Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia
8 kwietnia 2019
Szczegółowa instrukcja jest opisana, jak zbudować mikroskop HIST (o dużym nachyleniu) i jego zastosowanie do obrazowania pojedynczych molekuł.
Nasza metoda pozwala nam na wizualizację pojedynczych cząsteczek o 40-krotnie większym obszarze obrazu niż konwencjonalne metody i ma znacznie zmniejszony sygnał tła. W przeciwieństwie do innych technik, nasze podejście wykorzystuje pojedynczą soczewkę obiektywową, nie wymaga specjalnej komory na próbkę i jest łatwo kompatybilne z dostępnymi na rynku systemami mikroskopowymi. Po zebraniu niezbędnych komponentów przystąp za budowę systemu.
Tutaj kilka elementów jest już na swoim miejscu na ławce. Na aluminiowym bloku zamontowany jest korpus mikroskopu ze stolikiem piezoelektrycznym i uchwytem na próbkę. Na ławce znajdują się również trzy lasery i elementy optyczne do łączenia wiązek.
Połączone wiązki są sprzężone ze światłowodem jednomodowym tak wydajnie, jak to możliwe. Ostatnim krokiem wstępnym jest montaż skolimowanego źródła światła w systemie klatek. Ma tymczasowe spójne źródło światła podłączone do światłowodu jednomodowego, adaptera światłowodowego, soczewki achromatycznej i przysłony.
Rozpocznij pracę ze ścieżką wykrywania. Najpierw umieść skolimowane źródło światła w porcie obiektywu korpusu mikroskopu. Wyreguluj lustro pod obiektywami tak, aby wiązka wyjściowa była mniej więcej pozioma i wyrównana z otworami ławki.
Wstaw lustro dichroiczne w ścieżce wiązki i odbij wiązkę o 90 stopni. Dodaj lustra, aby umożliwić dostosowanie ścieżki przesyłanej wiązki do kamery sCMOS. Użyj lusterek, aby upewnić się, że wiązka uderza w środek chipa.
Następnie włóż 300-mililitrowy tubus o ogniskowej mniej więcej o ogniskowej aparatu. Usuń skolimowane źródło światła z korpusu mikroskopu. Następnie wyreguluj położenie soczewki tubusu, aby ustawić jej płaszczyznę ogniskową.
Zatrzymaj regulację, gdy kamera wyraźnie rozpozna wzór na suficie. Ścieżka detekcji jest przedstawiona na tym schemacie. Zwróć uwagę na dodanie wielopasmowego filtra przepustowego przed soczewką tubusu do wielokolorowego obrazowania fluorescencyjnego.
Wróć do korpusu mikroskopu. Tam ponownie zainstaluj skolimowane źródło światła w uchwycie obiektywu. Po lustrze dichroicznym umieść składane lustro na drodze odbitej wiązki, aby przekierować ją o 90 stopni.
Wyjmij skolimowane źródło światła z korpusu mikroskopu i umieść je w pobliżu. Następnie włóż obiektyw o ogniskowej 400 milimetrów w odległości około ogniskowej od lustra. W korpusie mikroskopu zainstaluj soczewkę obiektywu.
Następnie wyreguluj położenie lustra wzdłuż osi optycznej. Obserwuj sufit nad celem i zatrzymaj się, gdy uformuje się tam idealny wzór dysku Airy. Teraz zdejmij obiektyw i ponownie zainstaluj skolimowane źródło światła z otwartą przysłoną.
Określ, w którym miejscu na ścieżce wiązki wiązka jest najmniejsza w odległości około 400 milimetrów od lustra. Po zidentyfikowaniu punktu zamontuj tam lustro, sprzężoną płaszczyznę obrazu. Stan instalacji w tym momencie pojawia się na tym schemacie.
Właśnie dodane lustro jest oznaczone jako M5. Włóż kolejne lustro, aby odbić wiązkę pod kątem 90 stopni i zamontuj za nim obiektyw o ogniskowej 150 milimetrów. Obiektyw powinien znajdować się 150 milimetrów od sprzężonej płaszczyzny obrazu. Następnie tymczasowo usuń pierwszą soczewkę na ścieżce wiązki wzbudzenia.
Dzięki tej konfiguracji znajdź pozycję ogniskową drugiego obiektywu. Umieść jednoosiowe lustro galvo w tym punkcie ogniskowym jako sprzężoną tylną płaszczyznę ogniskową. Podłącz zero woltów do lustra galvo i obróć jego uchwyt tak, aby odbijał wiązkę o 90 stopni.
Następnie wzdłuż ścieżki wiązki umieść składane lustro, które odbija wiązkę pod kątem 90 stopni. Umieść soczewkę 100 milimetrów wzdłuż ścieżki wiązki od sprzężonej tylnej płaszczyzny ogniskowej. Ponownie wyjmij skolimowane źródło światła z mocowania mikroskopu.
Dodaj kolejną 100-milimetrową soczewkę kolimacyjną z adapterem światłowodowym i światłowodem jednomodowym wraz z przysłoną. Następnie użyj tęczówki, światłowodu i soczewki, aby wysłać skolimowaną wiązkę przez system obrazowania. Następnie włóż cylindryczną soczewkę o ogniskowej 400 milimetrów tuż przed ostatnią soczewką kolimacyjną na ścieżce wiązki.
Użyj go, aby ustawić ostrość wiązki. Włóż 50-milimetrową soczewkę cylindryczną 450 milimetrów przed pierwszą. Jest to schematyczne przedstawienie ostatecznej konfiguracji ze ścieżkami detekcji i wzbudzenia.
Wyjście trzech laserów jest sprzężone ze ścieżką za pomocą światłowodu jednomodowego. Do badań przygotuj próbkę hydrożelu 3D. Ten składa się z 20-nanometrowych szkarłatnych kulek zmieszanych z hydrożelem.
Po ustawieniu umieścić próbkę hydrożelu w uchwycie na próbkę. Aby wzbudzić próbkę, włącz laser 638 nm i dostosuj jego moc do mniej niż jednego miliwata. Skonfiguruj oprogramowanie sterujące kamerą w trybie wewnętrznego wyzwalania i przechwytuj wideo.
W tym momencie silnik galvo ma przyłożone zero woltów. Ustaw aparat tak, aby obraz znajdował się na środku obiektywu. Następnie wyreguluj lustro, które jest sprzężoną płaszczyzną obrazu.
Obróć poziome pokrętło na lustrze, aby uzyskać mocno nachylone oświetlenie. Zapisz obraz płytki, tak jak na przykładowym obrazie fluorescencji hydrożelu 3D z 20-nanometrowymi kulkami. Podziałka wynosi 20 mikrometrów.
Kontynuuj po skonfigurowaniu sprzętu i oprogramowania, aby zamiatać lustro galvo. To jest oprogramowanie do zamiatania luster galvo do konfiguracji. Uporządkuj obrazowanie w pełnym polu widzenia, ustawiając Vmin na minus 500 miliwoltów.
Następnie ustaw Vmax na 500 miliwoltów. Następnie przełącz się na oprogramowanie do akwizycji kamery. W trybie wyzwalania wybierz opcję Zewnętrzne.
W menu rozwijanym LightScan PLUS wybierz opcję W dół Następnie kliknij opcję Scan Speed Control (Kontrola prędkości skanowania). Można teraz ustawić niektóre parametry sterowania. W polu Wysokość okna wprowadź 180 wierszy.
W polu Ekspozycja wprowadź wartość 28 milisekund. Po zakończeniu wróć do oprogramowania sterującego lusterkiem. W oprogramowaniu do sterowania lustrem włącz stosy 3D. Określ liczbę stosów i rozmiar kroku.
Kliknij opcję Nagraj wideo, aby rozpocząć nagrywanie obrazów. Jest to przykład obrazowania Epi jednoniciowego znakowanego DNA. W przeciwieństwie do tego, technika mocno nachylonych zamiatanych płytek wytworzyła ten obraz.
Obraz HIST pokazuje mniej tła w porównaniu z obrazem Epi. DNA znajduje się w hydrożelu 3D, a długość fali wzbudzenia wynosi 638 nanometrów. Oto obraz Epi oznaczonego eukariotycznego czynnika wydłużenia translacji 2.
Obraz HIST ma poprawiony stosunek sygnału do tła. Ma również bardziej równomierne oświetlenie. Oba mają taką samą moc oświetlenia wynoszącą 7,5 miliwata.
Obie prędkości obrazowania wynosiły 2,5 klatki na sekundę. Ważne jest, aby stale utrzymywać duży kąt nachylenia i synchronizować zamiatanie lustra z odczytem z kamery. Gwarantuje to wysoki stosunek sygnału do tła podczas akwizycji obrazu.
Spodziewamy się, że mikroskopia HIST przyniesie korzyści w kilku zastosowaniach, w tym obrazowaniu w superrozdzielczości na głębszych głębokościach obrazowania i wysokoprzepustowemu profilowaniu ekspresji genów w grubych warstwach tkanki.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje konstrukcję i zastosowanie mikroskopu z silnie nachylonym płytkowym elementem przesuniętym (HIST) do obrazowania pojedynczych cząsteczek. Metoda ta zwiększa możliwości wizualizacji dzięki większemu obszarowi obrazowania oraz zredukowanemu szumowi tła w porównaniu z konwencjonalnymi technikami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia
- Obrazowanie pojedynczych cząsteczek
- Inżynieria optyczna
Wstęp
- Mikroskop HIST wykorzystuje pojedynczy obiektyw.
- Jest on kompatybilny z komercyjnymi systemami mikroskopowymi.
- System ten znacząco zwiększa obszar obrazowania i redukuje sygnały tła.
- Konwencjonalne metody często wymagają złożonych konfiguracji i specjalistycznych komór.
Cel badania
- Aby zapewnić szczegółowy przewodnik po konstrukcji mikroskopu HIST.
- Aby zademonstrować jego skuteczność w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek.
- Aby podkreślić zalety w stosunku do tradycyjnych technik obrazowania.
Zastosowane metody
- Montaż komponentów optycznych, w tym laserów i soczewek.
- Regulacja luster i soczewek w celu optymalnego wyrównania wiązki.
- Wykorzystanie lustra galwanometrycznego do skanowania i rejestrowania obrazów.
- Testowanie z wykorzystaniem trójwymiarowej próbki hydrożelu zawierającej koraliki fluorescencyjne.
Główne wyniki
- Mikroskop HIST pozwolił na uzyskanie 40 razy większego pola obrazowania.
- Wykazano redukcję szumu tła w obrazowaniu.
- Pomyślnie zarejestrowano wysokiej jakości obrazy pojedynczych cząsteczek.
- Przedstawiono przejrzyste porównanie z konwencjonalnymi technikami obrazowania.
Wnioski
- Mikroskop HIST jest cennym narzędziem dla badaczy zajmujących się obrazowaniem pojedynczych cząsteczek.
- Jego konstrukcja upraszcza proces konfiguracji, jednocześnie zwiększając możliwości obrazowania.
- Metodę tę można łatwo zintegrować z istniejącymi systemami mikroskopowymi.
Często zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Mikroskopia z wysoko nachylonym zmiecionym kafelkiem (HIST) rozwiązuje krytyczny problem w obrazowaniu pojedynczych cząsteczek: osiągnięcie dużego pola widzenia przy wysokim stosunku sygnału do tła w grubych próbkach biologicznych. Dzięki umożliwieniu 40-krotnie większego obszaru obrazowania i równomiernemu oświetleniu bez konieczności stosowania specjalistycznych komór, HIST wspiera skalowalną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w biologii odkrywczej. Kompatybilność tej metody z systemami komercyjnymi obniża bariery wdrożeniowe dla działów R&D przedsiębiorstw dążących do uzyskania pewności prognostycznej w zakresie angażowania celów molekularnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację dynamiki pojedynczych cząsteczek w 3D w środowiskach zbliżonych do naturalnych.
- Wartość operacyjna: Redukuje szum tła, zwiększając pewność odczytów dotyczących angażowania celu oraz wyjaśniania szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe, wysokokontrastowe obrazowanie oddziaływań molekularnych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne odczyty fluorescencji do opracowywania testów w modelach z grubą warstwą komórek lub modelach tkankowych.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z kamerami sCMOS i skanowaniem galwanometrycznym umożliwia przygotowanie do wysokoprzepustowych przesiewów.
- Skalowalność: Duże pole widzenia pozwala na multipleksową analizę celów na jednym obrazie, co zwiększa wydajność testu i gęstość danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając spójne monitorowanie pojedynczych cząsteczek w różnych skalach, od komórek po skrawki tkanek.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Jednorodne oświetlenie i zredukowane tło poprawiają niezawodność dopasowania biomarkerów oraz badań nad modulacją celu.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wysoki stosunek sygnału do tła wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o solidne fenotypowanie molekularne w złożonych modelach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Mikroskopia HIST wpisuje się w kontinuum odkryć, począwszy od wczesnego testowania hipotez dotyczących celów, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, szczególnie w przypadkach, gdy ilościowe odczyty pojedynczych cząsteczek dostarczają informacji niezbędnych do zrozumienia mechanizmów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez bezpośrednią wizualizację zachowania pojedynczych cząsteczek w hydrożelach 3D lub imitacjach tkanek.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki jednorodnemu oświetleniu, dużemu polu widzenia oraz kompatybilności z automatycznym skanowaniem galwanometrycznym i wyzwalaniem kamery.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (np. gęstości cząsteczek, kolokalizacji, kinetyki wiązania), które są niezbędne do porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście od etapu odkryć do badań przedklinicznych poprzez utrzymanie spójnej wydajności obrazowania przy różnych grubościach próbek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowano jako modularną, adaptowalną platformę do wielokrotnego użytku w różnych projektach, co redukuje nakłady pracy związane z powtarzalną konfiguracją optyczną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększona pewność predykcyjna w walidacji celu dzięki ograniczeniu niejednoznaczności mechanistycznej i wysokokontrastowej detekcji pojedynczych cząsteczek.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zsynchronizowanemu skanowaniu galwanometrycznemu oraz odrzucaniu tła przez szczelinę konfokalną.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej weryfikacji hipotez dotyczących celów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o solidne, ilościowe dane z obrazowania molekularnego złożonych systemów biologicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie wyrównywania optycznego, bezpieczeństwa laserowego oraz systemów sterowania lustrami galwanometrycznymi.
- Wymaga stabilnego stołu wibroizolowanego, precyzyjnych translatorów oraz zsynchronizowanego sprzętu do akwizycji danych.
- Wymaga standaryzacji mocy wzbudzenia, parametrów skanowania i ustawień kamery w obrębie zespołów badawczych w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dopasowanie współczynnika załamania światła próbki oraz dobór soczewek cylindrycznych dla różnych długości fal wzbudzenia.
- Ograniczenie praktyczne: Wydajność zależy od utrzymania precyzyjnej synchronizacji między skanowaniem galwanometrycznym a odczytem kamery w celu zachowania sekcji optycznej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Preliminary Setup
1:11
Setting up the Detection Path
2:14
Setting up the Excitation Path and the Cylindrical Lenses
4:59
Testing Tile Imaging
5:53
Highly Inclined Swept Tile (HIST) Imaging
6:52
Results: Highly Inclined Swept Tile Microscopy of Labeled DNA and RNA
7:38
Conclusion
