Name: Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Naucz się izolować fibroblasty brodawkowate i siatkowate ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania FACS bez hodowli in vitro. Ta metoda pozwala badać różnice funkcjonalne w patologiach skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc w sortowaniu FACS przez Bärbel Reininger i Wolfganga Bauera. Prace te były wspierane przez granty dla B. M. L. z Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF: V 525-B28) oraz Federacji Europejskich Towarzystw Biochemicznych (FEBS, Follow-Up Research Fund). S. F. jest stypendystą DOC Austriackiej Akademii Nauk (OeAW). Wyrażamy wdzięczność za doskonałe wsparcie ze strony głównych placówek Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu. Dziękujemy Bernhardowi Gesslbauerowi, Christine Radtke i Martinowi Vierhapperowi za dostarczenie materiału do ludzkiej skóry.

Ludzka skóra została uzyskana od mężczyzn i kobiet rasy kaukaskiej w wieku od 26 do 61 lat (skóra chroniona przed słońcem; korekty brzucha, zmniejszenie piersi). Przed pobraniem tkanek uzyskano pisemną świadomą zgodę pacjenta zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz za zgodą Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Wiedeńskiego Uniwersytetu Medycznego.
UWAGA: Udostępniamy protokół izolacji funkcjonalnie odrębnych subpopulacji fibroblastów z pełnej grubości skóry właściwej (proszę zapoznać się z sekcją 1) lub po podziale ludzkiej skóry właściwej na różne warstwy (pomiń sekcję 1 i bezpośrednio odnieś się do sekcji 2).
1. Przygotowanie skóry właściwej pełnej grubości
<ol>
	<li>Na grubej bibule filtracyjnej umieść kawałek ludzkiej skóry o wymiarach 10 cm x 10 cm (np. z korekcji brzucha lub zmniejszenia piersi) naskórkiem skierowanym w dół.</li>
	<li>Przytrzymaj mocno naskórek na jego krawędziach za pomocą kleszczy i zeskrob podskórną warstwę tłuszczu skalpelem. Następnie pokrój tkankę w paski o szerokości 5 mm przed włożeniem ich na szalkę Petriego. 
	nuta: Ułatwia to przenikanie enzymu Dispase II (zwanego dalej enzymem dysocjującym, patrz punkt 3) i jest stosowane, jeśli konieczne jest oddzielenie naskórka od całej skóry właściwej. W tym celu pomiń sekcję 2 i bezpośrednio odnieś się do sekcji 3. Aby uniknąć zanieczyszczenia, po chirurgicznym usunięciu tkanki należy ją zachować w sterylności lub dokładnie wyczyścić roztworem etanolu lub jodu. Jeśli w ogóle, obróbka powierzchni skóry etanolem powoduje tylko niewielką śmierć komórek. Pracuj w sterylnych warunkach w okapie przepływowym do hodowli tkankowych.</li>
</ol>
2. Podział skóry właściwej człowieka na warstwy brodawkowate i siatkowate za pomocą dermatomu
<ol>
	<li>Umieść kawałek skóry o wymiarach 10 cm x 10 cm (np. z korekcji brzucha lub zmniejszenia piersi) na grubej bibule filtracyjnej, naskórkiem skierowanym do góry. Trzymaj skórę mocno na jej krawędziach za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Naciąć skórę dermatomem elektrycznym, dostosowanym do grubości/głębokości cięcia 300 μm, odsuwając główkę dermatomu od siebie, z ostrzem ustawionym pod kątem 90° w stosunku do powierzchni skóry.</li>
	<li>Weź pierwszą warstwę składającą się z naskórka i brodawkowatej skóry właściwej (grubość 300 μm, "Warstwa skórna 1", <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i <silna klasa="xfig">Rysunek 2) i umieść ją na szalce Petriego. Przejdź natychmiast do sekcji 3 lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysychaniu tkanki. 
	nuta: Aby uniknąć zanieczyszczenia, po chirurgicznym usunięciu tkanki należy ją zachować w sterylności lub dokładnie wyczyścić roztworem etanolu lub jodu. Praca w sterylnych warunkach w okapie przepływowym do hodowli tkankowych. 
	ostrożność: Z dermatomem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ ostrza są bardzo ostre.</li>
	<li>Powtórz krok 2.2, dostosowując dermatom do grubości cięcia 700 μm i pokrój pozostałą skórę właściwą. Umieść górny plasterek, który jest zdefiniowany jako górna siatkowata skóra właściwa ("Warstwa skórna 2", <silna klasa="xfig">Rysunek 2) na osobnej szalce Petriego. Przejdź natychmiast do sekcji 4 lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysychaniu tkanki.</li>
	<li>Zeskrobać podskórną warstwę tłuszczu skalpelem z pozostałej dolnej siatkowatej warstwy skóry właściwej (>1,000 μm) i wyrzucić ją. Zbierz dolną siatkowatą skórę właściwą ("Warstwa skórna 3", <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) na innej szalce Petriego. Przejdź natychmiast do sekcji 4 lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysychaniu tkanki. 
	nuta: Alternatywnie, zamiast zeskrobywać tłuszcz skalpelem, usuń warstwę tłuszczu nożyczkami. Pomocne może być umieszczenie siatkowatej skóry właściwej na lodzie przed zeskrobaniem tłuszczu.</li>
</ol>
3. Oddzielenie naskórka od skóry właściwej
<ol>
	<li>Przygotować roztwór enzymu dysocjującego o stężeniu 3 j./ml (tj. Dyspazy II) w sterylnym 1x PBS. Umieścić 5-milimetrowe paski skóry (z sekcji 1) lub naskórek/brodawkowatą skórę właściwą (z kroku 2.2), z naskórkiem skierowanym do góry, na 10-centymetrowej szalce Petriego z 10 ml roztworu enzymu dysocjującego o stężeniu 3 U/mL. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
	<ol>
		<li>W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Zamiast tego inkubować naskórek/brodawkowatą skórę właściwą w proteazie w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc. W razie potrzeby przechowywać pozostałe warstwy (warstwa skórna 1, 2 i 3) przez noc zanurzone w 1x PBS w probówkach o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. 
		ostrożność: Pracuj ostrożnie z proteazą, może podrażniać skórę i oczy w kontakcie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji przenieś naskórek/brodawkowatą skórę właściwą na suchą pokrywę szalki Petriego i oddziel naskórek od górnej części skóry właściwej (warstwa skórna 1) za pomocą dwóch kleszczy, z których każdy przytrzymuje krawędź naskórka lub skóry właściwej.</li>
</ol>
4. Trawienie enzymatyczne tkanki skórnej
<ol>
	<li>Każdą warstwę skóry właściwej (warstwę skórną 1, 2 i 3) należy zmielić oddzielnie nożyczkami/skalpelem tak dokładnie, jak to możliwe; im mniejsze kawałki, tym lepsze trawienie tkanek. 
	nuta: Twardość skóry właściwej może się różnić w zależności od części ciała, z której pochodzi (np. skóra brzucha lub ramienia).</li>
	<li>Przygotuj mieszankę wytrawiającą, łącząc 1,25 mg/ml kolagenazy I, 0,5 mg/ml kolagenazy II, 0,5 mg/ml kolagenazy IV i 0,1 mg/ml hialuronidazy w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z L-glutaminą (patrz tabela materiałów), 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S). 
	ostrożność: Pracuj ostrożnie z kolagenazami, ponieważ mogą one podrażniać skórę i oczy w kontakcie.</li>
	<li>Umieścić każdą z rozdrobnionych tkanek z 10 ml przygotowanej mieszanki wytrawiającej do probówki o pojemności 50 ml i inkubować w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy stałym mieszaniu. Podczas trawienia kilkakrotnie odwróć rurki. 
	nuta: Należy rozważyć dostosowanie objętości trawienia w zależności od wielkości zmielonego kawałka skóry. Nie przeciążaj 10 ml mieszanki trawiącej zbyt dużą ilością tkanki, w przeciwnym razie wydajność komórek będzie minimalna. Zaleca się mniej niż jedną trzecią tkanki w całkowitej objętości (1:2 w/v).</li>
</ol>
5. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i lizy erytrocytów
<ol>
	<li>Zatrzymaj enzymatyczne trawienie tkanek, dodając 10 ml pożywki fibroblastowej (DMEM z L-glutaminą, 10% FCS i 1% P/S) do strawionej tkanki. Od tego momentu pracuj na lodzie.</li>
	<li>Przelej zawartość każdej probówki przez zwykłe sterylne sitko do herbaty ze stali nierdzewnej i zbierz zawiesinę komórek na czystej szalce Petriego. Przemyć sitko pożywką i rozgnieść niestrawione kawałki tkanek krawędzią tłoka strzykawki.</li>
	<li>Następnie pipeta zebrała zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać sitko komórkowe pożywką i zebrać przepływ do tej samej probówki.</li>
	<li>Probówki wirówkowe o sile 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Usunąć i wyrzucić supernatant oraz przemyć osad komórkowy 5 ml pożywki fibroblastowej. Powtórz etap wirowania.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml samodzielnie przygotowanym buforze do lizy erytrocytów ACK (0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA; pH 7,2\u20127,4). Pozostawić komórki w buforze do lizy na około 1 minutę w temperaturze otoczenia (20\u201222 °C).</li>
	<li>Przerwać lizę, dodając 9 ml 1x PBS z 10% FCS i ponownie odwirować probówki przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Wyrzucić supernatant. 
	ostrożność: Czas inkubacji w lizie erytrocytów można dostosować, jeśli liza wydaje się niekompletna (czerwona osadka). Nie należy jednak pozostawiać komórek w buforze do lizy erytrocytów zbyt długo, aby uniknąć lizy fibroblastów i komórek odpornościowych.</li>
</ol>
6. Blokowanie i barwienie fibroblastów dla FACS
<ol>
	<li>Przygotować 5 μl ludzkiego roztworu blokującego receptor Fc w 100 μL 1x PBS z 10% FCS i ponownie zawiesić komórki w 100 μl ludzkiego blokera Fc. Inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Zaprojektuj panel barwiący FACS do barwienia ludzkich fibroblastów skóry. Wymieszaj anty-ludzki FAP APC (1:20), anty-ludzki CD90 AF700 (1:30), anty-ludzki E-kadheryna PE (1:20), anty-ludzki CD31 FITC (1:30), anty-ludzki CD45 Pacific blue (1:20), anty-ludzki ITGA6 PE (1:20), anty-ludzki CD235ab Pacific blue (1:1,000) i anty-ludzki CD106 Pacific blue (1:100) w 1x PBS z 10% FCS.</li>
	<li>Po zablokowaniu receptora Fc, odwirować komórki w temperaturze 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Wyjąć i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl mieszanki przeciwciał. Inkubować komórki w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
	<ol>
		<li>Przed barwieniem należy usunąć 20 μl próbki o dużej liczbie komórek w przypadku niebarwionych i jednobarwnych kontroli FACS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłukać wybarwione komórki i kontrole FACS dwukrotnie 500 μl, 1x PBS z 10% FCS i odwirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 3 min. W międzyczasie dodaj 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) do 1x PBS z 10% FCS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μg/ml.</li>
	<li>Usunąć i wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 200 μl roztworu DAPI i przefiltrować każdą zawiesinę komórek przez sitko do komórek 70 μm do probówki FACS o pojemności 5 ml. 
	nuta: Jeśli FACS ma być wykonywany z opóźnieniem, dodaj DAPI i filtruj na krótko przed nagrywaniem.</li>
</ol>
7. Strategia bramkowania dla izolacji podzbioru fibroblastów ludzkiej skóry i FACS
<ol>
	<li>Rejestruj kontrole cytometrii przepływowej, ustaw prawidłowe ustawienia napięcia i wykonaj odpowiednią kompensację. Bramka dla pojedynczych komórek i żywych (DAPI-), komórek ujemnych błękitu pacyficznego, PE i FITC (CD45-, CD31-, CD235ab-, CD106-, ITGA6- i E-kadheryna-) w celu uzyskania trzech populacji fibroblastów: FAP+CD90-, FAP+CD90+ i FAP-CD90+. Zobacz Rysunek 3.</li>
	<li>Sortuj trzy subpopulacje fibroblastów do oddzielnych probówek wirówkowych z nakrętką gwintowaną o pojemności 1,5 ml wypełnionych buforem do lizy o pojemności 350 μl w celu izolacji RNA lub wypełnionych 350 μl pożywki wzrostowej fibroblastów (patrz tabela materiałów) do hodowli komórkowej. Odwróć probówki natychmiast po sortowaniu i albo umieść probówki buforowe do lizy w ciekłym azocie w celu natychmiastowego zamrożenia, albo umieść probówki z pożywką na lodzie. 
	ostrożność: Przygotować bufor do lizy z 0,1% b-merkaptoetanolem w dygestoriach i unikać wdychania.</li>
</ol>
8. Hodowla fibroblastów i test adipogenezy
<ol>
	<li>Po FACS odwirować komórki w temperaturze 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i płytkować równą liczbę komórek (5 000-10 000 komórek/dołek) w pożywce wzrostowej fibroblastów (patrz tabela materiałów) w 48-dołkowych szalkach do hodowli komórkowych. Pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną 70% zbieżności.</li>
	<li>Dodać 5 μg/ml insuliny, 5 μM troglitazonu, 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 1 μM deksamezosen do pożywki wzrostowej fibroblastów w celu przygotowania pożywki do różnicowania adipocytów.</li>
	<li>Zastąp pożywkę hodowanych komórek pożywką różnicującą adipocyty i pozwól komórkom różnicować się przez 14 dni. Po 2 dniu wymienić pożywkę na pożywkę o zmniejszonej adipogenezie zawierającą 5 μg/ml insuliny i 5 μM troglitazonu. Uzupełniaj pożywkę co 3 lub 4dni.</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 4% PFA przez 20 minut w temperaturze otoczenia (20\u201222 °C) w 14 dniu różnicowania. Umyj studzienki 60% izopropanolem i pozwól mu całkowicie odparować. Zabarwić ogniwa 5 mM Oil Red O (przefiltrować przed użyciem) przez 20 min. Umyj poplamione komórki czterokrotnie wodą destylowaną. Przystąp do wykonywania mikroskopii. 
	ostrożność: PFA jest toksyczny i szkodliwy. Obchodź się ostrożnie. 
	nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Stałe komórki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C do momentu przeprowadzenia barwienia czerwienią olejową O. Przed przechowywaniem przykryj naczynie folią parafinową, aby uniknąć parowania.</li>
	<li>Komórki obrazu zanurzone w wodzie za pomocą odwróconego mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu ze światłem przechodzącym.</li>
</ol>

<ol><li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+heterogeneity%3A+more+than+skin+deep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibroblast heterogeneity: more than skin deep.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 5), 667-675 (2004).</li>
<li>Lowry, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2883-2888 (2008).</li>
<li>Kisseleva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+fibrogenic+myofibroblasts+in+fibrotic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The origin of fibrogenic myofibroblasts in fibrotic liver.</a> Hepatology. 65 (3), 1039-1043 (2017).</li>
<li>LeBleu, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+myofibroblasts+in+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis.</a> Nature Medicine. 19 (8), 1047-1053 (2013).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulation Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li>
<li>Rinkevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+fibrosis.+Identification+and+isolation+of+a+dermal+lineage+with+intrinsic+fibrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential.</a> Science. 348 (6232), (2015).</li>
<li>Abhishek, S., Palamadai Krishnan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Differentiation+Complex%3A+A+Review+on+Its+Epigenetic+Regulation+and+Potential+Drug+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Epidermal Differentiation Complex: A Review on Its Epigenetic Regulation and Potential Drug Targets.</a> Cell Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li>
<li>Driskell, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+fibroblast+lineages+determine+dermal+architecture+in+skin+development+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair.</a> Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).</li>
<li>Mastrogiannaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+Stabilization+in+Skin+Fibroblasts+Causes+Fibrotic+Lesions+by+Preventing+Adipocyte+Differentiation+of+the+Reticular+Dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin Stabilization in Skin Fibroblasts Causes Fibrotic Lesions by Preventing Adipocyte Differentiation of the Reticular Dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (6), 1130-1142 (2016).</li>
<li>Lichtenberger, B. M., Mastrogiannaki, M., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+beta-catenin+activation+remodels+the+dermis+via+paracrine+signalling+to+distinct+fibroblast+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epidermal beta-catenin activation remodels the dermis via paracrine signalling to distinct fibroblast lineages.</a> Nature Communications. 7, 10537(2016).</li>
<li>Harper, R. A., Grove, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+fibroblasts+derived+from+papillary+and+reticular+dermis%3A+differences+in+growth+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro.</a> Science. 204 (4392), 526-527 (1979).</li>
<li>Hiraoka, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+clonal+types+of+human+skin+fibroblasts+with+different+potentials+for+proliferation+and+tissue+remodeling+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dermatological+Science%22%5BJournal%5D)">Two clonal types of human skin fibroblasts with different potentials for proliferation and tissue remodeling ability.</a> Journal of Dermatological Science. 82 (2), 84-94 (2016).</li>
<li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+role+of+hair+follicle+dermal+cells+in+bioengineered+skins%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted role of hair follicle dermal cells in bioengineered skins.</a> Br Journal of Dermatology. 176 (5), 1259-1269 (2017).</li>
<li>Korosec, A., Lichtenberger, B. M. Ch. 12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKorosec%2C+A+%22Skin+Tissue+Models%22">Skin Tissue Models</a>. Marques, A. P., Pirraco, R. P., Cerqueira, M., Reis, R. L. , Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-810545-0.00012-7 279-301 (2017).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. , (2018).</li>
<li>Higgins, C. A., Chen, J. C., Cerise, J. E., Jahoda, C. A., Christiano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+reprogramming+by+three-dimensional+culture+enables+dermal+papilla+cells+to+induce+de+novo+human+hair-follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental reprogramming by three-dimensional culture enables dermal papilla cells to induce de novo human hair-follicle growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19679-19688 (2013).</li>
<li>Philippeos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Single-Cell+Transcriptional+Profiling+Identifies+Functionally+Distinct+Human+Dermal+Fibroblast+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Spatial and Single-Cell Transcriptional Profiling Identifies Functionally Distinct Human Dermal Fibroblast Subpopulations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fibroblast+harvest+reveals+surface+marker+shift+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Jiang, D., Rinkevich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+Skin+Fibroblastic+Cell+Types+Beyond+CD90%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining Skin Fibroblastic Cell Types Beyond CD90.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 133(2018).</li>
<li>Sorrell, J. M., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+diverse+population+at+the+center+of+it+all%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a diverse population at the center of it all.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. , 161-214 (2009).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Fibroblast-Activation+Protein-Specific+Cancer-Associated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of Fibroblast-Activation Protein-Specific Cancer-Associated Fibroblasts.</a> BioMed Research International. 2017, 4825108(2017).</li>
<li>Jiang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+the+fibroblast+activation+protein+alpha-targeted+immunotherapy+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The application of the fibroblast activation protein alpha-targeted immunotherapy strategy.</a> Oncotarget. 7 (22), 33472-33482 (2016).</li>
<li>Pure, E., Blomberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumorigenic+roles+of+fibroblast+activation+protein+in+cancer%3A+back+to+the+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Pro-tumorigenic roles of fibroblast activation protein in cancer: back to the basics.</a> Oncogene. 37 (32), 4343-4357 (2018).</li>
<li>Hamson, E. J., Keane, F. M., Tholen, S., Schilling, O., Gorrell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+fibroblast+activation+protein+%28FAP%29%3A+substrates%2C+activities%2C+expression+and+targeting+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS+%E2%80%93+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Understanding fibroblast activation protein (FAP): substrates, activities, expression and targeting for cancer therapy.</a> PROTEOMICS – Clinical Applications. 8 (5-6), 454-463 (2014).</li>
<li>Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+skin+ageing+and+its+medical+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A review of skin ageing and its medical therapy.</a> Br Journal of Dermatology. 135 (6), 867-875 (1996).</li>
<li>Gilchrest, B. A., Krutmann, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilchrest%2C+BA+%22Skin+Aging%22">Skin Aging</a>. , Springer. 198(2006).</li>
<li>Makrantonaki, E., Zouboulis, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+skin+aging%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of skin aging: state of the art.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1119, 40-50 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Kundrotas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+markers+distinguishing+mesenchymal+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Medica+Lituanica%22%5BJournal%5D)">Surface markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts.</a> Acta Medica Lituanica. 19 (2), 75-79 (2012).</li>
<li>Lupatov, A. Y., Vdovin, A. S., Vakhrushev, I. V., Poltavtseva, R. A., Yarygin, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+expression+of+surface+markers+on+fibroblasts+and+fibroblast-like+cells+isolated+from+different+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the expression of surface markers on fibroblasts and fibroblast-like cells isolated from different human tissues.</a> Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 537-543 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano metodę izolacji fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry człowieka. CD90 jest szeroko stosowany do identyfikacji lub izolacji fibroblastów skóry 18,20,21. Wykazaliśmy jednak, że oprócz fibroblastów CD90 +, ludzka skóra właściwa zawiera również populację fibroblastów CD90 eksprymujących FAP16, który został ustalony jako marker aktywowanych fibroblastów i fibroblastów związanych z rakiem (CAF)22,23,24,25. Co ważne, udało nam się zidentyfikować trzy subpopulacje fibroblastów FAP+CD90-, FAP+CD90+ i FAP-CD90+ w biopsjach skóry od wszystkich zdrowych dawców. W związku z tym wnioskujemy, że FAP jest nie tylko markerem aktywowanych fibroblastów lub CAF, ale także normalnych fibroblastów tkankowych.
Warto zauważyć, że populacja komórek FAP-CD90 pozostała po zastosowaniu wyżej opisanej strategii wykluczania i bramkowania nie zawiera fibroblastów, ponieważ komórki te nie namnażają się w pożywce do hodowli fibroblastów in vitro, ale najprawdopodobniej w mieszanej populacji komórek, w tym między innymi komórek limfatycznych i perycytów16.
Wydajność komórek uzyskana przy użyciu wyżej opisanego protokołu może się różnić w zależności od części ciała, z której pochodzi fragment skóry użyty do izolacji. Skóra właściwa z różnych części ciała różni się między sobą budową, grubością, a także składem kolagenu. Na przykład skóra na twarzy lub ramieniu jest znacznie cieńsza niż skóra na brzuchu lub udzie, które również często mają grubszą podskórną warstwę tłuszczu. Ponadto wiek i płeć dawców skóry mogą nie tylko wpływać na skuteczność dysocjacji tkanek, ale mogą również wpływać na rozmieszczenie trzech subpopulacji fibroblastów (ryc. 3) po wyizolowaniu ze skóry o pełnej grubości. Wynika to z faktu, że brodawkowata skóra właściwa kurczy się, a całkowita liczba fibroblastów zmniejsza się wraz z wiekiem 11,26,27,28. Co więcej, osad komórkowy z brodawkowatej skóry właściwej będzie prawdopodobnie większy niż z siatkowatej skóry właściwej, ponieważ górna skóra właściwa jest gęściej wypełniona fibroblastami niż siatkowata skóra właściwa. Poza tym dolna część skóry właściwej jest również twardsza i gęściej wypełniona kolagenem, co utrudnia dysocjację tkanki i uwolnienie fibroblastów. Warto zauważyć, że osad komórkowy może wydawać się bardzo czerwony, dlatego zalecana jest liza czerwonych krwinek.
Oprócz identyfikacji trzech subpopulacji w nienaruszonej skórze ludzkiej, pokazujemy również, że w skórze dermatomowej każdy podzbiór fibroblastów jest wzbogacony w brodawkowatą lub siatkowatą skórę właściwą16. Precyzyjne cięcie skóry za pomocą dermatomu ma kluczowe znaczenie dla uzyskania odpowiedniego wzbogacenia każdej subpopulacji z różnych warstw skóry właściwej. Ponieważ brodawkowata skóra właściwa jest bardzo cienka, reprezentujący ją dermatomowy plasterek nie powinien przekraczać grubości 300 μm. Zarówno górne fibroblasty siatkowate, jak i dolne siatkowate reprezentują linię siatkowatą i wykazują podobne funkcje i sygnatury genów, dlatego można również rozważyć ich nierozdzielanie.
Co ważne, wszystkie trzy populacje fibroblastów znajdują się w całej skórze właściwej i nie są obecne wyłącznie w jednej warstwie, dlatego kultury eksplantatów z brodawkowatej lub siatkowatej skóry właściwej skutkują mieszanymi kulturami fibroblastów. Jednak fibroblasty brodawkowate FAP + CD90 są najliczniejsze w brodawkowatej skórze właściwej i podążają gradientem od powierzchownych do dolnych warstw skóry, podczas gdy fibroblasty FAP + CD90 + i FAP-CD90 + podążają za odwrotnym gradientem od niższych do powierzchownych warstw16. Co więcej, większość fibroblastów CD90 + brodawkowatej skóry właściwej znajduje się prawie wyłącznie wokół naczyń krwionośnych i wyraża marker fibroblastów okołonaczyniowych CD14629, a zatem prawdopodobnie wykazuje inne funkcje niż pozostałe fibroblasty siatkowate CD14616. CD146 może być wykorzystany jako dodatkowy marker w strategii bramkowania w celu wykluczenia tej populacji.
Po dysocjacji warstw skóry właściwej, wyizolowane komórki są barwione specjalnie zaprojektowanym koktajlem przeciwciał zawierającym różne przeciwciała w celu wykluczenia komórek odpornościowych, komórek śródbłonka i limfy, komórek naskórka, erytrocytów i MSCs w celu uzyskania czystych populacji fibroblastów. Warto zauważyć, że wybór markera do identyfikacji i wykluczenia MSC może być trudny ze względu na dużą liczbę opublikowanych markerów MSC30,31. Ponieważ MSCs wykazują ekspresję CD90, podobnie jak fibroblasty, dodatkowe markery MSC, takie jak CD105 lub CD271, mogą okazać się przydatne do ich identyfikacji. Jednak MSCs stanowią tylko bardzo niski odsetek wszystkich komórek skóry właściwej, a ponieważ fibroblasty CD90+ wykazują typowe cechy morfologiczne fibroblastów po sortowaniu, można argumentować, że wykluczenie MSCs za pomocą odrębnych markerów powierzchni komórek może być niepotrzebne.
Co ważne, przeanalizowaliśmy ekspresję genów FAP i CD90 po utrzymaniu komórek w hodowli przez 7-14 dni po sortowaniu (dane nie pokazane) i stwierdziliśmy, że ekspresja obu markerów jest regulowana w górę w odpowiednich posortowanych pojedynczych komórkach dodatnich (FAP+CD90- lub FAP-CD90+)16. W związku z tym podkreślamy, że wyżej opisane zestawy markerów i protokół pozwalają na izolację pierwotnych podzbiorów fibroblastów bezpośrednio z tkanki, ale nie z wcześniej hodowanych mieszanych populacji fibroblastów.
Niemniej jednak wykazujemy, że funkcjonalność wszystkich trzech subpopulacji jest zachowana w hodowli komórkowej niezależnie od zmiany ekspresji markerów powierzchniowych komórek, ponieważ fibroblasty posortowane jako FAP+CD90- fibroblasty brodawkowate nie nabywają zdolności do ulegania adipogenezie po dłuższym okresie hodowli, podczas gdy fibroblasty posortowane jako FAP+CD90+ lub FAP-CD90+ Fibroblasty siatkowate zachowują zdolność do różnicowania się w adipocyty 16. Co ważne, odkryliśmy również, że geny specyficzne dla brodawek włosowatych i siateczkowatych są nadal wyrażane w większym stopniu odpowiednio w FAP+CD90 i CD90+.
Podsumowując, ustaliliśmy protokół izolacji funkcjonalnie odrębnych podzbiorów fibroblastów za pomocą FACS, który po raz pierwszy pozwala na izolację i analizę czystych i naiwnych subpopulacji fibroblastów z ludzkiej skóry właściwej. Metoda ta stanowi duży postęp w stosunku do powszechnie stosowanego protokołu izolacji hodowli eksplantatów fibroblastów z górnej i dolnej części skóry właściwej, ponieważ (i) istnieje przeciwstawny gradient fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych od powierzchni skóry do tkanki podskórnej oraz (ii) fibroblasty zmieniają swoją sygnaturę genową in vitro.

Jako główny składnik komórkowy tkanki łącznej, fibroblasty są przede wszystkim odpowiedzialne za odkładanie kolagenu i elastycznych włókien, które ostatecznie tworzą macierz zewnątrzkomórkową1, a zatem ich rola w homeostazie tkanek, regeneracji i chorobie była przez długi czas niedoceniana. Jednak ostatnio fibroblasty znalazły się w centrum uwagi badaczy, nie tylko dlatego, że stanowią ważne źródło komórkowe dla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych2, ale także ze względu na ich wysoką plastyczność i wpływ na patogenezę wielu chorób, takich jak zwłóknienie narządów3,4,5 lub cancer6,7. 
Ludzka skóra składa się z wielowarstwowego nabłonka, naskórka i leżącej pod nim tkanki łącznej, skóry właściwej, która może być histologicznie podzielona na górną brodawkowatą i dolną siatkowatą skórę właściwą i składa się głównie z fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej8 i tkanki podskórnej. Ze względu na ich lokalizację w tkance, fibroblasty skórne zostały z grubsza sklasyfikowane jako fibroblasty brodawkowate i siatkowate1.
Co ważne, ostatnie dane wskazują, że te subpopulacje fibroblastów skórnych są nie tylko histologicznie rozróżnialne, ale także, że ich funkcja jest znacznie zróżnicowana. W skórze myszy fibroblasty brodawkowate i siatkowate wywodzą się z dwóch odrębnych linii podczas embriogenezy9. Kilka linii dowodowych sugeruje, że te dwie linie odgrywają różne role nie tylko w homeostazie tkanek, morfogenezie mieszków włosowych, gojeniu ran i zwłóknieniu7,9,10, ale także reagują na różne sygnały z nowotworowych komórek macierzystych naskórka11, co sugeruje rozbieżne role w patogenezie nowotworów. Dogodnie, obie linie wyrażają odrębny zestaw wzajemnie wykluczających się markerów komórkowych w skórze dorosłej myszy, umożliwiając w ten sposób izolację czystych populacji fibroblastów skórnych i późniejszą obszerną analizę ich specyficznych funkcji in vitro9,11.
Odpowiednio, co najmniej dwie odrębne podgrupy fibroblastów o odmiennej morfologii i funkcjach, w tym rozbieżne tempo proliferacji, zdolności do przebudowy tkanek12,13, a także zdolność do wspierania wzrostu komórek macierzystych naskórka in vitro, zostały opisane dla ludzkiej skóry właściwej14,15. Jednak większość opublikowanych badań nad ludzkimi fibroblastami skóry została przeprowadzona przy użyciu mieszanych populacji fibroblastów wyizolowanych z kultur eksplantatów ze skóry dermatomizowanej, ponieważ specyficzne zestawy markerów powierzchni komórek umożliwiające izolację czystych ludzkich subpopulacji fibroblastów brodawkowatych lub siatkowatych analogicznie do skóry właściwej myszy nie zostały jeszcze ustalone.
Ostatnio wykazaliśmy, że fibroblasty brodawkowate i siatkowate ludzkiej skóry charakteryzują się specyficznymi markerami powierzchni komórek, które umożliwiają izolację odpowiednich subpopulacji poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)16: Fibroblasty FAP+CD90- reprezentują fibroblasty brodawkowate zlokalizowane głównie w górnej części skóry właściwej, prezentujące wyższe tempo proliferacji, wyraźną sygnaturę genów, ale bez potencjału adipogennego. Fibroblasty FAP+CD90+ i FAP-CD90+ należą do linii siatkowatej dolnych przedziałów skórnych, które są mniej proliferacyjne, ale łatwo ulegają adipogenezie - cecha charakterystyczna fibroblastów siatkowatych. Metoda ta umożliwia dogłębne zbadanie tych odrębnych subpopulacji fibroblastów nie tylko pod kątem ich specyficznych funkcji w warunkach fizjologicznych, ale także w kontekście patogenezy chorób skóry, w tym raka skóry.
Jednakże, ponieważ fibroblasty zmieniają ekspresję markerów powierzchniowych komórek w dwuwymiarowej hodowli in vitro16,17,19, zastosowanie naszego protokołu ogranicza się do izolacji pierwotnych fibroblastów z ludzkiej skóry właściwej i nie pozwala na identyfikację brodawkowatych lub siatkowatych fibroblastów w mieszanych populacjach kultur komórkowych. Co ważne, mimo że ekspresja markerów powierzchniowych komórek zmienia się in vitro, wykazaliśmy, że podzbiory fibroblastów wyizolowane zgodnie z opisanym poniżej protokołem zachowują swoją specyficzną funkcjonalność podczas hodowli16, umożliwiając w ten sposób badania in vitro właściwości specyficznych dla podzbioru w warunkach fizjologicznych lub patologicznych.
Podsumowując, opracowaliśmy protokół izolacji odrębnych podzbiorów fibroblastów za pomocą FACS, który po raz pierwszy pozwala na izolację populacji czystych fibroblastów z ludzkiej skóry właściwej w stanie naiwnym.

<table><tbody><tr><td>< mocny> Materiał: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma</td><td>9718</td><td>używany do samodzielnie wykonanego buforu do lizy ACK</td></tr><tr><td>Amniomax-C100 (1x) Basal Medium</td><td>Gibco</td><td>17001-074</td><td>stosowany do podłoża wzrostu fibroblastów</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanolu</td><td>Scharlau</td><td>ME0095</td><td>CAUTION</td></tr><tr><td>C100 Suplement</td><td>Thermo Scientific</td><td>12556015</td><td>stosowany do podłoża wzrostu fibroblastów</td></tr><tr><td>Kolagenaza I</td><td>Thermo Scientific</td><td>17100017</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td></td><td>Sigma E1644</td><td>używana do samodzielnie wykonanego buforu do lizy ACK</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (inaktywowana termicznie)</td> <td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>UWAGA</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1,096,341,011</td><td></td></tr><tr><td>OilRed O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>UWAGA Rakotwórczy. Działa drażniąco na skórę i oczy. Obchodź się ostrożnie.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez Ca2+ & Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan potasu</td><td>Sigma</td><td>237205</td><td>używany do samodzielnie wykonanego buforu do lizy ACK</td></tr><tr><td>PureLink RNA MicroKit</td><td>Invitrogen</td><td>12183-016</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Synteza pierwszej nici SuperMix do qRT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11752</td><td></td></tr><tr><td>Taqman 2x Uniwersalny PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>UWAGA Działa drażniąco na skórę i oczy.</td></tr><tr><td>Troglitazone</td><td>Sigma</td><td>T2573</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Cytometria przepływowa Przeciwciała:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti human CD31-AF488</td><td>Biolegend</td><td>303109</td><td>Rozcieńczenie: 1:30, Partia: B213986, RRID: AB_493075</td></tr><tr><td>anty ludzki CD45-Pacific niebieski</td><td>Biolegend</td><td>304029</td><td>Rozcieńczenie: 1:20, Partia: B218608, RRID: AB_2174123</td></tr><tr><td>anit ludzki CD49f/ITGA6-PE</td><td>Serotec</td><td>MCA699PE</td><td>Rozcieńczenie: 1:20, Lot: 0109, RRID: AB_566833</td></tr><tr><td>anty ludzki CD90/Thy-1-AF700</td><td>Biolegend</td><td>328120</td><td>Rozcieńczenie: 1:30, Lot: B217250, RRID: AB_2203302</td></tr><tr><td>anty ludzki CD106-AF421</td><td>BD</td><td>744309</td><td>Rozcieńczenie: 1:100, Partia: 7170537, RRID: x</td></tr><tr><td>anty ludzki CD235ab-Pacific blue</td><td>Biolegend</td><td>306611</td><td>Rozcieńczenie: 1:1000, Partia: B224563, RRID: AB_2248153</td></tr><tr><td>anty-ludzka E-kadheryna-PE</td><td>Biolegend</td><td>147304</td><td>Rozcieńczenie: 1:20, Lot: B197481, RRID: AB_2563040</td></tr><tr><td>anty ludzki FAP-APC</td><td>R& D</td><td>FAB3715A</td><td>Rozcieńczenie: 1:20, Partia: AEHI0117111, RRID: x</td></tr><tr><td>Human TruStain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Rozcieńczenie: 1:20, Partia: B235080, RRID: x</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki mikroniczne 1,4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówka z nakrętką</td><td>Sarstedt</td><td>72,692,405</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem z nasadką sitka komórkowego</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowe probówki kanoniczne</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m Sitko do komórek nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Acculan 3Ti Dermatome</td><td>VWR</td><td>AESCGA670</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Ostrza dermatomowe</td><td>VWR</td><td>AESCGB228R</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96well</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>FST</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do herbaty</td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Podłoże do wzrostu fibroblastów:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX podłoże podstawowe z suplementem AmnioMAX C-100, 10% SKO i 1% P/S</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasty to wysoce heterogeniczna populacja komórek zamieszana w patogenezę wielu chorób ludzkich. W ludzkiej skórze właściwej fibroblasty tradycyjnie przypisuje się powierzchownej brodawkowatej lub dolnej siatkowatej skórze właściwej zgodnie z ich lokalizacją histologiczną. W skórze właściwej mysiej fibroblasty brodawkowate i siatkowate wywodzą się z dwóch różnych linii o rozbieżnych funkcjach dotyczących procesów fizjologicznych i patologicznych oraz odrębnym profilu ekspresji markerów powierzchni komórek, dzięki którym można je odróżnić.
Co ważne, dowody z hodowli eksplantatów z powierzchownych i dolnych warstw skóry sugerują, że w ludzkiej skórze właściwej istnieją co najmniej dwie funkcjonalnie odrębne linie fibroblastów skóry. Jednak w przeciwieństwie do skóry myszy, markery powierzchni komórek umożliwiające rozróżnianie różnych podzbiorów fibroblastów nie zostały jeszcze ustalone dla skóry ludzkiej. Opracowaliśmy nowy protokół izolacji populacji ludzkich fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu dwóch markerów powierzchniowych komórek: białka aktywacji fibroblastów (FAP) i antygenu tymocytowego 1 (Thy1)/CD90. Metoda ta umożliwia izolację czystych podzbiorów fibroblastów bez manipulacji in vitro, która, jak wykazano, wpływa na ekspresję genów, umożliwiając w ten sposób dokładną analizę funkcjonalną podzbiorów ludzkich fibroblastów skórnych w odniesieniu do homeostazy tkanek lub patologii choroby.

Przegląd głównych etapów przetwarzania tkanki skóry w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek przedstawiono na Rysunku 1, który obrazuje dermatomowanie skóry (Rysunek 1A), poszczególne warstwy skóry właściwej (Rysunek 1B), usuwanie warstwy tkanki tłuszczowej podskórnej (Rysunek 1C) oraz oddzielanie naskórka od skóry właściwej brodawkowatej (Rysunek 1D), a także poszczególne etapy manualnej i enzymatycznej dysocjacji tkanki (Rysunek 1E,F). Schemat trzech warstw skóry właściwej przedstawiono na Rysunku 2.
Rycina 3 przedstawia strategię bramkowania panelu barwień w cytometrii przepływowej do analizy różnych subpopulacji fibroblastów ze skóry człowieka. Dodatkowe markery powierzchniowe, które nie są ekspresowane przez fibroblasty, umożliwiają wykluczenie innych komórek obecnych w skórze, takich jak komórki odpornościowe, komórki naskórka, mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs), erytrocyty lub komórki śródbłonka, w celu uzyskania maksymalnej czystości izolowanych populacji. Identyfikacja tych subpopulacji fibroblastów nie wymaga koniecznie stosowania tego samego panelu FACS, który zaprezentowano na Rycini 2, jednak jest to nasza rekomendacja. Można zastosować przeciwciała znakowane innymi barwnikami fluorescencyjnymi lub zmienić kombinację markerów wykluczających.
Należy zauważyć, że protokół ten umożliwia identyfikację trzech populacji fibroblastów w ludzkiej skórze, które różnią się lokalizacją w obrębie skóry właściwej, profilami ekspresji genów, a także funkcjami (Rycina 4). Komórki FAP+CD90- są wzbogacone w skórze właściwej brodawkowatej, podczas gdy FAP+CD90+ i FAP-CD90+ występują liczniej w skórze właściwej siateczkowatej (Rycina 4A). Wszystkie trzy subpopulacje wykazują typową morfologię fibroblastów po sortowaniu w hodowli komórkowej (Rycina 4B). Co ciekawe, różnią się one zdolnością do różnicowania w adipocyty, co jest cechą charakterystyczną dla fibroblastów siateczkowatych. Łącząc te wyniki z profilowaniem ekspresji genów za pomocą polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (RT-PCR)16 (Rycina 4C), które wykazało, że komórki FAP+CD90- wykazują wysoką ekspresję markerów przypisywanych zazwyczaj fibroblastom brodawkowatym, takich jak CD26, NTN i PDPN, podczas gdy komórki CD90+ wykazują wysoką ekspresję znanych markerów siateczkowatych, takich jak CD36, ACTA2 i PPARγ, wyciągamy wniosek, że komórki FAP+CD90- należą do linii brodawkowatej, a komórki CD90+ do linii siateczkowatej.
<img alt="Sekwencja opracowania tkanki do analizy laboratoryjnej; obejmuje krojenie, barwienie i filtrowanie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Izolacja zawiesiny pojedynczych komórek skóry właściwej z nienaruszonej skóry ludzkiej. (A) Skórę tnie się elektrycznym dermatomem na skórę właściwą brodawkowatą i siateczkowatą. (B) Skóra właściwa brodawkowata z przyległym naskórkiem ma grubość 300 µm (góra), natomiast górna część skóry właściwej siateczkowatej ma grubość 700 µm (dół). (C) Podskórną warstwę tłuszczu z dolnej części skóry właściwej siateczkowatej zdrapuje się skalpelem. (D) Po inkubacji skóry właściwej brodawkowatej w roztworze enzymów dysocjujących w 37 °C przez 1 h, naskórek można łatwo usunąć pęsetą. (E) Różne warstwy skóry właściwej sieka się nożyczkami i przenosi do mieszaniny enzymatycznej do trawienia, składającej się z kolagenazy I, II i IV oraz hialuronidazy. (F) Po 1 h dysocjacji w 37 °C trawienie tkanki jest przerywane, a zawiesinę przelewa się przez sitko do herbaty, aby usunąć nietrawione fragmenty skóry. (G) Zawiesinę komórkową filtruje się ponownie przez sitko komórkowe 70 µm i wiruje przy 500 x g w 4 °C przez 10 min. (H) Po wirowaniu osad komórkowy płucze się w 1x PBS z 10% FCS, po czym jest on gotowy do barwienia metodą FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat struktury ludzkiej skóry: naskórek, warstwy skóry właściwej, tkanka podskórna, przekroje histologiczne, głębokość tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Podział skóry właściwej człowieka na warstwę brodawkowatą i siateczkowatą za pomocą dermatomu. Schemat przedstawiający trzy warstwy skóry właściwej uzyskane poprzez cięcie skóry o pełnej grubości na skórę brodawkowatą (łącznie z naskórkiem; 0‒300 µm; warstwa skóry właściwej 1), górną warstwę siateczkowatą (300‒1,000 µm; warstwa skóry właściwej 2) oraz dolną warstwę siateczkowatą (&gt;1,000 µm; warstwa skóry właściwej 3) przy użyciu dermatomu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagramy analizy cytometrii przepływowej przedstawiające sortowanie komórek za pomocą FSC-SSC oraz markerów Pacific blue, ITGA6 i FAP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Strategia bramkowania FACS dla subpopulacji ludzkich fibroblastów skóry właściwej. (A‒E) Najpierw wyznaczane są bramki dla pojedynczych komórek (B) oraz komórek żywych (DAPI-) (C). Wyklucza się komórki odpornościowe (CD45+), mezenchymalne komórki macierzyste (CD106+) oraz erytrocyty (CD235ab+) (C), a komórki negatywne pod względem Pacific blue są dalej bramkowane na komórki podwójnie negatywne dla E-kadheryny (Ecad) i ITGA6 (kanał PE, D). E-kadheryna i ITGA6 są markerami eksprymowanymi na komórkach naskórka. Następnie wyklucza się komórki pozytywne dla CD31-FITC (komórki śródbłonka i limfatyczne) (D), co prowadzi do wyodrębnienia trzech populacji fibroblastów eksprymujących jeden lub oba markery powierzchniowe fibroblastów FAP i CD90: FAP+CD90-, FAP+CD90+ oraz FAP-CD90+ (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Cytometria przepływowa, mikroskopia i analiza ekspresji genów w warstwach skóry właściwej; porównanie wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59372/59372fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Fibroblasty FAP+CD90-, FAP+CD90+ oraz FAP-CD90+ różnią się lokalizacją w skórze właściwej, ekspresją genów i funkcjonalnością. (A) Reprezentatywne wykresy FACS bramkowanych fibroblastów izolowanych z brodawkowatej, górnej siateczkowej i dolnej siateczkowej warstwy skóry właściwej. Strategia bramkowania wyjaśniona jest na Rycini 3. Fibroblasty FAP+CD90- są wzbogacone w skórze właściwej brodawkowatej (19,2%) w porównaniu do dolnej warstwy siateczkowej (0,83%). Komórki FAP+CD90+ występują w całej skórze właściwej, ale ich największa liczebność przypada na górną warstwę siateczkową (40,7%). Komórki FAP-CD90+ są wzbogacone w dolnej warstwie siateczkowej (64,4%). (B) Warto zauważyć, że wszystkie trzy posortowane subpopulacje wykazują typową morfologię fibroblastów po 7 dniach hodowli (lewo). Co ciekawe, zachowują się one różnie w teście adipogenezy. Po 14 dniach hodowli komórki FAP+CD90- nie różnicują się w adipocyty, podczas gdy komórki FAP+CD90+ i FAP-CD90+ łatwo ulegają adipogenezie (prawo; barwienie Oil Red O wybarwia komórki zawierające lipidy na czerwono). Paski skali = 1,000 µm. (C) Bezpośrednio posortowane fibroblasty FAP+CD90- wykazują ekspresję markerów fibroblastów brodawkowatych CD26, NTN1 i PDPN, podczas gdy komórki FAP-CD90+ wykazują ekspresję CD36, ACTA2 i PPARγ, które są znane z ekspresji w linii siateczkowej. * p ≤ 0.05; *** p ≤ 0.0005 w porównaniu do komórek FAP+/CD90-; # p ≤ 0.05; ### p ≤ 0.0005 w porównaniu do komórek FAP-/CD90+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59372/59372fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Protokół ten ułatwia izolację funkcjonalnie odrębnych podzbiorów fibroblastów od ludzkiej skóry poprzez sortowanie FAC na podstawie ekspresji markera na powierzchni komórki. Po raz pierwszy fibroblasty brodawkowate i siatkowate można wyizolować bezpośrednio ze skóry bez manipulacji in vitro. Jest to ogromny postęp w porównaniu z wcześniej ustalonymi metodami izolacji z wykorzystaniem kultur eksplantatów.Podzbiory fibroblastów skórnych pełnią różne funkcje w warunkach homeostazy. Za pomocą tego narzędzia możliwe jest zbadanie funkcjonalnych różnic w patologiach skóry, w tym raku lub chorobach zapalnych skóry. Ponieważ obchodzenie się z tkanką ludzką wymaga pewnej wprawy, aby osiągnąć zadowalającą wydajność komórek, chcielibyśmy przedstawić wizualną demonstrację, aby ułatwić i przyspieszyć ten proces.Aby przygotować skórę właściwą o pełnej grubości, umieść kawałek ludzkiej skóry na grubej bibule filtracyjnej naskórkiem skierowanym w dół. Przytrzymaj mocno naskórek kleszczami i zeskrob podskórną warstwę tłuszczu skalpelem. Następnie pokrój tkankę w paski o szerokości pięciu milimetrów przed włożeniem ich na szalkę Petriego.Aby podzielić skórę właściwą na warstwy brodawkowate i siatkowate, umieść kawałek skóry na grubej bibule filtracyjnej z naskórkiem skierowanym do góry. Przytrzymaj mocno skórę na jej krawędziach za pomocą kleszczy i wytnij odcinek o grubości 300 mikrometrów za pomocą elektrycznego dermatomu. Przenieś pierwszą warstwę składającą się z naskórka i brodawkowatej skóry właściwej na szalkę Petriego.Następnie natychmiast przystąp do oddzielenia naskórka i skóry właściwej lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki. Następnie dostosuj dermatom do grubości cięcia 700 mikrometrów i pokrój pozostałą skórę właściwą. Umieść górny plasterek, który jest zdefiniowany jako górna siatkowata skóra właściwa, na osobnej szalce Petriego.Następnie zeskrob podskórną warstwę tłuszczu skalpelem z pozostałej dolnej siateczkowatej warstwy skóry właściwej i wyrzuć ją. Zbierz dolną siatkowatą skórę właściwą na innej szalce Petriego. Natychmiast przejdź do procedury trawienia enzymatycznego lub dodaj 1x PBS, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.Aby przeprowadzić trawienie enzymatyczne, umieść pięciomilimetrowe paski skóry lub naskórek/brodawkowatą skórę właściwą z naskórkiem skierowanym do góry na szalce Petriego z 10 mililitrami dysocjującego roztworu enzymu. Następnie inkubuj szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji przenieś naskórek/brodawkowatą skórę właściwą na pokrywę szalki Petriego.Oddziel naskórek od górnej części skóry właściwej za pomocą dwóch kleszczy, z których każdy przytrzymuje krawędź skóry właściwej. Następnie zmiel każdą warstwę skóry tak dokładnie, jak to możliwe. Im mniejsze kawałki, tym lepsze trawienie tkankowe.Następnie przygotuj mieszankę trawiącą. Przenieś zmieloną tkankę z 10 milimetrami przygotowanej mieszanki wytrawiającej do 50-milimetrowej probówki. Inkubować tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę pod mieszaniem.Podczas trawienia odwróć rurkę kilka razy. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, zatrzymaj trawienie enzymatyczne tkanek, dodając 10 mililitrów pożywki fibroblastowej do strawionej tkanki na lodzie. Następnie przelej zawartość każdej probówki przez zwykłe sterylne sitko do herbaty ze stali nierdzewnej i zbierz zawiesinę komórek na czystej szalce Petriego.Umyć sitko pożywką i rozgnieść niestrawione kawałki tkanki krawędzią tłoka strzykawki. Następnie pipetować pobraną zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Przepłucz sitko komórkowe pożywką i zbierz przepływ przez tę samą probówkę.Następnie odwiruj probówkę o ciśnieniu 500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Usuń supernatant i przemyj osad komórkowy pięcioma mililitrami pożywki fibroblastowej. Powtórz ponownie etap wirowania.Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu do lizy erytrocytów ACK. Pozostaw komórki w buforze do lizy na około jedną minutę w temperaturze otoczenia. Następnie przerwij lizę, dodając dziewięć mililitrów 1x PBS z 10% FCS.Ponownie odwirować probówkę w temperaturze 500 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie wyrzucić supernatant. Po wybarwieniu komórek w celu sortowania FAC zgodnie ze standardowymi protokołami, należy posortować trzy subpopulacje fibroblastów do oddzielnych probówek mikrowirówek wypełnionych 350 mikrolitrami buforu do lizy w celu izolacji RNA lub 350 mikrolitrami pożywki wzrostowej fibroblastów do hodowli komórek. Natychmiast odwróć probówki i albo umieść probówki buforowe do lizy w ciekłym azocie, albo umieść probówki z pożywką wzrostu fibroblastów na lodzie.Po FACS wiruj komórki w dół z prędkością 500 razy g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umieść równą ilość komórek w pożywce wzrostowej fibroblastów w 24-dołkowym naczyniu do hodowli komórek i pozostaw je do wzrostu, aż osiągną 70% konfluencji. Następnie zastąp pożywkę z hodowanych komórek pożywką do różnicowania adipocytów i pozwól komórkom różnicować się przez 14 dni.W 14 dniu różnicowania utrwal komórki za pomocą 4% PFA przez 20 minut. Umyj studzienki 60% izopropanolem i pozwól mu całkowicie odparować. Następnie zabarwiaj komórki pięcioma milimolami przefiltrowanego czerwonego oleju O przez 20 minut.Po 20 minutach przemyj poplamione komórki czterokrotnie wodą destylowaną. Wyobraź sobie komórki zanurzone w wodzie za pomocą odwróconego mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu ze światłem przechodzącym. Protokół ten umożliwia identyfikację trzech populacji fibroblastów w ludzkiej skórze, które charakteryzują się różną lokalizacją śródskórną, profilami ekspresji genów i funkcjami.FAP-dodatni CD90-ujemny jest wzbogacony w brodawkowatej skórze właściwej, podczas gdy FAP-dodatni CD90-dodatni i FAP-ujemny CD90-dodatni są bardziej obfite w siatkowatej skórze właściwej. Wszystkie trzy posortowane subpopulacje wykazują typową morfologię fibroblastów po posadzie przez siedem dni. Co ciekawe, inaczej zachowują się one w teście adipogenezy.Po 14 dniach w hodowli FAP-dodatnie CD90-ujemne nie różnicują się w adipocyty, podczas gdy FAP-dodatnie CD90-dodatnie i FAP-ujemne CD90-dodatnie łatwo ulegają adipogenezie. Profilowanie ekspresji genów pokazuje, że FAP-dodatnie komórki CD90-ujemne wyrażają wysokie poziomy markerów powszechnie przypisywanych fibroblastom brodawkowatym, takim jak CD26, NTN i PDPN, podczas gdy komórki CD90-dodatnie wyrażają znane markery siatkowate, takie jak CD36, aktyna mięśni gładkich i PPAR-gamma na wysokich poziomach. Wnioskujemy, że FAP-dodatnie komórki CD90-ujemne należą do brodawkowatych, a komórki CD90-dodatnie należą do linii siatkowatej.Trawienie przebiega najlepiej, jeśli kawałki skóry są dokładnie zmielone i inkubowane w wystarczającej ilości pożywki trawiącej. Podzbiory fibroblastów skórnych są funkcjonalnie zróżnicowane. Zbadanie ich funkcji w kontekście patogenezy choroby utoruje drogę dla nowych interwencji diagnostycznych i terapeutycznych.

isolation-papillary-reticular-fibroblasts-from-human-skin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Protokół hodowli eksplantów fibroblastów z biopsji wycinanych ze skóry ludzkiej jest technicznie niezawodną i prostą metodą pozyskiwania komórek skóry w ciągu 4-8 tygodni w celu zamrożenia około 15-20 milionów komórek o niskim numerze pasażu.

Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Opisujemy protokół skutecznego izolowania limfocytów T rezydujących w skórze z biopsji ludzkiej skóry. Protokół ten zapewnia wystarczającą liczbę żywotnych limfocytów rezydentnych w ludzkiej skórze do analizy cytometrii przepływowej i hodowli ex vivo.

Izolacja limfocytów z ludzkiej skóry w celu analizy fenotypowej i hodowli komórkowej ex vivo

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Naucz się izolować fibroblasty brodawkowate i siatkowate ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania FACS bez hodowli in vitro. Ta metoda pozwala badać różnice funkcjonalne w patologiach skóry.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przeglądaj więcej filmów