Name: Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj metodę generowania fizjologicznych komórek dendrytycznych PhDC do immunoterapii nowotworowej z wykorzystaniem urządzenia TI. Technika ta umożliwia silne odpowiedzi przeciwnowotworowe u ludzi i myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH-NCI Spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); Dotacja na wsparcie Centrum Onkologii NIH 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); stypendium szkoleniowe Instytutu Medycznego Howarda Hughesa (A. Vassall); oraz NY Cardiac Foundation (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Częściowego wsparcia udzielił M. Bosenbergowi R01 CA196660-01.
Autorzy są wdzięczni dr Robertowi Tigelaarowi za jego mentoring, wskazówki i eksperymentalne spostrzeżenia. Dziękujemy naszym kolegom z Fraunhofer IBMT, w szczególności dr Thorstenowi Knollowi, za opracowanie i dostarczenie komory TI odpowiadającej ECP. Nicholas Theodosakis uprzejmie pomógł w początkowych etapach eksperymentów YUMM. Dziękujemy naszym wolontariuszom krwiodawcom, Inger Christensen i jej profesjonalnemu personelowi w Yale ECP Treatment Center, za pomoc w ochotniczym pobieraniu krwi. Dr Wendell Yarbrough i dr Natalia Issaeva uprzejmie podzielili się z nami liniami komórkowymi SCC61 i SCC61-E6/7. Za pomoc techniczną w projekcie dziękujemy dr Julii Lewis za porady dotyczące protokołu FACS oraz E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote z Yale FACS Core. Obrazy filmowe komórek wewnątrz płytki TI zostały uzyskane z pomocą dr Felixa Rivery-Moliny z Wydziału Biologii Komórki i Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Produkcja filmu była nadzorowana przez Andrew Osborne'a, starszego producenta wideo w Biurze Komunikacji w Yale School of Medicine.

Wszystkie opisane tutaj metody myszy zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Yale, w porozumieniu z National Institutes of Animal Healthcare Guidelines. Wszystkie badania na ludziach przeprowadzono z krwią oddaną przez zdrowych ochotników, za pisemną świadomą zgodą. Badania nad krwią ludzką zostały przeprowadzone zgodnie z uznanymi wytycznymi etycznymi (np. Deklaracją Helsińską, CIOMS, Raportem Belmonta, Wspólnymi Regułami Stanów Zjednoczonych) i zostały zatwierdzone przez Yale Human Investigational Review Board na podstawie protokołu numer 0301023636.
UWAGA: Poniżej znajduje się protokół opisujący transimmunizację w terapii przeciwnowotworowej mysich guzów syngenicznych.
1. Implantacja guza syngenicznego YUMM1.7
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z ustalonymi protokołami, aby wszczepić guzy syngeniczne w boki myszy, zgodnie z interesującą linią komórek nowotworowych. 
	nuta: Poniższy protokół opisuje mysi model czerniaka YUMM1.7 C57BL/6. Komórki czerniaka YUMM1.7 zostały dzięki uprzejmości dr Bosenberga, Yale18.</li>
	<li>Rozmrozić zamrożoną porcję komórek i użyć komórek po jednym pasażu komórkowym. Hodowla świeżo rozmrożonych komórek YUMM1.7 w zmodyfikowanej pożywce F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych, w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2 ).
	<ol>
		<li>Zbierz komórki YUMM1.7 w zbiegu 60-70%, dodając tyle trypsyny-EDTA, aby pokryć dno płytki lub kolby do hodowli komórkowej (np. 4 ml dla kolby T75).</li>
		<li>Odpocznij naczynia do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej przez 3–4 minuty, delikatnie stukając od czasu do czasu w dno lub boki naczynia, aby pomóc w odłączeniu komórek.</li>
		<li>Dodać 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 4 ml kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby zatrzymać reakcję po odłączeniu większości komórek. Zebrać komórki, pipetując do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłukać kolbę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodać płukanie do tej samej probówki zbiorczej. Napełnij probówkę do 15 ml PBS.</li>
		<li>Wyjmij małą porcję i policz komórki.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do hodowli tkankowych, aby zebrać komórki nowotworowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki YUMM1.7 w PBS o gęstości 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 x 105 komórek nowotworowych YUMM1.7 podskórnie w 100 μl PBS w prawe boki biorcy 4 do 6-tygodniowego samca C57BL/6J myszy typu dzikiego C57BL/6J, znieczulonego zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. 3\u20125% gaz wziewny izofluranu, znieczulenie potwierdzone brakiem odruchu szczypania tylnej łapy).</li>
	<li>Monitoruj objętość guza za pomocą dwutygodniowych pomiarów prostopadłych średnic i wysokości guza za pomocą suwmiarki. Obliczać YUMM1.7 (objętość guza jako długość guza x szerokość x wysokość)/2.</li>
	<li>Rozpocznij terapię transimmunizacyjną, gdy guzy stają się po prostu wyczuwalne; w przypadku guzów YUMM1.7 jest to zwykle dzień 7-10 po implantacji guza.</li>
</ol>
2. Pobieranie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do transimmunizacji
<ol>
	<li>Zbierz 100\u2012150 μl krwi od każdej myszy z guzem poprzez krwawienie z policzka.</li>
	<li>Podczas pobierania krwi należy zebrać krew z każdej grupy leczonej myszami (każde 5 myszy eksperymentalnych + 5 myszy kontrolnych) w jednej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5000 U/ml heparyny. Użyj 10 μl 10% heparyny na 100 μl pobranej krwi. 
	nuta: Często mieszaj probówkę podczas pobierania, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Podczas gdy myszy kontrolne z guzem mogą być wykrwawiane w tym samym czasie co myszy eksperymentalne, aby zapewnić równe warunki z grupą badaną, krew "kontrolna" może zostać albo odrzucona, albo połączona z krwią grupy leczonej w celu zapewnienia dodatkowego eksperymentalnego PBMC dla grupy leczonej, według uznania badaczy.</li>
	<li>Ustaw jedną probówkę o pojemności 15 ml z 4 ml pożywki do izolacji limfocytów (patrz tabela materiałów) na 5\u201210 wykrwawionych myszy. Powoli nakładaj warstwę krwi (pobranej od myszy z nowotworem) na wierzchu pożywki. Wiruj komórki przez 20 minut w temperaturze 1,000-500 x g, aby oddzielić PBMC od czerwonych krwinek.</li>
	<li>Pod koniec wirowania zebrać górną warstwę osocza, pozostawiając ~0,5 ml pozostałego nad kożuchem i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia (krok 7.1).</li>
	<li>Zebrać warstwę kożucha do czystej probówki o pojemności 15 ml, napełnić PBS do 15 ml i wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do hodowli tkankowych, aby zebrać PBMC.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad, przesuwając rurkę. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać utracony. Dodać 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek ACK (patrz Tabela Materiałów) do probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe czerwone krwinki z PBMC. Inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Napełnij probówkę PBS do 15 ml i wiruj przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do kultur tkankowych w celu zebrania PBMC.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad przez strzepnięcie. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać zgubiony. 
	nuta: Na tym etapie oczyszczony PBMC może być modyfikowany tak, jak najlepiej pasuje do eksperymentu. Różne składniki PBMC (płytki krwi, monocyty, inne typy komórek odpornościowych) mogą być zubożone lub wyizolowane z PBMC w razie potrzeby. Również sam PBMC może być narażony na działanie 8-MOPA, przed lub po sekcji 4 (przed lub po przejściu płytki - po sekcji 2 lub przed sekcją 5), postępując zgodnie z krokami protokołu 3.3\u20123.8 i podstawiając PBMC na komórki YUMM1.7. Spowoduje to zmniejszenie zdolności immunogennej leczenia i zamiast tego będzie promować tolerancję immunologiczną.</li>
	<li>Dla każdej grupy badanej (każde 5 myszy eksperymentalnych + 5 myszy kontrolnych) ponownie zawiesić osad PBMC w 300 μl FBS.</li>
</ol>
3. Leczenie komórek nowotworowych metodą 8-MOP/UVA
<ol>
	<li>Hoduj i zbieraj komórki nowotworowe YUMM1.7 zgodnie z opisem w krokach 1.2–1.3, aby przygotować źródło antygenu komórek nowotworowych narażone na 8-MOPA.</li>
	<li>Przygotuj 2,5 x 106 komórek nowotworowych YUMM1,7 na grupę leczoną 5 myszy. Dla każdej grupy leczonej ponownie zawieś osad komórek nowotworowych w FBS w temperaturze 2,5 x 106 komórek/300 μL (~8,33 x 106 komórek/ml).</li>
	<li>Przy wyłączonych światłach okapu do hodowli tkankowej dodać 8-MOP (patrz tabela materiałów) do zawiesiny komórek nowotworowych YUMM1.7, aby uzyskać końcowe stężenie 8-MOP 100 ng / mL. 
	UWAGA: 8-MOP jest fotoaktywowanym środkiem uszkadzającym DNA i rakotwórczym. Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się i dozowania, unikaj kontaktu z odsłoniętą skórą i odpowiednio wyrzuć.</li>
	<li>Dobrze wymieszać komórki, owinąć pojemnik na komórki folią aluminiową i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wstępnie pokryj 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, wypełniając jedną studzienkę dla każdej grupy 5 myszy poddanych działaniu substancji (2,5 x 106 komórek nowotworowych YUMM1,7) 1 ml FBS i przechowuj wypełnioną płytkę w lodówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Włącz źródło światła UVA, aby je wstępnie ogrzać. 
	ostrożność: Światło UVA jest czynnikiem rakotwórczym. Podczas pracy ze źródłami światła UVA pracuj szybko i ostrożnie, chroń skórę przed ekspozycją i używaj osłon twarzy lub okularów do ochrony twarzy i oczu.</li>
	<li>Po 20 minutach przenieś schłodzoną 12-dołkową płytkę (krok 3.5) do okapu do hodowli tkankowej, usuń FBS z dołków i dodaj 300 μl (2,5 x 106 komórek/dołek) komórek nowotworowych narażonych na MOP (od kroku 3.4) do dołka.</li>
	<li>Wystawić płytkę zawierającą ogniwa na działanie wstępnie ogrzanego źródła światła UVA, aby uzyskać całkowite napromieniowanie 4 J/cm2. 
	nuta: Opisane tutaj stężenie 8-MOP i dawka UVA są skalibrowane dla linii komórek nowotworowych YUMM1.7. Miareczkowanie dawki 8-MOP/UVA, wystarczającej do spowodowania 100% śmierci komórek nowotworowych w ciągu 1 tygodnia od ekspozycji, powinno być przeprowadzone dla każdej eksperymentalnej linii komórek nowotworowych, w celu określenia skutecznej dawki zabijającej. Jest to niezwykle ważne dla eksperymentów TI in vivo na myszach, ponieważ komórki są ponownie wstrzykiwane po orbicie (krok 6.1), a zatem wszelkie nieuszkodzone komórki nowotworowe mogą w przeciwnym razie tworzyć guzy oka u leczonego zwierzęcia. Jako wskazówkę, 4\u20128 J/cm2 UVA, 100\u2012200 ng/mL 8-MOP, jest typowym efektywnym zakresem dla większości linii komórek nowotworowych.</li>
	<li>Zbierz komórki nowotworowe poddane działaniu8-MOP A z każdej studzienki, obracając płytką i ostrożnie pipetując, aby zapewnić całkowite odzyskanie komórek.</li>
</ol>
4. Płyta TI Przejście komórek
<ol>
	<li>Dla każdej grupy leczonej 5 myszy połączyć w jednej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml 300 μl odpowiedniego PBMC (z kroku 2.11) i 300 μl komórek nowotworowych traktowanych 8-MOPA (z kroku 3.9). Wymieszaj komórki.</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 10 ml, aby napełnić zestawy "wejściowe" i "wyjściowe" rurki TI (patrz 
	Tabela materiałów) z FBS. Otwórz rurkę clamps, aby napełnić rurki, i zamknij zaciski po napełnieniu rurek przed odłączeniem strzykawki, aby utrzymać FBS wewnątrz rurki.</li>
	<li>Użyj pipety P1000, aby dodać mieszaninę PBMC i komórek nowotworowych (z kroku 4.1) do płytki TI (patrz Tabela materiałów). Trzymaj płytkę pod kątem 45°, umieść końcówkę pipety bezpiecznie we wlocie płytki TI i powoli napełniaj płytkę, unikając pęcherzyków.</li>
	<li>Wyjąć końcówkę pipety z wlotu przed zwolnieniem tłoka pipety. Płytka mieści 450 μl; Pozostałe komórki umieścić z powrotem w stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Inkubować rurkę wypełnioną FBS, płytkę TI wypełnioną komórkami i stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Po inkubacji opróżnij rurkę TI grawitacyjnie, zwalniając zaciski.</li>
	<li>Użyj pipety P1000, aby usunąć komórki z płytki TI, wkładając końcówkę pipety z tłokiem wciśniętym w port płytki. Trzymaj płytkę pod kątem 45° i napełnij końcówkę pipety P1000. Umieść komórki z powrotem w ich oryginalnej stożkowej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Aby uruchomić płytę TI, podłącz rurkę wyjściową do płyty i przymocuj płytę TI do systemu jezdnego płyty.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml pobrać 600 μl mieszaniny PBMC i komórek nowotworowych z stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml, pozbyć się wszelkich pęcherzyków ze strzykawki, przymocować strzykawkę do rurki wejściowej z otwartym zaciskiem i powoli napełniać, aż płyn dotrze do końca rurki.</li>
	<li>Przymocuj wolny koniec rurki wejściowej do płyty TI i kontynuuj delikatne ładowanie pozostałej objętości. Zamknij wejście clamp.</li>
	<li>Odłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml i podłączyć rurkę wejściową do pompy strzykawkowej. Przymocuj rurkę wyjściową do czystej stożkowej rurki o pojemności 1.5 ml w celu pobrania komórek.</li>
	<li>Wyreguluj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,09 ml/min, ale nie uruchamiaj jeszcze pompy. Przechylić płytkę TI o ~30° w kierunku strony pompy strzykawkowej, używając platformy do biegania z płytką TI lub w dowolny inny sposób (np. mały płaski przedmiot pod jednym końcem płytki).</li>
	<li>Ostrożnie zwolnij zacisk na wężu wejściowym. Uruchomić pompę strzykawkową, uważnie obserwując, jak napełnia się płytka TI i w razie potrzeby przesunąć rurkę lub płytkę, jeśli pęcherzyki powietrza utrudniają przepływ.</li>
	<li>Gdy płyta TI zostanie całkowicie napełniona, przechyl ją o ~30° w przeciwnym kierunku podczas opróżniania. Gdy wszystkie komórki i płyn znajdą się w stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml, zatrzymaj pompę.</li>
	<li>Aby umyć płytkę TI, odłącz rurkę wejściową od pompy strzykawkowej, podłącz do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 600 μl FBS i postępuj zgodnie z procedurą dla kroków 4.8\u20124.9.</li>
	<li>Wyreguluj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0.49 ml/min, zwolnij wejście clamp i uruchom płytkę TI zgodnie z opisem w krokach 4.12\u20124.13, zbierając płyn do tej samej stożkowej probówki o pojemności 1.5 ml. Delikatnie przesuwaj lub stukaj w płytkę TI przez cały czas, aby pomóc w odłączeniu i elucji wszelkich przylegających komórek.</li>
	<li>Obracać stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml w laboratoryjnym mikrofugowaniu o sile 250 x g przez 8 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
</ol>
5. Przygotowanie autologicznej surowicy mysiej do nocnego podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>Pobrać krew od 10-12-tygodniowych myszy C57BL/6J dowolną metodą zatwierdzoną przez instytucję (np. krwawienie z oka, krwawienie z żyły ogonowej, krwawienie z policzka lub końcowe wykrwawienie przez nakłucie serca), bez żadnych antykoagulantów. Oszacuj pobranie 1 ml krwi na każde potrzebne 300 μl surowicy. 
	nuta: Potrzeba 300 μl surowicy na każdą grupę leczoną 5 myszy w eksperymencie.</li>
	<li>Pozostawić krew do krzepnięcia przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirowywać zakrzepłą krew w ilości 3 000 x g przez 15 minut. Ostrożnie zebrać wierzchnią warstwę zawierającą surowicę 
	nuta: Surowicę można natychmiast wykorzystać do przygotowania pożywki do inkubacji komórek przez noc (krok 6.1) lub zachować do przyszłych eksperymentów. Aby zachować surowicę, zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Nocna koinkubacja PBMC z antygenem
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić PBMC i osad komórek nowotworowych (krok 4.5) w 2 ml przezroczystego RPMI z 15% autologiczną surowicą myszy (przygotowaną w kroku 5). Płytkę umieścić w sterylnym naczyniu o średnicy 35 mm bez hodowli tkankowej i inkubować przez noc w standardowych warunkach hodowli tkankowej (37 °C, 5% CO2 ). 
	nuta: Jeśli PBMC jest używany z antygenem niekomórkowym (peptyd, nanocząstka, białko itp.), należy pominąć sekcję 3 protokołu i przejść z sekcji 2 bezpośrednio do sekcji 4, dodając pożądany antygen do PBMC przepuszczonego przez płytkę TI w celu koinkubacji przez noc w kroku 6.1.</li>
	<li>Następnego dnia ostrożnie odłącz wszelkie przylegające komórki od dna naczynia za pomocą skrobaka do kultur tkankowych, obracając naczynie podczas skrobania, aby zapewnić równomierne zbieranie komórek. Zbierz komórki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj 2 ml PBS do naczynia i powtórz etap skrobania, zbierając komórki do tej samej probówki. Opłucz naczynie o średnicy 35 mm 1 ml PBS i dodaj płukankę do tej samej probówki.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 250 x g w standardowej wirówce do kultur tkankowych w celu zebrania komórek. Ostrożnie odpipetować supernatant i ponownie zawiesić osad, przesuwając probówkę. Nie dekantować, ponieważ granulat jest miękki i może zostać utracony.</li>
</ol>
7. Ponowna iniekcja komórek leczonych TI myszom z nowotworem
<ol>
	<li>Odwirowywać autologiczne osocze (przygotowane w kroku 2.4) w temperaturze 750 x g przez 15 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek. Zawiesić osad komórkowy (z kroku 6.4) w 600 μl osocza autologicznego lub PBS.</li>
	<li>Wstrzyknąć komórki w dawce 100 μl na mysz do splotu zaoczodołowego odpowiednio znieczulonych (np. 3\u20125% gaz wziewny izofluranu, znieczulenie potwierdzone brakiem odruchu szczypania tylnej łapy) myszy eksperymentalnych z nowotworem. Jeśli jest to pożądane, należy ponownie wstrzyknąć myszom z grupą kontrolną nowotwór 100 μl samego osocza autologicznego lub PBS.</li>
	<li>W przypadku myszy z guzem YUMM1.7 należy powtarzać zabieg (kroki 2–7.2) dwa razy w tygodniu przez 3 tygodnie, co daje w sumie 6 zabiegów. Zbieraj i przetwarzaj PBMC od myszy z nowotworem co tydzień (sekcje protokołu 2-4) w poniedziałki i czwartki, a następnie ponownie wlewaj po całonocnej inkubacji (sekcje protokołu 5-7) we wtorki i piątki. 
	nuta: Ten schemat leczenia został opracowany z myślą o specyficznej kinetyce wzrostu guzów YUMM1.7 u myszy. Może być konieczne miareczkowanie dla innych układów nowotworowych o wolniejszym lub szybszym tempie wzrostu guza - odpowiednio zwiększając lub zmniejszając liczbę zabiegów.</li>
	<li>Monitoruj objętość guza za pomocą dwutygodniowego pomiaru - najlepiej w momencie podawania terapii (wtorek i piątek) - prostopadłych średnic i wysokości guza za pomocą suwmiarki. Zakończ eksperyment, gdy kontrolne objętości guza osiągną maksymalny rozmiar dozwolony przez wytyczne i protokoły instytucjonalne.</li>
</ol>
8. Adaptacja protokołu do leczenia małych objętości krwi ludzkiej
<ol>
	<li>Dostosuj protokół do stosowania z komórkami ludzkimi, najpierw izolując PBMC od ludzkiej krwi. Stosuj heparynę jako antykoagulant, z dowolnym preferowanym protokołem izolacji PBMC.</li>
	<li>Upewnij się, że wyizolowana frakcja PBMC zawiera fizjologiczną liczbę płytek krwi, aby uzyskać najlepsze wyniki protokołu. Monitoruj liczbę płytek krwi przed i po izolacji PBMC za pomocą dowolnego standardowego licznika hematologicznego.</li>
	<li>W przypadku korzystania ze źródła ludzkiego antygenu komórkowego należy traktować ludzkie komórki antygenowe zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 3 dla komórek YUMM1.7. Miareczkować odpowiednio dawki 8-MOP i UVA.</li>
	<li>Wykonać etapy przejścia płytki opisane w rozdziale 4, używając do 3 x 107 PBMC na płytkę TI.</li>
	<li>Hodowla PBMC przez noc z komórkowym/innym wybranym antygenem, jak opisano w punkcie 6, ale zastąp 15% ludzką surowicę AB autologicznym osoczem myszy pożywką do hodowli przez noc w kroku 6.1.</li>
	<li>Użyj otrzymanych komórek w dowolnym teście. Na przykład współhodowla z limfocytami T reagującymi na antygen w celu obserwacji odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu zainicjowanych przez komórki traktowane TI.</li>
</ol>

<ol><li>Edelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+cutaneous+T-cell+lymphoma+by+extracorporeal+photochemotherapy.+Preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment of cutaneous T-cell lymphoma by extracorporeal photochemotherapy. Preliminary results.</a> The New England Journal of Medicine. 316 (6), 297-303 (1987).</li>
<li>Berger, C. L., Wang, N., Christensen, I., Longley, J., Heald, P., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+class+I-associated+tumor-specific+cutaneous+T-cell+lymphoma+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The immune response to class I-associated tumor-specific cutaneous T-cell lymphoma antigens.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 107 (3), 392-397 (1996).</li>
<li>Scarisbrick, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicentre+UK+study+of+GVHD+following+DLI%3A+rates+of+GVHD+are+high+but+mortality+from+GVHD+is+infrequent%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A multicentre UK study of GVHD following DLI: rates of GVHD are high but mortality from GVHD is infrequent.</a> Bone Marrow Transplantation. 50 (1), 62-67 (2015).</li>
<li>Barten, M. J., Dieterlen, M. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+photopheresis+after+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal photopheresis after heart transplantation.</a> Immunotherapy. 6 (8), 927-944 (2014).</li>
<li>Heald, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+erythrodermic+cutaneous+T-cell+lymphoma+with+extracorporeal+photochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Treatment of erythrodermic cutaneous T-cell lymphoma with extracorporeal photochemotherapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 27 (3), 427-433 (1992).</li>
<li>Ratcliffe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health+State+of+the+Science+Symposium+in+Therapeutic+Apheresis%3A+Scientific+Opportunities+in+Extracorporeal+Photopheresis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health State of the Science Symposium in Therapeutic Apheresis: Scientific Opportunities in Extracorporeal Photopheresis.</a> Transfusion Medicine Reviews. 29 (1), 62-70 (2015).</li>
<li>Edelson, R., Wu, Y., Schneiderman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+council+on+ECP+%28ACE%29%3A+Why+now%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">American council on ECP (ACE): Why now?</a> Journal of Clinical Apheresis. , (2018).</li>
<li>Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+extracorporeal+photochemotherapy%3A+Efficient+induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into extracorporeal photochemotherapy: Efficient induction of monocyte-to-dendritic cell maturation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 322-329 (2014).</li>
<li>Gasparro, F. P., Dall’Amico, R., Goldminz, D., Simmons, E., Weingold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+aspects+of+extracorporeal+photochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Yale+journal+of+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular aspects of extracorporeal photochemotherapy.</a> The Yale journal of biology and medicine. 62 (6), 579(1989).</li>
<li>Bevilacqua, P. M., Edelson, R. L., Gasparro, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromotography+analysis+of+8-methoxypsoralen+monoadducts+and+crosslinks+in+lymphocytes+and+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromotography analysis of 8-methoxypsoralen monoadducts and crosslinks in lymphocytes and keratinocytes.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 97 (1), 151-155 (1991).</li>
<li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+Photochemotherapy+Drives+Monocyte-to-Dendritic+Cell+Maturation+to+Induce+Anticancer+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal Photochemotherapy Drives Monocyte-to-Dendritic Cell Maturation to Induce Anticancer Immunity.</a> Cancer Research. 78 (14), 4045-4058 (2018).</li>
<li>Perez, M., Lobo, F. M., Yamane, Y., John, L., Berger, C. L., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+antiskin+allograft+immunity+induced+by+infusions+with+photoinactivated+effector+T+lymphocytes+%28PET+cells%29.+Is+in+vivo+cell+transferrable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of antiskin allograft immunity induced by infusions with photoinactivated effector T lymphocytes (PET cells). Is in vivo cell transferrable?</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 636 (1), 95-112 (1991).</li>
<li>Girardi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transimmunization+for+cutaneous+T+cell+lymphoma%3A+A+phase+I+study%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transimmunization for cutaneous T cell lymphoma: A phase I study.</a> Leukemia & Lymphoma. 47 (8), 1495-1503 (2006).</li>
<li>Durazzo, T. S., Tigelaar, R. E., Filler, R., Hayday, A., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+monocyte-to-dendritic+cell+maturation+by+extracorporeal+photochemotherapy%3A+Initiation+via+direct+platelet+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Induction of monocyte-to-dendritic cell maturation by extracorporeal photochemotherapy: Initiation via direct platelet signaling.</a> Transfusion and Apheresis Science. 50 (3), 370-378 (2014).</li>
<li>Gonzalez, A. L., Berger, C. L., Remington, J., Girardi, M., Tigelaar, R. E., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-driven+monocyte+to+dendritic+cell+conversion+in+modified+extracorporeal+photochemotherapy%3A+ECP+activation+of+monocytes+by+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrin-driven monocyte to dendritic cell conversion in modified extracorporeal photochemotherapy: ECP activation of monocytes by fibronectin.</a> Clinical & Experimental Immunology. 175 (3), 449-457 (2014).</li>
<li>Kibbi, N., Sobolev, O., Girardi, M., Edelson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+anti-tumor+CD8+T+cell+responses+by+experimental+ECP-induced+human+dendritic+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Induction of anti-tumor CD8 T cell responses by experimental ECP-induced human dendritic antigen presenting cells.</a> Transfusion and Apheresis Science. 55 (1), 146-152 (2016).</li>
<li>Maeda, A., Schwarz, A., Bullinger, A., Morita, A., Peritt, D., Schwarz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Extracorporeal+Photopheresis+Inhibits+the+Sensitization+and+Effector+Phases+of+Contact+Hypersensitivity+via+Two+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Generation+of+IL-10+and+Induction+of+Regulatory+T+Cells.+The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Experimental Extracorporeal Photopheresis Inhibits the Sensitization and Effector Phases of Contact Hypersensitivity via Two Mechanisms.</a> Generation of IL-10 and Induction of Regulatory T Cells. The Journal of Immunology. 181 (9), 5956-5962 (2008).</li>
<li>Meeth, K., Wang, J., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YUMM+lines%3A+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , (2016).</li>
<li>Gubanova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+SMG-1+in+HPV-Positive+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma+Due+to+Promoter+Hypermethylation+Correlates+with+Improved+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of SMG-1 in HPV-Positive Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Due to Promoter Hypermethylation Correlates with Improved Survival.</a> Clinical Cancer Research. 18 (5), 1257-1267 (2012).</li>
<li>Berger, C. L., Perez, M., Laroche, L., Edelson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Autoimmune+Disease+in+a+Murine+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+Induced+by+Exposure+to+Syngeneic+Photoinactivated+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Autoimmune Disease in a Murine Model of Systemic Lupus Erythematosus Induced by Exposure to Syngeneic Photoinactivated Lymphocytes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 94 (1), 52-57 (1990).</li>
<li>Spisek, R., Gasova, Z., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+state+of+dendritic+cells+during+the+extracorporeal+photopheresis+and+its+relevance+for+the+treatment+of+chronic+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Maturation state of dendritic cells during the extracorporeal photopheresis and its relevance for the treatment of chronic graft-versus-host disease.</a> Transfusion. 46 (1), 55-65 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+maturationally+synchronized+human+dendritic+cells%3A+contribution+to+the+clinical+efficacy+of+extracorporeal+photochemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of maturationally synchronized human dendritic cells: contribution to the clinical efficacy of extracorporeal photochemotherapy.</a> Blood. 116 (23), 4838-4847 (2010).</li>
</ol>

Uniwersytet Yale jest właścicielem patentów wywodzących się z badań nad komórkami dendrytycznymi prof. Richarda Edelsona, które zostały licencjonowane przez start-up z Yale, Transimmune AG. Richard Edelson i Michael Girardi są konsultantami naukowymi Transimmune AG, a Olga Sobolev jest pracownikiem Transimmune AG. Firma Transimmune AG nie posiada obecnie żadnych produktów komercyjnych, jednak we współpracy produkuje płytki Transimmune użyte w tym artykule. Niewykluczone, że ci trzej autorzy mogliby potencjalnie skorzystać na komercjalizacji tych odkryć w przyszłości.

Zminiaturyzowane urządzenie i opisany powyżej protokół po raz pierwszy pozwalają na efektywne badanie laboratoryjne mechanizmów ECP w mysich układach doświadczalnych oraz w małych próbkach krwi ludzkiej. To wielki postęp; Na przykład pozwoliło nam to po raz pierwszy zademonstrować skuteczność transimmunizacji przeciwko guzom litym w mysim modelu 11, otwierając przyszłą możliwość podobnego zastosowania w onkologii u ludzi.
Przed opracowaniem opisanego tutaj urządzenia i metody transimmunizacji niemożliwe było pełne zbadanie wszystkich aspektów ECP. W modelach mysich, chociaż aspekt terapii 8-MOPA można było nieco odtworzyć poprzez traktowanie komórek na szalce Petriego12,20, nie było zdolności do zintegrowania z metodą pasażu płytki, która, jak wykazano, zapewnia dynamiczne interakcje płytek krwi, które są krytycznie ważne dla fizjologicznej aktywacji ECP DC14. W badaniach na ludziach, alternatywnie, składnik przepływu był w pełni obecny, ale brakowało zdolności do selektywnego wystawiania określonych składników komórkowych na działanie 8-MOPA lub ochrony przed nim21,22. Uniemożliwiało to pełne zrozumienie mechanizmu ECP i jego optymalizację pod kątem odporności czy tolerancji. Ponadto ilość krwi potrzebna do pracy z klinicznym aparatem ECP jest duża, co utrudnia badania naukowe. Opisane tutaj po raz pierwszy zminiaturyzowane urządzenie i protokół ECP pozwalają na wydajne, w pełni elastyczne i przestrajalne laboratoryjne modelowanie ECP. Ponadto płytka TI pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym i monitorowanie interakcji komórek w płytce za pomocą mikroskopii.
Aby protokół zakończył się sukcesem przy użyciu zarówno systemów in vivo, jak i ex vivo, niezwykle ważne jest, aby leczony PBMC zawierał monocyty, które mogą być aktywowane do funkcjonalnych DC. Aby ta aktywacja mogła przebiegać, konieczne jest również upewnienie się, że frakcja PBMC zawiera fizjologiczną liczbę zdrowych, aktywowanych płytek krwi oraz że protokół pasażu płytki TI jest ściśle przestrzegany. Aby skierować nowo aktywowane DC w kierunku określonej reaktywności, należy je zaopatrzyć w antygen. Odkryliśmy, że najbardziej efektywną metodą dostarczania antygenu w celu uzyskania odporności przeciwnowotworowej jest nocna koinkubacja nowo aktywowanych DC z komórkami nowotworowymi zawierającymi antygen 8-MOPA. Ma to tę dodatkową zaletę, że jest w stanie stworzyć immunogenną odpowiedź przeciwnowotworową bez konieczności wcześniejszej wiedzy na temat antygenów nowotworowych, umożliwiając DC ich selekcję. Jednak w przypadkach, gdy antygen jest znany, odnieśliśmy pewien sukces w systemach ex vivo, gdy używaliśmy wolnych peptydów jako antygenów we wspólnej inkubacji. W przypadku zastosowań immunogennych same DC powinny być chronione przednarażeniem na 8-MOP A. Wreszcie, w eksperymentach in vivo, ważne jest, aby pracować z modelem zwierzęcym, który jest zdolny do odporności przeciwnowotworowej. Transimmunizacja działa poprzez tworzenie aktywowanych, specyficznych dla antygenu DC , które działają w organizmie w celu zainicjowania wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Upośledzona aktywność lub brak limfocytów T NK, CD4 lub CD8 u leczonej myszy wpłynie na skuteczność protokołu 5,11.
Chociaż opisany tutaj protokół jest dowodem słuszności zasady, który został zoptymalizowany dla mysiego modelu guza syngenicznego litego, niemniej jednak ujawnia wiele możliwości. Mechanizmy ECP w onkologii dopiero się wyjaśniają i wciąż jest wiele miejsca na lepsze zrozumienie. W szerszym ujęciu, zdolność do generowania fizjologicznie aktywowanych mysich i ludzkich DC oraz selektywnego kierowania ich w kierunku odporności specyficznej dla antygenu ma wiele potencjalnych zastosowań poza rakiem. Zdolność do zrobienia tego samego, ale zamiast tego skierowania DC w kierunku tolerancji specyficznej dla antygenu, jak sugeruje tolerancyjna skuteczność samego ECP, ma również szerokie implikacje medyczne. Mamy nadzieję, że dzięki tej metodzie dostarczymy narzędzi i otworzymy produktywną ścieżkę badań dla każdego, kto jest zainteresowany fizjologicznymi terapiami DC.

Pozaustrojowa fotochemioterapia (ECP) to uznana immunoterapia, która jest szeroko stosowana w ośrodkach uniwersyteckich na całym świecie. Jego zastosowanie było napędzane wyjątkową selektywnością, bezpieczeństwem i dwukierunkową skutecznością terapii ECP, cechami, które ECP dzieli z samym fizjologicznym układem odpornościowym, z którym wydaje się współpracować. ECP selektywnie uodparnia przeciwko komórkom nowotworowym w chłoniaku skórnym z komórek T (CTCL)1,2 i selektywnie toleruje dla docelowych antygenów w ustawieniach przeszczepu, autoimmunizacji i choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)3,4. Immunogenność ECP jest podkreślona przez jego zależność od nienaruszonego przedziału limfocytów T CD8 w CTCL5, podczas gdy swoistość znajduje odzwierciedlenie w bardzo korzystnym profilu działań niepożądanych ECP, bez supresji immunologicznej poza celem w warunkach przeszczepu lub GvHD i bez zwiększonej podatności na infekcje oportunistyczne w CTCL, gdzie niepatogenne klony komórek T mogą potencjalnie zostać utracone wraz ze złośliwymi limfocytami T.
Biorąc pod uwagę kliniczne znaczenie ECP, nadzieja, że lepsze zrozumienie jego mechanizmów może rozszerzyć zasięg terapeutyczny ECP na szersze spektrum nowotworów i zaburzeń immunologicznych, pobudziła międzynarodowe zainteresowanie. Przeprowadzono i zrelacjonowano dwa usankcjonowane przez kraj warsztaty, sympozjum National Institutes of Health (NIH) State-of-the-Science6 oraz konferencję konsensusu American Society for Apheresis7, w celu przyspieszenia identyfikacji głównych komórkowych czynników przyczyniających się do przeciwnowotworowego i tolerogennego działania ECP.
Do tej pory, pomimo licznych opublikowanych raportów próbujących rozwiązać problem mechanizmu ECP, dwie główne przeszkody utrudniły postęp naukowy. Po pierwsze, badania mechanizmów ECP w eksperymentalnych warunkach laboratoryjnych były ograniczone ze względu na brak miniaturowego urządzenia ECP, które w pełni odzwierciedlałoby efekty komórkowe i in vivo ECP oraz miałoby zastosowanie do modeli zwierzęcych. Po drugie, dogłębna analiza laboratoryjna próbek ECP w warunkach klinicznych została ograniczona przez ograniczoną dostępność komórek odpornościowych pacjentów przetwarzanych w ECP, które wymagają dostępu do ośrodków leczenia, a dodatkowo są uzależnione od czasu infuzji pacjenta, a także etycznego zapotrzebowania na bezkompromisowe zestawy leukocytów podawanych pacjentowi w infuzji.
Aby rozwiązać przeszkody utrudniające postęp badań nad ECP, postanowiliśmy opracować miniaturowy aparat ECP, który jak najwierniej naśladowałby kluczowe elementy terapii. Standardowe leczenie ECP polega na przejściu leukocytów pacjenta wzbogaconych w leukaferezę przez przezroczystą w świetle ultrafioletowym (UVA) płytkę z tworzywa sztucznego o grubości 1 mm6,8. Na płytce leukocyty są wystawione na działanie 8-metoksypsoralenu (8-MOP), czynnika fotoaktywowanego, który po ekspozycji na promieniowanie UVA jest przejściowo przekształcany w formę reaktywną (8-MOPA), zdolną do sieciowania DNA poprzez jego dwuwartościowe wiązanie z zasadami pirymidynowymi na siostrzanych niciach DNA9,10. Przetworzone, leczone 8-MOPA leukocyty są pobierane i zwracane pacjentowi dożylnie.
Ponieważ samo ECP jest terapią dwukierunkową, uodparniającą na raka i tolerującą w warunkach transplantacji, autoimmunizacji i GvHD, dla wyjaśnienia nazwaliśmy tryb immunizacji modelu ECP "transimmunizacją", a tryb tolerogenny "transtolerancją". Najpierw skupiliśmy się na modalności transimmunizacji. Nasze niedawno zgłoszone zminiaturyzowane, skalowalne urządzenie ECP typu mysz-człowiek, komora lub płytka do transimmunizacji (TI) i odpowiedni protokół, odtwarzają zarówno efekty komórkowe, jak i in vivo ludzkiego urządzenia ECP w warunkach nowotworowych11.
Aby model transimmunizacji in vivo był jak najbardziej klinicznie istotny, rozpoczęliśmy immunoterapię po tym, jak podskórnie wstrzyknięte syngeniczne guzy myszy stały się wyczuwalne, testując w ten sposób skuteczność protokołu w ustalonym raku. Podobnie jak w przypadku ECP w CTCL, protokół szczepień transimmunologicznych typu proof-of-principle w modelu czerniaka YUMM1.7 wykorzystuje komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) od zwierząt z nowotworem. Komórki są przepuszczane przez płytkę TI pod przepływem. Chociaż możliwe jest poddanie się działaniu 8-MOPA komórek w miniaturowej komorze, zaleca się przeprowadzenie go oddzielnie, aby upewnić się, że tylko pożądany typ komórek jest narażony na działanie 8-MOPA. Wcześniejsze badania wskazują, że tolerogenny efekt ECP jest pośredniczony przez komórki prezentujące antygen uszkodzony przez 8-MOPA12, podczas gdy efekt immunizujący wymaga uszkodzenia docelowych komórek nowotworowych 8-MOPA11. W protokole transimmunizacji zarówno komórki nowotworowe, jak i komórki odpornościowe mogą być selektywnie wystawione na działanie 8-MOPA w razie potrzeby. Ponieważ wykazano, że maksymalizacja czasu kontaktu między komórkami nowotworowymi uszkodzonymi przez 8-MOPA a komórkami dendrytycznymi (DC) indukowanymi przez ECP znacznie zwiększa zdolność immunoterapeutyczną klinicznej klasy ECP13, włączyliśmy do naszego protokołu etap koinkubacji przez noc. Po całonocnej inkubacji leczone komórki są zwracane zwierzęciu z nowotworem.
Ten system niezawodnie zmniejszył wzrost guza i zainicjował specyficzną odporność przeciwnowotworową u myszy z ustalonymi guzami syngenicznymi11, i pozwolił nam przeanalizować mechanizm klinicznej skuteczności przeciwnowotworowej ECP. W kilku badaniach wykazaliśmy, że odporność ECP jest inicjowana poprzez aktywację płytek krwi ex vivo w TI plate14,15. Aktywowane płytki krwi sygnalizują następnie dojrzewanie komórek monocytów do komórek dendrytycznych14, co prowadzi do produkcji fizjologicznych DC. Nowo utworzone DC pochodzące z monocytów są w stanie krzyżować zinternalizowane antygeny z komórek nowotworowych uszkodzonych przez 8-MOPA, aby aktywować odpowiedzi limfocytów T specyficzne dla antygenu16. Jak zasugerowano wcześniej12,17, jednakże, wywołane przez 8-MOPA uszkodzenia powstających DC mogą przeciwdziałać lub nawet odwrócić efekt przeciwnowotworowy11, zapewniając mechanistyczne powiązanie z tolerancją ECP.
Płytka TI została również użyta do produkcji fizjologicznie aktywowanych DC z ludzkiego PBMC. Podobnie jak w badaniach na myszach, ludzkie DC pochodzące z TI są zależne od pasażu płytki w obecności płytek krwi do ich wytwarzania, wydają się fenotypowo identyczne z tymi wytwarzanymi na klinicznej płytce ECP i są zdolne do wydajnego przetwarzania i krzyżowej prezentacji ludzkich antygenów nowotworowych w celu aktywacji ludzkich limfocytów T11,16.
Odkrywając mechanizm immunoterapii ECP, odkryliśmy metodę szybkiego generowania fizjologicznych mysich i ludzkich komórek dendrytycznych o pożądanej swoistości antygenowej, które mogą być funkcjonalnie modulowane. Innowacyjne urządzenie i protokół TI mają duże potencjalne znaczenie w dziedzinie badań i terapii ECP oraz szerzej immunoterapii nowotworów, a także w każdej innej dziedzinie zainteresowanej fizjologicznymi, funkcjonalnymi komórkami dendrytycznymi zarówno w trybie immunizacji, jak i tolerancji. Mamy nadzieję, że niniejsza publikacja dostarczy niezbędnych narzędzi osobom zainteresowanym takimi obszarami badawczymi.

<table><tbody><tr><td>8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL)</td><td>Therakos, Inc</td><td>Tylko Rx, NDC nr 64067-0216-01</td><td>Kroki protokołu 3 i 8 - mysie i ludzkie leczenie komórek 8-MOP/UVA</td></tr><tr><td>Surowica AB</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>14-498E</td><td>Protokół krok 8.5 - nocna hodowla ludzkiego PBMC</td></tr><tr><td>ACK bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>10-548E</td><td>Protokół krok 2 - przygotowanie</td></tr> <tr><td>PBMC u myszyAnestezjologiczny system stołowy V1 z aktywnym oczyszczaniem</td><td>VetEquip</td><td>901820</td><td>Kroki protokołu 1 i 7 - wprowadzenie guza sc myszy i podanie TI</td></tr><tr><td>Autologiczne osocze myszy</td><td>przygotować w laboratorium</td><td>n/a</td><td>Przygotuj się zgodnie z krokiem protokołu 2.4, użyj w&nbsp; 7.1 - podawanie leczenia TI u myszy</td></tr><tr><td>Autologiczna surowica myszy</td><td>przygotować w laboratorium</td><td>n/a</td><td>Przygotuj się zgodnie z krokiem 5 protokołu, użyj w kroku 6.1 - nocna hodowla myszy PBMC</td></tr><tr><td>C57Bl / 6J</td> Jackson <td>labs</td><td>0000664</td><td>Kroki protokołu 1, 2, 5 i 7 - wstrzyknięcie guza myszy, pobranie krwi/surowicy i powrót terapii</td></tr><tr><td>Krwawienie z policzka Nakłuwacz nawłociowy, 5 um</td><td>Medipoint</td><td>9891620</td><td>Protokół krok 2 - przygotowanie PBMC myszy</td></tr><tr><td>Clear RPMI</td><td>Gibco firmy LifeTech</td><td>11835-030</td><td>Kroki protokołu 6 i 8 - całonocna hodowla myszy / człowieka PBMC</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco firmy LifeTech</td><td>11330-032</td><td>Kroki protokołu 1 i 2 - Hodowla komórkowa YUMM1.7</td></tr><tr><td>EasyGrip Szalki Petriego EasyGrip, 35 mm</td><td></td><td></td><td>Falcon 351008 Kroki protokołu 5 i 8 - całonocna hodowla myszy / człowieka PBMC</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe Eppendorf 1,5 ml DOT</td> scientific <td>1700-GMT</td><td>Kroki protokołu 1-8</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie)</td><td>SAFC Biosciences</td><td>12306C-500mL</td><td>Kroki protokołu 1-4 - hodowla komórkowa YUMM1.7, leczenie komórek 8-MOP/UVA, płytka TI</td></tr><tr><td>Licznik hematologiczny Hemavet 950FS</td><td>Drew Scientific</td><td>HV950FS</td><td>Protokół krok 8.2 - monitorowanie liczby płytek krwi u ludzi</td></tr><tr><td>Heparyna 5,000U/ml</td><td>McKesson Usługi pakowania</td><td>949512</td><td>Kroki 2 i 8 protokołu - przygotowanie PBMC u myszy i ludzi</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>5260-04-05</td><td>Kroki protokołu 1 i 7 - wprowadzenie guza sc myszy i podanie TI</td></tr><tr><td>Pożywka do izolacji limfolitów M</td><td>Protokół Cedarlane Labs</td><td>CL5035</td><td>Krok 2 - mysi preparat PBMC</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco firmy LifeTech</td><td>11140-050</td><td>Kroki protokołu 1 i 2 - YUMM1.7 hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2)</td><td>Gibco by LifeTech</td><td>14190-144</td><td>Kroki protokołu 1-7</td></tr><tr><td>Pióro/paciorkowiec</td><td>Gibco by LifeTech</td><td>15140-122</td><td>Kroki protokołu 1 i 2 - Hodowla komórkowa YUMM1.7</td></tr><tr><td>Polipropylenowe rurki stożkowe 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Kroki protokołu 1-8</td></tr><tr><td>Programowalna 2-kanałowa pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>model NE-4000</td><td>Kroki protokołu 4 i 8 - uruchamianie płytki TI</td></tr><tr><td>Igły do wstrzykiwań retro-orbitalnych, 27G x 1/2</td><td>Protokół BD Biosciences</td><td></td><td>305109 krok 7 - podawanie leczenia TI u myszy</td></tr><tr><td>Strzykawki, 10 ml (LUER-LokTip)</td> <td>Protokół BD Biosciences</td><td>309604</td><td>kroki 4, 8 - uruchamianie płytki TI</td></tr><tr><td>Strzykawki, 1 ml (końcówka poślizgowa)</td> <td>Protokół BD Biosciences</td><td>309659</td><td>kroki 1, 4, 7, 8</td></tr><tr><td>Zestaw płytek i przewodów TI</td><td>Transimmune AG</td><td>niedostępne w handlu&nbsp;</td><td>Prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem lub firmą Transimmune w celu uzyskania urządzenia na zasadzie współpracy.</td></tr><tr><td>Platforma do biegania płytowego TI</td><td>Transimmune AG</td><td>niedostępna na rynku&nbsp;</td><td>Prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem lub firmą Transimmune w celu uzyskania urządzenia na zasadzie współpracy.</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych, T75 (75 cm2)</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td>Protocol etapy 1, 2, 6 i 8 - hodowla komórek mysich i ludzkich</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 12-dołkowe</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td>Protocol kroki 3 i 8 - mysie i ludzkie leczenie komórek 8-MOP/UVA</td></tr><tr><td>Skrobaki do kultur tkankowych</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td>Protocol etapy 6 i 8 - całonocna hodowla trypsyny-EDTA u myszy/człowieka PBMC</td></tr><tr><td>0,25% (1x)</td><td>Gibco by LifeTech</td><td>25200-056</td><td>Kroki protokołu 1 i 2 - Igły do wstrzykiwań guza do hodowli komórkowych YUMM1.7</td></tr><tr><td>, 25G x 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td>Protocol krok 1 - wprowadzenie guza podskórnego myszy</td></tr><tr><td>Promiennik UVA</td><td>Johnson and Johnson</td><td>nie jest dostępny na rynku&nbsp;</td><td>Aparatura została specjalnie opracowana przez J& J jak laboratorium prof. R. Edelsona. W laboratorium dostępnych jest kilka maszyn współpracujących ze sobą; prosimy o kontakt z prof. R. Edelsonem w celu skorzystania z jednego z nich. Alternatywne promienniki UVA są dostępne na rynku, ale nie zostały przez nas przetestowane.</td></tr><tr><td>System obrazowania Invitrogen EVOS FL Auto 2</td><td>Przyrząd do obrazowania fluorescencyjnego</td> <td>Invitrogen</td><td></td></tr></tbody></table>

nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Pozaustrojowa fotochemioterapia (ECP) jest szeroko stosowaną immunoterapią nowotworów w leczeniu chłoniaka skórnego z komórek T (CTCL), działającą w ponad 350 ośrodkach uniwersyteckich na całym świecie. Podczas gdy skuteczność kliniczna ECP i wzorowy profil bezpieczeństwa przyczyniły się do jego powszechnego stosowania, wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska pozostaje wyzwaniem, częściowo ze względu na brak laboratoryjnego modelu ECP. Aby pokonać tę przeszkodę i stworzyć prostą, przyjazną dla użytkownika platformę do badań ECP, opracowaliśmy pomniejszoną wersję klinicznego urządzenia do przetwarzania leukocytów ECP, nadającą się do pracy zarówno z modelami mysimi, jak i małymi próbkami krwi ludzkiej. To urządzenie jest nazywane komorą lub płytką Transimmunization (TI). W serii przełomowych eksperymentów zminiaturyzowane urządzenie wykorzystano do wyprodukowania szczepionki komórkowej, która regularnie inicjowała terapeutyczną odporność przeciwnowotworową w kilku syngenicznych modelach guzów myszy. Usuwając poszczególne czynniki z systemu eksperymentalnego i ustalając ich wkład w odpowiedź przeciwnowotworową in vivo, wyjaśniliśmy następnie kluczowe mechanistyczne czynniki potencjału immunizacyjnego ECP. Podsumowując, nasze wyniki ujawniły, że przeciwnowotworowe działanie ECP jest inicjowane przez komórki dendrytyczne (DC), fizjologicznie generowane przez interakcję monocytów krwi z płytkami krwi w płytce TI i naładowane antygenami z komórek nowotworowych, których apoptotyczna śmierć komórki jest drobno miareczkowana przez ekspozycję na fotoaktywowany czynnik sieciujący DNA 8-metoksypsoralen i światło UVA (8-MOPA). Po powrocie do myszy ta szczepionka komórkowa prowadzi do specyficznej i zbywalnej odporności przeciwnowotworowych limfocytów T. Sprawdziliśmy, że komora TI nadaje się również do przetwarzania krwi ludzkiej, wytwarzając ludzkie DC w pełni porównywalne pod względem stanu aktywacji i profilu do tych pochodzących z klinicznej komory ECP. Przedstawione tutaj protokoły są przeznaczone do badań ECP na myszach i ludziach, kontrolowanego generowania apoptotycznych komórek nowotworowych z 8-MOPA oraz szybkiej produkcji fizjologicznych DC pochodzących z ludzkich i mysich monocytów do różnych zastosowań.

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...

Fizjologiczne komórki prezentujące antygen dendrytyczny, zwane PhDC, są głównymi przełącznikami immunologicznymi, które inicjują odporność i tolerancję limfocytów T specyficznych dla antygenu. W artykule przedstawiono efektywną metodę wytwarzania doktoratu doktora. Kliniczne zastosowanie komórek dendrytycznych jest utrudnione przez niefizjologiczne metody cytokin stosowane do ich wytwarzania.Nasza metoda rozwiązuje ten problem poprzez skuteczną sygnalizację płytkową konwersji monocytów do DC u ludzi i myszy. Te PhDC nie są zależne od warunków cytokin niedostępnych in vivo, dzięki czemu mogą generować silne kliniczne odpowiedzi przeciwnowotworowe limfocytów T zarówno u ludzi, jak i myszy z ustalonymi nowotworami. Niezależna od gatunku inicjacja dojrzewania monocytów do PhDC ma szerokie zastosowanie eksperymentalne.Doktorat pozwala na analizę fizjologii komórek dendrytycznych, ułatwia indukcję terapeutycznej odporności przeciwnowotworowej na nowotwory immunogenne i daje nadzieję na spersonalizowane szczepienia przeciwdrobnoustrojowe. Ten eksperymentalny system jest nowatorski, a wiele jego aspektów, takich jak powlekanie plastikowej komory, leczenie komórek nowotworowych 8-MOP / UVA, warunki przepływu i uwalnianie monocytów są najlepiej przedstawione wizualnie. Procedurę zademonstruje Eve Robinson, technik z mojego laboratorium.Aby zebrać komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, najpierw ustaw 15-mililitrową rurkę z czterema mililitrami pożywki do izolacji limfocytów na pięć do 10 krwawiących myszy. Następnie powoli ułóż warstwę krwi pobranej od myszy z guzem na pożywce. Obracaj komórki w temperaturze od 1 000 do 1 500 razy G przez 20 minut, aby oddzielić PBMC od czerwonych krwinek.Pod koniec wirowania zbierz górną warstwę osocza, pozostawiając 0,5 mililitra pozostałego nad kożuchem i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Następnie zbierz warstwę kożucha do czystej 15-mililitrowej probówki wypełnionej PBS do 15 mililitrów i wiruj z prędkością 250 razy G w standardowej wirówce do kultur tkankowych przez 10 minut, aby zebrać PBMC. Pod koniec wirowania ostrożnie odpipetować supernatant i przesunąć probówkę, aby ponownie zawiesić osad.Następnie dodaj dwa mililitry buforu do lizy czerwonych krwinek ACK do probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe czerwone krwinki z PBMC. Inkubować PBMC na lodzie przez 10 minut. Napełnij probówkę PBS do 15 mililitrów i odwiruj z prędkością 250 razy G w standardowej wirówce do hodowli tkankowych przez 10 minut, aby zebrać PBMC.Ostrożnie odpipetować supernatant i przesunąć probówkę, aby poluzować osad. Zawiesić granulat w 300 mikrolitrach FBS. Aby przygotować komórki nowotworowe YUMM1.7 na grupę leczoną, najpierw ponownie zawieś osad komórek nowotworowych w FBS w ilości 2,5 miliona komórek na 300 mikrolitrów.Przy wyłączonym kapturze do hodowli tkankowej dodaj 8-metoksypsoralen, aby uzyskać końcowe stężenie 100 nanogramów na mililitr do zawiesiny komórek nowotworowych YUMM1.7. Następnie wymieszaj komórki, zawiń pojemnik na komórki w folię i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby wstępnie pokryć 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, dodaj jeden mililitr FBS do jednego dołka na każdą grupę pięciu myszy poddanych działaniu substancji i wstaw płytkę do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.Po 20 minutach, pod kapturem do hodowli tkankowej, usuń FBS z dołków i dodaj 300 mikrolitrów komórek nowotworowych narażonych na metoksypsoralen na studzienkę. Następnie wystawij płytkę zawierającą komórkę na działanie wstępnie ogrzanego źródła światła ultrafioletowego A, aby uzyskać całkowite napromieniowanie czterech dżuli na centymetr kwadratowy. Aby zebrać 8 komórek nowotworowych poddanych działaniu metoksypsoralenu/UVA z każdej studzienki, należy ostrożnie zakręcić płytką i pipetą, aby zapewnić całkowite odzyskanie komórek.Aby przeprowadzić pasaż płytki uodparniającej dla każdej grupy pięciu myszy leczonych, połącz 300 mikrolitrów odpowiedniego PBMC i 300 mikrolitrów komórek nowotworowych traktowanych 8-metoksypsoralenem/UVA w stożkowej probówce o pojemności 1,5 mililitra i wymieszaj komórki. Następnie otwórz rurki wejściowe i wyjściowe clamps płyty TI. Użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby napełnić rurkę TI FBS, zamykając zaciski, gdy rurka jest napełniana, aby zatrzymać FBS wewnątrz rurki.Odłączyć strzykawkę. Umieść końcówkę pipety P1000 bezpiecznie we wlocie płytki TI. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni i powoli napełniaj płytkę mieszanką PBMC i komórek nowotworowych, unikając pęcherzyków.Wyjąć końcówkę pipety z wlotu przed zwolnieniem tłoka pipety. Umieść pozostałe komórki z powrotem w stożkowej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Inkubować rurkę wypełnioną FBS, wypełnioną komórkami płytkę TI i stożkową rurkę o pojemności 1,5 mililitra zawierającą pozostałe komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.Po inkubacji zwolnij zaciski i opróżnij rurkę TI grawitacyjnie. Następnie włóż końcówkę pipety P1000 z tłokiem wciśniętym w port płytki, aby usunąć komórki z płytki TI. Trzymaj płytkę pod kątem 45 stopni i napełnij końcówkę pipety P1000.Umieść komórki z powrotem w ich oryginalnej stożkowej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Aby uruchomić płytę TI, podłącz rurkę wyjściową do płyty i przymocuj płytkę TI do systemu bieżnika płyty. Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki, pobierz te 600 mikrolitrów mieszanki PBMC i komórek nowotworowych z 1,5-mililitrowej stożkowej probówki.Przymocować strzykawkę do rurki wejściowej z zaciskiem otwartym i powoli napełniać, aż płyn dotrze do końca rurki. Przymocuj wolny koniec rurki wejściowej do płyty TI i kontynuuj delikatne ładowanie pozostałej objętości. Zamknij wejście clamp po zakończeniu.Odłączyć strzykawkę o pojemności jednego mililitra i podłączyć rurkę wejściową do pompy strzykawkowej. Przymocuj rurkę wyjściową do czystej stożkowej rurki o pojemności 1.5 mililitra w celu zbierania komórek. Dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,09 mililitra na minutę.Przechylić płytkę TI o około 30 stopni w kierunku strony pompy strzykawkowej za pomocą platformy do biegania z płytą TI. Ostrożnie zwolnij zacisk na wężu wejściowym. Uruchomić pompę strzykawkową, uważnie obserwując, jak napełnia się płytka TI.Gdy płyta TI zostanie całkowicie napełniona, przechyl ją o około 30 stopni w przeciwnym kierunku podczas opróżniania. Gdy wszystkie komórki w cieczy znajdą się w stożkowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 mililitra, zatrzymaj pompę. Aby umyć płytkę TI, odłącz rurkę wejściową od pompy strzykawkowej i podłącz ją do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej 600 mikrolitrami FBS.Napełniaj, aż FBS zostanie w pełni załadowany. Następnie odłączyć strzykawkę i podłączyć rurkę do pompy strzykawki. Dostosuj natężenie przepływu pompy strzykawki na 0.49 mililitra na minutę.Zwolnij zacisk wejściowy i uruchom płytkę TI, zbierając pranie w tej samej stożkowej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Delikatnie przesuwaj lub stukaj w płytkę TI przez cały czas, aby pomóc w odłączeniu i elucji wszelkich przylegających komórek podczas opróżniania płytki. Odłącz stożkową rurkę zbiorczą o pojemności 1,5 mililitra od zestawu płytek TI.Obracać probówkę zbiorczą w laboratoryjnym mikrofugowaniu z prędkością 250 razy G przez osiem minut i wyrzucić supernatant. Aby przeprowadzić nocną koinkubację PBMC z antygenem, najpierw ponownie zawieś PBMC i osad komórek nowotworowych w dwóch mililitrach przezroczystego RPMI uzupełnionego 15% autologiczną surowicą mysią. Następnie umieść komórki w sterylnym naczyniu o średnicy 35 milimetrów bez hodowli tkankowej i inkubuj przez noc w standardowych warunkach hodowli tkankowej.Następnego dnia ostrożnie oderwij wszelkie przylegające komórki od dna naczynia za pomocą skrobaka do kultur tkankowych. Obracaj naczynie podczas skrobania, aby zapewnić równomierne zbieranie komórek. Zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce.Dodaj dwa mililitry PBS do naczynia i powtórz etap skrobania, zbierając komórki do tej samej probówki. Opłucz 35-milimetrowe naczynie jednym mililitrem PBS i dodaj płukanie do tej samej probówki. Wirować z prędkością 250 razy w standardowej wirówce do hodowli tkankowych przez 10 minut, aby zebrać komórki.Ostrożnie odpipetować supernatant, a następnie przesunąć probówkę, aby ponownie zawiesić osad. Terapia wykazała zmniejszenie wzrostu guza YUMM1.7 u ponad 100 leczonych myszy w porównaniu z kontrolnymi, co zaobserwowano w skumulowanych danych dotyczących wzrostu guza z dziewięciu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych w ciągu dwóch lat. Reprezentatywne krzywe wzrostu guza dla poszczególnych zwierząt w ramach jednego eksperymentu dają poczucie zmienności w systemie.Gdy monocyty lub płytki krwi są zubożone z frakcji PBMC lub gdy pominięto pasaż płytki, efekt terapeutyczny nie jest już obserwowany. Leczenie jest nieskuteczne w przypadku braku komórek odpornościowych lub źródła antygenu lub w obecności niedopasowanego antygenu, takiego jak guzy YUMM1.7 leczone przy użyciu komórek raka jelita grubego MC38. Aby uzyskać wynik szczepienia, ważne jest również, aby unikać narażenia PBMC na 8-metoksypsoralen.Analiza FACS zmiany wskazanych markerów z odpowiadających im kontroli IgG w ludzkich komórkach CD11c+ wśród świeżo wyizolowanych PBMC, PBMC traktowanych TI, PBMC traktowanych TI bez pasażu płytki, zubożonych płytek krwi przed pasażem płytki lub obu powyższych, wykazała, że aktywacja DC zależy od obecności płytek krwi w PBMC i od pasażu płytki TI. Aktywowane przez TI ludzkie DC mogą skutecznie przetwarzać i prezentować krzyżowo antygeny peptydowe lub antygeny z całych ludzkich komórek nowotworowych narażonych na działanie 8-metoksypsoralenu w celu aktywacji linii limfocytów T specyficznych dla ludzkiego antygenu w testach in vitro w sposób zależny od TI i płytek krwi. Swoistość odpowiedzi limfocytów T zależy od źródła przetwarzanych antygenów.Podczas indukowania odporności przeciwnowotworowej apoptoza każdej linii komórek rakowych musi być miareczkowana, aby zmaksymalizować immunogenność. Ponieważ odporność indukowana będzie specyficzna dla antygenów uodparniających, możliwa będzie szczegółowa analiza każdego układu. Każdy eksperymentalny lub kliniczny nowotwór i każda odpowiedź przeciwdrobnoustrojowa będą miały unikalne źródło informacji.Każdy pojedynczy ludzki nowotwór ma swój własny zestaw antygenów specyficznych dla nowotworu. Doktor medycyny przeprowadza niezbędne sortowanie i prezentację antygenów nowotworowych, bez konieczności ich wcześniejszej identyfikacji laboratoryjnej. Należy pamiętać, że światło 8-MOP i UVA są substancjami rakotwórczymi.Używaj odpowiedniego sprzętu ochronnego i przestrzegaj procedur bezpieczeństwa podczas obchodzenia się z 8-MOP oraz podczas pracy ze źródłami światła UVA.

novel-protocol-for-generating-physiologic-immunogenic-dendritic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Ten film pokazuje wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych (DC) z ludzkich monocytów. Inkubacja monocytów z czynnikami wzrostu i cytokinami prowadzi do produkcji niedojrzałych DC. W odpowiedzi na cząsteczki regulatora immunologicznego niedojrzałe DC różnicują się w tolerogenne i dojrzałe DC.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Oceniane na syngenetycznych immunokompetentnych gospodarzach, szczepionka z komórek dendrytycznych (DC) na bazie nowotworowych komórek macierzystych (CSC) wykazała znacznie wyższą odporność przeciwnowotworową niż tradycyjne szczepionki DC pulsujące z heterogenicznymi komórkami nowotworowymi.

Opracowanie nowej szczepionki z komórek dendrytycznych z wykorzystaniem komórek macierzystych czerniaka i raka płaskonabłonkowego

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metodę generowania fizjologicznych komórek dendrytycznych PhDC do immunoterapii nowotworowej z wykorzystaniem urządzenia TI. Technika ta umożliwia silne odpowiedzi przeciwnowotworowe u ludzi i myszy.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Przeglądaj więcej filmów