Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów
1 czerwca 2019
Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.
Moje laboratorium interesuje się mechanobiologią, która bada, w jaki sposób komórki wywierają wpływ sił mechanicznych i jak na nie wpływają. Jednym ze sposobów ilościowego określenia mechanobiologii jest pomiar kurczliwości komórek. W komórkach przylegających kurczliwość objawia się siłami trakcyjnymi wywieranymi na substrat komórkowy. Określamy ilościowo te siły za pomocą metodologii ogólnie określanej jako mikroskopia sił trakcyjnych lub TFM. TFM jest wdrażany na wiele różnych sposobów, ale wspólnym aspektem jest to, że jest to raczej seryjna i powolna technika laboratoryjna, wykonywana zazwyczaj w jednym daniu, takim jak to tutaj. Ogranicza nas to do oceny jednej populacji lub stanu na raz. Hodowla komórkowa została ulepszona jakiś czas temu, ale tworząc naczynia wielodołkowe i pomyśleliśmy, czy nie byłoby wspaniale, gdybyśmy mogli TFM z taką samą zwiększoną przepustowością i tą samą wydajnością czasu i odczynników? I to było nasze rozwiązanie. Stworzyliśmy więc 96-dołkową antenę o sile uciągowej. Wygląda bardzo podobnie do konwencjonalnej 96-dołkowej naczynia do hodowli tkankowej, jednak dzięki tej naczyniu możemy nie tylko zbadać 96 różnych warunków hodowli komórek, ale także określić ilościowo ich kurczliwość komórek. Stanowi to rozwiązanie o znacznie wyższej przepustowości niż podejścia oparte na pojedynczym szalku, co pozwala nam badać różne warunki komórkowe i reakcje skurczowe. Podczas przerzutów nowotworowych komórki rakowe przemieszczają się z miejsca pierwotnego do miejsca wtórnego, rozprzestrzeniając chorobę w naszym organizmie. To przerzutowe zachowanie komórek rakowych odpowiada za 90% zgonów związanych z rakiem. Jednym z proponowanych mechanizmów uzyskiwania przez komórki raka nabłonka bardziej migrującego i inwazyjnego fenotypu jest przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Podczas EMT stają się bardziej migrujące i inwazyjne, zmieniając swoje zachowanie fizyczne. Aby lepiej zrozumieć te zmiany w zachowaniu fizycznym, wykorzystujemy nasz miękki substrat krzemowy do pomiaru zmian kurczliwości komórek gruczołu sutkowego myszy z indukcją EMT przez TGF-W tym badaniu zbadaliśmy, jak różne stężenia i czas inkubacji TGF wpływają na fizyczne zachowanie komórek. Polidimetylosiloksan jest bardzo podatną gumą o najniższym module Younga wynoszącym około 0,6 kilopaskala. Sztywność tego materiału można również przestrajać za pomocą różnych stężeń czynnika sieciującego, w tym SYLGARD 184.To pomiaru właściwości mechanicznych PDMS używamy reometru. Po wymieszaniu części A i części B PDMS, w stosunku wagowym jeden do jednego i dodaniu utwardzacza o określonej zawartości wagowej, należy załadować przygotowaną partię na płytkę reometryczną. Upewnij się, że załadowano wystarczającą ilość próbki, aby całkowicie pokryć obszar wrzeciona. Ważne jest, aby upewnić się, że wrzeciono całkowicie dotyka próbki, bez pozostawienia wolnej przestrzeni na jego krawędzi. Każdą dodatkową próbkę należy ostrożnie przyciąć i wytrzeć z płytki. Zmierz końcowy moduł przechowywania i zależność od czasu lepkosprężystości każdej próbki, wykonując przemiatanie w czasie i częstotliwości przy oscylacyjnym odkształceniu ścinającym 0,5%Newsha]Ten wykres jest jednym z przykładów testu sekwencyjnego w czasie, który wykonano w celu zmierzenia zachowania reologicznego polidimetylosiloksanu z zastosowanym oscylacyjnym odkształceniem ścinającym 0,5% i temperaturą 100
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wysokoprzepustowy test sił trakcyjnych wykonany z gumy silikonowej (PDMS), zaprojektowany do badania zmian fizycznych w kurczliwości komórek podczas różnych procesów biologicznych. Użyteczność tej metody została zademonstrowana poprzez pomiar zależnego od TGF-β wzrostu kurczliwości podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biomechanika
- Inżynieria biomedyczna
Wstęp
- Kurczliwość komórek jest kluczowa w wielu procesach biologicznych.
- Zrozumienie zmian w kurczliwości może dostarczyć cennych informacji na temat chorób.
- Tradycyjne metody mogą charakteryzować się niską przepustowością i czułością.
- PDMS jest wszechstronnym materiałem do tworzenia testów analitycznych.
Cel badania
- Opracowanie wysokoprzepustowego testu do pomiaru kurczliwości komórek.
- Ocena wpływu TGF-β na kurczliwość podczas przejścia epitelialno-mezenchymalnego.
- Zapewnienie niezawodnej metody badania zachowania komórek w różnych warunkach.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie testu siły trakcyjnej z wykorzystaniem PDMS.
- Pomiar kurczliwości komórek w odpowiedzi na TGF-β.
- Analiza wysokoprzepustowa w celu oceny wielu próbek.
- Ocena dynamiki przejścia epitelialno-mezenchymalnego.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar zmian kurczliwości w komórkach.
- Wykazanie zależnych od TGF-β wzrostów kurczliwości.
- Potwierdzenie użyteczności testu opartego na PDMS.
- Przedstawienie informacji na temat mechaniki procesów przejścia komórkowego.
Wnioski
- Test siły trakcyjnej na podłożu PDMS jest skutecznym narzędziem do badania kurczliwości komórek.
- Potwierdzono zwiększenie kurczliwości podczas przejścia epitelialno-mezenchymalnego.
- Metoda ta może być zastosowana w różnorodnych badaniach biologicznych i biomedycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta wysokoprzepustowa platforma do mikroskopii sił trakcyjnych umożliwia ilościową ocenę kurczliwości komórkowej w formacie skalowalnym, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Poprzez powiązanie indukowanego przez TGF-β przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego z mierzalnymi zmianami biofizycznymi, metoda ta dostarcza wartości prognostycznej dla walidacji celów w badaniach nad włóknieniem i przerzutami. System oparty na PDMS zapewnia powtarzalność i kompatybilność z istniejącymi przepływami pracy w płytkach wielodołkowych, co zwiększa możliwości ponownego wykorzystania w ramach biologii odkrywczej i potoków opracowywania testów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie roli TGF-β jako modulatora kurczliwości komórkowej podczas EMT, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zależnych od dawki i rozdzielonych w czasie danych o kurczliwości, co pozwala na priorytetyzację mechanistycznych celów w szlakach włóknienia i nowotworzenia.
- Wartość prognostyczna: Ilościowo określa fenotypy biofizyczne powiązane z EMT, pomagając w przedklinicznym wyborze celów i ograniczaniu ryzyka związanego z badaniami nad szlakami sygnałowymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych, niezależnych od podłoża pomiarów kurczliwości w celu standaryzacji testów w przesiewowych badaniach z zakresu mechanobiologii.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z formatami 96-dołkowymi umożliwia równoległe przesiewanie bibliotek związków lub dawek cytokin.
- Gotowość do analizy: Wykorzystanie stabilnych, obojętnych podłoży PDMS o regulowanym module (0.4–100 kPa) i nieokreślonym terminie przydatności do użycia, co redukuje zmienność między partiami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wiąże dawkę i czas ekspozycji na TGF-β z wynikiem kurczliwym, co wspiera modele przedkliniczne EMT zgodne z biomarkerami.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Umożliwia ocenę zmian kurczliwości jako funkcjonalnego odczytu w systemach istotnych dla danej choroby przed walidacją in vivo.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez korelację interwencji molekularnej z modulacją fenotypu biofizycznego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając odczytów biofizycznych, które wspierają podejmowanie decyzji we wczesnych fazach badań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu sygnalizacji TGF-β na mechanikę i kurczliwość komórkową.
- Screening: Umożliwia wysokoprzepustową, powtarzalną kwantyfikację sił trakcyjnych w formatach wielodołkowych w celu analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Analityka: Generuje wskaźniki kurczliwości (wielkość i rozkład siły), które pozwalają na porównanie stężeń TGF-β oraz czasów ekspozycji.
- Badania translacyjne: Łączy indukcję EMT in vitro z mierzalnymi zmianami biomechanicznymi, co potwierdza przydatność modeli przedklinicznych.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do pomiaru sił trakcyjnych, którą można zastosować w różnych typach komórek i celach mechanobiologicznych w onkologii oraz włóknieniu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną walidacji punktów uchwytu poprzez redukcję niejednoznaczności w fenotypach mechanobiologicznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanym podłożom z PDMS oraz kompatybilności z płytkami wielodołkowymi.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając równoległe testowanie warunków i zmniejszając zużycie odczynników na pojedynczy punkt danych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację punktów uchwytu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe zmiany kurczliwości podczas przejść patogennych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, analizy obrazów TFM oraz przygotowania podłoży z PDMS.
- Metoda opiera się na reometrii w celu charakterystyki podłoża oraz na mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczenia sił trakcyjnych.
- Konieczna jest standaryzacja gęstości wysiewu, funkcjonalizacji podłoża oraz warunków obrazowania we wszystkich dołkach.
- Adaptacja do różnych typów komórek może wymagać optymalizacji sztywności podłoża i ligandów adhezyjnych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują jednorodność grubości podłoża oraz potencjalną autofluorescencję PDMS przy określonych długościach fal.
