Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego
June 3rd, 2019
Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.
Sekwencjonowanie nanoporowe trzeciej generacji to potężna, nowatorska technologia sekwencjonowania, która pozwala bardzo łatwo uzyskać informacje o sekwencji z szerokiej gamy próbek. Głównymi zaletami tej techniki są przenośność urządzenia sekwencjonującego, wyjątkowo długa długość odczytu oraz dostępność danych w czasie rzeczywistym. Sekwencjonowanie nanoporowe jest szczególnie pomocną technologią podczas wybuchów chorób w odległych lokalizacjach.
Z powodzeniem stosuje się go w laboratoriach terenowych podczas i po wybuchu epidemii wirusa Ebola w Afryce Zachodniej i Środkowej. Poprzez sekwencjonowanie nanospor i użycie urządzenia MinION do tego celu jest dość łatwe, należy zachować ostrożność podczas przygotowywania biblioteki i podczas ładowania komórek przepływowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy skonfigurować PCR z przyłożeniem w celu amplifikacji cDNA za pomocą zestawu starterów przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności na gorąco z odpowiednim buforem reakcyjnym w objętości reakcyjnej 50 mikrolitrów z jedną matrycą mikrolitrową.
Jeśli to możliwe, zaplanuj reakcję na lodzie lub w chłodnym bloku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inkubować reakcję w termocyklerze, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie przenieś 50 mikrolitrów produktu PCR do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej o niskim poziomie wiązania DNA.
Dokładnie zawieś kulki magnetyczne przez wirowanie. Następnie dodaj 50 mikrolitrów kulek do reakcji PCR i dobrze wymieszaj. Inkubować próbkę w mieszalniku obrotowym przez pięć minut w temperaturze pokojowej, obracając się z prędkością 15 obr./min.
Krótko odkręć próbkę, a następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby granulować kulki magnetyczne. Poczekaj, aż supernatant zostanie całkowicie oczyszczony, zanim przejdziesz dalej. Następnie odessać supernatant bez naruszania granulki kulki i wyrzucić ją.
Pobrać pipetą 200 mikrolitrów 70% etanolu do probówki reakcyjnej i inkubować przez 30 sekund w temperaturze pokojowej. Zassać etanol bez naruszania granulki i wyrzucić ją. Powtórz ten proces mycia etanolem jeszcze raz, w sumie dwa prania.
Suszyć granulki na powietrzu przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie wyjmij rurkę reakcyjną ze stojaka magnetycznego. Zawiesić osad w 30 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.
Umieść probówkę reakcyjną z powrotem na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż kulki reakcyjne zostaną całkowicie granulowane. Następnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i przenieść do nowej 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Jeśli kilka próbek ma być sekwencjonowanych w tym samym czasie, kody kreskowe mogą być teraz dodawane przez dwa dodatkowe etapy PCR, po których następuje oczyszczanie DNA, jak pokazano wcześniej.
Najpierw połącz równą ilość DNA oznaczonego kodem kreskowym z każdej próbki, aby uzyskać łącznie jeden mikrogram DNA w objętości 45 mikrolitrów w probówce reakcyjnej o pojemności 0,2 mililitra. W przypadku dA-Tailing dodaj siedem mikrolitrów bufora reakcyjnego przygotowania końcowego, trzy mikrolitry mieszanki enzymów przygotowania końcowego i pięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Delikatnie przesuń tubkę, aby wymieszać.
W termocyklerze inkubuj reakcję przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza, a następnie pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie należy przeprowadzić oczyszczanie PCR produktu reakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Opcjonalnie należy pobrać jeden mikrolitr w celu ilościowego określenia stężenia próbki za pomocą spektrofotometru UV.
Połącz 22,5 mikrolitra wcześniej uzyskanego oczyszczonego DNA z 2,5 mikrolitrami adaptera 1D2 i 25 mikrolitrami Blunt/TA Ligase Master Mix w nowej 1,5 mililitrowej probówce reakcyjnej o niskim poziomie wiązania DNA. Delikatnie przesuń tubkę, aby wymieszać. Krótko odwiruj mieszaninę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Następnie należy przeprowadzić oczyszczanie PCR produktu reakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Połącz 45 mikrolitrów produktu reakcyjnego z pięcioma mikrolitrami mieszanki adaptera kodów kreskowych i 50 mikrolitrami Blunt/TA Ligase Master Mix w probówce reakcyjnej o niskim wiązaniu DNA. Delikatnie strzepuj, aby wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Oczyścić produkt reakcji zgodnie z opisem w protokole tekstowym i przechowywać otrzymany produkt na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia gotowego do użycia. Aby rozpocząć, przed użyciem należy przeprowadzić kontrolę jakości komory przepływowej. W tym celu podłącz urządzenie sekwencjonujące do komputera hosta i otwórz oprogramowanie.
Włóż komórkę przepływową do urządzenia sekwencjonującego. Następnie wybierz typ komórki przepływowej z pola selektora i kliknij dostępny, aby potwierdzić. U dołu ekranu kliknij opcję sprawdź komórkę przepływu i wybierz odpowiedni typ komórki przepływu.
Kliknij przycisk Rozpocznij test, aby rozpocząć sprawdzanie jakości. Aby komora przepływowa nadawała się do użytku, potrzeba łącznie co najmniej 800 aktywnych nanoporów. Najpierw otwórz pokrywę portu zalewowego, przesuwając ją w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
Ustaw pipetę P1000 na 200 mikrolitrów i włóż końcówkę do portu zasysania. Następnie dostosuj pipetę do 230 mikrolitrów, trzymając końcówkę w porcie zasysania, aby pobrać od 20 do 30 mikrolitrów buforu i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. W nowej 1,5-mililitrowej probówce reakcyjnej o niskim poziomie wiązania DNA przygotuj mieszankę gruntującą, łącząc 576 mikrolitrów buforu RBF z 624 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz.
Ostrożnie odpipetować 800 mikrolitrów przygotowanej mieszanki gruntującej do portu zalewowego i odczekać pięć minut. Następnie podnieść pokrywę portu próbki i odpipetować dodatkowe 200 mikrolitrów przygotowanej mieszanki gruntującej do portu zasysającego. Odpipetować 35 mikrolitrów buforu RBF do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra o niskim poziomie wiązania DNA.
Dokładnie wymieszaj kulki LLB przez pipetowanie i dodaj 25,5 mikrolitra kulek do bufora RBF. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra wody wolnej od nukleaz i 12 mikrolitrów biblioteki DNA i wymieszaj przez pipetowanie. Dodać 75 mikrolitrów mieszaniny próbki w sposób powolny kroplami do celi przepływowej przez port próbki.
Następnie załóż pokrywę portu próbki, zamknij port zalewowy i zamknij pokrywę urządzenia sekwencjonującego. W oprogramowaniu upewnij się, że komórka przepływowa jest nadal dostępna. Otwórz nowy eksperyment i skonfiguruj parametry uruchamiania, wybierając używany zestaw.
Wybierz połączenia bazowe na żywo. Rozpocznij sekwencjonowanie, klikając przycisk rozpocznij eksperyment. Kontynuuj sekwencjonowanie, dopóki nie zostanie zebrana wystarczająca ilość danych eksperymentalnych.
W reprezentatywnym eksperymencie RNA jest ekstrahowane z 10 różnych próbek krwi od pięciu gatunków zwierząt. Stężenia RNA obserwuje się od 43 nanogramów do 543 nanogramów na mikrolitr. Po amplifikacji metodą RT-PCR, analiza żelowa produktów MPC1 PCR wykazuje różne wyniki ze znacznie słabszymi prążkami dla próbek BC01 i BC02.
Różnice te są najprawdopodobniej spowodowane różnicami w jakości próbki, chociaż nie można wykluczyć różnic w skuteczności PCR wynikających z różnic w wiązaniu starterów z genem MCP1 różnych gatunków. Jednak te różnice w wydajności i/lub wydajności amplifikacji nie mają znaczącego wpływu na ogólny wynik sekwencjonowania. Podzbiór 10 000 uzyskanych odczytów jest następnie wybierany i demultipleksowany do dalszej analizy.
Spośród 10 000 przeanalizowanych odczytów, 5 457 wykazuje długość od 1 750 do 2 000 nukleotydów, co odpowiada oczekiwanym rozmiarom fragmentów PCR amplifikowanych w ramach naszego przepływu pracy. Dodatkowy pik w rozkładzie długości odczytów obserwuje się między 250 a 500 nukleotydami, które można przypisać niespecyficznym produktom PCR. Demultipleksowanie odczytów pozwala na przypisanie 87,6% odczytów do jednej z 10 analizowanych próbek.
Chociaż ta metoda jest dość niezawodna, w warunkach polowych amplifikacja PCR jest najbardziej problematycznym krokiem. Z naszych doświadczeń wynika, że zagnieżdżone protokoły były często konieczne do wzmocnienia sekwencji docelowych. Oprócz sekwencjonowania genów gospodarza zwierzęcego, metoda ta może być również stosowana do sekwencjonowania dowolnego DNA lub RNA, w tym patogenów wirusowych lub bakteryjnych.
Sekwencjonowanie nanoporowe jest zatem obecnie coraz częściej stosowane nie tylko podczas wybuchów epidemii lub do badań naukowych w odległych lokalizacjach, ale także w zwykłych laboratoriach, w których długie odczyty otwierają nowe, ekscytujące możliwości badawcze. Chociaż żaden ze stosowanych odczynników nie jest szczególnie niebezpieczny, należy przestrzegać standardowych dobrych praktyk laboratoryjnych. Oczywiście podczas sekwencjonowania czynników chorobotwórczych należy przestrzegać wszystkich niezbędnych środków ostrożności przy obchodzeniu się z tymi czynnikami.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół sekwencjonowania nanoporowego mRNA z pełnej krwi, podkreślając jego przydatność w odległych i ograniczonych pod względem zasobów środowiskach. Metoda wykorzystuje przenośność i dostępność danych w czasie rzeczywistym oferowanych przez technologię sekwencjonowania nanoporowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Sekwencjonowanie nanoporowe
- Analiza mRNA
- Zastosowania terenowe w przypadku epidemii chorób
Tło
- Sekwencjonowanie nanoporowe to technologia sekwencjonowania trzeciej generacji.
- Umożliwia uzyskanie długich długości odczytów i pozyskiwanie danych w czasie rzeczywistym.
- Technologia ta była skutecznie wykorzystywana podczas epidemii wirusa Ebola.
- Jest szczególnie przydatna w odległych lokalizacjach, gdzie tradycyjne metody sekwencjonowania mogą być niewykonalne.
Cel badania
- Zapewnienie szczegółowego protokołu sekwencjonowania mRNA z pełnej krwi.
- Wykazanie wykonalności sekwencjonowania nanoporowego w warunkach ograniczonych pod względem zasobów.
- Podkreślenie zalet stosowania przenośnych urządzeń sekwencjonujących.
Zastosowane metody
- PCR touchdown do amplifikacji cDNA.
- Przygotowanie biblioteki z wykorzystaniem magnesowych kul.
- Kontrola jakości komórek przepływowych przed sekwencjonowaniem.
- Sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym za pomocą urządzenia MinION.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia efektywne sekwencjonowanie mRNA z próbek pełnej krwi.
- Wykazał pomyślne zastosowanie w warunkach terenowych.
- Dostarczył szczegółowych kroków przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.
- Zapewniał wysokiej jakości wyniki sekwencjonowania przy minimalnym wykorzystaniu zasobów.
Wnioski
- Sekwencjonowanie nanoporowe jest opcją przydatną do analizy mRNA w odległych obszarach.
- Przedstawiony protokół można dostosować do różnych zastosowań terenowych.
- Technologia ta może znacznie zwiększyć szybkość reakcji podczas epidemii chorób.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Nanopore sequencing enables rapid, field-deployable mRNA analysis from whole blood, supporting early target validation in outbreak scenarios. Its portability and real-time data generation reduce logistical barriers in resource-limited settings, accelerating pathogen and host response characterization. This capability enhances predictive confidence in preclinical target selection by providing direct transcriptomic insights under realistic sample conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-pathogen interactions by sequencing mRNA targets like Niemann-Pick C1 from animal blood samples.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct RNA sequencing without amplification bias in remote settings.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking gene expression to viral receptor activity in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates long-read, quantitative mRNA data enabling precise transcript detection and isoform resolution.
- Operational Value: Delivers reproducible library preparation workflows compatible with low-resource field deployment.
- Scalability: Allows multiplexed barcoding of multiple samples for parallel processing in outbreak surveillance.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptomic profiles from whole blood, enabling biomarker discovery in preclinical models.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation through standardized RNA extraction and sequencing.
- Risk Mitigation: Supports go/no-go decisions by confirming target expression consistency across species and sample qualities.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling target confirmation prior to assay development and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by validating mRNA expression of therapeutic targets in native blood matrices.
- Screening: Produces standardized, quantifiable RNA libraries suitable for downstream target engagement studies.
- Analytics: Yields length-resolved read distributions and demultiplexed outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects host gene expression to pathogen response, informing preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable sequencing capability applicable across multiple targets and geographic sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct RNA sequencing in physiologically relevant samples.
- Operational Value: Enhances reproducibility via bead-based cleanup and standardized priming protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling decentralized sequencing, reducing reliance on core facilities.
- Portfolio Impact: Accelerates advancement decisions by providing early transcriptomic evidence of target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and nucleic acid handling for accurate RNA extraction and RT-PCR.
- Depends on functional MinION device, flow cells, and compatible reagents for library preparation and sequencing.
- Necessitates cross-team standardization of barcode addition and demultiplexing procedures for multi-sample runs.
- Requires adaptation of input quantity and cycling conditions when applying to diverse species or sample qualities.
- Limited by raw read accuracy, which can be mitigated through sufficient read depth and post-sequencing filtering.
