Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Fizjologiczne komórki prezentujące antygen dendrytyczny, zwane PhDC, są głównymi przełącznikami immunologicznymi, które inicjują odporność i tolerancję limfocytów T specyficznych dla antygenu. W artykule przedstawiono efektywną metodę wytwarzania doktoratu doktora. Kliniczne zastosowanie komórek dendrytycznych jest utrudnione przez niefizjologiczne metody cytokin stosowane do ich wytwarzania.

Nasza metoda rozwiązuje ten problem poprzez skuteczną sygnalizację płytkową konwersji monocytów do DC u ludzi i myszy. Te PhDC nie są zależne od warunków cytokin niedostępnych in vivo, dzięki czemu mogą generować silne kliniczne odpowiedzi przeciwnowotworowe limfocytów T zarówno u ludzi, jak i myszy z ustalonymi nowotworami. Niezależna od gatunku inicjacja dojrzewania monocytów do PhDC ma szerokie zastosowanie eksperymentalne.

Doktorat pozwala na analizę fizjologii komórek dendrytycznych, ułatwia indukcję terapeutycznej odporności przeciwnowotworowej na nowotwory immunogenne i daje nadzieję na spersonalizowane szczepienia przeciwdrobnoustrojowe. Ten eksperymentalny system jest nowatorski, a wiele jego aspektów, takich jak powlekanie plastikowej komory, leczenie komórek nowotworowych 8-MOP / UVA, warunki przepływu i uwalnianie monocytów są najlepiej przedstawione wizualnie. Procedurę zademonstruje Eve Robinson, technik z mojego laboratorium.

Aby zebrać komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, najpierw ustaw 15-mililitrową rurkę z czterema mililitrami pożywki do izolacji limfocytów na pięć do 10 krwawiących myszy. Następnie powoli ułóż warstwę krwi pobranej od myszy z guzem na pożywce. Obracaj komórki w temperaturze od 1 000 do 1 500 razy G przez 20 minut, aby oddzielić PBMC od czerwonych krwinek.

Pod koniec wirowania zbierz górną warstwę osocza, pozostawiając 0,5 mililitra pozostałego nad kożuchem i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Następnie zbierz warstwę kożucha do czystej 15-mililitrowej probówki wypełnionej PBS do 15 mililitrów i wiruj z prędkością 250 razy G w standardowej wirówce do kultur tkankowych przez 10 minut, aby zebrać PBMC. Pod koniec wirowania ostrożnie odpipetować supernatant i przesunąć probówkę, aby ponownie zawiesić osad.

Następnie dodaj dwa mililitry buforu do lizy czerwonych krwinek ACK do probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe czerwone krwinki z PBMC. Inkubować PBMC na lodzie przez 10 minut. Napełnij probówkę PBS do 15 mililitrów i odwiruj z prędkością 250 razy G w standardowej wirówce do hodowli tkankowych przez 10 minut, aby zebrać PBMC.

Ostrożnie odpipetować supernatant i przesunąć probówkę, aby poluzować osad. Zawiesić granulat w 300 mikrolitrach FBS. Aby przygotować komórki nowotworowe YUMM1.7 na grupę leczoną, najpierw ponownie zawieś osad komórek nowotworowych w FBS w ilości 2,5 miliona komórek na 300 mikrolitrów.

Przy wyłączonym kapturze do hodowli tkankowej dodaj 8-metoksypsoralen, aby uzyskać końcowe stężenie 100 nanogramów na mililitr do zawiesiny komórek nowotworowych YUMM1.7. Następnie wymieszaj komórki, zawiń pojemnik na komórki w folię i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby wstępnie pokryć 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, dodaj jeden mililitr FBS do jednego dołka na każdą grupę pięciu myszy poddanych działaniu substancji i wstaw płytkę do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Po 20 minutach, pod kapturem do hodowli tkankowej, usuń FBS z dołków i dodaj 300 mikrolitrów komórek nowotworowych narażonych na metoksypsoralen na studzienkę. Następnie wystawij płytkę zawierającą komórkę na działanie wstępnie ogrzanego źródła światła ultrafioletowego A, aby uzyskać całkowite napromieniowanie czterech dżuli na centymetr kwadratowy. Aby zebrać 8 komórek nowotworowych poddanych działaniu metoksypsoralenu/UVA z każdej studzienki, należy ostrożnie zakręcić płytką i pipetą, aby zapewnić całkowite odzyskanie komórek.

Aby przeprowadzić pasaż płytki uodparniającej dla każdej grupy pięciu myszy leczonych, połącz 300 mikrolitrów odpowiedniego PBMC i 300 mikrolitrów komórek nowotworowych traktowanych 8-metoksypsoralenem/UVA w stożkowej probówce o pojemności 1,5 mililitra i wymieszaj komórki. Następnie otwórz rurki wejściowe i wyjściowe clamps płyty TI. Użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby napełnić rurkę TI FBS, zamykając zaciski, gdy rurka jest napełniana, aby zatrzymać FBS wewnątrz rurki.

Odłączyć strzykawkę. Umieść końcówkę pipety P1000 bezpiecznie we wlocie płytki TI. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni i powoli napełniaj płytkę mieszanką PBMC i komórek nowotworowych, unikając pęcherzyków.

Wyjąć końcówkę pipety z wlotu przed zwolnieniem tłoka pipety. Umieść pozostałe komórki z powrotem w stożkowej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Inkubować rurkę wypełnioną FBS, wypełnioną komórkami płytkę TI i stożkową rurkę o pojemności 1,5 mililitra zawierającą pozostałe komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Po inkubacji zwolnij zaciski i opróżnij rurkę TI grawitacyjnie. Następnie włóż końcówkę pipety P1000 z tłokiem wciśniętym w port płytki, aby usunąć komórki z płytki TI. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni i napełnij końcówkę pipety P1000.

Umieść komórki z powrotem w ich oryginalnej stożkowej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Aby uruchomić płytę TI, podłącz rurkę wyjściową do płyty i przymocuj płytkę TI do systemu bieżnika płyty. Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki, pobierz te 600 mikrolitrów mieszanki PBMC i komórek nowotworowych z 1,5-mililitrowej stożkowej probówki.

Przymocować strzykawkę do rurki wejściowej z zaciskiem otwartym i powoli napełniać, aż płyn dotrze do końca rurki. Przymocuj wolny koniec rurki wejściowej do płyty TI i kontynuuj delikatne ładowanie pozostałej objętości. Zamknij wejście clamp po zakończeniu.

Odłączyć strzykawkę o pojemności jednego mililitra i podłączyć rurkę wejściową do pompy strzykawkowej. Przymocuj rurkę wyjściową do czystej stożkowej rurki o pojemności 1.5 mililitra w celu zbierania komórek. Dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,09 mililitra na minutę.

Przechylić płytkę TI o około 30 stopni w kierunku strony pompy strzykawkowej za pomocą platformy do biegania z płytą TI. Ostrożnie zwolnij zacisk na wężu wejściowym. Uruchomić pompę strzykawkową, uważnie obserwując, jak napełnia się płytka TI.

Gdy płyta TI zostanie całkowicie napełniona, przechyl ją o około 30 stopni w przeciwnym kierunku podczas opróżniania. Gdy wszystkie komórki w cieczy znajdą się w stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 mililitra, zatrzymaj pompę. Aby umyć płytkę TI, odłącz rurkę wejściową od pompy strzykawkowej i podłącz ją do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej 600 mikrolitrami FBS.

Napełniaj, aż FBS zostanie w pełni załadowany. Następnie odłączyć strzykawkę i podłączyć rurkę do pompy strzykawki. Dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawki na 0.49 mililitra na minutę.

Zwolnij zacisk wejściowy i uruchom płytkę TI, zbierając pranie w tej samej stożkowej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Delikatnie przesuwaj lub stukaj w płytkę TI przez cały czas, aby pomóc w odłączeniu i elucji wszelkich przylegających komórek podczas opróżniania płytki. Odłącz stożkową rurkę zbiorczą o pojemności 1,5 mililitra od zestawu płytek TI.

Obracać probówkę zbiorczą w laboratoryjnym mikrofugowaniu z prędkością 250 razy G przez osiem minut i wyrzucić supernatant. Aby przeprowadzić nocną koinkubację PBMC z antygenem, najpierw ponownie zawieś PBMC i osad komórek nowotworowych w dwóch mililitrach przezroczystego RPMI uzupełnionego 15% autologiczną surowicą mysią. Następnie umieść komórki w sterylnym naczyniu o średnicy 35 milimetrów bez hodowli tkankowej i inkubuj przez noc w standardowych warunkach hodowli tkankowej.

Następnego dnia ostrożnie oderwij wszelkie przylegające komórki od dna naczynia za pomocą skrobaka do kultur tkankowych. Obracaj naczynie podczas skrobania, aby zapewnić równomierne zbieranie komórek. Zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce.

Dodaj dwa mililitry PBS do naczynia i powtórz etap skrobania, zbierając komórki do tej samej probówki. Opłucz 35-milimetrowe naczynie jednym mililitrem PBS i dodaj płukanie do tej samej probówki. Wirować z prędkością 250 razy w standardowej wirówce do hodowli tkankowych przez 10 minut, aby zebrać komórki.

Ostrożnie odpipetować supernatant, a następnie przesunąć probówkę, aby ponownie zawiesić osad. Terapia wykazała zmniejszenie wzrostu guza YUMM1.7 u ponad 100 leczonych myszy w porównaniu z kontrolnymi, co zaobserwowano w skumulowanych danych dotyczących wzrostu guza z dziewięciu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w ciągu dwóch lat. Reprezentatywne krzywe wzrostu guza dla poszczególnych zwierząt w ramach jednego eksperymentu dają poczucie zmienności w systemie.

Gdy monocyty lub płytki krwi są zubożone z frakcji PBMC lub gdy pominięto pasaż płytki, efekt terapeutyczny nie jest już obserwowany. Leczenie jest nieskuteczne w przypadku braku komórek odpornościowych lub źródła antygenu lub w obecności niedopasowanego antygenu, takiego jak guzy YUMM1.7 leczone przy użyciu komórek raka jelita grubego MC38. Aby uzyskać wynik szczepienia, ważne jest również, aby unikać narażenia PBMC na 8-metoksypsoralen.

Analiza FACS zmiany wskazanych markerów z odpowiadających im kontroli IgG w ludzkich komórkach CD11c+ wśród świeżo wyizolowanych PBMC, PBMC traktowanych TI, PBMC traktowanych TI bez pasażu płytki, zubożonych płytek krwi przed pasażem płytki lub obu powyższych, wykazała, że aktywacja DC zależy od obecności płytek krwi w PBMC i od pasażu płytki TI. Aktywowane przez TI ludzkie DC mogą skutecznie przetwarzać i prezentować krzyżowo antygeny peptydowe lub antygeny z całych ludzkich komórek nowotworowych narażonych na działanie 8-metoksypsoralenu w celu aktywacji linii limfocytów T specyficznych dla ludzkiego antygenu w testach in vitro w sposób zależny od TI i płytek krwi. Swoistość odpowiedzi limfocytów T zależy od źródła przetwarzanych antygenów.

Podczas indukowania odporności przeciwnowotworowej apoptoza każdej linii komórek rakowych musi być miareczkowana, aby zmaksymalizować immunogenność. Ponieważ odporność indukowana będzie specyficzna dla antygenów uodparniających, możliwa będzie szczegółowa analiza każdego układu. Każdy eksperymentalny lub kliniczny nowotwór i każda odpowiedź przeciwdrobnoustrojowa będą miały unikalne źródło informacji.

Każdy pojedynczy ludzki nowotwór ma swój własny zestaw antygenów specyficznych dla nowotworu. Doktor medycyny przeprowadza niezbędne sortowanie i prezentację antygenów nowotworowych, bez konieczności ich wcześniejszej identyfikacji laboratoryjnej. Należy pamiętać, że światło 8-MOP i UVA są substancjami rakotwórczymi.

Używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego i przestrzegaj procedur bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z 8-MOP oraz podczas pracy ze źródłami światła UVA.