Name: Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego pomiaru zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe. Technika ta umożliwia ilościowe określenie zajętości celu w próbkach komórkowych i tkankowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche oraz częściowo wspierane przez program współpracy CIIP-20152001 i RETOS RTC-2015-3332-1.

<ol><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li>
<li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1%3A+biologic+roles+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-1001%2C+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor%2C+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li>
<li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li>
<li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-Specific+Histone+Demethylase%2C+LSD1%2C+%28KDM1A%29+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601(2015).</li>
<li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22HemaSphere%22%5BJournal%5D)">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54(2018).</li>
<li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li>
<li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RN-1%2C+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor%2C+increases+%CE%B3-globin+expression%2C+F+reticulocytes%2C+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li>
<li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li>
<li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+LSD1%2FMAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905(2015).</li>
<li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li>
<li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li>
<li>Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , WO2017158136 (2016).</li>
<li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).</li>
<li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li>
<li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li>
<li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+%28LSD1%29+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000(2017).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-2001%3A+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192(2017).</li>
</ol>

Autorka Tamara Maes jest dyrektorem wykonawczym i udziałowcem, a autorzy Cristina Mascaró i Raquel Ruiz Rodriguez są pracownikami Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. opracowuje inhibitory KDM1A i posiada patenty obejmujące związki i metody stosowane w tym artykule.

Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu bezpośredniego pomiaru zaangażowania celu KDM1A przy użyciu nowatorskiego testu ELISA opartego na chemoprobe KDM1A. Metoda została zwalidowana na hodowanych ludzkich liniach komórkowych i próbkach ex vivo od ludzi, szczurów, myszy i pawianów (w tym PBMC, płuc, mózgu, skóry, guzów), ale może być łatwo stosowana do innych gatunków, u których zachowane są docelowe epitopy przeciwciała KDM1A i centrum katalityczne. Ponieważ OG-881 jest chemosondą opartą na aktywności, jak...

Demetylaza 1 specyficzna dla lizyny (KDM1A)1 jest demetylazą zaangażowaną w kontrolę transkrypcji genów. Białko to stało się potencjalnym celem farmakologicznym2 w onkologii; w tym w ostrej białaczce szpikowej3 (AML), zespole mielodysplastycznym (MDS)4, mielofibrozie (MF)5,6, drobnokomórkowym raku płuc (SCLC)7; w anemii sierpowatej (SCD)8,9, a także w chorobach ośrodkowego układu nerwowego, w tym w chorobie Alzheimera (AD), stwardnieniu rozsianym (MS) oraz w zaburzeniach związanych z agresją10.
Większość związków hamujących KDM1A znajdujących się w fazie rozwoju klinicznego to pochodne cyklopropylaminy, które hamują białko poprzez wiązanie kowalencyjne z jego kofaktorem flawinoadeninonukleotydowym (FAD)11. Hamowanie KDM1A indukuje zmiany w ekspresji genów, jednak zmiany te różnią się znacząco w zależności od tkanki, typu komórek lub przypadku choroby. Inhibicja KDM1A zmienia również modyfikacje histonów12, lecz zmiany te występują zazwyczaj lokalnie w konkretnym miejscu w genomie i są ponownie wysoce specyficzne dla danej tkanki i komórki.
Protokół został opracowany w celu bezpośredniego pomiaru stopnia związania (target engagement) KDM1A w próbkach biologicznych i został zoptymalizowany do stosowania z inhibitorami pochodzącymi od cyklopropylaminy. Test opiera się na technologii ELISA i analizuje równolegle całkowitą oraz wolną (tj. niezwiązaną przez inhibitor) ilość KDM1A w natywnym ekstrakcie białkowym z próbki biologicznej w badaniu w fazie stałej. W pierwszym kroku próbkę biologiczną lizuje się w obecności biotynylowanej selektywnej chemosondy KDM1A OG-88113,14, pochodnej selektywnego inhibitora KDM1A ORY-1001 (iadademstat), silnego inhibitora KDM1A znajdującego się w fazie rozwoju klinicznego do leczenia chorób onkologicznych. Chemosonda posiada wartość IC50 dla KDM1A wynoszącą 120 nM i zawiera motyw wiążący FAD połączony z biotynylowanym ogonem z glikolu polietylenowego (PEG). Chemosonda wiąże się wyłącznie z wolnym KDM1A, a nie z KDM1A związanym z inhibitorem w próbce. Po związaniu chemosondy kompleksy zawierające KDM1A w próbce są wychwytywane na płytkach mikrotitracyjnych z powierzchnią pokrytą streptawidyną w celu oznaczenia wolnego KDM1A lub na płytkach pokrytych monoklonalnym przeciwciałem wychwytującym anty-KDM1A w celu oznaczenia całkowitego KDM1A. Po przemyciu obie płytki inkubuje się z przeciwciałem detekcyjnym anty-KDM1A, ponownie przemywa i inkubuje z wtórnym przeciwciałem osiołkowym anty-króliczym IgG sprzężonym z HRP w celu detekcji przy użyciu substratu luminescencyjnego i kwantyfikacji poprzez pomiar względnych jednostek światła (RLU) w luminometrze (Rycina 1).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg" /> 
Rysunek 1. Schemat testu immunoabsorpcyjnego ELISA z użyciem enzymatycznej chemosondy w celu oceny zaangażowania celu KDM1A: A) Oznaczanie całkowitej ilości KDM1A przy użyciu kanapkowego testu ELISA oraz B) Oznaczanie wolnej ilości KDM1A przy użyciu testu ELISA z chemosondą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Na obu płytkach ELISA umieszcza się krzywą wzorcową w celu weryfikacji liniowości każdego testu. Określenie stopnia zaangażowania celu KDM1A w każdej próbce jest następnie obliczane jako wartość względna w stosunku do próbki przed podaniem dawki lub próbki traktowanej nośnikiem.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>10 x tabletki inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td></td></tr><tr><td>96 blok do przechowywania studni głębinowych</td><td>VWR#</td><td>734-1679</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki ELISA</td><td>Nunc</td><td>#436110</td><td></td></tr><tr><td>Klej Film</td><td>Perkin Elmer</td><td>#6050173</td><td></td></tr><tr><td>Klej folia przezroczysta</td><td>VWR</td><td>#60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowana sonda KDM1A OG-881</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td> <td># 3117057001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23208)</td><td></td></tr><tr><td>Test białka Bradford</td><td>BioRad</td><td>#500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy komórek 10X</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do płytek 96-dołkowych</td><td>Hettich</td><td>Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Kolba</td><td>Thermo Scientific</td><td>#156499</td><td></td></tr><tr><td>Pełnowymiarowy, enzymatycznie aktywny ludzki rekombinowany motyw LSD1 / KDM1A</td><td></td><td>#31426</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5 Project</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Luminol-Enhacer i roztwór nadtlenku (podłoże chemiluminescencyjne)</td><td>Thermo Scientific</td><td>#37074</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Infinite 200-Tecan</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne wychwytujące Anti-KDM1A (epitop N-końcowy)</td><td>Abcam</td><td>#ab53269</td><td></td></tr><tr><td>Igła głowa głowa,</td>, <td>BD</td><td>#303129</td><td></td></tr><tr><td>ORY-1001 (iadademstat)</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td>Probówki separacyjne NA</td><td></td></tr><tr><td>PBMC 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#163288</td><td></td></tr><tr><td>Probówki separacyjne PBMC 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227288</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do płytek</td><td>Heidolph Instruments</td><td>Rotamax 120</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma</td><td>#P7949</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne do wykrywania królika Anty-KDM1A (epitop C-końcowy)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>#672184BF-100</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Osioł sprzężony z peroksydazą Anty-królicze IgG Thermo</td><td>Scientific</td><td>#31458</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr kuweta 1.5</td><td>Deltalab</td><td>#302100</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr do kuwety</td><td>GE Healthcare</td><td>GeneQuant 1300</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Promega</td><td>#Z704A</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>#303172</td><td></td></tr><tr><td>Typ 1 ultraczysta woda</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>VWR</td><td>USC200T</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośredni pomiar zaangażowania celu kdm1a za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

Ocena docelowego zaangażowania, zdefiniowana jako interakcja leku z białkiem, do którego został zaprojektowany, jest podstawowym wymogiem dla interpretacji biologicznej aktywności dowolnego związku w rozwoju leku lub w podstawowych projektach badawczych. W epigenetyce zaangażowanie celu jest najczęściej oceniane na podstawie analizy markerów zastępczych, a nie pomiaru związku związku z celem. Dalsze odczyty biologiczne, które zostały przeanalizowane, obejmują modulację znacznika histonowego lub zmiany ekspresji genów. KDM1A to demetylaza lizynowa, która usuwa grupy metylowe z mono- i dimetylowanego H3K4, modyfikacja związana z wyciszeniem ekspresji genów. Modulacja markerów zastępczych zależy od typu komórki i funkcji składu genetycznego badanych komórek, co może znacznie utrudnić interpretację i porównanie różnych przypadków. Aby obejść te problemy, przedstawiono wszechstronny protokół oceny wpływu dawki i dynamiki bezpośredniego zaangażowania celu KDM1A. Opisany test wykorzystuje chemosondę KDM1A do wychwytywania i ilościowego oznaczania niehamowanego enzymu, może być szeroko stosowany do próbek komórek lub tkanek bez konieczności modyfikacji genetycznej, ma doskonałe okno wykrywania i może być stosowany zarówno do badań podstawowych, jak i analizy próbek klinicznych.

Liniowość oznaczania całkowitego i wolnego KDM1A.
Serię standardową przygotowano zgodnie z opisem w kroku 5.3.2., wykorzystując od 0 do 2500 pg pełnowymiarowego ludzkiego rekombinowanego enzymu KDM1A. Wartości RLU dla całkowitego i wolnego rKDM1A oceniono w celu weryfikacji liniowości (Rysunek 2A oraz 2B). Dane przedstawiono jako średnią z 3 eksperymentów z 3 powtór...

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru docelowego zaangażowania KDM1A w próbkach ludzkich lub zwierzęcych komórek, tkanek lub krwi leczonych inhibitorami KDM1A. Protokół wykorzystuje znakowanie chemoprobem wolnego enzymu KDM1A i bezpośrednią kwantyfikację docelowego zajęcia za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe i może być stosowany w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

Ocena zaangażowania docelowego, czyli interakcji leku z białkiem, dla którego został zaprojektowany, jest podstawowym wymogiem interpretacji aktywności biologicznej dowolnego związku podczas opracowywania leku lub w podstawowych projektach badawczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośredni pomiar wpływu dawki i dynamiki zaangażowania celu KDM1A, a nie pomiary dalszych efektów, takich jak znaczniki histonów i ekspresja. Technika ta może być stosowana w badaniach podstawowych, a także w badaniach klinicznych, w onkologicznych chorobach OUN lub innych chorobach będących przedmiotem leczenia inhibitorem KDM1A w celu badania farmakodynamiki.Technika ta opiera się na chemoprobe opracowanym do badania ORY-1001, iadademstat, ale może być naprawdę stosowana do innych inhibitorów KDM1A, a strategia może być stosowana do innych celów. Procedura zostanie zademonstrowana przez Raquel Ruiz, kierownika operacyjnego platformy wykrywania PK/PD z mojego laboratorium. Podczas leczenia komórkowego ORY-1001 związek ten wiąże się z białkiem KDM1A obecnym w jądrze.Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij z lodówki 10-mikrolitrową jednorazową porcję 20-milimolowego roztworu podstawowego sondy biotynylowej OG-881 i pozwól mu się ogrzać w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Za pomocą mikropipety z końcówkami filtrującymi seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy, aby przygotować dwumikromolowy roztwór roboczy. Następnie rozpuść jedną tabletkę inhibitora proteazy w jednym mililitrze PBS w probówce do mikrowirówki.Na każdy mililitr pożądanej objętości 1x buforu do lizy komórek z chemosondą wymieszaj 100 mikrolitrów uzyskanego komercyjnego buforu do lizy komórek 10x, 150 mikrolitrów 10x inhibitora proteazy, 12,5 mikrolitrów dwóch mikromolowych roztworu roboczego OG-881 i 737,5 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody typu 1. Komórki są lizowane w 1x buforze do lizy w obecności chemosondy, która wiąże się z dowolnym wolnym białkiem KDM1A. Aby przygotować z chusteczek, użyj moździerza i tłuczka, które są schłodzone na suchym lodzie, aby sproszkować i homogenizować jednocentymetrowy kawałek zamrożonej tkanki.Porcjować tkankę do jednorazowych fiolek, upewniając się, że do każdej fiolki przeniosło się około 40 miligramów sproszkowanej tkanki, unikając przy tym rozmrażania przez cały czas. Przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do przetworzenia. Aby przygotować się z granulek komórkowych, ponownie zawieś osad około 10 milionów komórek w 200 mikrolitrach 1x buforu do lizy komórek zawierającego 25 nanomolowych OG-881.Każdą próbkę należy krótko zmieszać i trzymać na lodzie przez pięć minut. Za pomocą sonikatora poddaj próbki sonikacji trzema impulsami o częstotliwości 45 kiloherców, z których każdy trwa 20 sekund. Umieść próbki na lodzie na 20 sekund między impulsami.Próbki należy przechowywać na lodzie przez dodatkowe pięć minut. Następnie należy krótko przemieszać i odwirować próbki w temperaturze 14 000 razy G przez 10 minut w wirówce, która jest wstępnie schłodzona w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra przenieś każdy supernatant do oddzielnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Pozostaw probówki na lodzie na dwie godziny przed przetworzeniem. Następnie określ ilościowo białko natywne za pomocą testu Bradforda, jak opisano w protokole tekstowym. Całkowita płytka jest pokryta przeciwciałem anty-KDM1A.Wolna płytka jest pokryta streptawidyną. Lizat komórkowy jest następnie dodawany do obu płytek, a kompleks KDM1A jest wychwytywany bezpośrednio lub przez chemosondę. Płytki przemywa się i inkubuje z przeciwciałem wykrywającym anty-KDM1A i przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową.Na koniec dodawane jest podłoże luminescencyjne i generowany jest sygnał. Aby uzyskać całkowity test ELISA KDM1A, należy przygotować 10 mililitrów przeciwciała wychwytującego KDM1A w PBS do końcowego stężenia dwóch mikrogramów na mililitr dla każdej płytki. Przenieś 100 mikrolitrów do każdej studzienki płytki.Aby uzyskać wolny test ELISA KDM1A, przygotuj 10 mililitrów streptawidyny w PBS w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr na każdą płytkę. Przenieś 100 mikrolitrów do każdej studzienki płytki. Następnie uszczelnij każdą płytkę folią samoprzylepną i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia wyjmij talerze z lodówki i pozwól im zachować równowagę w temperaturze pokojowej przez około 45 minut. Umyj każdą płytkę trzy razy buforem do mycia, pamiętając, aby po każdym etapie mycia stukać płytką w ręczniki papierowe, aby usunąć resztki roztworu. Dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki obu płytek.Na wierzchu uszczelnij płytki folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. W międzyczasie rozcieńczyć wcześniej otrzymane natywne ekstrakty białkowe PBS do odpowiedniego stężenia i ułożyć płytkę w celu przygotowania krzywej wzorcowej przy użyciu ludzkiego rKDM1A, jak opisano w protokole tekstowym. Po zakończeniu dwugodzinnej inkubacji wyrzuć bufor blokujący i umyj płytki buforem do mycia, upewniając się, że po każdym etapie mycia uderzasz płytką w ręczniki papierowe, aby usunąć resztki roztworu.Przenieść odpowiednie rozcieńczone próbki do chłodzonego bloku do przechowywania 96 studni głębokościowych zgodnie z rozkładem płytek znajdującym się w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Trzymaj ten blok na lodzie podczas pipetowania 100 mikrolitrów na studzienkę do całkowitej i wolnej płytki ELISA, zgodnie z rozkładem płytek znajdującym się w tabeli trzeciej protokołu tekstowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, następnie wyrzucić próbki i przemyć płytki pięciokrotnie buforem do przemywania wodą.Przygotować 20 mililitrów króliczego przeciwciała wykrywającego anty-KDM1A w buforze blokującym w stężeniu 0,125 mikrograma na mililitr. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała do wykrywania do każdej studzienki na obu płytkach, z wyjątkiem tych, które odpowiadają kontrolom ujemnym. Na wierzch uszczelnij płytki folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.Następnie należy wyrzucić roztwór przeciwciała wykrywającego i przemyć płytki sześciokrotnie buforem do mycia. Przygotować 25 mililitrów wtórnego koziego przeciwciała anty-króliczego, HRP, w rozcieńczeniu od jednego do 5 000 w buforze blokującym. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego dołka na płytkach do mikromiareczkowania i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę.30 minut przed końcem tej inkubacji wymieszać równe części wzmacniacza luminolu i roztworu nadtlenku w bursztynowej butelce w miękkich warunkach oświetleniowych. Pozostaw tę mieszaninę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji należy odrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć płytki sześciokrotnie buforem do przemywania wodą.Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu roboczego luminolu do każdej studzienki na płytkach, upewniając się, że pipetujesz bardzo powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Użyj timera, aby kontrolować czas między dodaniem roztworu a pomiarem luminescencji płytek i utrzymuj ten czas na stałym poziomie, aby uzyskać dobrą odtwarzalność między testami. Górne uszczelnienie płytek folią samoprzylepną i odwirowanie w temperaturze 500 razy G i w temperaturze pokojowej przez 45 sekund, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki.Inkubować płytki na wytrząsarce płytek z prędkością 100 obr./min przez jedną minutę. Następnie usuń folię samoprzylepną i włóż płytkę do czytnika mikropłytek i pozostaw ją na trzy minuty, aby ustabilizować temperaturę na poziomie 25 stopni Celsjusza. Odczytaj względne jednostki luminescencji każdego testu płytki ELISA.Zapisz i skopiuj nieprzetworzone wartości RLU z plików arkusza kalkulacyjnego nieprzetworzonych danych w celu dalszej analizy. W tym badaniu nowy test ELISA oparty na chemoprobcie KDM1A służy do bezpośredniego pomiaru docelowego zaangażowania KDM1A w komórkach i próbkach tkanek. Wartości RLU całkowitego i swobodnego rKDM1A są oceniane w celu sprawdzenia liniowości.Wartości RLU całkowitego i wolnego KDM1A wykryte w ludzkich PBMC od trzech niezależnych ochotników są następnie nakładane na krzywą standardową. Komórki AML są hodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy i są traktowane nośnikiem lub ORY-1001 w różnych stężeniach. Natywny ekstrakt białkowy otrzymuje się w obecności 25-milimolowej chemosondy OG-881, a 0,5 mikrograma białka całkowitego wykorzystuje się do przeprowadzenia analizy docelowego zaangażowania.Następnie określa się całkowity i wolny KDM1A i oblicza procentowy udział ORY-1001 w stosunku do KDM1A w stosunku do pojazdu. Reagujące na dawkę zaangażowanie docelowe KDM1A w PBMC i w leczeniu płuc szczurów ORY-1001 przez zgłębnik doustny, obliczone w odniesieniu do grupy nośnika, pokazano tutaj. Inkubacja ex vivo z 25 nanomolowymi ekstraktami białkowymi płuc ORY-1001 od zwierząt leczonych nośnikiem, daje jeszcze pełne TE, ale nie zwiększa dalej TE w próbkach od szczurów leczonych przez cztery dni 30 mikrogramami na kilogram ORY-1001, potwierdzając, że KDM1A był już w pełni zahamowany in vivo.Protokół ten ocenia docelowe zaangażowanie KDM1A, mierząc wolne i całkowite KDM1A. Pamiętaj, że wymaga ekstrakcji białka natywnego. Technika ta może być stosowana na próbkach pochodzących z różnych gatunków w celu oceny konkretnego inhibitora, a także w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych inhibitorów.Chemosonda zastosowana w tym badaniu może być również zastosowana w chemoproteomice do badania interactum KDM1A. Pamiętaj, aby pracować bezpiecznie i zawsze przestrzegać środków zapobiegawczych podczas obchodzenia się z próbkami biologicznymi i związkami bioaktywnymi, takimi jak inhibitor KDM1A.

direct-measurement-kdm1a-target-engagement-using-chemoprobe-based

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Interakcje DNA-białko są niezbędne dla wielu procesów biologicznych. Podczas oceny funkcji komórkowych analiza interakcji DNA-białko jest niezbędna do zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do analizy takich interakcji in vivo.

Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Tutaj prezentujemy protokół koimmunoprecypitacji i test aktywności enzymatycznej na koraliku, aby jednocześnie badać udział specyficznych domen białkowych receptorów błony komórkowej zarówno w rekrutacji enzymów, jak i ich aktywności.

Test koimmunoprecypitacji do badania funkcjonalnych interakcji między receptorami i enzymami

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

To badanie przedstawia protokół immunocytochemii żywych komórek 3D zastosowany do pediatrycznej linii komórkowej rozlanego glejaka pośrodkowego, przydatny do badania w czasie rzeczywistym ekspresji białek na błonie plazmatycznej podczas dynamicznych procesów, takich jak inwazja i migracja komórek 3D.

Testy immunocytochemiczne żywych komórek 3D rozlanego glejaka pośrodkowego u dzieci

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Ten protokół opisuje test blokady dla inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Wykorzystuje dwuetapową strategię unieruchomienia i dostosowany system buforowy do dokładnego pomiaru jednostek reakcji, ułatwiając ocenę wskaźników blokady dla związków lub leków biologicznych. Dodatkowo wspomaga wysokoprzepustową identyfikację inhibitorów PD-1/PD-L1.

Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Poznaj metodę bezpośredniego pomiaru zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe. Technika ta umożliwia ilościowe określenie zajętości celu w próbkach komórkowych i tkankowych.

Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe

Przeglądaj więcej filmów