Name: PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę badania przesiewowego biblioteki sgRNA ukierunkowaną na loci HOX w celu identyfikacji krytycznych granic CTCF. Technika ta pozwala badać rolę elementów niekodujących w regulacji ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują również Nicholasowi Cesariemu za redakcję rękopisu. Prace były wspierane przez granty z National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).

1. CTCF sgRNALibrary Design za pomocą narzędzia online
<ol>
	<li>Zaprojektuj sgRNA ukierunkowane na miejsca wiązania CTCF w ludzkich loci HOX za pomocą narzędzia do projektowania platformy perturbacji genetycznych (GPP) (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).</li>
	<li>Zsyntetyzuj łącznie 1,070 sgRNA składających się z sgRNA ukierunkowanych na 303 losowe geny docelowe, 60 kontroli pozytywnych, 500 kontroli nieukierunkowanych na człowieka i 207 elementów CTCF lub genów docelowych lncRNA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1, Tabela 1). Każdy docelowy element DNA jest atakowany przez 5-10 różnych sgRNA.</li>
</ol>
2. Klonowanie biblioteki sgRNA
<ol>
	<li>Sklonuj zsyntetyzowane oligonukleotydy do wektora szkieletowego lentiwirusa CRISPR (lentiCRISPRv2).
	<ol>
		<li>Trawić wektor LentiCRISPRv2 enzymem restrykcyjnym BsmBI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Poszukaj obecności większego prążka (około 12 873 pz) na żelu po trawieniu BsmBI, a następnie oczyść go za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. 
		nuta: Mały kawałek wypełniacza o pojemności 2 kb jest również obecny na żelu po strawieniu, ale należy to zignorować.</li>
		<li>Zliguj zsyntetyzowane oligonukleotydy i strawiony wektor LentiCRISPR za pomocą 150 ng strawionego DNA LentiCRISPR, 1 μL 10 μM oligonukleotydów, 2 μL 10x buforu ligazy T4, 1 μL ligazy T4, a następnie inkubuj je w temperaturze 16 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć bibliotekę lentiwirusową CRISPR/sgRNA w elektrokompetentne komórki do amplifikacji.
	<ol>
		<li>Przygotuj elektroporator przy napięciu 1,8 kV, 200 Ω i 25 μF. Następnie podgrzej wstępnie pożywkę regeneracyjną SOC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i podgrzej płytki z antybiotykiem LB ampicyliny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozmrażać właściwe komórki na lodzie przez 10 minut.</li>
		<li>Przygotuj na lodzie mikroprobówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml i kuwety do elektroporacji o średnicy 1 mm.</li>
		<li>Wymieszaj 1 μl plazmidowego DNA o sile 10 ng/μl z 25 μl kompetentnych komórek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj, kilkakrotnie ręcznie przesuwając spód probówki.</li>
		<li>Gdy kuweta jest wystarczająco zimna, przenieś do niej mieszaninę DNA/kompetentnych komórek. Postukaj dwukrotnie w blat i wytrzyj wszelkie kropelki wody z zewnętrznej części kuwety bibułą. Następnie umieść kuwetę w module elektroporacyjnym i naciśnij impuls.</li>
		<li>Natychmiast dodać 975 μl wstępnie podgrzanej pożywki SOC o temperaturze 37 °C. Mieszać pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Obracać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozcieńczyć 100 μl komórek w 900 μl pożywki SOC i umieścić 100 μl na płytce agarowej z antybiotykiem LB ampicylina. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA z połączonych kolonii za pomocą kolumny maxi-prep, jak opisano w protokole producenta.
	<ol>
		<li>Zeskrobać wszystkie kolonie z płytki agarowej LB i zaszczepić kulturę starterową składającą się z 2 ml pożywki antybiotykowej LB ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem (~200 x g).</li>
		<li>Rozcieńczyć kulturę starterową w stosunku 1:500 w 100 ml pożywki LB ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin, energicznie wstrząsając (~200 x g).</li>
		<li>Zebrać osad komórek bakteryjnych przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny.</li>
		<li>Zawiesiny osad należy zlizować 10 ml buforu do lizy i energicznie odwrócić 4-6 razy. Inkubować lizat przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zneutralizować lizat za pomocą 10 ml schłodzonego buforu neutralizującego. Wymieszaj, delikatnie odwracając probówki 4-6 razy i inkubuj przez 20 minut na lodzie.</li>
		<li>Wirować w dół przy 13 500 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Natychmiast przenieść supernatant zawierający plazmidowe DNA do nowej probówki.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.3.7 i niezwłocznie przenieść supernatant zawierający plazmidowe DNA do nowej probówki.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę, nakładając 10 ml buforu równoważącego i pozwolić, aby kolumna opróżniła się przez przepływ grawitacyjny.</li>
		<li>Dodaj supernatant do kolumny i pozwól mu dostać się do żywicy przez przepływ grawitacyjny.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 2x 30 ml buforu do mycia.</li>
		<li>Eluować DNA za pomocą 15 ml buforu elucyjnego.</li>
		<li>Wytrącić DNA za pomocą 10,5 ml izopropanolu o temperaturze pokojowej do wymytego DNA. Wymieszać i natychmiast odwirować w temperaturze 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, a następnie delikatnie zdekantować supernatant.</li>
		<li>Przemyć osad DNA 5 ml 70% etanolu, odwirować osad DNA o sile 15 000 x g przez 10 minut i wyrzucić klarowny supernatant.</li>
		<li>Powtórz krok 2.5.14 jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Odwirować osad DNA o sile 15 000 x g przez 10 minut i delikatnie zdekantować supernatant bez naruszania osadu DNA.</li>
		<li>Suszyć osad na powietrzu przez 5-10 minut i rozpuścić DNA w wymaganej objętości buforu (bufor TE, pH 8,0).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generacja biblioteki sgRNA o wysokim mianie
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek: Hodowla HEK293T komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (obj./obj.) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% (obj./obj.) penicyliną-streptomycyną (PS) w kolbach T-25. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Pakiet lentiwirusa: Kotransfekcja komórek HEK293T z 20 μg oczyszczonych wektorów bibliotecznych z kroku 2, 15 μg plazmidu pakietowego (psPAX2) i 10 μg plazmidu otoczki (pMD2.G) przez 48 godzin przed pobraniem wirusów.</li>
	<li>Zbieranie wirusa: Po 48 godzinach zebrać supernatant wirusa i przefiltrować supernatant wirusa przez błonę PVDF o niskiej wiązalności białka 0,45 μm.</li>
	<li>Stężenie wirusa: Zagęścić supernatant lentiwirusa 50-krotnie za pomocą koncentratora i przetestować MOI wirusa w kroku 5.</li>
	<li>Przechowywanie wirusów: Podwielokrotnić skoncentrowane wirusy i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Zoptymalizowane stężenie Puromycyny
<ol>
	<li>Hodowla komórek białaczkowych: Hodowla komórek AML MOLM13 w RPMI 1640 uzupełniona 10% (vol/vol) płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1x antybiotykami penicylina-streptomycyna (PS) w kolbie T-125. Umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	nuta: Komórki są zwykle przepuszczane co 4-5 dni w stosunku podziału 1:4 lub 1:6, nigdy nie pozwalając komórkom osiągnąć więcej niż 70% konfluencji.</li>
	<li>Umieść komórki MOLM13 na 12-dołkowej płytce o gęstości 1,0 x 104 komórki/ml, przy całkowitej objętości 2 ml na dołek (2,0 x 104 komórki).</li>
	<li>Test przebiegu w czasie: Traktuj komórki MOLM13 puromycyną przez 7 dni w rosnących stężeniach (0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1,0 μg/ml i 2,0 μg/ml)
	<ol>
		<li>Ustaw komórki MOLM13 bez leczenia puromycyną w dniu 0 i ustaw 3 studzienki replikowane bez leczenia puromycyną jako kontrolę od dnia 0 do dnia 7.</li>
		<li>Traktuj komórki MOLM13 0,1 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,5 μg/mL, 1,0 μg/ml i 2,0 μg/ml, oddzielnie, przy czym każdy warunek eksperymentalny zawiera 3 dołki replikatów.</li>
		<li>Policz stosunek żywych komórek i sporządź krzywą przeżycia od dnia 0 do dnia 7, zawierającą wszystkie warunki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krzywa przeżycia: Wybarwiaj komórki błękitem trypanowym i licz żywotność codziennie, aby uzyskać krzywe przeżycia dla każdego stężenia puromycyny.</li>
	<li>Optymalizacja minimalnego stężenia puromycyny: Określ minimalne stężenie puromycyny poprzez barwienie błękitem trypanowym, w którym wszystkie komórki MOLM13 są zabijane w ciągu 5-7 dni.</li>
</ol>
5. Miareczkowanie biblioteki lentiwirusowej w komórkach białaczkowych MOLM13
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek AML: Zbierz komórki AML MOLM13 za pomocą pożywki transdukcyjnej (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS i 8,0 μg/ml pożywki powlekającej) o gęstości 1,5 x 106 komórek / ml.</li>
	<li>Umieść komórki MOLM13 w 12-dołkowej płytce z 1,5 x 106 komórek w każdym dołku.</li>
	<li>Rozmrozić lentiwirusa: Wyjąć skoncentrowany lentiwirus z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić go na lodzie.</li>
	<li>Wymieszaj komórki MOLM13 z inną dawką skoncentrowanego lentiwirusa w oddzielnych studzienkach, w tym 0, 1, 2,5, 5, 7,5 i 10 μL (łącznie 6 grup).</li>
	<li>Mieszaniny te należy natychmiast odwirować przy 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 33 °C i przenieść 12-dołkowe płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
	<li>Po 4 godzinach wirować zainfekowane komórki w masie 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić transdukowane komórki za pomocą świeżej pożywki (RPMI 1640, 10% FBS i 1% PS), a następnie przenieść je do kolb T-25 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin bez puromycyny.</li>
	<li>Po 48 godzinach podziel te komórki na 2 kolby (2 grupy): grupę eksperymentalną leczoną 1 μg/ml puromycyny przez 5 dni i grupę kontrolną bez leczenia puromycyną przez 5 dni.</li>
	<li>Przeprowadzaj selekcję puromycyny przez 5 dni z 1 μg/ml puromycyny zgodnie z krokiem 4, aż wszystkie nietransdukowane komórki kontrolne będą martwe. Wymieniaj na nowe nośniki co 2 dni.</li>
	<li>Zmierz zoptymalizowaną wartość MOI dla transdukcji, dzieląc liczbę żywych komórek leczonych puromycyną przez liczbę komórek bez leczenia puromycyną.</li>
</ol>
6. Transdukcja zbiorczej biblioteki CRISPR-Cas9 KO
<ol>
	<li>Transdukcja lentiwirusem: Zainfekuj 1,5 x 106 komórek MOLM13 0,3 MOI lentiwirusa połączonego z sgRNA w pożywce (RPMI 1640, 10% FBS, 1% PS i 8 μg/ml pożywki powlekającej) na płytce 6-dołkowej i użyj komórek bez infekcji lentiwirusem jako kontroli.</li>
	<li>Natychmiast odwirować 6-dołkową płytkę w temperaturze 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 33 °C w celu przeszczepienia komórek i przenieść płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.</li>
	<li>Wiruj zainfekowane komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić transdukowane komórki za pomocą świeżej pożywki (RPMI 1640, 10% FBS i 1% PS), a następnie przenieść je do kolb T-25 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin bez puromycyny.</li>
	<li>Po 48 godzinach traktuj komórki 1 μg/ml puromycyny przez 5 dni. Po 2 dniach wymień na świeże podłoże i utrzymuj optymalną gęstość komórek.</li>
	<li>Wysiewać pojedynczy klon na 96-dołkowych płytkach z metodami ograniczającego rozcieńczania i inkubować te pojedyncze klony w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Hoduj je przez 3-4 tygodnie.</li>
	<li>Po tym, jak pojedyncza komórka wyrośnie w populację, przenieś połowę komórek na płytki 24-dołkowe w celu dalszej hodowli pod kontrolą selekcji puromycyny i zweryfikuj te klony w następnym kroku. Zachowaj resztę komórek.</li>
</ol>
7. Badanie przesiewowe biblioteki CRISPR-Cas9 KO z jednoetapowym RT-qPCR
<ol>
	<li>Określ skuteczność zintegrowanego badania przesiewowego klonów sgRNA, oceniając ekspresję genu markerowego HOXA9 z jednoetapową reakcją łańcuchową polimerazy z odwrotną transkryptazą (jednoetapowa RT-qPCR). 
	UWAGA: HOXA9 ulegają silnej ekspresji w komórkach AML MOLM13 w leukemogenezie22,23.</li>
	<li>Policz zintegrowaną komórkę MOLM13 zintegrowaną z sgRNA i przenieś 1 x 104 komórki na studzienkę na 96-dołkową płytkę PCR.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut, a następnie dokładnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
	<li>Umyć komórki 125 μl buforu PBS i odwirować probówkę o sile 1 000 x g przez 5 minut. Następnie usunąć 120 μl supernatantu za pomocą pipety i zachować około 5 μl PBS w każdym dołku.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 50 μl głównej mieszaniny do lizy komórek zawierającej 48 μl buforu do lizy komórek, 1 μl roztworu proteinazy K (10 mg/ml) i 1 μl roztworu DNazy (1 mg/ml). Następnie pipetuj w górę i w dół 5 razy, aby ponownie zawiesić osad komórkowy.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, następnie 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie w temperaturze 75 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Przechowywać lizat komórkowy w zamrażarce w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przygotowanie jednoetapowej reakcji RT-qPCR: Rozmrozić jednoetapową mieszaninę reakcyjną i inne składniki reakcji do temperatury 4 °C. Następnie krótko obrócić w dół, aby zebrać roztwory na dnie probówek i umieścić na lodzie bez światła. Wymieszaj i delikatnie odwiruj.</li>
	<li>Dodać 1 μl lizatu komórkowego do dołków PCR z mieszaniną reakcyjną RT-qPCR, w tym 1 μl startera do przodu (300 nM) i startera odwrotnego genu markerowego (300 nM), 0,125 μl odwrotnej transkryptazy (10 U/μL) i 5 μl jednoetapowej mieszaniny reakcyjnej (2x).</li>
	<li>Uszczelnij studzienki optycznie przezroczystą folią, delikatnie zwiruj i wymieszaj składniki reakcji.</li>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę do PCR na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję odwrotnej transkrypcji na 10 minut w temperaturze 50 °C, a następnie inaktywować polimerazę i denaturację DNA na 1 minutę w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić RT-PCR z 40 cyklami reakcji PCR: denaturacja przez 15 s w temperaturze 95 °C, wyżarzanie/wydłużanie i odczyt fluorescencji płytki przez 20 s w temperaturze 60 °C, a następnie analiza krzywej topnienia w temperaturze 65-95 °C w krokach co 0,5 °C przy 2-5 s/krok.</li>
	<li>Skonfiguruj grupy z regulacją w górę, w dół i bez zmian zgodnie z poziomami ekspresji genu HOXA9 w porównaniu z kontrolą, oddzielnie. Użyj genu β-aktyny jako kontroli genów domowych.</li>
</ol>
8. Weryfikacja zintegrowanych klonów sgRNA z dodatnim wynikiem poprzez genotypowanie i sekwencję Sangera
<ol>
	<li>Zweryfikuj klony HOXA9 o zmniejszonej ekspresji za pomocą sekwencjonowania Sangera i przeprowadź PCR z 50-100 ng DNA genomu MOLM13, 5 μl buforem reakcyjnym polimerazy (10x), 1 μl starterem do przodu (10 μM) (AATGGACTATCATATGCTTACCATGAAAGTATTTCG) i 1 μl startera odwróconego (10 μM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGCGTGCCTG), 1 μl dNTP (10mM), 1 jednostką polimerazy (5 U / μL). Przeprowadzić reakcję PCR z początkową denaturacją w temperaturze 94 °C przez 30 s, a następnie dalszą denaturacją w temperaturze 94 °C przez 20 s, wyżarzaniem w temperaturze 56 °C przez 20 s, przedłużaniem w temperaturze 68 °C przez 20 s (łącznie 30 cykli), końcowym przedłużeniem w temperaturze 68 °C przez 10 minut, a następnie utrzymywaniem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ekstrahować i oczyszczać produkty PCR (rozmiar 285 pz) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.</li>
	<li>Związać oczyszczone produkty PCR z wektorem T za pomocą 2 μl buforu do ligacji T4 (10x), 50 ng wektora T DNA (50 ng/μL), 25 ng oczyszczonego DNA PCR (285 pz), 1 μl ligazy T4 (3 jednostki/μl) i umieścić mieszaninę ligacyjną w inkubatorze w temperaturze 16 °C na noc.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę ligacyjną do komórki DH5α kompetentnej, hodować na płytce agarowej z antybiotykiem LB ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz pojedyncze klony z płytki LB i zweryfikuj je za pomocą genotypowania i sekwencjonowania Sangera.</li>
</ol>
9. Wykrywanie mutacji indel wywołanej sgRNA za pomocą testu trawienia nukleazy
<ol>
	<li>Wykryj wskaźniki indel indukowane pojedynczym klonem zintegrowanym z sgRNA za pomocą testu nukleazy.</li>
	<li>Oddzielnie przygotuj amplikony PCR z 50-100 ng zmutowanym DNA Indel (test) i DNA typu dzikiego (WT, odniesienie) jako matrycą PCR, 5 μl buforu reakcyjnego polimerazy (10x), 1 μL dNTP (10 mM), 1 jednostką polimerazy (5 U/μL), 1 μl startera do przodu (10 μM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') i 1 μl startera odwrotnego (10 μM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). Reakcję PCR przeprowadzono z początkową denaturacją w temperaturze 98 °C przez 30 s, a następnie denaturacją w temperaturze 98 °C przez 20 s, wyżarzaniem w temperaturze 56 °C przez 20 s, przedłużaniem w temperaturze 72 °C przez 30 s (łącznie 30 cykli) i końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 10 minut i utrzymywaniem w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ustaw grupę mieszanin heterodupleksowych z 200 ng "referencyjnych" (20 ng / μL) i 200 ng "testowych" (20 ng / μL) amplikonów PCR w 0,2 ml probówce PCR, a grupę mieszaniny homodupleksu z tylko 400 ng "referencyjnych" amplikonów PCR jako kontrolę.</li>
	<li>Mieszaninę heterodupleksu i homodupleksu inkubować oddzielnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut w zlewce o pojemności 1 l wypełnionej 800 ml wody, a następnie stopniowo schładzać do temperatury pokojowej do wyżarzania i tworzenia heterodupleksu lub homodupleksów.</li>
	<li>Oddzielnie roztwarzać 400 ng wyżarzonej mieszaniny heterodupleksu i homodupleksu z 1 μl nukleazy do wykrywania mutacji indel (2,5 U/μL) i 2 μl buforu reakcyjnego nukleazy (10x) w temperaturze 42 °C przez 60 min.</li>
	<li>Analizować strawione próbki za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, DNA mieszaniny heterodupleksowej należy pociąć na małe fragmenty (70-250 pz), a DNA homodupleksu (320 pz) nie należy ciąć.</li>
</ol>

<ol><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li>
<li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%3A+master+weaver+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li>
<li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li>
<li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li>
<li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li>
<li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li>
<li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1%2FMLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li>
<li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li>
<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li>
<li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li>
<li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).</li>
<li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Hox%3A+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li>
<li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li>
<li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li>
<li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li>
<li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li>
<li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+HOXA9+in+leukemia%3A+dysregulation%2C+cofactors+and+essential+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li>
<li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR%2FCas9-mediated+mouse+genome+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li>
<li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li>
<li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li>
<li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+%28FLT3%29+and+Nucleophosmin+1+%28NPM1%29+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes%3A+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li>
<li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li>
<li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).</li>
<li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów w związku z tym raportem.

Biblioteki sgRNA związane z genami kodującymi białka zostały zastosowane w funkcjonalnym systemie badań przesiewowych do identyfikacji genów i sieci regulujących określone funkcje komórkowe poprzez wzbogacenie sgRNA 24,25,26,27,28. Kilka bibliotek sgRNA związanych z regionem niekodującym wykazano również w specyficznych dla genów funkcjonalnych badaniach przes...

Ostatnie badania interakcji genomu wykazały, że ludzki genom jądrowy tworzy stabilne topologicznie asocjujące domeny (TAD), które są zachowane w różnych typach komórek i gatunkach. Organizacja genomu w odrębne domeny ułatwia i ogranicza interakcje między elementami regulatorowymi (np. wzmacniaczami i promotorami). Czynnik wiążący CCCTC (CTCF) wiąże się z granicami TAD i odgrywa kluczową rolę w ograniczaniu interakcji elementów DNA, które znajdują się w sąsiednich TADs1. Jednak dane dotyczące wiązania CTCF w całym genomie ujawniły, że chociaż CTCF w większości oddziałuje z tymi samymi miejscami DNA w różnych typach komórek, często działa jako bariera chromatyny w określonym miejscu w jednym typie komórki, ale nie w drugim, co sugeruje, że CTCF działa razem z innymi działaniami w tworzeniu granic chromatyny2. Nie wiadomo natomiast, czy elementy graniczne (miejsca wiązania CTCF) są bezpośrednio związane z biologiczną funkcją CTCF i w jaki sposób te powiązania występują. Dlatego stawiamy hipotezę, że określone miejsca wiązania CTCF w genomie bezpośrednio regulują tworzenie TAD i kontrolują interakcje promotora/wzmacniacza w tych domenach lub między sąsiednimi domenami. Zakończenie projektów sekwencjonowania genomu ludzkiego i mysiego oraz późniejsze analizy epigenetyczne pozwoliły na odkrycie nowych sygnatur molekularnych i genetycznych genomu. Jednak rola specyficznych sygnatur/modyfikacji w regulacji genów i funkcji komórkowych, a także ich mechanizm molekularny, nie została jeszcze w pełni poznana.
Wiele linii dowodowych potwierdza, że TADy, w których pośredniczy CTCF, reprezentują funkcjonalne domeny chromatyny3,4,5. Chociaż CTCF w większości oddziałuje z tymi samymi miejscami DNA w różnych typach komórek, dane sekwencyjne CTCF dotyczące całego genomu ujawniły, że CTCF często działa jako bariera chromatyny w jednym typie komórki, ale nie w drugim2. CTCF odgrywa istotną rolę podczas rozwoju, pośrednicząc w organizacji genomu4,6,7. Naruszenie granic CTCF upośledza interakcje wzmacniacz/promotor i ekspresję genów, prowadząc do zablokowania rozwoju. Sugeruje to, że TAD, w których pośredniczy CTCF, są nie tylko składnikami strukturalnymi, ale także jednostkami regulatorowymi wymaganymi do prawidłowego działania wzmacniacza i transkrypcji genów5,8,9.
Geny HOX odgrywają kluczową rolę podczas rozwoju embrionalnego i są czasowo i przestrzennie ograniczone w swoich wzorcach ekspresji. Locus HOXA tworzy dwa stabilne TAD oddzielające geny przednie i tylne za pomocą elementu granicznego związanego z CTCF zarówno w komórkach hESC, jak i IMR901. Ostatnie doniesienia wykazały, że HoxBlinc, lncRNA związany z locus HoxB, pośredniczy w tworzeniu TAD kierowanych przez CTCF i interakcji wzmacniacz/promotor w locus HOXB. Prowadzi to do aktywacji genu HOXB w przedniej części ESC podczas angażowania i różnicowania ESC10. Ponadto, w określonych loci genów, w tym locus HOXA, zmiana domen TAD za pośrednictwem CTCF zmieniła profile ekspresji genów specyficzne dla linii i była związana z rozwojem stanów chorobowych11,12. Dowody potwierdzają podstawową funkcję CTCF w koordynowaniu transkrypcji genów i określaniu tożsamości komórki poprzez organizowanie genomu w domeny funkcjonalne.
Pomimo swojej roli w rozwoju embrionalnym, podczas hematopoezy, geny HOX regulują funkcję hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HS/PC). Odbywa się to poprzez kontrolowanie równowagi między proliferacją a różnicowaniem10,13,14,15. Ekspresja genów HOX jest ściśle regulowana przez cały okres specyfikacji i różnicowania komórek krwiotwórczych, z najwyższą ekspresją w HS / PC. Ekspresja genu HOX stopniowo spada w okresie dojrzewania, przy czym najniższy poziom występuje w zróżnicowanych komórkach krwiotwórczych16. Rozregulowanie genu HOX jest dominującym mechanizmem transformacji białaczki poprzez rozregulowanie właściwości samoodnawiania i różnicowania HS/PC, co prowadzi do transformacji białaczkowej17,18. Jednak mechanizm ustanawiania i utrzymywania prawidłowych i onkogennych wzorców ekspresji genów HOX, a także związanych z nimi sieci regulacyjnych, pozostaje niejasny.
Przesiewowe badanie biblioteki sgRNA CRISPR-Cas9 było szeroko stosowane do badania genów kodujących białka19, jak również genów niekodujących, takich jak lncRNA20 i miRNA21 u różnych gatunków. Jednak koszt korzystania z biblioteki sgRNA CRISPR-Cas9 do identyfikacji nowych celów genomowych pozostaje wysoki, ponieważ sekwencjonowanie genomu o wysokiej przepustowości jest często stosowane do weryfikacji badań przesiewowych biblioteki sgRNA. Nasz system badań przesiewowych sgRNA koncentruje się na określonych loci genomu i ocenia docelowe sgRNA za pomocą jednoetapowego RT-PCR zgodnie z ekspresją genu markera, takiego jak HOXA9. Ponadto sekwencjonowanie Sangera potwierdziło, że sgRNA zostało zintegrowane z genomem, a mutacje Indel można wykryć w celu zidentyfikowania miejsca docelowego sgRNA. Dzięki specyficznym dla loci genetycznym badaniom przesiewowym CRISPR-Cas9, granica chromatyny CBS7/9 została zidentyfikowana jako krytyczny regulator dla ustanowienia domeny chromatyny onkogennej i utrzymania ektopowych wzorców ekspresji genu HOX w patogenezie AML12. Metoda ta może być szeroko stosowana nie tylko do identyfikacji specyficznej funkcji granicy CTCF w rozwoju embrionalnym, hematopoezie, białaczce, ale także granicy CTCF jako potencjalnych celów terapeutycznych dla przyszłej terapii epigenetycznej.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Stbl3&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>&nbsp; </td><td></td>C737303</tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>DSMZ</td><td>ACC 554</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pGEM&reg;-T Easy Vector Systems&nbsp;</td>Ligaza <td>Promega</td><td>A137A</td><td></td></tr><tr><td>T4&nbsp;</td><td>Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii</td><td>&nbsp; M0202S</td> QIAquick Zestaw do ekstrakcji <td></td></tr><tr><td>żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAuick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SingleShot&trade; SYBR&reg; &nbsp; Zielony zestaw jednoetapowy</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725095</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł Średni&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>&nbsp; </td><td></td>11965084</tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna/L-glutamina&nbsp;</td><td>Technologie życiowe&nbsp;</td><td></td><td></td>10378016</tr><tr><td>Koncentrator Lenti-X&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)&nbsp;</td><td>Genessee Scientific</td><td>&nbsp; 25-507</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TAE&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>Geodeta&reg; Zestawy do wykrywania mutacji</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>706020</td><td></td></tr><tr><td>Biorad Universal Hood II Gel Doc System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8126</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowe suche łaźnie/grzejniki blokowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88870002</td><td></td></tr><tr><td>serii TSX Zamrażarki ultraniskotemperaturowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSX40086V</td><td></td></tr><tr><td>Forma&handel; Steri-Cult&handel; CO2&nbsp; Inkubatory</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3308</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe&trade; KS, Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasy II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51022484</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&trade; Legenda i handel; Seria wirówek XT/XF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004506</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Isotemp&handel; Kąpiele wodne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Lokalizator i handel; Plus Rack and Box Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-762-353</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp&trade; Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems technology</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Sowa i handel; EC300XL2 Kompaktowy zasilacz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7217581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Sowa i handel; EasyCast&handel; B1 Mini żelowe systemy elektroforetyczne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-528-178</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Rotator rurowy i rożna</td><td>VWR International</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Mini wytrząsarka inkubacyjna</td> Waga analityczna <td>VWR International</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>MS104TS/00</td><td></td> Spektrofotometr <td>METTLER TOLEDO</td> 30133522 <td></td></tr><tr><td>DS-11 FX i DS-11 FX+</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 FX</td><td></td></tr></tbody></table>

przekĄtna terenu badania przesiewowe biblioteki crispr/sgrna skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice ctcf

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

Stabilne topologicznie asocjujące domeny (TAD), w których pośredniczy czynnik wiążący CCCTC (CTCF), odgrywają kluczową rolę w ograniczaniu oddziaływań elementów DNA, które znajdują się w sąsiednich TAD. CTCF odgrywa ważną rolę w regulacji przestrzennej i czasowej ekspresji genów HOX, które kontrolują rozwój embrionalny, wzorce ciała, hematopoezę i leukemogenezę. Jednak pozostaje w dużej mierze nieznane, czy i w jaki sposób granice CTCF związane z loci HOX regulują organizację chromatyny i ekspresję genów HOX. W obecnym protokole wygenerowano specyficzną bibliotekę puli sgRNA ukierunkowaną na wszystkie miejsca wiązania CTCF w loci HOXA/B/C/D w celu zbadania wpływu zakłócenia granic chromatyny związanych z CTCF na tworzenie TAD i ekspresję genu HOX. Dzięki genetycznym badaniom przesiewowym CRISPR-Cas9 miejsce wiązania CTCF zlokalizowane między genami HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) zostało zidentyfikowane jako krytyczny regulator domeny chromatyny onkogennej, a także ważne dla utrzymania ektopowych wzorców ekspresji genu HOX w ostrej białaczce szpikowej (AML) reorganizowanej przez MLL. W związku z tym to podejście do badań przesiewowych biblioteki sgRNA dostarcza nowych informacji na temat organizacji genomu za pośrednictwem CTCF w określonych loci genów, a także stanowi podstawę do funkcjonalnej charakterystyki adnotowanych genetycznych elementów regulatorowych, zarówno kodujących, jak i niekodujących, podczas normalnych procesów biologicznych w erze projektu po ludzkim genomie.

Technologia CRISPR-Cas9 jest potężnym narzędziem badawczym w genomice funkcjonalnej. Szybko zastępuje ona konwencjonalne techniki edycji genów i wykazuje wysoką użyteczność zarówno w zastosowaniach obejmujących cały genom, jak i w badaniach skoncentrowanych na poszczególnych genach. Przedstawiona tutaj pierwsza indywidualnie klonowana, specyficzna dla loci biblioteka sgRNA w układzie CRISPR-Cas9 zawiera 1070 sgRNA, w tym sgRNA celujące w 303 losowe geny, 60 kontroli pozytywnych, 500 kontr...

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Nasze zbiorcze sgRNA, zwane przesiewowym badaniem biblioteki, jest potężnym podejściem genetycznym do identyfikacji i oceny biologicznej funkcji elementów niekodujących w całym genomie. Technika ta pozwala nam zbadać wpływ zakłócenia powiązanych miejsc wiązania, granic chromatycznych lub innych elementów regulatorowych na ekspresję docelowych genów. Nasze podejście może być wykorzystane do identyfikacji roli CTCF, długich niekodujących RNA i wzmacniaczy, w regulacji genów HOX we wczesnym rozwoju embrionalnym, a także niektórych białaczek z nieprawidłową sygnaturą genu HOX.Rozpocznij tę procedurę od zaprojektowania sgRNA ukierunkowanego na miejsca wiązania CTCF. Klonowanie biblioteki sgRNA w preparacji komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zapakować lentiwirusa, kotransfekcyjne limfocyty T HEK293 z 20 mikrogramami oczyszczonych wektorów bibliotecznych, 15 mikrogramami upakowanego plazmidu i 10 mikrogramami plazmidu otoczkowego przez 48 godzin przed pobraniem wirusów.Po 48 godzinach zebrać supernatant wirusa i przefiltrować go przez błonę PVDF o grubości 0,45 mikrona o niskiej wartości wiązania białek. Następnie należy 50-krotnie zagęścić supernatant lentiwirusowy za pomocą koncentratora. Podmień skoncentrowane wirusy i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Pracuj w oddzielnych studzienkach na 12-dołkowej płytce, aby wymieszać komórki MOLM13 z różnymi dawkami skoncentrowanego lentiwirusa dla sześciu całkowitych grup. Natychmiast odwirować te mieszaniny w temperaturze 1000 razy g przez dwie godziny w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Przenieś 12-dołkowe płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na cztery godziny.Delikatnie odessać supernatant bez naruszania palety komórek i ponownie zawiesić transdukowane komórki za pomocą świeżo uzupełnionego podłoża RPMI 1640. Następnie przenieś ponownie zawieszone komórki do kolb T25 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin bez puromycyny. Po 48 godzinach podzielili te komórki na dwie kolby, grupa eksperymentalna leczona jednym mikrolitrem na mililitr puromycyny przez pięć dni i grupa kontrolna bez leczenia puromycyną przez pięć dni.Zmierz zoptymalizowaną wartość MOI dla transdukcji, dzieląc liczbę żywych komórek leczonych puromycyną przez liczbę komórek bez leczenia puromycyną. Aby transdukować komórki za pomocą połączonej biblioteki, zainfekuj 1,5 miliona komórek MOLM13 na 6-dołkowej płytce z 0,3 MOI lentiwirusa sgRNA w pożywce. Używaj komórek bez infekcji lentiwirusem jako kontroli.Natychmiast odwirować sześciodołkową płytkę o masie 1000 razy g przez dwie godziny w temperaturze 33 stopni Celsjusza, aby przeinfekować komórki. Następnie przenieś płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na cztery godziny. Delikatnie odessać supernatant bez naruszania palety komórek i ponownie zawiesić transdukowane komórki świeżą pożywką.Następnie przenieś komórki do kolb T25 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin bez puromycyny. Po 48 godzinach podawaj komórkom jeden mikrogram na mililitr puromycyny przez pięć dni. Po dwóch dniach wymień na świeże podłoże i utrzymuj optymalną gęstość komórek.Zasiać pojedynczy klon w 96-dołkowych płytkach z metodami ograniczającego rozcieńczania. Inkubuj te pojedyncze klony w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Hoduj je przez 3-4 tygodnie.Policz zintegrowane komórki MOLM13 z sgRNA z barwieniem 0,4% roztworem błękitu trypanowego, a następnie przenieś 10 000 żywych komórek na studzienkę na 96-dołkową płytkę PCR. Odwirować płytkę w temperaturze 1000 razy g przez pięć minut, a następnie dokładnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Unikaj naruszania palety komórek.Po umyciu komórek zgodnie z opisem w tekście dodaj 50 mikrolitrów głównej mieszanki do lizy komórek do każdej studzienki. Pipetuj w górę i w dół pięć razy, aby ponownie zawiesić paletę komórek. Inkubuj mieszankę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie przenieś mieszaninę do 37 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie do 75 stopni Celsjusza na dodatkowe pięć minut. Teraz dodaj jeden mikrolitr lizatu komórkowego do studzienek PCR zawierających mieszaninę reakcyjną RT qPCR. Ta mieszanina zawiera geny markerowe starter do przodu i do tyłu, odwrotną transkryptazę i jednoetapową mieszankę reakcyjną.Uruchom reakcję odwrotnej transkrypcji na 10 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie aktywację polimeryzacji i denaturację DNA na jedną minutę w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Wykonaj RT PCR z 40 cyklami reakcji PCR, jak opisano w protokole tekstowym. Zweryfikuj klony HOXA9 o obniżonej ekspresji za pomocą sekwencjonowania Sangera i wykonaj PCR z DNA genomu MOLM13, jak opisano w protokole tekstowym.Ekstrahuj i oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Zlikulować oczyszczone produkty PCR do wektora T za pomocą buforu ligacyjnego T4, DNA wektora T, DNA PCR i ligazy T4. Umieść mieszankę do podwiązywania w inkubatorze w temperaturze 16 stopni Celsjusza na noc.Przenieść mieszaninę ligacyjną do komórek DH5 alfa kompetentnych i umieścić na płytce agarowej z antybiotykiem LB ampicyliny. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz pojedyncze klony z płytki LB i zweryfikuj je za pomocą genotypowania i sekwencjonowania Sangera.Ustaw grupę mieszanin heterodupleksowych z 200 nanogramami odniesienia i 200 nanogramami amplikonów testowych PCR w 0,2 mililitrowej probówce PCR. Uwzględnij grupę mieszanin homodupleksowych z zaledwie 400 nanogramami referencyjnych amplikonów PCR jako kontrolę. Oddzielnie inkubować mieszaninę heteroduplex i homoduplex w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut w jednolitrowej zlewce wypełnionej 800 mililitrami wody.Następnie stopniowo schładzaj mieszaniny do temperatury pokojowej do wyżarzania i uformuj heteroduplex lub homoduplex. Teraz oddzielnie trawić 400 nanogramów wyżarzonej mieszaniny heterodupleksu i homodupleksu z jednym mikrolitrem nukleazy wykrywającej mutacje indel i dwoma mikrolitrami buforu reakcyjnego nukleazy w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut. Przetrawione próbki przeanalizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.DNA mieszaniny heteroduplex należy pociąć na małe fragmenty, a DNA homoduplex nie powinno być cięte. sgRNA ukierunkowane na klony MOLM13 dodatnie potwierdzono metodą RT qPCR, w oparciu o poziomy ekspresji genów HOXA9 z porównaniem z komórkami kontrolnymi. Spośród 528 przebadanych klonów, które przeżyły, 10 klonów wykazało ponad 50% redukcję poziomu HOXA9.sgRNA zintegrowane z klonami o zmniejszonej redukcji HOXA9, niezmienionej HOXA9 i zwiększonej HOXA9 zostały dodatkowo potwierdzone przez amplifikację PCR sgRNA i identyfikację za pomocą sekwencji Sangera. Sześć z dziesięciu klonów wykazujących obniżony poziom HOXA9 zawierało sgRNA ukierunkowane na miejsce CBS79, jak określono za pomocą sekwencjonowania Sangera. Mutacje indel zintegrowanych klonów sgRNA dodatnich określono za pomocą genotypowania opartego na PCR i trawienia nukleazy.Heterozygotyczną delecję miejsca CTCF zlokalizowanego między genami HOXA7 i HOXA9 zidentyfikowano za pomocą genotypowania opartego na PCR. Klony 5, 6, 28 i 121 o zmniejszonej zawartości HOXA9 wykazywały delecję w lokalizacji granicznej CBS79. Podobne wyniki zaobserwowano dla mutacji indel w miejscu CBS79, które analizowano za pomocą testu trawienia nukleazy.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wykonać równe ilości heterodupleksów i homodupleksów w celu wykrycia mutacji indel indelowanych przez sgRNA za pomocą testu trawienia nukleazy. Nasze podejście umożliwia wykorzystanie wybranego markera do przeprowadzenia sekwencjonowania nowej generacji genu docelowego w celu odkrycia wpływu genu na białaczkę. Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście zapobiega błędom RPC w zakresie funkcjonalnej poprawności i redukcji zauważonych nieregularnych elementów genetycznych podczas normalnego procesu biologicznego oraz błędu leukemogenezy w projekcie genomu pośmiertnego.

hox-loci-focused-crisprsgrna-library-screening-identifying-critical

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje metodę przesiewową w celu identyfikacji transgenicznych muszek Drosophila, których genom został zmodyfikowany za pomocą CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 to potężne narzędzie do edycji genomu, które zrewolucjonizowało sposób, w jaki naukowcy mogą manipulować genomem organizmu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak zidentyfikować mutanty generowane przez CRISPR, w których insercja sekwencji transaktywacyjnej zastępuje pierwszy ekson genu bezgałęziowego (bnl), tworząc w ten sposób linię...

Badania przesiewowe pod kątem modyfikacji genomu: metoda identyfikacji mutantów generowanych przez CRISPR u Drosophila

Eksperymentalne potwierdzenie aktywności wzmacniacza najlepiej podejść poprzez analizę utraty funkcji. Przedstawiono tutaj skuteczny protokół, który wykorzystuje delecję za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do badania specyficznej dla alleli regulacji transkrypcji genów w komórkach F1 ES, które zawierają genom hybrydowy (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generowanie delecji monoallelicznych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w celu zbadania funkcji wzmacniacza w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodologię badań przesiewowych in vivo CRISPR/Cas9 za pomocą ultrasonograficznych iniekcji embrionalnych lentiwirusów in utero w celu jednoczesnej oceny funkcji kilku genów w skórze i jamie ustnej myszy immunokompetentnych.

Badania przesiewowe in vivo CRISPR/Cas9 w celu jednoczesnej oceny funkcji genów w skórze myszy i jamie ustnej myszy

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Opracowaliśmy zoptymalizowany protokół przesiewowy CRISPR-Cas9 dla pierwotnych komórek CAR T. Poprzez redukcję przenoszenia gDNA poprzez trawienie enzymatyczne i pulldown kasety sgRNA, podejście to minimalizuje artefakty PCR, zapewniając dokładne wykrywanie sgRNA i solidną identyfikację funkcjonalnych celów genowych.

Ulepszanie ekranów CRISPR-Cas9 w komórkach CAR T: udoskonalona metoda przygotowania biblioteki

Poznaj metodę badania przesiewowego biblioteki sgRNA ukierunkowaną na loci HOX w celu identyfikacji krytycznych granic CTCF. Technika ta pozwala badać rolę elementów niekodujących w regulacji ekspresji genów.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Przeglądaj więcej filmów