PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Nasze zbiorcze sgRNA, zwane przesiewowym badaniem biblioteki, jest potężnym podejściem genetycznym do identyfikacji i oceny biologicznej funkcji elementów niekodujących w całym genomie. Technika ta pozwala nam zbadać wpływ zakłócenia powiązanych miejsc wiązania, granic chromatycznych lub innych elementów regulatorowych na ekspresję docelowych genów. Nasze podejście może być wykorzystane do identyfikacji roli CTCF, długich niekodujących RNA i wzmacniaczy, w regulacji genów HOX we wczesnym rozwoju embrionalnym, a także niektórych białaczek z nieprawidłową sygnaturą genu HOX.

Rozpocznij tę procedurę od zaprojektowania sgRNA ukierunkowanego na miejsca wiązania CTCF. Klonowanie biblioteki sgRNA w preparacji komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zapakować lentiwirusa, kotransfekcyjne limfocyty T HEK293 z 20 mikrogramami oczyszczonych wektorów bibliotecznych, 15 mikrogramami upakowanego plazmidu i 10 mikrogramami plazmidu otoczkowego przez 48 godzin przed pobraniem wirusów.

Po 48 godzinach zebrać supernatant wirusa i przefiltrować go przez błonę PVDF o grubości 0,45 mikrona o niskiej wartości wiązania białek. Następnie należy 50-krotnie zagęścić supernatant lentiwirusowy za pomocą koncentratora. Podmień skoncentrowane wirusy i przechowuj je w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Pracuj w oddzielnych studzienkach na 12-dołkowej płytce, aby wymieszać komórki MOLM13 z różnymi dawkami skoncentrowanego lentiwirusa dla sześciu całkowitych grup. Natychmiast odwirować te mieszaniny w temperaturze 1000 razy g przez dwie godziny w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Przenieś 12-dołkowe płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na cztery godziny.

Delikatnie odessać supernatant bez naruszania palety komórek i ponownie zawiesić transdukowane komórki za pomocą świeżo uzupełnionego podłoża RPMI 1640. Następnie przenieś ponownie zawieszone komórki do kolb T25 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin bez puromycyny. Po 48 godzinach podzielili te komórki na dwie kolby, grupa eksperymentalna leczona jednym mikrolitrem na mililitr puromycyny przez pięć dni i grupa kontrolna bez leczenia puromycyną przez pięć dni.

Zmierz zoptymalizowaną wartość MOI dla transdukcji, dzieląc liczbę żywych komórek leczonych puromycyną przez liczbę komórek bez leczenia puromycyną. Aby transdukować komórki za pomocą połączonej biblioteki, zainfekuj 1,5 miliona komórek MOLM13 na 6-dołkowej płytce z 0,3 MOI lentiwirusa sgRNA w pożywce. Używaj komórek bez infekcji lentiwirusem jako kontroli.

Natychmiast odwirować sześciodołkową płytkę o masie 1000 razy g przez dwie godziny w temperaturze 33 stopni Celsjusza, aby przeinfekować komórki. Następnie przenieś płytki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla na cztery godziny. Delikatnie odessać supernatant bez naruszania palety komórek i ponownie zawiesić transdukowane komórki świeżą pożywką.

Następnie przenieś komórki do kolb T25 i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin bez puromycyny. Po 48 godzinach podawaj komórkom jeden mikrogram na mililitr puromycyny przez pięć dni. Po dwóch dniach wymień na świeże podłoże i utrzymuj optymalną gęstość komórek.

Zasiać pojedynczy klon w 96-dołkowych płytkach z metodami ograniczającego rozcieńczania. Inkubuj te pojedyncze klony w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Hoduj je przez 3-4 tygodnie.

Policz zintegrowane komórki MOLM13 z sgRNA z barwieniem 0,4% roztworem błękitu trypanowego, a następnie przenieś 10 000 żywych komórek na studzienkę na 96-dołkową płytkę PCR. Odwirować płytkę w temperaturze 1000 razy g przez pięć minut, a następnie dokładnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Unikaj naruszania palety komórek.

Po umyciu komórek zgodnie z opisem w tekście dodaj 50 mikrolitrów głównej mieszanki do lizy komórek do każdej studzienki. Pipetuj w górę i w dół pięć razy, aby ponownie zawiesić paletę komórek. Inkubuj mieszankę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś mieszaninę do 37 stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie do 75 stopni Celsjusza na dodatkowe pięć minut. Teraz dodaj jeden mikrolitr lizatu komórkowego do studzienek PCR zawierających mieszaninę reakcyjną RT qPCR. Ta mieszanina zawiera geny markerowe starter do przodu i do tyłu, odwrotną transkryptazę i jednoetapową mieszankę reakcyjną.

Uruchom reakcję odwrotnej transkrypcji na 10 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie aktywację polimeryzacji i denaturację DNA na jedną minutę w temperaturze 95 stopni Celsjusza. Wykonaj RT PCR z 40 cyklami reakcji PCR, jak opisano w protokole tekstowym. Zweryfikuj klony HOXA9 o obniżonej ekspresji za pomocą sekwencjonowania Sangera i wykonaj PCR z DNA genomu MOLM13, jak opisano w protokole tekstowym.

Ekstrahuj i oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Zlikulować oczyszczone produkty PCR do wektora T za pomocą buforu ligacyjnego T4, DNA wektora T, DNA PCR i ligazy T4. Umieść mieszankę do podwiązywania w inkubatorze w temperaturze 16 stopni Celsjusza na noc.

Przenieść mieszaninę ligacyjną do komórek DH5 alfa kompetentnych i umieścić na płytce agarowej z antybiotykiem LB ampicyliny. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wybierz pojedyncze klony z płytki LB i zweryfikuj je za pomocą genotypowania i sekwencjonowania Sangera.

Ustaw grupę mieszanin heterodupleksowych z 200 nanogramami odniesienia i 200 nanogramami amplikonów testowych PCR w 0,2 mililitrowej probówce PCR. Uwzględnij grupę mieszanin homodupleksowych z zaledwie 400 nanogramami referencyjnych amplikonów PCR jako kontrolę. Oddzielnie inkubować mieszaninę heteroduplex i homoduplex w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut w jednolitrowej zlewce wypełnionej 800 mililitrami wody.

Następnie stopniowo schładzaj mieszaniny do temperatury pokojowej do wyżarzania i uformuj heteroduplex lub homoduplex. Teraz oddzielnie trawić 400 nanogramów wyżarzonej mieszaniny heterodupleksu i homodupleksu z jednym mikrolitrem nukleazy wykrywającej mutacje indel i dwoma mikrolitrami buforu reakcyjnego nukleazy w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut. Przetrawione próbki przeanalizować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

DNA mieszaniny heteroduplex należy pociąć na małe fragmenty, a DNA homoduplex nie powinno być cięte. sgRNA ukierunkowane na klony MOLM13 dodatnie potwierdzono metodą RT qPCR, w oparciu o poziomy ekspresji genów HOXA9 z porównaniem z komórkami kontrolnymi. Spośród 528 przebadanych klonów, które przeżyły, 10 klonów wykazało ponad 50% redukcję poziomu HOXA9.

sgRNA zintegrowane z klonami o zmniejszonej redukcji HOXA9, niezmienionej HOXA9 i zwiększonej HOXA9 zostały dodatkowo potwierdzone przez amplifikację PCR sgRNA i identyfikację za pomocą sekwencji Sangera. Sześć z dziesięciu klonów wykazujących obniżony poziom HOXA9 zawierało sgRNA ukierunkowane na miejsce CBS79, jak określono za pomocą sekwencjonowania Sangera. Mutacje indel zintegrowanych klonów sgRNA dodatnich określono za pomocą genotypowania opartego na PCR i trawienia nukleazy.

Heterozygotyczną delecję miejsca CTCF zlokalizowanego między genami HOXA7 i HOXA9 zidentyfikowano za pomocą genotypowania opartego na PCR. Klony 5, 6, 28 i 121 o zmniejszonej zawartości HOXA9 wykazywały delecję w lokalizacji granicznej CBS79. Podobne wyniki zaobserwowano dla mutacji indel w miejscu CBS79, które analizowano za pomocą testu trawienia nukleazy.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wykonać równe ilości heterodupleksów i homodupleksów w celu wykrycia mutacji indel indelowanych przez sgRNA za pomocą testu trawienia nukleazy. Nasze podejście umożliwia wykorzystanie wybranego markera do przeprowadzenia sekwencjonowania nowej generacji genu docelowego w celu odkrycia wpływu genu na białaczkę. Ogólnie rzecz biorąc, nasze podejście zapobiega błędom RPC w zakresie funkcjonalnej poprawności i redukcji zauważonych nieregularnych elementów genetycznych podczas normalnego procesu biologicznego oraz błędu leukemogenezy w projekcie genomu pośmiertnego.