Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów
June 1st, 2019
Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.
Moje laboratorium interesuje się mechanobiologią, która bada, w jaki sposób komórki wywierają wpływ sił mechanicznych i jak na nie wpływają. Jednym ze sposobów ilościowego określenia mechanobiologii jest pomiar kurczliwości komórek. W komórkach przylegających kurczliwość objawia się siłami trakcyjnymi wywieranymi na substrat komórkowy. Określamy ilościowo te siły za pomocą metodologii ogólnie określanej jako mikroskopia sił trakcyjnych lub TFM. TFM jest wdrażany na wiele różnych sposobów, ale wspólnym aspektem jest to, że jest to raczej seryjna i powolna technika laboratoryjna, wykonywana zazwyczaj w jednym daniu, takim jak to tutaj. Ogranicza nas to do oceny jednej populacji lub stanu na raz. Hodowla komórkowa została ulepszona jakiś czas temu, ale tworząc naczynia wielodołkowe i pomyśleliśmy, czy nie byłoby wspaniale, gdybyśmy mogli TFM z taką samą zwiększoną przepustowością i tą samą wydajnością czasu i odczynników? I to było nasze rozwiązanie. Stworzyliśmy więc 96-dołkową antenę o sile uciągowej. Wygląda bardzo podobnie do konwencjonalnej 96-dołkowej naczynia do hodowli tkankowej, jednak dzięki tej naczyniu możemy nie tylko zbadać 96 różnych warunków hodowli komórek, ale także określić ilościowo ich kurczliwość komórek. Stanowi to rozwiązanie o znacznie wyższej przepustowości niż podejścia oparte na pojedynczym szalku, co pozwala nam badać różne warunki komórkowe i reakcje skurczowe. Podczas przerzutów nowotworowych komórki rakowe przemieszczają się z miejsca pierwotnego do miejsca wtórnego, rozprzestrzeniając chorobę w naszym organizmie. To przerzutowe zachowanie komórek rakowych odpowiada za 90% zgonów związanych z rakiem. Jednym z proponowanych mechanizmów uzyskiwania przez komórki raka nabłonka bardziej migrującego i inwazyjnego fenotypu jest przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Podczas EMT stają się bardziej migrujące i inwazyjne, zmieniając swoje zachowanie fizyczne. Aby lepiej zrozumieć te zmiany w zachowaniu fizycznym, wykorzystujemy nasz miękki substrat krzemowy do pomiaru zmian kurczliwości komórek gruczołu sutkowego myszy z indukcją EMT przez TGF-W tym badaniu zbadaliśmy, jak różne stężenia i czas inkubacji TGF wpływają na fizyczne zachowanie komórek. Polidimetylosiloksan jest bardzo podatną gumą o najniższym module Younga wynoszącym około 0,6 kilopaskala. Sztywność tego materiału można również przestrajać za pomocą różnych stężeń czynnika sieciującego, w tym SYLGARD 184.To pomiaru właściwości mechanicznych PDMS używamy reometru. Po wymieszaniu części A i części B PDMS, w stosunku wagowym jeden do jednego i dodaniu utwardzacza o określonej zawartości wagowej, należy załadować przygotowaną partię na płytkę reometryczną. Upewnij się, że załadowano wystarczającą ilość próbki, aby całkowicie pokryć obszar wrzeciona. Ważne jest, aby upewnić się, że wrzeciono całkowicie dotyka próbki, bez pozostawienia wolnej przestrzeni na jego krawędzi. Każdą dodatkową próbkę należy ostrożnie przyciąć i wytrzeć z płytki. Zmierz końcowy moduł przechowywania i zależność od czasu lepkosprężystości każdej próbki, wykonując przemiatanie w czasie i częstotliwości przy oscylacyjnym odkształceniu ścinającym 0,5%Newsha]Ten wykres jest jednym z przykładów testu sekwencyjnego w czasie, który wykonano w celu zmierzenia zachowania reologicznego polidimetylosiloksanu z zastosowanym oscylacyjnym odkształceniem ścinającym 0,5% i temperaturą 100
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie prezentuje test siły pociągowej o wysokiej wydajności wykonany z silikonowej gumy (PDMS), zaprojektowany w celu zbadania fizycznych zmian w kurczliwości komórek podczas różnych procesów biologicznych. Przydatność metody jest demonstrowana poprzez pomiar zależnego od TGF-β wzrostu kurczliwości podczas przejścia nabłonkowo-mezenchimalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biomechanika
- Inżynieria biomedyczna
Tło
- Kurczliwość komórek jest kluczowa w różnych procesach biologicznych.
- Rozumienie zmian kurczliwości może dać wgląd w choroby.
- Tradycyjne metody mogą brakować przepustowości i wrażliwości.
- PDMS jest wszechstronnym materiałem do tworzenia testów.
Cel badania
- Rozwój testu o wysokiej wydajności do pomiaru kurczliwości komórek.
- Ocenienie wpływu TGF-β na kurczliwość podczas przejścia nabłonkowo-mezenchimalnego.
- Dostarczenie niezawodnej metody do badania zachowania komórek w różnych warunkach.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie testu siły pociągowej za pomocą PDMS.
- Pomiar kurczliwości komórek w odpowiedzi na TGF-β.
- Analiza o wysokiej wydajności do oceny wielu próbek.
- Ocena dynamiki przejścia nabłonkowo-mezenchimalnego.
Główne wyniki
- Udane pomiary zmian kurczliwości w komórkach.
- Zdemonstrowano zależne od TGF-β zwiększenie kurczliwości.
- Zweryfikowano przydatność testu opartego na PDMS.
- Dostarczono wglądu w mechanikę procesów przejścia komórek.
Wnioski
- Test siły pociągowej PDMS jest skuteczny w badaniu kurczliwości komórek.
- Potwierdzono wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowo-mezenchimalnego.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych badań biologicznych i biomedycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
