Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe

Ocena zaangażowania docelowego, czyli interakcji leku z białkiem, dla którego został zaprojektowany, jest podstawowym wymogiem interpretacji aktywności biologicznej dowolnego związku podczas opracowywania leku lub w podstawowych projektach badawczych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośredni pomiar wpływu dawki i dynamiki zaangażowania celu KDM1A, a nie pomiary dalszych efektów, takich jak znaczniki histonów i ekspresja. Technika ta może być stosowana w badaniach podstawowych, a także w badaniach klinicznych, w onkologicznych chorobach OUN lub innych chorobach będących przedmiotem leczenia inhibitorem KDM1A w celu badania farmakodynamiki.

Technika ta opiera się na chemoprobe opracowanym do badania ORY-1001, iadademstat, ale może być naprawdę stosowana do innych inhibitorów KDM1A, a strategia może być stosowana do innych celów. Procedura zostanie zademonstrowana przez Raquel Ruiz, kierownika operacyjnego platformy wykrywania PK/PD z mojego laboratorium. Podczas leczenia komórkowego ORY-1001 związek ten wiąże się z białkiem KDM1A obecnym w jądrze.

Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij z lodówki 10-mikrolitrową jednorazową porcję 20-milimolowego roztworu podstawowego sondy biotynylowej OG-881 i pozwól mu się ogrzać w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Za pomocą mikropipety z końcówkami filtrującymi seryjnie rozcieńczyć roztwór podstawowy, aby przygotować dwumikromolowy roztwór roboczy. Następnie rozpuść jedną tabletkę inhibitora proteazy w jednym mililitrze PBS w probówce do mikrowirówki.

Na każdy mililitr pożądanej objętości 1x buforu do lizy komórek z chemosondą wymieszaj 100 mikrolitrów uzyskanego komercyjnego buforu do lizy komórek 10x, 150 mikrolitrów 10x inhibitora proteazy, 12,5 mikrolitrów dwóch mikromolowych roztworu roboczego OG-881 i 737,5 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody typu 1. Komórki są lizowane w 1x buforze do lizy w obecności chemosondy, która wiąże się z dowolnym wolnym białkiem KDM1A. Aby przygotować z chusteczek, użyj moździerza i tłuczka, które są schłodzone na suchym lodzie, aby sproszkować i homogenizować jednocentymetrowy kawałek zamrożonej tkanki.

Porcjować tkankę do jednorazowych fiolek, upewniając się, że do każdej fiolki przeniosło się około 40 miligramów sproszkowanej tkanki, unikając przy tym rozmrażania przez cały czas. Przechowuj próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do przetworzenia. Aby przygotować się z granulek komórkowych, ponownie zawieś osad około 10 milionów komórek w 200 mikrolitrach 1x buforu do lizy komórek zawierającego 25 nanomolowych OG-881.

Każdą próbkę należy krótko zmieszać i trzymać na lodzie przez pięć minut. Za pomocą sonikatora poddaj próbki sonikacji trzema impulsami o częstotliwości 45 kiloherców, z których każdy trwa 20 sekund. Umieść próbki na lodzie na 20 sekund między impulsami.

Próbki należy przechowywać na lodzie przez dodatkowe pięć minut. Następnie należy krótko przemieszać i odwirować próbki w temperaturze 14 000 razy G przez 10 minut w wirówce, która jest wstępnie schłodzona w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą mikropipety o pojemności jednego mililitra przenieś każdy supernatant do oddzielnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Pozostaw probówki na lodzie na dwie godziny przed przetworzeniem. Następnie określ ilościowo białko natywne za pomocą testu Bradforda, jak opisano w protokole tekstowym. Całkowita płytka jest pokryta przeciwciałem anty-KDM1A.

Wolna płytka jest pokryta streptawidyną. Lizat komórkowy jest następnie dodawany do obu płytek, a kompleks KDM1A jest wychwytywany bezpośrednio lub przez chemosondę. Płytki przemywa się i inkubuje z przeciwciałem wykrywającym anty-KDM1A i przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową.

Na koniec dodawane jest podłoże luminescencyjne i generowany jest sygnał. Aby uzyskać całkowity test ELISA KDM1A, należy przygotować 10 mililitrów przeciwciała wychwytującego KDM1A w PBS do końcowego stężenia dwóch mikrogramów na mililitr dla każdej płytki. Przenieś 100 mikrolitrów do każdej studzienki płytki.

Aby uzyskać wolny test ELISA KDM1A, przygotuj 10 mililitrów streptawidyny w PBS w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr na każdą płytkę. Przenieś 100 mikrolitrów do każdej studzienki płytki. Następnie uszczelnij każdą płytkę folią samoprzylepną i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia wyjmij talerze z lodówki i pozwól im zachować równowagę w temperaturze pokojowej przez około 45 minut. Umyj każdą płytkę trzy razy buforem do mycia, pamiętając, aby po każdym etapie mycia stukać płytką w ręczniki papierowe, aby usunąć resztki roztworu. Dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki obu płytek.

Na wierzchu uszczelnij płytki folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. W międzyczasie rozcieńczyć wcześniej otrzymane natywne ekstrakty białkowe PBS do odpowiedniego stężenia i ułożyć płytkę w celu przygotowania krzywej wzorcowej przy użyciu ludzkiego rKDM1A, jak opisano w protokole tekstowym. Po zakończeniu dwugodzinnej inkubacji wyrzuć bufor blokujący i umyj płytki buforem do mycia, upewniając się, że po każdym etapie mycia uderzasz płytką w ręczniki papierowe, aby usunąć resztki roztworu.

Przenieść odpowiednie rozcieńczone próbki do chłodzonego bloku do przechowywania 96 studni głębokościowych zgodnie z rozkładem płytek znajdującym się w tabeli drugiej protokołu tekstowego. Trzymaj ten blok na lodzie podczas pipetowania 100 mikrolitrów na studzienkę do całkowitej i wolnej płytki ELISA, zgodnie z rozkładem płytek znajdującym się w tabeli trzeciej protokołu tekstowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę, następnie wyrzucić próbki i przemyć płytki pięciokrotnie buforem do przemywania wodą.

Przygotować 20 mililitrów króliczego przeciwciała wykrywającego anty-KDM1A w buforze blokującym w stężeniu 0,125 mikrograma na mililitr. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciała do wykrywania do każdej studzienki na obu płytkach, z wyjątkiem tych, które odpowiadają kontrolom ujemnym. Na wierzch uszczelnij płytki folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie należy wyrzucić roztwór przeciwciała wykrywającego i przemyć płytki sześciokrotnie buforem do mycia. Przygotować 25 mililitrów wtórnego koziego przeciwciała anty-króliczego, HRP, w rozcieńczeniu od jednego do 5 000 w buforze blokującym. Dodać 100 mikrolitrów roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdego dołka na płytkach do mikromiareczkowania i inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę.

30 minut przed końcem tej inkubacji wymieszać równe części wzmacniacza luminolu i roztworu nadtlenku w bursztynowej butelce w miękkich warunkach oświetleniowych. Pozostaw tę mieszaninę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji należy odrzucić drugorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć płytki sześciokrotnie buforem do przemywania wodą.

Następnie odpipetuj 100 mikrolitrów roztworu roboczego luminolu do każdej studzienki na płytkach, upewniając się, że pipetujesz bardzo powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Użyj timera, aby kontrolować czas między dodaniem roztworu a pomiarem luminescencji płytek i utrzymuj ten czas na stałym poziomie, aby uzyskać dobrą odtwarzalność między testami. Górne uszczelnienie płytek folią samoprzylepną i odwirowanie w temperaturze 500 razy G i w temperaturze pokojowej przez 45 sekund, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki.

Inkubować płytki na wytrząsarce płytek z prędkością 100 obr./min przez jedną minutę. Następnie usuń folię samoprzylepną i włóż płytkę do czytnika mikropłytek i pozostaw ją na trzy minuty, aby ustabilizować temperaturę na poziomie 25 stopni Celsjusza. Odczytaj względne jednostki luminescencji każdego testu płytki ELISA.

Zapisz i skopiuj nieprzetworzone wartości RLU z plików arkusza kalkulacyjnego nieprzetworzonych danych w celu dalszej analizy. W tym badaniu nowy test ELISA oparty na chemoprobcie KDM1A służy do bezpośredniego pomiaru docelowego zaangażowania KDM1A w komórkach i próbkach tkanek. Wartości RLU całkowitego i swobodnego rKDM1A są oceniane w celu sprawdzenia liniowości.

Wartości RLU całkowitego i wolnego KDM1A wykryte w ludzkich PBMC od trzech niezależnych ochotników są następnie nakładane na krzywą standardową. Komórki AML są hodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy i są traktowane nośnikiem lub ORY-1001 w różnych stężeniach. Natywny ekstrakt białkowy otrzymuje się w obecności 25-milimolowej chemosondy OG-881, a 0,5 mikrograma białka całkowitego wykorzystuje się do przeprowadzenia analizy docelowego zaangażowania.

Następnie określa się całkowity i wolny KDM1A i oblicza procentowy udział ORY-1001 w stosunku do KDM1A w stosunku do pojazdu. Reagujące na dawkę zaangażowanie docelowe KDM1A w PBMC i w leczeniu płuc szczurów ORY-1001 przez zgłębnik doustny, obliczone w odniesieniu do grupy nośnika, pokazano tutaj. Inkubacja ex vivo z 25 nanomolowymi ekstraktami białkowymi płuc ORY-1001 od zwierząt leczonych nośnikiem, daje jeszcze pełne TE, ale nie zwiększa dalej TE w próbkach od szczurów leczonych przez cztery dni 30 mikrogramami na kilogram ORY-1001, potwierdzając, że KDM1A był już w pełni zahamowany in vivo.

Protokół ten ocenia docelowe zaangażowanie KDM1A, mierząc wolne i całkowite KDM1A. Pamiętaj, że wymaga ekstrakcji białka natywnego. Technika ta może być stosowana na próbkach pochodzących z różnych gatunków w celu oceny konkretnego inhibitora, a także w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych inhibitorów.

Chemosonda zastosowana w tym badaniu może być również zastosowana w chemoproteomice do badania interactum KDM1A. Pamiętaj, aby pracować bezpiecznie i zawsze przestrzegać środków zapobiegawczych podczas obchodzenia się z próbkami biologicznymi i związkami bioaktywnymi, takimi jak inhibitor KDM1A.