji mezodermy somitycznej w celu liczenia i wysiewać jedną razy 10 do piątej komórki do każdej studzienki 12-dołkowej płytki pokrytej roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej zawierającej jeden mililitr pożywki do indukcji mezodermy somitycznej uzupełnionej 10 mikromolami kinazy rho lub inhibitora ROCK Y-27632. Następnie należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowej na kolejne cztery dni, zmieniając pożywkę niezawierającą inhibitora w pierwszym i trzecim dniu hodowli.

W celu różnicowania syndetomii z komórek sklerotomizmu, umyj komórki sklerotomu PBS przed odłączeniem komórek 0,2 mililitra odczynnika dysocjacji komórek na studzienkę. Po trzech minutach w temperaturze pokojowej dodaj 0,8 mililitra chemicznie zdefiniowanej pożywki podstawowej do każdej studzienki i odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki do indukcji syndetomii do liczenia.

Wysiewaj pięć razy po 10 do czwartej komórki do każdej studzienki 24-dołkowej płytki pokrytej macierzą zewnątrzkomórkową pokrytej roztworem, zawierającej jeden mililitr pożywki do indukcji syndetomii i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na trzy dni. W trzecim dniu indukcji syndetomii należy zastąpić pożywkę drugą pożywką do indukcji syndetomii i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 18 dni, zmieniając pożywkę co trzy dni. Po różnicowaniu mezodermy presomitycznej ponad 85% komórek jest dodatnich dla białka podobnego do delta 1, markera mezodermy presomatowej, ale ujemnych dla PAX3, markera mezodermy somidowej.

Populacja ta staje się PAX3-dodatnimi komórkami mezorynki somitycznej po czterech dniach indukcji mezodermy somitycznej. Co więcej, barwienie kadheryny-11, markera nabłonkowej mezodermy somitycznej, gromadzi się tylko na połączeniach międzykomórkowych, po dodaniu CHIR99021. Różnicowanie w kierunku dermomyotomii, miotomu, dermatomu, sklerotomu i syndetomii można ocenić za pomocą immunocytochemii i fluorescencji PAX3.

Podobnie jak ludzkie fibroblasty skóry, komórki dermatomowe pochodzące z iPSC wytwarzają kolagen i kwas hialuronowy, zgodnie z oceną ELISA. Aby wykazać porównywalną reaktywność ludzkiego syndetomu pochodzącego z iPSC i ludzkich dorosłych tenocytów, można przeprowadzić test mechanicznej stymulacji rozciągania. Przed pasażowaniem iPSC upewnij się, że zbieg kultur wynosi od 70 do 80%, a podzielone komórki odpowiednio w stosunku jeden do dwóch do jednego.

To pasażowanie ma kluczowe znaczenie dla skutecznego różnicowania iPSC. W przypadku przyszłych terapii komórkowych wykorzystujących tę metodę konieczne jest ustanowienie nowego stanu wolnego od zarazków, który nie zawiera żadnych składników pochodzących od zwierząt innych niż ludzie.