Name: Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę wzbogacania i profilowania nitropeptydów z użyciem spektrometrii masowej na przykładzie angiotensyny II. Technika zwiększa czułość detekcji w próbkach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack jest głównym badaczem; X.L. jest badaczem pododbiorcy). Publikacja ta była możliwa dzięki częściowemu wsparciu grantów o numerach KL2 TR002530 i UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) z National Institutes of Health, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. jest laureatem nagrody Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. jest wspierany przez Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer grants. X. W. jest wspierany przez National Natural Science Foundation of China General Program (grant nr 817773047).

1. Nitrowanie angiotensyny II
<ol>
	<li>Aby wytworzyć peptyd nitrowany, należy rozcieńczyć 10 μl roztworu macierzystego angiotensyny II (DRVYIHPF) (2 mM w wodzie) w 390 μl roztworu PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4) przy końcowym stężeniu 50 μM.</li>
	<li>Dodać 10 μl nadtlenoazotynu (200 mM w 4,7% NaOH) do roztworu angiotensyny II, aby uzyskać końcowe stężenie nadtlenoazotynu 5 mM. 
	UWAGA: Nadtlenoazotyn jest niestabilny i łatwo się rozpuszcza, gdy występuje w postaci kwasu, więc roztwór macierzysty nadtlenoazotynu jest przechowywany w roztworze zasadowym i przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dostosować wartość pH roztworu do 7-8 na 1 M HCl. Aby rozpocząć reakcję nitracji, należy wstrząsnąć probówką z prędkością 400 obr./min przez 5 minut.</li>
	<li>Do odsalania należy użyć dostępnej w handlu kolumny SPE z odwróconą fazą (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Przygotuj 2 roztwory do odsalania, 5% metanolu w wodzie do mycia i 80% metanolu w wodzie do elucji.</li>
		<li>Dodać 500 μl metanolu, a następnie 500 μl wody, aby wstępnie przygotować kolumnę, umieścić 1 ml pipetora końcówką na górze kolumny, nacisnąć pipetor, aby przyspieszyć przepływ.</li>
		<li>Załadować 410 μl próbki w kroku 1.3 do kolumny, odrzucić przepływ.</li>
		<li>Po umyciu 500 μl 5% metanolu, użyj 300 μl 80% metanolu do wymycia nitropeptydu, który jest następnie całkowicie suszony przez speed-vac w domyślnym ustawieniu w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Odsalanie jest bardzo ważne dla reakcji, ponieważ rozpuszczalnik pozostawiony w poprzednim etapie może mieć negatywny wpływ na kolejne kroki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Alkilowanie amin pierwszorzędowych przez znakowanie dimetylu
<ol>
	<li>Rozpuścić sproszkowaną nitro-angiotensynę II w 100 μl 100 mM roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego (TEAB). 
	UWAGA: Wartość pH roztworu powinna wynosić od 7 do 9 i upewnić się, że do roztworu nie dodano żadnej pierwszorzędowej aminy.</li>
	<li>Dodać 4 μl 4% formaldehydu do roztworu, krótko wymieszać. 
	UWAGA: Opary formaldehydu są toksyczne; Eksperymenty należy wykonywać w dygestorium.</li>
	<li>Dodać 4 μl 0,6 M NaBH3CN do roztworu, wstrząsać probówką z prędkością 400 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ugasić reakcję znakowania, dodając 16 μl 1% roztworu amoniaku, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 8 μl kwasu mrówkowego w celu zakwaszenia roztworu i przeprowadzić odsalanie za pomocą kolumny SPE z odwróconymi fazami, jak opisano w kroku 1.4.</li>
</ol>
3. Redukcja nitrotyrozyny do aminotyrozyny
<ol>
	<li>Nitro-angiotensynę II znakowaną dimetylem należy rozpuścić w 500 μl PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4).</li>
	<li>Dodać 10 μl 1 M ditionianu sodu do roztworu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po reakcji redukcji żółty kolor roztworu staje się przezroczysty. 
	UWAGA: Odważyć 174,1 mg ditionianu sodu i rozpuść go w wodzie, aby uzyskać końcową objętość 1 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C nie dłużej niż tydzień.</li>
	<li>Do odsalania należy użyć kolumny SPE z odwróconą fazą, jak opisano w kroku 1.4.</li>
</ol>
4. Biotynylacja, wzbogacanie i wykrywanie
<ol>
	<li>Rozpuść znakowaną dimetylo aminoangiotensynę II w 500 μl PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4).</li>
	<li>Dodać 5 μl 40 nM NHS-S-S-biotyny, rozpuszczonej w DMSO, do roztworu, po 2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej użyć 1 μl 5% hydroksyloaminy do wygaszenia reakcji.</li>
	<li>W międzyczasie należy zrównoważyć kulki agarozy streptawidyny, dodając 500 μl PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4), odwirowując przy 580 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucając supernatant. Wykonaj równoważenie 3 razy.</li>
	<li>Dodać 100 μl kulek agarozy streptawidyny do układu reakcyjnego, inkubować przez 1 godzinę na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej. Przemyć 4 razy PBS (10 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,4). Na każdym etapie płukania dodać 500 μl PBS do kulek, dobrze wymieszać, a następnie odwirować przy 580 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Użyć 400 μl 10 mM ditiotreitolu (DTT) do inkubacji z kulkami agarozy w temperaturze 50 °C przez 45 min, odwirować w dół przy 580 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej i wyrzucić kulki, dodać 20 μl 0,5 M idoacetamidu (IAM) do supernatantu na 20 minut w ciemności. 
	UWAGA: DTT służy do zerwania wiązania dwusiarczkowego między wiązaniem biotyny a peptydem, ten ostatni jest uwalniany z kulek i dalej alkilowany przez IAM.</li>
	<li>Użyj kolumny SPE z odwróconą fazą do odsalania pokazanego w kroku 1.4.</li>
	<li>Po rozpuszczeniu suchych peptydów w 20 μl 0,1% kwasu mrówkowego (FA), produkt każdej sekcji poddać chromatografii cieczowej z analizą tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).
	<ol>
		<li>Oddzielić zmodyfikowane peptydy Ang II przez 60-minutową elucję gradientową (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) przy natężeniu przepływu 0,300 μl / min z systemem nano-HPLC, który jest bezpośrednio połączony ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości. 
		UWAGA: Kolumna analityczna ma średnicę wewnętrzną 75 μm, długość 150 mm, wypełniona żywicą C-18. Faza ruchoma A składała się z 0,1% kwasu mrówkowego, a faza ruchoma B składała się ze 100% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.</li>
		<li>Uruchom spektrometr masowy w trybie akwizycji zależnej od danych, ustaw pojedyncze widmo masowe pełnego skanowania (300-1800 m/z, rozdzielczość 60 000), a następnie 20 zależnych od danych skanów MS/MS przy 28% znormalizowanej energii zderzenia.</li>
		<li>Otwórz dane widm mas i zidentyfikuj piki produktu na każdym etapie, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie przeprowadzona.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja nitropeptydu
<ol>
	<li>Przygotować 3 zestawy roztworów nitro-angiotensyny II z kroku 1.4, każdy zestaw zawierający 2 stężenia nitro-angiotensyny II: zestaw #1, 20 nmol w probówce A i 20 nmol w probówce B, każdy w 100 μl roztworu TEAB; Zestaw #2, 10 nmol w probówce C i 20 nmol w probówce D, każdy w 100 μl roztworu TEAB; Zestaw #3, 40 nmol w probówce E i 10 nmol w probówce F, każdy w 100 μl roztworu TEAB. 
	Uwaga: Dwa stężenia nitro-angiotensyny II w każdym zestawie są używane do znakowania dimetylu, aby reagować odpowiednio z formaldehydem (lekkim) i formaldehydem-D2 (ciężkim).</li>
	<li>Do każdego zestawu dodaj 4 μl 4% formaldehydu i formaldehydu-D2 do próbki, która ma być oznaczona odpowiednio jako lekka i ciężka. Wykonaj kroki od 2.3 do 2.5, aby zakończyć etykietowanie dimetylu.</li>
	<li>Wymieszaj lekkie i ciężkie oznakowane próbki.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z krokami od 3.1 do 4.6 dla redukcji, biotynylacji, wzbogacania i wykrywania.</li>
</ol>

<ol><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+oxidants%2C+and+protein+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li>
<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+nitration%3A+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin%2C+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin%2C+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li>
<li>Batthyány, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine-Nitrated+Proteins%3A+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li>
<li>Feeney, M. B., Schöneich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li>
<li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li>
<li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li>
<li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje wzbogacanie i profilowanie nitropeptydów. Używając angiotensyny II jako peptydu modelowego, zilustrowaliśmy procedurę pokazaną na rycinie 1. Po uzyskaniu nitro-angiotensyny II, pierwszorzędowa amina na peptydzie powinna zostać zablokowana, aby uniknąć dalszej koniugacji amin, co jest jednym z najbardziej krytycznych kroków w protokole. W obecnym protokole znakowanie dimetylu jest stosowane do blokowania amin pierwszorzędowych z dwóch powodów: po pierwsze, umożliwia...

Nitrowanie reszt tyrozyny w białkach do postaci 3-nitrotyrozyny reguluje wiele procesów biologicznych. Ze względu na różne właściwości chemiczne między tyrozyną a 3-nitrotyrozyną, białko nitrowane może mieć zaburzoną aktywność sygnalizacyjną1,2. Dlatego ważne jest, aby opracować metody, które mogą skutecznie wzbogacać i identyfikować miejsca nitracji białek. Ponieważ 3-nitrotyrozyna jest modyfikacją białek o niskiej obfitości w porównaniu z innymi formami PTM, takimi jak fosforylacja i acetylacja, trudno jest zidentyfikować endogenne miejsca nitrowania bezpośrednio z linii komórkowych lub próbek tkanek. Niemniej jednak opracowano metodologię wykorzystania spektrometrii mas (MS) do scharakteryzowania wzorca fragmentacji nitrotpeptydu (na przykład Zhan & Desiderio3), co stanowi podstawę dla nowych metod nitroproteomiki. 
Obecnie, etap wzbogacania, po którym następuje MS, jest najpotężniejszą strategią profilowania nitropeptydów4,5. Metody wzbogacania można podzielić na dwie klasy. Jedna klasa opiera się na przeciwciałach, które mogą rozpoznawać specyficznie 3-nitrotyrozynę, podczas gdy druga klasa opiera się na pochodnym chemicznym, które redukuje grupę nitrową do grupy aminowej 4,5. W przypadku metody opartej na przeciwciałach do wzbogacania stosuje się kolumnę powinowactwa nitrotyrozyny, z której eluowany materiał jest dalej rozpuszczany i analizowany za pomocą wysokiej rozdzielczości MS6,7. W przypadku metody opartej na wyprowadzeniu chemicznym grupy aminowe na N-końcu peptydu lub lizyny powinny być blokowane w pierwszym etapie za pomocą odczynników acetylacji, znaczników izobarycznych do względnej i bezwzględnej oceny ilościowej (iTRAQ) lub znaczników masy tandemowej (TMT). Następnie stosuje się reduktor w celu redukcji nitrotyrozyny do aminotyrozyny, a następnie modyfikuje się nowo utworzoną grupę aminową, która obejmuje ligację biotyny, konwersję peptydu sulfidrylowego lub inne rodzaje systemów znakowania8,9,10,11. Większość ustalonych do tej pory protokołów opiera się na białkach nadmiernie nitrowanych in vitro, a nie na białkach nitrowanych endogennie.
W obecnym badaniu, zmodyfikowana procedura chemicznego wyprowadzania nitrotyrozyny jest rozwijana do wzbogacania i identyfikacji nitropeptydu, która wykazuje zwiększoną czułość podczas wykrywania SM i jest odpowiednia do celów kwantyfikacji. Nasze ostatnie badanie z zastosowaniem tej metody w systemach biologicznych wykazało, że nitrowanie specyficznej dla limfocytów białkowej kinazy tyrozynowej (LCK) w Tyr394 przez RNS wytwarzane z komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC) odgrywa ważną rolę w immunosupresji mikrośrodowiska nowotworu12. Dlatego nasza metoda identyfikacji nitropeptydów może być stosowana również do złożonych próbek biologicznych. Tutaj opisujemy nasz protokół, używając modelowego peptydu angiotensyny II, którego wzór fragmentacji jest znany i szeroko stosowany w badaniach nitroproteomicznych8,9,10,11, jako przykład.

<table><tbody><tr><td>Kolumna Acclaim pepmap 100 C18</td><td>Thermo-Fisher</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór TEAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>50% hydroksyloaminy</td><td>Thermo-Fisher</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A955</td><td>MS Grade</td></tr><tr><td>ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Biologia molekularna</td></tr><tr><td>Klasa formaldehyd-D2</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>F691353</td><td></td></tr><tr><td>kwas mrówkowy</td><td>Odczynnik Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Fusion Lumos</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>izoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A456</td><td>MS Grade</td></tr><tr><td>NHS-S-S-bition</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21441</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB kolumna (10 mg)</td><td>Wody</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>nadtlenoazotyn</td><td>Merck-Millipore</td><td>516620</td><td></td></tr><tr><td>cyjanoborohydryt sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42077</td><td>Ditionian</td></tr><tr><td>sodu</td><td>PhamaGrade Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>klasa techniczna</td></tr><tr><td>Streptawidyna Sepharose</td><td>GE Healcare</td><td>GE17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 nanoLC</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną ii

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitrowanie białek jest jedną z najważniejszych modyfikacji potranslacyjnych (PTM) reszt tyrozyny i może być indukowane przez chemiczne działanie reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNS) w komórkach eukariotycznych. Precyzyjna identyfikacja miejsc nitrowania białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia fizjologicznych i patologicznych procesów związanych z nitrowaniem białek, takich jak stany zapalne, starzenie się i nowotwory. Ze względu na to, że białka nitrowane występują w niskiej liczebności w komórkach nawet w warunkach indukowanych, nie opracowano uniwersalnych i skutecznych metod profilowania i identyfikacji miejsc nitrowania białek. Tutaj opisujemy protokół wzbogacania nitropeptydów za pomocą reakcji redukcji chemicznej i znakowania biotyną, a następnie spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości. W naszej metodzie pochodne nitropeptydów mogą być identyfikowane z dużą dokładnością. Nasza metoda wykazuje dwie zalety w porównaniu z poprzednio opisywanymi metodami. Po pierwsze, znakowanie dimetylu służy do blokowania pierwszorzędowej aminy na nitropeptydach, które można wykorzystać do generowania wyników ilościowych. Po drugie, do wzbogacania stosuje się wiązanie dwusiarczkowe zawierające odczynnik NHS-biotyna, który można dodatkowo zredukować i zalkilować w celu wzmocnienia sygnału wykrywania na spektrometrze masowym. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do modelowego peptydu Angiotensyny II w niniejszej pracy.

Schemat blokowy profilowania nitropeptydów w niniejszym manuskrypcie przedstawiono na Rysunku 1. Rysunki 2, 3, 4 i 5 przedstawiają odpowiednio widma masowe angiotensyny II, nitro-angiotensyny II, dimetylowo znakowanej nitro-angiotensyny II oraz dimetylowo znakowanej amino-angiotensyny II. Masa cząsteczkowa związku może być odczytana z wartości m/z piku monoizotopowego na każdym rysunku, co wskazuje, że modyfikac...

Profilowanie proteomiczne białek azotowanych tyrozyną było trudną techniką ze względu na niską obfitość modyfikacji 3-nitrotyrozyny. W tym miejscu opisano nowatorskie podejście do wzbogacania i profilowania nitropeptydów przy użyciu angiotensyny II jako modelu. Metoda ta może zostać rozszerzona na inne systemy in vitro lub in vivo.

Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Jest to wiadomość, która może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące wzbogacania i identyfikacji nitropeptydów za pomocą podejścia chemicznego i spektrometrii mas. Technika ta ma zwiększoną czułość wykrywania nitropeptydów za pomocą spektrometrii mas i może być stosowana zarówno do systemów biochemicznych in vitro, jak i endogennych tkanek biologicznych. W przypadku odsalania nitro-angiotensyny II należy użyć pipety o pojemności jednego mililitra do wstępnego kondycjonowania ekstrakcji w fazie stałej w odwrotnej fazie lub kolumny SPE z dodatkiem 500 mikrolitrów metanolu i 500 mikrolitrów wody do górnej części kolumny.Gdy cała woda przepłynie przez kolumnę, załaduj 410 mikrolitrów roztworu nitro-angiotensyny II na kolumnę. Przemyć kolumnę 500 mikrolitrami 5% metanolu i wody oraz 300 mikrolitrami 80% metanolu i wodą w celu elucji nitropeptydu. Następnie wysuszyć eluat za pomocą szybkiego odkurzania w domyślnym ustawieniu w temperaturze pokojowej.W przypadku pierwszorzędowej alkilacji aminowej należy rozpuścić sproszkowaną nitro-angiotensynę II w 100 mikrolitrach 100-milimolowego roztworu wodorowęglanu trietyloamoniowego i dodać 400 mikrolitrów 4% formaldehydu do roztworu w dygestorium po krótkim wymieszaniu. Następnie dodaj cztery mikrolitry 0,6-molowego cyjanoborowodorku sodu do roztworu, wytrząsając z prędkością 400 obrotów na minutę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wygasić reakcję znakowania 16 mikrolitrami 1% roztworu amoniaku przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie zakwasić ośmioma mikrolitrami kwasu mrówkowego.Następnie odsolić roztwór w nowej kolumnie SPE z odwróconymi fazami, jak właśnie pokazano. W celu redukcji nitrotyrozyny do aminotyrozyny należy rozpuścić znakowaną dimetylo nitro-angiotensynę II w 500 mikrolitrach PBS i dodać 10 mikrolitrów jednego molowego ditionianu sodu na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Po reakcji redukcji żółty roztwór stanie się klarowny.Zredukowaną próbkę odsolić w nowej kolumnie SPE z odwróconymi fazami, jak pokazano. W celu biotynylacji i wzbogacenia rozpuść znakowaną dimetyloznakowaną aminoangiotensynę II w 500 mikrolitrach PBS, a następnie dodaj pięć mikrolitrów 40 nanomolowej biotyny NHS-S-S rozpuszczonej w dimetylosulfotlenku przez dwie godziny inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji wygasić reakcję jednym mikrolitrem 5% hydroksyloaminy i dodać 500 mikrolitrów świeżego PBS do 100 mikrolitrów kulek Streptawidyny Agarozy w celu zrównoważenia przez trzy oddzielne wirowania.Po ostatnim odwirowaniu dodać 100 mikrolitrów kulek do układu reakcyjnego na jednogodzinną inkubację na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przemyć system czterokrotnie 500 mikrolitrami świeżego PBS na przemycie, a następnie dodać 400 mikrolitrów 10-milimolowego ditiotreitolu na 45-minutową inkubację w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować kolumnę i przenieść supernatant do nowej probówki zawierającej 20 mikrolitrów 0,5-molowego jodoacetamidu na 20-minutową inkubację w ciemności.Następnie odsolić roztwór w nowej kolumnie SPE z odwróconymi fazami, jak pokazano, i rozpuścić suchy peptyd w 20 mikrolitrach 0,1% kwasu mrówkowego. W celu wykrycia załadować produkt do chromatografu cieczowego z tandemowym spektrometrem masowym. Oddzielić zmodyfikowane peptydy angiotensyny II przez 60-minutową eluzję gradientową przy natężeniu przepływu 0,3 mikrolitra na minutę za pomocą systemu nanowysokociśnieniowej chromatografii cieczowej, który jest bezpośrednio połączony ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.W trybie akwizycji zależnej od danych ustaw pojedyncze pełne widmo masowe skanowania w spektrometrze mas, a następnie 20 zależnych od danych skanów tandemowego spektrometru mas przy 28% znormalizowanej energii zderzenia. Następnie otwórz dane widm masowych i zidentyfikuj piki produktu na każdym etapie, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie przeprowadzona. Tutaj można zaobserwować reprezentatywne widma masowe angiotensyny II przed i po każdej modyfikacji chemicznej, jak wykazano.Masa cząsteczkowa związku jest wskazywana przez wartości stosunku masy do ładunku piku monoizotopu, co wskazuje, że modyfikacja chemiczna angiotensyny II została pomyślnie osiągnięta na tym etapie. W tym miejscu przedstawiono produkt końcowy wykryty i scharakteryzowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas. Analiza ilościowa nitropeptydów za pomocą znakowania dimetylu pozwala na obliczenie względnych ilości lekkich i ciężkich poprzez porównanie intensywności piku monoizotopu w każdej grupie, co pozwala na ilościowe określenie wzbogaconych nitropeptydów z różnych grup.Postępując zgodnie z procedurą, możesz użyć wyszukiwarki programów, takiej jak SEQUEST max count of pFIND, aby zidentyfikować potencjalne nitropeptydy. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do rozpoczęcia funkcji biologicznych w określonych miejscach nitrowania.

nitropeptide-profiling-identification-illustrated-angiotensin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Tutaj prezentujemy protokół opisujący lokalizację receptorów angiotensyny II typu 1 w mózgu szczura za pomocą ilościowej, densytometrycznej autoradiografii receptorów in vitro przy użyciu analogu angiotensyny II, znakowanego jodem-125.

Protokół autoradiografii receptorów do miejscowej wizualizacji receptorów angiotensyny II

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania komórek wyrażających receptory angiotensyny typu 1a znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym podczas endocytozy zainicjowanej przez leczenie angiotensyną II. Technika ta obejmuje znakowanie lizosomów drugim markerem fluorescencyjnym, a następnie wykorzystanie oprogramowania do analizy kolokalizacji receptora i lizosomu w trzech wymiarach w czasie.

Obrazowanie żywych komórek i analiza 3D transportu receptora angiotensyny typu 1a w transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Neutralne klastry SO2 o niskiej energii kinetycznej (&lt; 0,8 eV/składnik) są używane do desorpcji złożonych cząsteczek powierzchniowych, takich jak peptydy lub lipidy, do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas przy użyciu spektrometru masowego z pułapką jonową. Nie jest wymagane specjalne przygotowanie próbki i możliwa jest obserwacja reakcji w czasie rzeczywistym.

Analiza złożonych cząsteczek i ich reakcji na powierzchniach za pomocą spektrometrii mas desorpcji/jonizacji indukowanej klastrami

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię pomiaru izolewukleryn w tkankach metodą immunofluorescencji przy użyciu przeciwciała ScFv D11 sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Modele nadciśnienia zarówno u myszy, jak i u ludzi są wykorzystywane do wyjaśnienia krok po kroku procedur i podstawowych zasad związanych z pomiarem izolewuklesyny w próbkach tkanek.

Bezpośrednie wykrywanie izolewuglandyn w tkankach przy użyciu białka fuzyjnego fosfatazy alkalicznej D11 scFv i immunofluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół odnerwienia współczulnego nerek (RDN) u myszy z nadciśnieniem wywołanym infuzją angiotensyny II. Zabieg jest powtarzalny, wygodny i pozwala na zbadanie mechanizmów regulacyjnych RDN na nadciśnienie tętnicze i przerost mięśnia sercowego.

Poprawa unerwienia nerek łagodziła nadciśnienie indukowane przez infuzję angiotensyny II

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Poznaj metodę wzbogacania i profilowania nitropeptydów z użyciem spektrometrii masowej na przykładzie angiotensyny II. Technika zwiększa czułość detekcji w próbkach biologicznych.

Profilowanie i identyfikacja nitropeptydów zilustrowane angiotensyną II

Przeglądaj więcej filmów