Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Protokół ten ułatwia izolację funkcjonalnie odrębnych podzbiorów fibroblastów od ludzkiej skóry poprzez sortowanie FAC na podstawie ekspresji markera na powierzchni komórki. Po raz pierwszy fibroblasty brodawkowate i siatkowate można wyizolować bezpośrednio ze skóry bez manipulacji in vitro. Jest to ogromny postęp w porównaniu z wcześniej ustalonymi metodami izolacji z wykorzystaniem kultur eksplantatów.

Podzbiory fibroblastów skórnych pełnią różne funkcje w warunkach homeostazy. Za pomocą tego narzędzia możliwe jest zbadanie funkcjonalnych różnic w patologiach skóry, w tym raku lub chorobach zapalnych skóry. Ponieważ obchodzenie się z tkanką ludzką wymaga pewnej wprawy, aby osiągnąć zadowalającą wydajność komórek, chcielibyśmy przedstawić wizualną demonstrację, aby ułatwić i przyspieszyć ten proces.

Aby przygotować skórę właściwą o pełnej grubości, umieść kawałek ludzkiej skóry na grubej bibule filtracyjnej naskórkiem skierowanym w dół. Przytrzymaj mocno naskórek kleszczami i zeskrob podskórną warstwę tłuszczu skalpelem. Następnie pokrój tkankę w paski o szerokości pięciu milimetrów przed włożeniem ich na szalkę Petriego.

Aby podzielić skórę właściwą na warstwy brodawkowate i siatkowate, umieść kawałek skóry na grubej bibule filtracyjnej z naskórkiem skierowanym do góry. Przytrzymaj mocno skórę na jej krawędziach za pomocą kleszczy i wytnij odcinek o grubości 300 mikrometrów za pomocą elektrycznego dermatomu. Przenieś pierwszą warstwę składającą się z naskórka i brodawkowatej skóry właściwej na szalkę Petriego.

Następnie natychmiast przystąp do oddzielenia naskórka i skóry właściwej lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Następnie dostosuj dermatom do grubości cięcia 700 mikrometrów i pokrój pozostałą skórę właściwą. Umieść górny plasterek, który jest zdefiniowany jako górna siatkowata skóra właściwa, na osobnej szalce Petriego.

Następnie zeskrob podskórną warstwę tłuszczu skalpelem z pozostałej dolnej siateczkowatej warstwy skóry właściwej i wyrzuć ją. Zbierz dolną siatkowatą skórę właściwą na innej szalce Petriego. Natychmiast przejdź do procedury trawienia enzymatycznego lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.

Aby przeprowadzić trawienie enzymatyczne, umieść pięciomilimetrowe paski skóry lub naskórek/brodawkowatą skórę właściwą z naskórkiem skierowanym do góry na szalce Petriego z 10 mililitrami dysocjującego roztworu enzymu. Następnie inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji przenieś naskórek/brodawkowatą skórę właściwą na pokrywę szalki Petriego.

Oddziel naskórek od górnej części skóry właściwej za pomocą dwóch kleszczy, z których każdy przytrzymuje krawędź skóry właściwej. Następnie zmiel każdą warstwę skóry tak dokładnie, jak to możliwe. Im mniejsze kawałki, tym lepsze trawienie tkankowe.

Następnie przygotuj mieszankę trawiącą. Przenieś zmieloną tkankę z 10 milimetrami przygotowanej mieszanki wytrawiającej do 50-milimetrowej probówki. Inkubować tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę pod mieszaniem.

Podczas trawienia odwróć rurkę kilka razy. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, zatrzymaj trawienie enzymatyczne tkanek, dodając 10 mililitrów pożywki fibroblastowej do strawionej tkanki na lodzie. Następnie przelej zawartość każdej probówki przez zwykłe sterylne sitko do herbaty ze stali nierdzewnej i zbierz zawiesinę komórek na czystej szalce Petriego.

Umyć sitko pożywką i rozgnieść niestrawione kawałki tkanki krawędzią tłoka strzykawki. Następnie pipetować pobraną zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Przepłucz sitko komórkowe pożywką i zbierz przepływ przez tę samą probówkę.

Następnie odwiruj probówkę o ciśnieniu 500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Usuń supernatant i przemyj osad komórkowy pięcioma mililitrami pożywki fibroblastowej. Powtórz ponownie etap wirowania.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu do lizy erytrocytów ACK. Pozostaw komórki w buforze do lizy na około jedną minutę w temperaturze otoczenia. Następnie przerwij lizę, dodając dziewięć mililitrów 1x PBS z 10% FCS.

Ponownie odwirować probówkę w temperaturze 500 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Po wybarwieniu komórek w celu sortowania FAC zgodnie ze standardowymi protokołami, należy posortować trzy subpopulacje fibroblastów do oddzielnych probówek mikrowirówek wypełnionych 350 mikrolitrami buforu do lizy w celu izolacji RNA lub 350 mikrolitrami pożywki wzrostowej fibroblastów do hodowli komórek. Natychmiast odwróć probówki i albo umieść probówki buforowe do lizy w ciekłym azocie, albo umieść probówki z pożywką wzrostu fibroblastów na lodzie.

Po FACS wiruj komórki w dół z prędkością 500 razy g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść równą ilość komórek w pożywce wzrostowej fibroblastów w 24-dołkowym naczyniu do hodowli komórek i pozostaw je do wzrostu, aż osiągną 70% konfluencji. Następnie zastąp pożywkę z hodowanych komórek pożywką do różnicowania adipocytów i pozwól komórkom różnicować się przez 14 dni.

W 14 dniu różnicowania utrwal komórki za pomocą 4% PFA przez 20 minut. Umyj studzienki 60% izopropanolem i pozwól mu całkowicie odparować. Następnie zabarwiaj komórki pięcioma milimolami przefiltrowanego czerwonego oleju O przez 20 minut.

Po 20 minutach przemyj poplamione komórki czterokrotnie wodą destylowaną. Wyobraź sobie komórki zanurzone w wodzie za pomocą odwróconego mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu ze światłem przechodzącym. Protokół ten umożliwia identyfikację trzech populacji fibroblastów w ludzkiej skórze, które charakteryzują się różną lokalizacją śródskórną, profilami ekspresji genów i funkcjami.

FAP-dodatni CD90-ujemny jest wzbogacony w brodawkowatej skórze właściwej, podczas gdy FAP-dodatni CD90-dodatni i FAP-ujemny CD90-dodatni są bardziej obfite w siatkowatej skórze właściwej. Wszystkie trzy posortowane subpopulacje wykazują typową morfologię fibroblastów po posadzie przez siedem dni. Co ciekawe, inaczej zachowują się one w teście adipogenezy.

Po 14 dniach w hodowli FAP-dodatnie CD90-ujemne nie różnicują się w adipocyty, podczas gdy FAP-dodatnie CD90-dodatnie i FAP-ujemne CD90-dodatnie łatwo ulegają adipogenezie. Profilowanie ekspresji genów pokazuje, że FAP-dodatnie komórki CD90-ujemne wyrażają wysokie poziomy markerów powszechnie przypisywanych fibroblastom brodawkowatym, takim jak CD26, NTN i PDPN, podczas gdy komórki CD90-dodatnie wyrażają znane markery siatkowate, takie jak CD36, aktyna mięśni gładkich i PPAR-gamma na wysokich poziomach. Wnioskujemy, że FAP-dodatnie komórki CD90-ujemne należą do brodawkowatych, a komórki CD90-dodatnie należą do linii siatkowatej.

Trawienie przebiega najlepiej, jeśli kawałki skóry są dokładnie zmielone i inkubowane w wystarczającej ilości pożywki trawiącej. Podzbiory fibroblastów skórnych są funkcjonalnie zróżnicowane. Zbadanie ich funkcji w kontekście patogenezy choroby utoruje drogę dla nowych interwencji diagnostycznych i terapeutycznych.