Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II

Jest to wiadomość, która może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wzbogacania i identyfikacji nitropeptydów za pomocą podejścia chemicznego i spektrometrii mas. Technika ta ma zwiększoną czułość wykrywania nitropeptydów za pomocą spektrometrii mas i może być stosowana zarówno do systemów biochemicznych in vitro, jak i endogennych tkanek biologicznych. W przypadku odsalania nitro-angiotensyny II należy użyć pipety o pojemności jednego mililitra do wstępnego kondycjonowania ekstrakcji w fazie stałej w odwrotnej fazie lub kolumny SPE z dodatkiem 500 mikrolitrów metanolu i 500 mikrolitrów wody do górnej części kolumny.

Gdy cała woda przepłynie przez kolumnę, załaduj 410 mikrolitrów roztworu nitro-angiotensyny II na kolumnę. Przemyć kolumnę 500 mikrolitrami 5% metanolu i wody oraz 300 mikrolitrami 80% metanolu i wodą w celu elucji nitropeptydu. Następnie wysuszyć eluat za pomocą szybkiego odkurzania w domyślnym ustawieniu w temperaturze pokojowej.

W przypadku pierwszorzędowej alkilacji aminowej należy rozpuścić sproszkowaną nitro-angiotensynę II w 100 mikrolitrach 100-milimolowego roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego i dodać 400 mikrolitrów 4% formaldehydu do roztworu w dygestorium po krótkim wymieszaniu. Następnie dodaj cztery mikrolitry 0,6-molowego cyjanoborowodorku sodu do roztworu, wytrząsając z prędkością 400 obrotów na minutę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wygasić reakcję znakowania 16 mikrolitrami 1% roztworu amoniaku przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie zakwasić ośmioma mikrolitrami kwasu mrówkowego.

Następnie odsolić roztwór w nowej kolumnie SPE z odwróconymi fazami, jak właśnie pokazano. W celu redukcji nitrotyrozyny do aminotyrozyny należy rozpuścić znakowaną dimetylo nitro-angiotensynę II w 500 mikrolitrach PBS i dodać 10 mikrolitrów jednego molowego ditionianu sodu na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Po reakcji redukcji żółty roztwór stanie się klarowny.

Zredukowaną próbkę odsolić w nowej kolumnie SPE z odwróconymi fazami, jak pokazano. W celu biotynylacji i wzbogacenia rozpuść znakowaną dimetyloznakowaną aminoangiotensynę II w 500 mikrolitrach PBS, a następnie dodaj pięć mikrolitrów 40 nanomolowej biotyny NHS-S-S rozpuszczonej w dimetylosulfotlenku przez dwie godziny inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wygasić reakcję jednym mikrolitrem 5% hydroksyloaminy i dodać 500 mikrolitrów świeżego PBS do 100 mikrolitrów kulek Streptawidyny Agarozy w celu zrównoważenia przez trzy oddzielne wirowania.

Po ostatnim odwirowaniu dodać 100 mikrolitrów kulek do układu reakcyjnego na jednogodzinną inkubację na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć system czterokrotnie 500 mikrolitrami świeżego PBS na przemycie, a następnie dodać 400 mikrolitrów 10-milimolowego ditiotreitolu na 45-minutową inkubację w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować kolumnę i przenieść supernatant do nowej probówki zawierającej 20 mikrolitrów 0,5-molowego jodoacetamidu na 20-minutową inkubację w ciemności.

Następnie odsolić roztwór w nowej kolumnie SPE z odwróconymi fazami, jak pokazano, i rozpuścić suchy peptyd w 20 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. W celu wykrycia załadować produkt do chromatografu cieczowego z tandemowym spektrometrem masowym. Oddzielić zmodyfikowane peptydy angiotensyny II przez 60-minutową eluzję gradientową przy natężeniu przepływu 0,3 mikrolitra na minutę za pomocą systemu nanowysokociśnieniowej chromatografii cieczowej, który jest bezpośrednio połączony ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

W trybie akwizycji zależnej od danych ustaw pojedyncze pełne widmo masowe skanowania w spektrometrze mas, a następnie 20 zależnych od danych skanów tandemowego spektrometru mas przy 28% znormalizowanej energii zderzenia. Następnie otwórz dane widm masowych i zidentyfikuj piki produktu na każdym etapie, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie przeprowadzona. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne widma masowe angiotensyny II przed i po każdej modyfikacji chemicznej, jak wykazano.

Masa cząsteczkowa związku jest wskazywana przez wartości stosunku masy do ładunku piku monoizotopu, co wskazuje, że modyfikacja chemiczna angiotensyny II została pomyślnie osiągnięta na tym etapie. W tym miejscu przedstawiono produkt końcowy wykryty i scharakteryzowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas. Analiza ilościowa nitropeptydów za pomocą znakowania dimetylu pozwala na obliczenie względnych ilości lekkich i ciężkich poprzez porównanie intensywności piku monoizotopu w każdej grupie, co pozwala na ilościowe określenie wzbogaconych nitropeptydów z różnych grup.

Postępując zgodnie z procedurą, możesz użyć wyszukiwarki programów, takiej jak SEQUEST max count of pFIND, aby zidentyfikować potencjalne nitropeptydy. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do rozpoczęcia funkcji biologicznych w określonych miejscach nitrowania.