Name: Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj budowę mikroskopu HIST do obrazowania pojedynczych cząsteczek z polem widzenia powiększonym 40-krotnie i zredukowanym tłem. Metoda wykorzystuje pojedynczą soczewkę obiektywową i jest kompatybilna z komercyjnymi systemami mikroskopowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Agencję Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obronności (DARPA) (HR00111720066) i Narodową Fundację Nauki (NSF) (1805200). Dziękujemy Michaelowi Serge'owi z firmy Andor Technology za hojne wypożyczenie kamery sCMOS.

1. Ustawianie mikroskopu, laserów i narzędzi do osiowania
<ol>
	<li>Przed zbudowaniem mikroskopu należy przygotować wszystkie niezbędne elementy, w tym optykę, optomechanikę i elektronikę, zgodnie z tabelą materiałów.</li>
	<li>Przygotuj korpus mikroskopu składający się głównie z dwóch części: uchwytu obiektywu z portem z gwintem RMS i stolika piezo-stokrotnego zamontowanego na aluminiowym bloku (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Wykonany na zamówienie korpus mikroskopu został użyty dla wygody i elastyczności oprzyrządowania12. Do mikroskopii HIST można użyć dowolnego dostępnego na rynku korpusu mikroskopu.</li>
	<li>Łączenie wielu linii laserowych i sprzęganie ich ze światłowodem jednomodowym
	<ol>
		<li>Zainstaluj lasery 405, 561, 638 nm na stole optycznym i połącz wiązki za pomocą rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej i długoprzepustowego lustra dichroicznego, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. Upewnij się, że wszystkie wiązki laserowe przechodzą przez otwory w narzędziu do wyrównywania. Włóż płytki półfalowe do regulacji mocy. 
		UWAGA: Nosić okulary ochronne dla ochrony oczu i używać bloków wiązki do pochłaniania niepożądanych wiązek laserowych.</li>
		<li>Zainstaluj soczewkę sprzęgającą światłowód (f = 4,5 mm) i adapter światłowodowy umieszczony w translatorze osi z systemem klatek.</li>
		<li>Podłącz światłowód wielomodowy (MMF, Ø 62,5 μm) do adaptera światłowodowego. Wyreguluj każdą parę lusterka kierowniczego i translatora z tak, aż skuteczność sprzężenia każdego lasera będzie wyższa niż 95%. Belka wyjściowa ma profil zbliżony do gaussowskiego z wzorami plamkowymi.</li>
		<li>Wyjmij światłowód wielomodowy i podłącz światłowód jednomodowy (SMF). Podobnie jak w przypadku MMF, dostosuj i zmaksymalizuj wydajność sprzężenia trzech laserów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj skolimowane źródło światła, które będzie używane do wyrównania wiązki w ścieżkach wzbudzenia i detekcji. Urządzenie to składa się z czasowo spójnego źródła światła (561 nm) podłączonego do SMF, adaptera światłowodowego, soczewki achromatycznej (f = 60 mm), przysłony i dystansu rurki Ø1" w systemie klatkowym (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1C). Dostosuj odległość między adapterem światłowodowym a soczewką za pomocą interferometru ścinającego, aby zapewnić kolimację.</li>
	<li>Przygotuj narzędzie do wyrównywania belki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Jest to para aluminiowych słupków z otworami na wysokości 2 cali od powierzchni stołu optycznego, co pozwala na szybkie i precyzyjne ustawienie wiązki.</li>
	<li>Zamontuj system z podwójnym otworkiem, który składa się z dwóch tarcz wyrównujących ze szkła szlifowanego Ø1" na każdym końcu i dwóch tubusów soczewek Ø1" (dolna jest szczelinowa), jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1E.</li>
</ol>
2. Ustawianie ścieżki wykrywania
<ol>
	<li>Wyjmij obiektyw i zainstaluj skolimowane źródło światła. Wyreguluj pokrętła lustra (M1) pod uchwytem obiektywu tak, aby wiązka wyjściowa z mikroskopu była mniej więcej równoległa do wysokości stołu optycznego i wyrównana z gwintowanymi otworami na stole. Patrz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe pozycje każdego komponentu optycznego.</li>
	<li>Włóż wielopasmowe zwierciadło dichroiczne (DM) i odbij wiązkę o 90 stopni. Użyj maksymalnego rozmiaru tęczówki i upewnij się, że wiązka przechodzi przez środek lustra dichroicznego bez przycinania.</li>
	<li>Użyj nieszczelnej wiązki przechodzącej przez zwierciadło dichroiczne, aby pokierować wyrównaniem ścieżki wykrywania. Umieść kamerę sCMOS w wiązce i upewnij się, że wiązka uderza w środek układu kamery za pomocą dwóch luster (M2 i M3).</li>
	<li>Włóż soczewkę tubusu (TL; f = 300 mm) w odległości około 300 mm od aparatu.</li>
	<li>Usuń skolimowane źródło światła i dostosuj względną odległość między obiektywem tubusu a kamerą, aż wzór na suficie zostanie wyraźnie rozwiązany przez kamerę.</li>
	<li>Umieść wielopasmowy filtr przepustowy (BF) przed soczewką tubusu, aby uzyskać wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne.</li>
</ol>
3. Ustawianie ścieżki wzbudzenia
<ol>
	<li>Zamontuj ponownie skolimowane źródło światła na uchwycie obiektywu. Umieść składane lustro (M4), aby przekierować wiązkę wyjściową z mikroskopu o 90 stopni. Dostosuj pokrętła lustra dichroicznego i lustra składanego iteracyjnie, aż wiązka przejdzie przez otwory w narzędziu do wyrównywania wiązki.</li>
	<li>Odłącz skolimowane źródło światła i zainstaluj je na stole, w którym wiązka skierowana jest w stronę korpusu mikroskopu. Wyrównaj belkę za pomocą narzędzia do wyrównywania belki i systemu podwójnych otworków.</li>
	<li>Włóż soczewkę L4 (f = 400 mm; Ø = 2") do ścieżki optycznej w odległości około 400 mm od uchwytu obiektywu. Zamontuj soczewkę obiektywu i wyreguluj położenie L4 wzdłuż osi optycznej, aż na suficie utworzy się idealny wzór dysku Airy. 
	UWAGA: Podczas wkładania soczewki pozycja wiązki przechodzącej przez soczewkę powinna pozostać niezmieniona. Obiektyw L4 ma gwint SM2, który umożliwia łatwe mocowanie/odłączanie go od płytki klatkowej z gwintem SM2 60 mm.</li>
	<li>Odkręć obiektyw i ponownie zainstaluj skolimowane źródło światła z otwartą przysłoną. Prześledź wiązkę wyjściową z mikroskopu za pomocą wizytówki. Zamontuj lustro M5 w miejscu, w którym wielkość wiązki jest najmniejsza i w odległości około 400 mm od L4, które jest sprzężoną płaszczyzną obrazu ().</li>
	<li>Zamontuj lustro M6 i odbij wiązkę o 90 stopni. Dostosuj M5 i M6 iteracyjnie za pomocą narzędzia do wyrównywania belki.</li>
	<li>Włóż obiektyw L3 (f = 150 mm) w odległości około 150 mm od M5. Użyj interferometru ścinającego, aby zapewnić kolimację wiązki wyjściowej.</li>
	<li>Tymczasowo odejmij L4 i prześledź wiązkę w dół, aby znaleźć ogniskową L3. Umieść w tym miejscu jednoosiowe lustro galvo, które jest sprzężoną tylną płaszczyzną ogniskową (cBFP). Podłącz 0 woltów do lustra galvo i obróć uchwyt lustra galvo tak, aby odbijał wiązkę o 90 stopni.</li>
	<li>Umieść lusterko składane M7. Prawidłowo umieść L2 (f = 100 mm) w taki sam sposób, jak w kroku 3.6.</li>
	<li>Wyjmij skolimowane źródło światła z uchwytu na przedmioty. Zainstaluj soczewkę kolimacyjną L1 (f = 100 mm), adapter światłowodowy i przysłonę. Podłącz światłowód jednomodowy do adaptera i wyślij wiązkę przez system obrazowania.</li>
	<li>Włóż ponownie L4 i dostrój system, aż na suficie pojawi się idealny wzór dysku Airy.</li>
</ol>
4. Ustawianie soczewek cylindrycznych
<ol>
	<li>Włóż soczewkę cylindryczną (CL1, f = 400 mm) za L1 i upewnij się, że soczewka cylindryczna skupia wiązkę wzdłuż osi x.</li>
	<li>Włóż kolejną soczewkę cylindryczną (CL2, f = 50 mm) do ścieżki wiązki. Użyj interferometru ścinającego, aby upewnić się, że wiązka wyjściowa jest skolimowana. 
	UWAGA: Odległość między dwiema soczewkami cylindrycznymi wynosi 450 mm. Belka wyjściowa ma stopień kompresji 8, a na suficie tworzy się wydłużony, owalny wzór dysku Airy.</li>
</ol>
5. Testowanie obrazowania kafelków
<ol>
	<li>Przygotuj próbkę hydrożelu 3D. Wymieszaj kulki Crimson 20 nm z roztworem hydrożelu, który składa się z 12% akrylamidu: bisakryloamidu (29:1), 0,2% (v/v) TEMED i 0,2% (w/v) nadsiarczanu amonu w 0,75x buforze TAE. Wstrzyknąć 50 μl zmieszanego roztworu do komory przepływowej, jak opisano w innym miejscu11. Po 10 minutach próbka hydrożelu 3D jest gotowa do obrazowania.</li>
	<li>Umieścić próbkę na uchwycie na próbkę. Włącz laser 638 nm i ustaw moc na <1 mW w celu wzbudzenia próbki.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie sterujące kamerą. W panelu ustawień akwizycji kamery wybierz opcję Wewnętrzna w trybie wyzwalania, a następnie kliknij opcję Nagraj wideo w trybie swobodnego uruchamiania.</li>
	<li>Nieznacznie dostosuj położenie kamery tak, aby obraz znajdował się na środku kamery, gdy do lustra galvo zostanie przyłożone 0 woltów.</li>
	<li>Obróć poziome pokrętło lustra M5, aby uzyskać bardzo nachylone oświetlenie. 
	UWAGA: Wraz ze wzrostem kąta oświetlenia obraz hydrożelowy staje się wyraźniejszy niż obraz Epi, ponieważ wiązka staje się cieńsza. Jednak obraz zachowuje prawie tę samą pozycję.</li>
	<li>Nagraj obraz kafelka. Oblicz efektywną szerokość oświetlenia11. Na przykład Rysunek 3 pokazuje efektywną szerokość oświetlenia wynoszącą 12 μm.</li>
</ol>
6. Obrazowanie HIST
<ol>
	<li>Przygotuj płytkę akwizycji danych połączoną z listwą zaciskową. Podłącz złącze BNC USER 1 z P0.0 za pomocą przewodu elektrycznego. Użyj USER 1 jako wyjścia cyfrowego do zewnętrznego wyzwalania kamery sCMOS. Podłącz wyjście analogowe AO0 do sterownika lustra galvo.</li>
	<li>Wygeneruj ciągi impulsów TTL z P0.0 za pomocą specjalnie przygotowanego programu (Rysunek 4A) i ustaw czas okresu = 400 ms i t_ON = 2 ms. Sprawdź wygenerowane impulsy z terminala BNC USER 1 za pomocą oscyloskopu cyfrowego, a następnie podłącz BNC do zewnętrznego portu wyzwalania kamery. 
	UWAGA: Oprogramowanie sterujące użyte w tym artykule jest dostępne na żądanie. W przypadku obrazowania z różną liczbą klatek na sekundę kamery czas okresu należy odpowiednio dostosować.</li>
	<li>Rozpocznij zamiatanie lustra galvo za pomocą niestandardowego programu. Dostosuj Vmin do -500 mV i Vmax do 500 mV, aby uzyskać pełne obrazowanie FOV. Należy zauważyć, że w tej operacji próbki hydrożelu 3D nadal wykazują wysokie tło podobne do oświetlenia Epi.</li>
	<li>Zmiana ustawień akwizycji kamery.
	<ol>
		<li>Wybierz Zewnętrzny w trybie wyzwalania i W dół (sekwencyjny) w menu rozwijanym LightScan Plus, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 4B. 
		UWAGA: Przy tym ustawieniu aparat nie robi zdjęć, chyba że włączony jest sygnał wyzwalający.</li>
		<li>Kliknij opcję Scan Speed Control (Kontrola prędkości skanowania), aby wyświetlić kontrolę wysokości okna i czasu ekspozycji linii, a następnie ustaw wartości odpowiednio na 180 wierszy i 28 ms. 
		UWAGA: Gdy szerokość płytki (Weff) wynosi 180 wierszy (12 μm), a czas całkowania na linię (Tint) wynosi 28 ms, czas opóźnienia między liniami (TD) jest określany jako TD = Tint/Weff = 0,156 ms. W przypadku obrazowania 2,048 x 2,048 pikseli całkowity czas akwizycji wynosi 2,048 x TD + Tint = 346 ms, co odpowiada ~2,9 kl./s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nieznacznie dostosuj Vmax i Vmin, aby uzyskać wyraźniejsze obrazy.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy stosu 3D za pomocą niestandardowego programu, włączając stos 3D i określając liczbę stosów oraz rozmiar kroku.</li>
</ol>

<ol><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li>
<li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+structural+biology%3A+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+optical+sectioning+in+the+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Resolution and optical sectioning in the confocal microscope.</a> Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).</li>
<li>Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+of+single+fluorophores+on+moving+actin+with+an+epifluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope.</a> Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nature Methods. 8, 1047(2011).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12, 641(2015).</li>
<li>Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+single-molecule+super-resolution+microscopy+with+a+tilted+light+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet.</a> Nature Communications. 9, 123(2018).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li>
<li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li>
<li>Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li>
</ol>

University of Central Florida złożył wniosek patentowy obejmujący pracę opisaną w tym artykule.

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Pierwszym z nich jest prawidłowe umieszczenie L4 w kroku 3.3, upewniając się, że padająca wiązka przechodzi przez środek soczewki, a na suficie tworzy się idealny wzór dysku Airy. Położenie L4 określa rozmieszczenie wszystkich pozostałych elementów optycznych, w tym M5, L3, GM i L2. Drugim krytycznym krokiem jest proces synchronizacji. Aby odrzucić nieostre tło, aktywne piksele, których efektywna szerokość wykrywania jest równa szerokości kafelka, powinny być zsynchronizowane z przemiataniem wiązki. Dlatego konieczne jest zmierzenie efektywnej szerokości oświetlenia wiązki kafelków (krok 5.6) i odpowiednie ustawienie parametrów kamery w kroku 6.4.
Przy obrazowaniu z bardzo dużym polem widzenia, prezentowana metoda wykazuje zwiększone tło z jednej strony w porównaniu z drugą stroną. Przypisuje się to nieznacznie zmienionym kątom oświetlenia w różnych pozycjach obrazowania. Wdrożenie drugiego lustra galvo zamiast M5 łagodzi ten problem, jak pokazano wcześniej, poprzez synchroniczną regulację pozycji i kąta skanowania11. Zamiast gotowych dubletów achromatycznych pomocny będzie również telecentryczny obiektyw skanujący. Jednak do zobrazowania obszaru o powierzchni <8 080μm2 wystarczające było pojedyncze zamiatanie zwierciadła galvo. Mikroskopia HIST ma ograniczenie głębokości obrazowania, jednak jest w stanie uzyskać dobry SBR podczas obrazowania do ~15 μm za pomocą wiązki płytek 12 μm i soczewki obiektywowej zanurzeniowej NA 1,4511.
W tym protokole użyliśmy współczynnika kompresji belki wynoszącego 8, aby wykonać belkę z płytek. W mikroskopii HIST można zastosować cieńsze oświetlenie w celu uzyskania wyższego SBR, co może być skuteczne w obrazowaniu tkanek jednocząsteczkowych11. Jednak w tym przypadku efekt fotowybielania należy rozpatrywać poprzez zwiększoną intensywność wzbudzenia, podczas gdy obecny współczynnik kompresji wiązki wykazał zmniejszone fotowybielanie w obrazowaniu 3D w porównaniu z Epi11. W porównaniu z mikroskopami z arkuszami świetlnymi z dwoma ortogonalnie ustawionymi obiektywami, mikroskopia HIST jest prosta do wdrożenia i kompatybilna z konwencjonalnymi preparatami próbek. Ulepszony SBR i duże pole widzenia mikroskopii HIST są odpowiednie do badania interakcji i dynamiki pojedynczych biomolekuł w wielu komórkach i mogą być dalej wykorzystywane w obrazowaniu w superrozdzielczości i śledzeniu pojedynczych cząsteczek.

Obrazowanie fluorescencji pojedynczej cząsteczki odgrywa ważną rolę w wielu badaniach biologicznych, które ujawniają ultrastruktury, dynamikę i ilość biomolekuł1,2,3. Jednak badanie pojedynczych cząsteczek wewnątrz komórek lub tkanek było wyzwaniem. Podczas gdy mikroskopia konfokalna zapewnia wysoką zdolność do wycinania4, nie nadaje się do obrazowania pojedynczych cząsteczek ze względu na silne fotobielenie spowodowane wysoką intensywnością wzbudzenia lub niską prędkością obrazowania. Mikroskopia szerokokątna wykorzystuje słabsze oświetlenie, ale cierpi z powodu słabego stosunku sygnału do tła (SBR)5. Z drugiej strony, mikroskopia z jasnymi arkuszami może wykazać dobre przekroje i niskie fotowybielanie6; jednak dostępna apertura numeryczna (NA) jest znacznie ograniczona przez wymóg ortogonalnie rozmieszczonych obiektywów7. Alternatywnie wymaga specjalnych iluminatorów i komór na próbki8,9.
Z tych powodów, mikroskopia z wysoce nachylonym i laminowanym arkuszem optycznym (HILO) jest szeroko stosowana do obrazowania 3D pojedynczych cząsteczek10. Kiedy nachylona wiązka napotyka interfejs dwóch mediów (na przykład szkła i wody), wiązka jest załamywana zgodnie z prawem Snella. Co ważne, załamująca się wiązka staje się cieńsza, a jej grubość jest opisana jako dz = R/tan(θ), gdzie R to średnica nachylonej wiązki, a θ to kąt załamania nadawanej wiązki. Ta prosta implementacja zapewnia dobrą zdolność do cięcia. Niemniej jednak zależność ta wskazuje, że cienkie oświetlenie (tj. wysoka zdolność przekroju) wymaga małego R i/lub dużego θ. Na przykład, gdy R = 20 μm i θ = 72 stopnie, można uzyskać dz = 6,5 μm. Ponieważ istnieje praktyczne ograniczenie do zwiększania kąta załamania w celu obrazowania głęboko wewnątrz komórek i uniknięcia całkowitego wewnętrznego odbicia, istnieje silne sprzężenie średnicy oświetlenia i grubości wiązki. Z tego powodu obrazowanie HILO wykazuje stosunkowo małe pole widzenia (FOV), co znacznie ogranicza jego zastosowania w obrazowaniu wielokomórkowym.
Ostatnio rozwiązaliśmy ten problem za pomocą mikroskopii HIST (Inclined Stair), gdzie pole widzenia jest oddzielone od grubości wiązki w bardzo prosty sposób11. Po pierwsze, wiązka wydłużona w jednym kierunku jest generowana przez parę cylindrycznych soczewek. Ta wiązka, określana jako płytka, wytwarza cienkie oświetlenie o dz ~ 4 μm, podczas gdy jej pole widzenia wynosi 130 x 12 μm2. Następnie płytka jest przesuwana po próbce za pomocą obrotowego lustra galvo. Tymczasem obraz fluorescencyjny jest rejestrowany w naukowej kamerze z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (sCMOS), która skutecznie filtruje nieostre tło, działając w trybie rolling shutter, który służy do przestrajalnego wykrywania szczelin konfokalnych. W ten sposób mikroskopia HIST umożliwia obrazowanie pojedynczych cząsteczek z większym polem widzenia (~130 x 130μm2) i cieńszym oświetleniem niż obrazowanie HILO. Zastosowaliśmy tę nową technikę obrazowania do wykrywania transkryptów RNA za pomocą pojedynczej sondy w komórkach lub kilku sond w tkankach mózgowych myszy, co ma znaczny potencjał w badaniu ekspresji genów i chorób. W przeciwieństwie do innych podejść, HIST wykorzystuje tylko jeden obiektyw o dużej aperturze numerycznej bez dodatkowego oświetlacza lub obiektywów do zdalnego wykrywania i jest w pełni kompatybilny z mikroskopami odwróconymi. Te zalety, wraz z dużym polem widzenia i wysokim kontrastem, sprawią, że mikroskopia HIST stanie się znaczącym narzędziem w biologii i medycynie. Poniżej przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące oprzyrządowania mikroskopu HIST oraz sposobu testowania i kalibracji jego działania.

<table><tbody><tr><td>Dublet achromatyczny 1"</td><td>Kolimator</td><td>AC254-060-A-ML</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1" Achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L1,L2</td></tr><tr><td>1" Achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td>TL</td></tr><tr><td>1" Szerokopasmowe lustra dielektryczne</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02-10</td><td>M1~M7</td></tr><tr><td>1" Soczewki cylindryczne</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1363RM-A</td><td>CL1</td></tr><tr><td>1" Soczewki cylindryczne</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM-A</td><td>CL2</td></tr><tr><td>1" kwadratowy montaż kinematyczny</td><td>Edmund Optics</td><td>58-857</td><td>Do montażu zwierciadła dichroicznego</td></tr><tr><td>1" Gwintowana płyta klatkowa</td><td>Thorlabs</td><td>CP02</td><td>Do mocowania innych soczewek</td></tr><tr><td>2" Achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-150-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>2" Achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-400-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>2" Gwintowany Płyta klatkowa</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Do trzymania L4</td></tr><tr><td>2 "Gwintowana płyta klatkowa</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01T</td><td>Do przechowywania L3</td></tr><tr><td>2% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>64085292</td><td>składnik hydrożelowy</td></tr><tr><td>20 nm kulki fluorescencyjne</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8782</td><td>Do testowania obrazowania</td></tr><tr><td>30 mm Klatka kątowa Kinematyczne lusterko do montażu</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Dla obiektywnych i Mocowanie kamery</td></tr><tr><td>30mm Cage System Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CP20S</td><td></td></tr><tr><td>3-osiowy stolik NanoMax</td><td>Thorlabs</td><td>MAX311D</td><td></td></tr><tr><td>40% roztwór akrylamidu</td><td>Bio Rad</td><td>64148001</td><td>składnik hydrożelowy</td></tr><tr><td>405 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>50x bufor TAE</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0743</td><td>składnik hydrożelowy</td></tr><tr><td>561 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-DPL</td><td></td></tr><tr><td>638 nm laser</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td>składnik hydrożelowy</td></tr><tr><td>Narzędzie do wyrównywania wiązki</td><td>wykonane na</td><td></td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>Listwy zaciskowe BNC</td><td>Natural Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>Płyta klatkowa z gwintem wewnętrznym M9 x 0,5</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>Do mocowania soczewek asferycznych</td></tr><tr><td>Pręty systemu klatkowego</td><td>Seria</td><td></td><td>Thorlabs</td> SR</tr><tr><td>Hodowle komórkowe i smFISH</td><td></td><td></td><td>Zobacz referencje [11]</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna&nbsp;</td><td>Scotch</td><td>515182</td><td>Komora przepływowa</td></tr><tr><td>Epoksyd&nbsp;</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td>Lustro</td></tr><tr><td>przepływowe Galvo</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211</td><td>GM</td></tr><tr><td>Galvo System Zasilacz liniowy</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td></td></tr><tr><td>Płyta półfalowa</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-405/561/633</td><td>Regulacja mocy</td></tr><tr><td>zwierciadło dichroiczne dalekiego przepustu</td><td>Chroma</td><td>T550lpxr</td><td>Do łączenia laserów</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12549-3</td><td>Komora przepływowa</td></tr><tr><td>Mikroskopische Deckglaser</td><td>Hecht Assistent</td><td>990/5024</td><td>Komora przepływowa</td></tr><tr><td>Montowana tarcza wyrównująca z matowego szkła</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td><td>Do systemu z podwójnym otworkiem</td></tr><tr><td>Zamontowana soczewka asferyczna Rochester</td><td>Thorlabs</td><td>A230TM-A Wielopasmowe</td><td></td></tr><tr><td>lustro dichroiczne</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635- t3</td><td>DM; Grubość 3 mm</td></tr><tr><td>Filtr wielopasmowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677-25</td><td>BF</td></tr><tr><td>Włókno wielomodowe</td><td>Thorlabs</td><td>M31L02</td><td>MMF</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametylo etylenodiamina</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ML</td><td>składnik hydrożelowy</td></tr><tr><td>płyta NI-DAQ</td><td>Natural Instruments</td><td>PCI-6733</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 1" Kinematic Mirror Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>Do trzymania luster</td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu</td><td>Olympus</td><td>PLANAPO N 60X</td><td>60X 1.45NA</td></tr><tr><td>olej Podstawa cokołu Widelce mocujące</td><td>Newport</td><td>9916</td><td></td></tr><tr><td>Słupki filarowe</td><td>Thorlabs</td><td>RS1P8E</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler piezoelektryczny</td><td>Thorlabs</td><td>BPC303</td><td></td></tr><tr><td>Spolaryzowany rozdzielacz wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>PBS251</td><td>Do łączenia laserów</td></tr><tr><td>Adapter RMS-SM1</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A3TS</td><td>Do obiektywu</td></tr><tr><td>Uchwyt pręta</td><td>wykonany</td><td></td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>Mocowanie klatki obrotowej&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1 / CRM1 / CRM1P</td><td>Do HWP i cylindrycznego montażu obiektywu</td></tr><tr><td>Kamera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Interferometr ścinający</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td>Test kolimacji wiązki</td></tr><tr><td>Światłowód jednomodowy</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>SMF</td></tr><tr><td>SM1 Tubusy obiektywu</td><td>Thorlabs</td><td>SM1S25</td><td>Do systemu</td></tr> <tr>z podwójnym otworkiem<td>SM1 Szczelinowy tubus</td><td>obiektywu Thorlabs</td><td>SM1L30C</td><td>Do systemu z podwójnym otworkiem</td></tr><tr><td>Montaż na scenie</td><td>wykonany na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gwintowany adapter światłowodowy</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td></td></tr><tr><td>Oś Z Montaż translacyjny</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>Złącze światłowodowe</td></tr></tbody></table>

przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek znacznie poszerzyło nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych w badaniach biologicznych. Jednak uzyskanie obrazów o dużym polu widzenia i wysokim kontraście w grubych komórkach i tkankach było wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy mikroskopię HIST (Spirit Sweep Til), która pozwala przezwyciężyć ten problem. Para cylindrycznych soczewek została zaimplementowana w celu wygenerowania wydłużonej wiązki wzbudzenia, która została zeskanowana na dużym obszarze obrazowania za pomocą jasnego zwierciadła galvo. Do pozycjonowania elementów optycznych zastosowano konfigurację 4f. Naukowa komplementarna kamera półprzewodnikowa z tlenkiem metalu wykryła sygnał fluorescencyjny i zablokowała nieostre tło za pomocą dynamicznej szczeliny konfokalnej zsynchronizowanej z przemiataniem wiązki. Przedstawiamy instrukcję krok po kroku, jak zbudować mikroskop HIST ze wszystkimi podstawowymi elementami.

Jako przykład, jednoniciowe DNA znakowane Atto647N obrazowano z długością fali wzbudzenia 638 nm w hydrożelu 3D. DNA zostało zakotwiczone w sieci hydrożelu za pomocą grupy acrydite podczas polimeryzacji żelu. Obrazy wykonano w odległości 5 µm nad powierzchnią, jak pokazano na Rysunku 5a. Obraz HIST wykazał znacznie mniejsze tło w porównaniu z obrazem Epi, dla którego obliczono stosunek sygnału do tła wynoszący 1,9 ± 0,7 dla obrazu HIST, podczas gdy większość plamek pojedynczych cząsteczek była ledwo wykrywalna w technice Epi.
Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA (smFISH) przeprowadzono z użyciem 4 sond FISH. Rysunek 5b przedstawia obrazy smFISH EEF2 (eukariotyczny czynnik elongacji translacji 2) znakowanego AlexaFluor 647 w komórkach A549 w buforze obrazowym (przygotowanie próbek opisano w naszej poprzedniej pracy11). Wykonano projekcję maksymalnej intensywności z 20 stosów z-stack odpowiadających grubości 5 µm. Obraz HIST wykazał nie tylko znacznie lepszy stosunek sygnału do tła (SBR), ale także bardziej jednorodne oświetlenie w porównaniu z obrazem Epi. W obrazowaniu Epi czas ekspozycji wynosił 400 ms, natomiast w obrazowaniu HIST czas integracji na linię wynosił 32 ms; w obu przypadkach moc oświetlenia mierzona przed obiektywem wynosiła 7,5 mW. Prędkość obrazowania dla Epi i HIST wynosiła 2,5 fps.
<img alt="Konfiguracja laboratorium optycznego z pryzmatem, źródłami laserowymi oraz soczewkami do badań absorpcji i emisji fotonów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Korpus mikroskopu, lasery i narzędzia do pozycjonowania. (A) Obiektyw i uchwyt na próbkę. (B) Zdjęcie systemów laserowych. LP, dichroiczne lustro długoprzepuszczalne; λ/2, płytki półfalowe; PBS, polaryzacyjny dzielnik wiązki. (C) Kolimowane źródło światła. (D) Narzędzie do centrowania wiązki z dwoma wymiennymi otworami zwężającymi. (E) System z podwójnym otworem zwężającym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ optyczny do mikroskopii, lustra, soczewki, kamery; schemat z opisanymi komponentami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Szczegółowy układ mikroskopii z silnie nachylonym skanowaniem kafelkowym (HIST). Zdjęcie (A) i schemat (B) systemu mikroskopu HIST. BF, filtr przepustowy wielopasmowy; CL1-2, soczewki cylindryczne; DM, lustro dichroiczne; GM, lustro galwanometryczne; BF, filtr przepustowy; M1-7, lustra; L1-4, soczewki; SMF, światłowód jednomodowy; TL, soczewka tubusowa; cIP, sprzężona płaszczyzna obrazu; cBFP, sprzężona tylna płaszczyzna ogniskowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy i wykres przedstawiający odchylenie standardowe na osi x, powiązane z analizą optyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3Oświetlenie pól z zastosowaniem współczynnika kompresji wynoszącego 8. (A) Obraz fluorescencyjny kulek o średnicy 20 nm w hydrożelu 3D. Pasek skali, 20 µm. (B) Projekcja odchylenia standardowego A wzdłuż kierunku y, wygładzona za pomocą 10 punktów danych. Czerwona strzałka wskazuje efektywną szerokość oświetlenia wynoszącą 12 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sterowania lustrem galwanometrycznym dla obrazowania stosu 3D z układem piezoelektrycznym i ustawieniami skanowania sekwencyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Panele sterowania oprogramowaniem do obrazowania i kontroli. (A) Autorski program LabView synchronizuje sterowanie skanowaniem lustra galwanometrycznego, rozpoczęcie akwizycji kamery sCMOS oraz ruch stolika piezoelektrycznego. (B) Panel sterowania ustawieniami akwizycji kamery. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie obrazowania komórek w mikroskopii epi-fluorescencyjnej i HIST, prezentujące wizualizację jąder." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. (A) Obrazy DNA znakowanego Atto647N w hydrożelu 3D przy oświetleniu Epi oraz HIST. (B) Obrazy smFISH dla EEF2 przy użyciu 4 sond FISH w komórkach A549 wykonane za pomocą mikroskopii Epi i HIST. Barwienie DAPI przedstawiono w kolorze niebieskim. Paski skali, 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Szczegółowa instrukcja jest opisana, jak zbudować mikroskop HIST (o dużym nachyleniu) i jego zastosowanie do obrazowania pojedynczych molekuł.

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Nasza metoda pozwala nam na wizualizację pojedynczych cząsteczek o 40-krotnie większym obszarze obrazu niż konwencjonalne metody i ma znacznie zmniejszony sygnał tła. W przeciwieństwie do innych technik, nasze podejście wykorzystuje pojedynczą soczewkę obiektywową, nie wymaga specjalnej komory na próbkę i jest łatwo kompatybilne z dostępnymi na rynku systemami mikroskopowymi. Po zebraniu niezbędnych komponentów przystąp za budowę systemu.Tutaj kilka elementów jest już na swoim miejscu na ławce. Na aluminiowym bloku zamontowany jest korpus mikroskopu ze stolikiem piezoelektrycznym i uchwytem na próbkę. Na ławce znajdują się również trzy lasery i elementy optyczne do łączenia wiązek.Połączone wiązki są sprzężone ze światłowodem jednomodowym tak wydajnie, jak to możliwe. Ostatnim krokiem wstępnym jest montaż skolimowanego źródła światła w systemie klatek. Ma tymczasowe spójne źródło światła podłączone do światłowodu jednomodowego, adaptera światłowodowego, soczewki achromatycznej i przysłony.Rozpocznij pracę ze ścieżką wykrywania. Najpierw umieść skolimowane źródło światła w porcie obiektywu korpusu mikroskopu. Wyreguluj lustro pod obiektywami tak, aby wiązka wyjściowa była mniej więcej pozioma i wyrównana z otworami ławki.Wstaw lustro dichroiczne w ścieżce wiązki i odbij wiązkę o 90 stopni. Dodaj lustra, aby umożliwić dostosowanie ścieżki przesyłanej wiązki do kamery sCMOS. Użyj lusterek, aby upewnić się, że wiązka uderza w środek chipa.Następnie włóż 300-mililitrowy tubus o ogniskowej mniej więcej o ogniskowej aparatu. Usuń skolimowane źródło światła z korpusu mikroskopu. Następnie wyreguluj położenie soczewki tubusu, aby ustawić jej płaszczyznę ogniskową.Zatrzymaj regulację, gdy kamera wyraźnie rozpozna wzór na suficie. Ścieżka detekcji jest przedstawiona na tym schemacie. Zwróć uwagę na dodanie wielopasmowego filtra przepustowego przed soczewką tubusu do wielokolorowego obrazowania fluorescencyjnego.Wróć do korpusu mikroskopu. Tam ponownie zainstaluj skolimowane źródło światła w uchwycie obiektywu. Po lustrze dichroicznym umieść składane lustro na drodze odbitej wiązki, aby przekierować ją o 90 stopni.Wyjmij skolimowane źródło światła z korpusu mikroskopu i umieść je w pobliżu. Następnie włóż obiektyw o ogniskowej 400 milimetrów w odległości około ogniskowej od lustra. W korpusie mikroskopu zainstaluj soczewkę obiektywu.Następnie wyreguluj położenie lustra wzdłuż osi optycznej. Obserwuj sufit nad celem i zatrzymaj się, gdy uformuje się tam idealny wzór dysku Airy. Teraz zdejmij obiektyw i ponownie zainstaluj skolimowane źródło światła z otwartą przysłoną.Określ, w którym miejscu na ścieżce wiązki wiązka jest najmniejsza w odległości około 400 milimetrów od lustra. Po zidentyfikowaniu punktu zamontuj tam lustro, sprzężoną płaszczyznę obrazu. Stan instalacji w tym momencie pojawia się na tym schemacie.Właśnie dodane lustro jest oznaczone jako M5. Włóż kolejne lustro, aby odbić wiązkę pod kątem 90 stopni i zamontuj za nim obiektyw o ogniskowej 150 milimetrów. Obiektyw powinien znajdować się 150 milimetrów od sprzężonej płaszczyzny obrazu. Następnie tymczasowo usuń pierwszą soczewkę na ścieżce wiązki wzbudzenia.Dzięki tej konfiguracji znajdź pozycję ogniskową drugiego obiektywu. Umieść jednoosiowe lustro galvo w tym punkcie ogniskowym jako sprzężoną tylną płaszczyznę ogniskową. Podłącz zero woltów do lustra galvo i obróć jego uchwyt tak, aby odbijał wiązkę o 90 stopni.Następnie wzdłuż ścieżki wiązki umieść składane lustro, które odbija wiązkę pod kątem 90 stopni. Umieść soczewkę 100 milimetrów wzdłuż ścieżki wiązki od sprzężonej tylnej płaszczyzny ogniskowej. Ponownie wyjmij skolimowane źródło światła z mocowania mikroskopu.Dodaj kolejną 100-milimetrową soczewkę kolimacyjną z adapterem światłowodowym i światłowodem jednomodowym wraz z przysłoną. Następnie użyj tęczówki, światłowodu i soczewki, aby wysłać skolimowaną wiązkę przez system obrazowania. Następnie włóż cylindryczną soczewkę o ogniskowej 400 milimetrów tuż przed ostatnią soczewką kolimacyjną na ścieżce wiązki.Użyj go, aby ustawić ostrość wiązki. Włóż 50-milimetrową soczewkę cylindryczną 450 milimetrów przed pierwszą. Jest to schematyczne przedstawienie ostatecznej konfiguracji ze ścieżkami detekcji i wzbudzenia.Wyjście trzech laserów jest sprzężone ze ścieżką za pomocą światłowodu jednomodowego. Do badań przygotuj próbkę hydrożelu 3D. Ten składa się z 20-nanometrowych szkarłatnych kulek zmieszanych z hydrożelem.Po ustawieniu umieścić próbkę hydrożelu w uchwycie na próbkę. Aby wzbudzić próbkę, włącz laser 638 nm i dostosuj jego moc do mniej niż jednego miliwata. Skonfiguruj oprogramowanie sterujące kamerą w trybie wewnętrznego wyzwalania i przechwytuj wideo.W tym momencie silnik galvo ma przyłożone zero woltów. Ustaw aparat tak, aby obraz znajdował się na środku obiektywu. Następnie wyreguluj lustro, które jest sprzężoną płaszczyzną obrazu.Obróć poziome pokrętło na lustrze, aby uzyskać mocno nachylone oświetlenie. Zapisz obraz płytki, tak jak na przykładowym obrazie fluorescencji hydrożelu 3D z 20-nanometrowymi kulkami. Podziałka wynosi 20 mikrometrów.Kontynuuj po skonfigurowaniu sprzętu i oprogramowania, aby zamiatać lustro galvo. To jest oprogramowanie do zamiatania luster galvo do konfiguracji. Uporządkuj obrazowanie w pełnym polu widzenia, ustawiając Vmin na minus 500 miliwoltów.Następnie ustaw Vmax na 500 miliwoltów. Następnie przełącz się na oprogramowanie do akwizycji kamery. W trybie wyzwalania wybierz opcję Zewnętrzne.W menu rozwijanym LightScan PLUS wybierz opcję W dół Następnie kliknij opcję Scan Speed Control (Kontrola prędkości skanowania). Można teraz ustawić niektóre parametry sterowania. W polu Wysokość okna wprowadź 180 wierszy.W polu Ekspozycja wprowadź wartość 28 milisekund. Po zakończeniu wróć do oprogramowania sterującego lusterkiem. W oprogramowaniu do sterowania lustrem włącz stosy 3D. Określ liczbę stosów i rozmiar kroku.Kliknij opcję Nagraj wideo, aby rozpocząć nagrywanie obrazów. Jest to przykład obrazowania Epi jednoniciowego znakowanego DNA. W przeciwieństwie do tego, technika mocno nachylonych zamiatanych płytek wytworzyła ten obraz.Obraz HIST pokazuje mniej tła w porównaniu z obrazem Epi. DNA znajduje się w hydrożelu 3D, a długość fali wzbudzenia wynosi 638 nanometrów. Oto obraz Epi oznaczonego eukariotycznego czynnika wydłużenia translacji 2.Obraz HIST ma poprawiony stosunek sygnału do tła. Ma również bardziej równomierne oświetlenie. Oba mają taką samą moc oświetlenia wynoszącą 7,5 miliwata.Obie prędkości obrazowania wynosiły 2,5 klatki na sekundę. Ważne jest, aby stale utrzymywać duży kąt nachylenia i synchronizować zamiatanie lustra z odczytem z kamery. Gwarantuje to wysoki stosunek sygnału do tła podczas akwizycji obrazu.Spodziewamy się, że mikroskopia HIST przyniesie korzyści w kilku zastosowaniach, w tym obrazowaniu w superrozdzielczości na głębszych głębokościach obrazowania i wysokoprzepustowemu profilowaniu ekspresji genów w grubych warstwach tkanki.

a-guide-to-build-highly-inclined-swept-tile-microscope-for-extended

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano moduł do mikroskopii z oświetleniem jednopłaszczyznowym (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych. Próbka znajduje się w prostokątnej kapilarze, a za pomocą układu mikroprzepływowego można w niewielkich ilościach aplikować barwniki fluorescencyjne, środki farmaceutyczne lub leki.

Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Obrazowanie wiązką jonów (MIBI) jest często używane do obrazowania mikromacierzy tkanek i sąsiadujących, sąsiadujących ze sobą obszarów tkanek, ale obecne oprogramowanie do konfiguracji tych eksperymentów jest kłopotliwe. Interfejs kafelków/SED/tablicy to intuicyjne, interaktywne narzędzie graficzne opracowane w celu znacznego uproszczenia i przyspieszenia konfiguracji uruchamiania MIBI.

Szybka konfiguracja obrazowania mikromacierzy tkankowej i obszaru kafelkowego w mikroskopie obrazowania z multipleksowaną wiązką jonów za pomocą interfejsu Tile/SED/Array

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj budowę mikroskopu HIST do obrazowania pojedynczych cząsteczek z polem widzenia powiększonym 40-krotnie i zredukowanym tłem. Metoda wykorzystuje pojedynczą soczewkę obiektywową i jest kompatybilna z komercyjnymi systemami mikroskopowymi.

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia (Wideo) | JoVE Journal

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

Przeglądaj więcej filmów