Name: Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę pomiaru wzorców oddychania u myszy przy użyciu nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej. Technika ta eliminuje wpływ aktywnych zachowań i nie wymaga znieczulenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Angeli Le, Sarah Ruby i Marisie Mickey za ich pracę na rzecz utrzymania kolonii zwierząt. Praca ta została sfinansowana przez 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. wspierające CNR) oraz McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. Wykorzystanie zwierząt było zgodne z zasadami opisanymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych8.
UWAGA: (Krytyczne) Przed eksperymentami uzyskaj wszystkie niezbędne zgody i szkolenia wymagane do stosowania na zwierzętach. Ważne jest, aby eksperymentatorzy byli zaznajomieni z zachowaniami i poziomami aktywności myszy, w tym z oznakami snu, niepokoju i/lub artefaktami ruchowymi w porównaniu z normalnym wąchaniem i oddychaniem.
1. Komora pletyzmografii barometrycznej całego ciała
<ol>
	<li>Zapoznaj się z odpowiednimi instrukcjami obsługi komory pletyzmografii barometrycznej, w tym złączami, O-ringami itp., i utwórz standardowy plik protokołu do definiowania analizatorów (np. metabolicznych) i parametrów specyficznych dla oprogramowania.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie węże i rurki są podłączone do komory. Podłączyć rurkę przepływu gazu (wlotową) i rurę próżniową (wypływającą) bezpośrednio do komory pletyzmografii barometrycznej. 
	nuta: Dopływ musi być dołączony do otworu z zaznaczonym przepływem diagonalnym.</li>
	<li>Podłączyć zbiorniki gazu CO2, O2 i N2 do mieszalnika gazów. Przed eksperymentowaniem upewnij się, że wszystkie zbiorniki gazu są w pozycji otwartej.</li>
</ol>
2. Kalibracja komory pletyzmografu barometrycznego
<ol>
	<li>Skalibruj wysoki i niski przepływ gazu, wybierając 7700-Amplifier Setup (Konfiguracja wzmacniacza 7700) na karcie Hardware (Sprzęt) w oprogramowaniu do pletyzmografii barometrycznej.</li>
	<li>Ustawić podciśnienie (wypływ z komory) odpowiednie dla projektu eksperymentalnego i analizatorów gazów (~0,1 l/min). 
	nuta: Szybkość wypływu musi pozostać taka sama przez cały czas kalibracji i eksperymentu w celu uzyskania dokładnych zapisów metabolicznych.</li>
	<li>Ustaw niski przepływ powietrza, wyjmując rurkę przepływową z komory i wyłączając podciśnienie.</li>
	<li>Zapisz przepływ zerowy, wprowadzając 0 do komórki Low Unit dla odpowiedniej komory. Kliknij dwukrotnie komórkę Low Cal, zmień czas na 3 s i naciśnij Zmierz.</li>
	<li>Ponownie podłączyć rurkę przepływową i pozwolić, aby gaz (20,93%O2, zrównoważony N2) przepłynął przez komorę pletyzmografii barometrycznej z mieszalnika gazów.</li>
	<li>Przelicz dopływ z litrów/minut na mililitry/sekundę. Kliknij komórkę Wysoka jednostka dla odpowiedniej komory i wprowadź wartość w mililitrach/sekundę. Kliknij dwukrotnie pozycję High Cal, zmień czas na 3 s, a następnie kliknij przycisk Measure (Zmierz).</li>
	<li>Pozostaw otwartą kartę 7700-Amplifier Setup (Ustawienia wzmacniacza 7700), aby skalibrować analizatory metaboliczne z oprogramowaniem pletyzmografii barometrycznej.</li>
</ol>
3. Kalibracja analizatora metabolicznego
<ol>
	<li>W programie mieszalnika gazów ustawić mieszalnik gazów tak, aby uwalniał strumień gazu zawierającego 20,93%O2 i 79,07% N2.</li>
	<li>W analizatorach metabolicznych ustaw poziom kalibracji O2 na 20,93%, a CO2 na 0%. Przekręć pokrętło z powrotem na Sample po wprowadzeniu odpowiednich wartości.</li>
	<li>Ustaw wysoką wartość procentową O2. Kliknij zakładkę ABCD-4 w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej, a następnie wprowadź 20.93 w polu Wysoka jednostka linii C2. W obszarze Wysoka kalibracja zmień czas na 3 s i naciśnij Zmierz.</li>
	<li>Ustaw niską wartość procentową CO2 . Wprowadź wartość 0 w polu Mała kalibracja w wierszu C3, a następnie zmień czas na 3 s i kliknij opcję Zmierz w obszarze Mała kalibracja.</li>
	<li>W programie mieszalnika gazów zmień wartość O2 na 10%, a wartość CO2 na 5%. Poczekaj kilka minut, aż przepływ gazu dostosuje się do tych wartości. W analizatorach metabolicznych przekręć pokrętła regulacyjne, aby skalibrować CO2 równy 5%. Pamiętaj, aby przekręcić pokrętło z powrotem na Sample po skalibrowaniu wartości.</li>
	<li>Ustaw wysoką wartość procentową CO2 . Upewnij się, że odczyty analizatora są stabilne przed wprowadzeniem odpowiednich wartości do O2 i CO2 w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej. Kliknij opcję Wysoka jednostka w obszarze C3 i wprowadź wartość 5. Zmień High Cal na 3 s i naciśnij Measure.</li>
	<li>Ustaw dolną wartość procentową O2. Kliknij opcję Low Unit (Niska jednostka) w opcji C2 (C2) i wprowadź wartość 10. Kliknij opcję Low Cal, wprowadź 3 s, a następnie kliknij pozycję Measure (Miara).</li>
	<li>Zmień wartości gazu w mieszalniku gazów z powrotem na 20,93%O2 i 79,07% N2. Poczekaj kilka minut, aż komora dostosuje się do tych wartości. Powtórz kroki 3.1\u20123.7, jeśli analizatory metaboliczne nie odczytują automatycznie 20.93% O2 i 0% CO2 , aby zapewnić prawidłową kalibrację. Rutynowo potwierdzaj prawidłową kalibrację za pomocą certyfikowanych zbiorników gazu.</li>
	<li>Ponownie sprawdź przepływomierze podłączone do komory pletyzmografii barometrycznej. Dostosuj przepływ powietrza do i z komory do szybkości odpowiedniej dla eksperymentu (zwykle 0,1–0,3 l/min).</li>
	<li>Po zastosowaniu wszystkich ustawień w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej kliknij przycisk OK, aby rozpocząć nagrywanie.</li>
</ol>
4. Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna
<ol>
	<li>Zapisz wagę myszy i początkową temperaturę ciała. Odczekaj 10 minut przed umieszczeniem myszy w komorze, aby zebrać dane oO2 i CO2 z pustej komory. Pracuj w cichym miejscu znanym myszom, aby hałas i zapachy nie przeszkadzały w zbieraniu danych. Unikaj wszelkich możliwych zakłóceń, w tym otwierania i zamykania drzwi lub personelu wchodzącego/wychodzącego z pomieszczenia gromadzenia danych. 
	nuta: W tym konkretnym protokole wykorzystano 22-miesięcznego samca myszy C57BL/6J.</li>
	<li>W ciągu pierwszej godziny dokumentuj zachowania myszy i rób szczegółowe notatki, w tym konkretne wartości przepływu do/z komory.</li>
	<li>Po 60 minutach habituacji w komorze obserwuj segmenty spokojnego oddychania przez następne 60 minut. Wymień wszystkie segmenty trwające co najmniej 15 s długości bez wąchania i pielęgnacji. Wykonuj pomiary temperatury ciała co 10 minut podczas korzystania z urządzenia do implantacji.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu wyjmij mysz z komory i umieść ją z powrotem w klatce. Cały sprzęt należy dokładnie wyczyścić i wytrzeć. Jeśli pozostaną kropelki wody, użyj sprężonego powietrza, aby je usunąć.</li>
</ol>
5. Analiza wzorca oddychania i metabolizmu
<ol>
	<li>Otwórz plik przeglądu pletyzmografii barometrycznej i zapoznaj się z zapisanymi notatkami dla interesującego Cię zwierzęcia.</li>
	<li>Otwórz panel metaboliczny w oprogramowaniu i zmierz średnią z pierwszych 10 minutO2 i CO2 , kiedy komora była pusta. Zapisz te wartości jako FiO2 i FiCO2.</li>
	<li>Wyświetl panel Przepływ w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Analizuj atrybuty i ustaw odpowiednie parametry. Na karcie Meta 1 wprowadź FiO2 i FiCO2 z kroku 5.2, a także przepływ do komory w Meta 2, aby obliczyć VO2 i VCO2.</li>
	<li>Aby zapoznać się z analizą wzorca oddychania, potwierdź czasy dla 15 sekund cichego oddychania, korzystając z notatek na temat zachowania zwierząt, a także śledzenia na panelu przepływu. Wprowadź czasy dla 15-sekundowych interwałów cichego oddychania w obszarze Otwórz okno dialogowe parsera danych na karcie Parser danych. Kliknij opcję Tryb widoku parsera, aby wyświetlić tylko określone interesujące Cię segmenty 15 sekund.</li>
	<li>Kliknij Zapisz przeanalizowane dane pochodne. Otwórz plik danych w arkuszu kalkulacyjnym, aby uzyskać dane z kosza.</li>
</ol>
6. Analiza bezdechów i przyspieszonych oddechów
<ol>
	<li>W otwartym pliku recenzji wyjdź z trybu widoku analizatora składni. Przejdź do opcji Graph Setup (Ustawienia wykresu) w obszarze Setup (Ustawienia > Ustawienia P3) i wybierz opcję Page View (Widok strony) w obszarze Type (Typ). Wybierz wartość 5 dla liczby okienek. Wprowadź -2 w polu oznaczonym Niski i 2 w polu oznaczonym Wysoki, aby uzyskać pomiary przepływu w mililitrach/sekundę. Zastosuj zmiany.</li>
	<li>Przewiń do znaku 30 minut na panelu śledzenia przepływu.</li>
	<li>Policz bezdechy i wzmocnione oddechy przez 30-60 minut po umieszczeniu myszy w komorze. Określ ilościowo okresy wstrzymanego oddychania trwające dłużej lub równe 0,5 s, wskazujące na bezdech. Wzmocnione oddechy są wskazywane przez gwałtowny wzrost śladu oddechowego powyżej 1,25 ml / s, po którym następuje gwałtowny spadek poniżej -0,75 ml / s.</li>
</ol>

<ol><li>DeRuisseau, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+deficits+contribute+to+respiratory+insufficiency+in+Pompe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).</li>
<li>Ogier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+expression+and+respiratory+function+improve+after+ampakine+treatment+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).</li>
<li>Ohshima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+ventilatory+response+during+light+and+dark+periods+and+the+involvement+of+histamine+H1+receptor+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice.</a> American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).</li>
<li>van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+affects+pulmonary+function+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice.</a> Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).</li>
<li>Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+and+noninvasive+methods+for+studying+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice.</a> Respiratory Research. 8, (2007).</li>
<li>Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+Blood+Sampling+in+Male+CD-1+and+C57BL%2F6J+Mice+with+1%25+Isoflurane+is+Similar+to+Awake+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice.</a> Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).</li>
<li>Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pattern+of+breathing+in+young+wild+type+and+Ts65Dn+mice+during+the+dark+and+light+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle.</a> FASEB Journal. 32 (1), (2018).</li>
<li>Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%2C+8th+edition%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saline+as+a+vehicle+control+does+not+alter+ventilation+in+male+CD-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice.</a> Physiological Reports. 6 (10), (2018).</li>
<li>Shanksy, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+behavioral+strategies%3A+Avoiding+interpretational+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls.</a> Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).</li>
<li>Kopp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotor+activity+rhythm+in+inbred+strains+of+mice%3A+implications+for+behavioural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies.</a> Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).</li>
<li>Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+measuring+spontaneous+physical+activity+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents.</a> American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).</li>
<li>Kabir, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+pattern+in+awake+rats%3A+Effects+of+motor+activity+and+of+alerting+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli.</a> Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).</li>
<li>Terada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilatory+long-term+facilitation+in+mice+can+be+observed+during+both+sleep+and+wake+periods+and+depends+on+orexin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).</li>
<li>Friedman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilatory+behavior+during+sleep+among+A%2FJ+and+C57BL%2F6J+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains.</a> Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).</li>
<li>Seifert, E. L., Mortola, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+pattern+of+breathing+in+conscious+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration+Physiology%22%5BJournal%5D)">The circadian pattern of breathing in conscious adult rats.</a> Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).</li>
<li>Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiet+breathing+in+hindlimb+casted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Physiology+%26+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Quiet breathing in hindlimb casted mice.</a> Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół dostarcza informacji na temat linii bazowej cichego oddychania u myszy, a także gromadzi dane na temat centralnych bezdechów i rozszerzonych oddechów. Reprezentatywne wyniki pokazują, że 10-minutowa cicha linia bazowa ma podobny wzorzec oddychania w porównaniu ze średnią z czterech 15-sekundowych napadów dla kohorty starych myszy. Co ważne, 15-sekundowe walki nie różnią się statystycznie, ani też te grupy nie różnią się od siebie różnicami za pomocą testu Levene'a. Dane te pokazują, że nawet jeden krótki atak je...

UBP to powszechna technika oceny wzorców oddychania1,2,3,4. W tej metodzie myszy umieszcza się w zamkniętej komorze, w której różnice ciśnień między komorą główną (w której trzymane jest zwierzę) a komorą referencyjną są filtrowane przez pneumotachograf w celu uzyskania wartości. Uzyskana w ten sposób konfiguracja UBP jest nieinwazyjna i nieskrępowana oraz pozwala na ocenę środków oddechowych bez konieczności znieczulenia lub operacji. Ponadto technika ta jest odpowiednia dla badań wymagających wielu pomiarów na tej samej myszy w czasie. Zmienne, takie jak częstotliwość oddychania, objętość oddechowa i wentylacja minutowa, można określić ilościowo za pomocą tej metody, podczas pojedynczej próby lub w kilku próbach. UBP dla całego ciała zapewnia również pomiary przepływów szczytowych i czasu trwania cyklu oddechowego. Razem parametry te określają ilościowo wzorzec oddychania. Zarejestrowane ślady oddechowe umożliwiają również przeglądanie danych i zliczanie liczby centralnych bezdechów wyświetlanych w danym okresie czasu. Liczba ta może być używana wraz z analizą objętości oddechowej i czasu wdechu, aby ocenić inne zmiany we wzorcu oddychania.
Chociaż istnieje kilka nieinwazyjnych technik pletyzmografii do bezpośredniej oceny parametrów fizjologicznych płuc, UBP całego ciała pozwala na badanie przesiewowe funkcji oddechowych przy minimalnym niepotrzebnym obciążeniu myszy. Pletyzmografia typu head-out, która wykorzystuje pomiary przepływu śródwydechowego w połowie oddechu i jest również nieinwazyjna, opiera się na powściągliwości, podobnie jak wiele innych rodzajów pletyzmografii (np. Pletyzmografia dwukomorowa). Podczas gdy metody te były stosowane w modelach gryzoni do pomiaru reakcji dróg oddechowych5, użycie obroży na szyję lub małych rurek ograniczających może zająć myszom (w porównaniu z innymi gatunkami) więcej czasu, aby przyzwyczaić się i przywrócić oddech do poziomu spoczynkowego.
Uzyskanie optymalnego segmentu oddychania powietrzem jest ważnym czynnikiem przy porównaniach linii bazowych. Coraz częstsze stosowanie dostępnych na rynku systemów pletyzmograficznych umożliwia zbieranie danych dotyczących wzorca oddychania w wielu laboratoriach. Co ważne, wzorzec oddychania jest zmienny przez cały okres zbierania, szczególnie u myszy. Mając to na uwadze, konieczna jest standaryzacja analizy wyjściowej jako sposób na zapewnienie, że poziom wyszkolenia eksperymentatorów nie zakłóca wyników. Istnieje wiele sposobów zbierania segmentu oddychania powietrzem, który służy jako jeden z obszarów różnic między projektami eksperymentalnymi. Jednym z przykładów jest uśrednienie danych z ostatnich 10–30 minut zgodnie z wcześniej zdefiniowanym zestawem czasu w chamber1, podczas gdy inna metoda polega na czekaniu, aż mysz będzie widocznie spokojna przez 5–10 minut6. Osiągnięcie tego ostatniego może zająć 2-3 godziny, a w niektórych przypadkach może być konieczne przerwanie próby, jeśli mysz nie jest spokojna wystarczająco długo. Ten problem jest szczególnie ważny w przypadku szczepów myszy, u których obserwowane zachowania są bardziej niespokojne i pobudliwe7. Myszy te mogą potrzebować więcej czasu, aby przystosować się do środowiska komory i zachować spokój tylko przez krótkie okresy czasu. Ograniczenie czasu poświęconego na zbieranie danych z linii bazowej standaryzuje czas pracy w komorze dla każdej myszy.
Kluczowe jest, aby eksperymentatorzy uzyskali odpowiedni punkt odniesienia, który obejmuje wartości zachowania spoczynkowego u myszy, ale także występuje w odpowiednim czasie. W związku z tym celem niniejszego raportu jest przedstawienie opisu metod stosowanych do uzyskania krótkich, cichych wartości wyjściowych parametrów oddychania u myszy. Co więcej, donosimy, że bezdechy i wzmocnione oddechy można określić ilościowo w ciągu pierwszej godziny w komorze.

<table><tbody><tr><td>Analizator dwutlenku węgla</td><td>AEI Technologies</td><td>CD-3A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik dwutlenku węgla AEI</td><td>Technologies</td><td>&nbsp; Komputer P-61B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>musi być zgodny z wymaganiami Ponemah</td>Koraliki Drierite PermaPure LLC DM-AR Kontrola przepływu AEI Technologies R-1 przepływomierz próżniowy TSI 4100 potrzebuje jednego na komorę i jednego do próżni Mieszalnik gazów MCQ Instruments GB-103 Gaz <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zbiorniki</td><td>Haun</td><td></td><td>100% tlenu, 100% dwutlenku węgla, 100% azotu - dopuszczone do kontaktu z żywnością lub wstępnie zmieszane zbiorniki do normalnych wyzwań związanych z powietrzem w pomieszczeniu i gazem</td></tr><tr><td>Analizator tlenu</td><td>AEI Technologies</td><td>S-3A</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik tlenu</td><td>AEI Technologies</td><td>&nbsp; </td> Rurki poliuretanowe N-22M <td></td></tr><tr><td></td><td>SMC</td><td>TUS 0604 Y-20</td><td></td></tr><tr><td>Ponemah Software</td><td>DSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mała komora na gryzonie</td><td>Termometr Buxco / DSI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(LifeChip System)Destron-Fearing</td><td></td><td></td> <td>Każdy rodzaj termometru do pomiaru dokładnej temperatury ciała jest odpowiedni, ale użycie wszczepialnych chipów pozwala na minimalne zakłócenia dla zwierzęcia podczas pobierania kilka pomiarów temperatury ciała podczas przebywania zwierzęcia w komorze UBP&nbsp;</td></tr><tr><td>Przetworniki</td><td>Validyne</td><td>DP45</td><td>wymagają jednego na komorę&nbsp;</td></tr><tr><td>System Pletyzmografii Całego Ciała&nbsp;</td><td>Data Science International (DSI)</td><td></td><td>Obejmuje ACQ-7700, sondy ciśnienia/temperatury itp.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej

Method to Obtain Pattern of Breathing in Senescent Mice through Unrestrained Barometric Plethysmography

Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna (UBP) to metoda ilościowego określania wzorca oddychania u myszy, gdzie częstotliwość oddychania, objętość oddechowa i minutowa wentylacja są rutynowo raportowane. Ponadto można zbierać informacje na temat wyjścia neuronalnego oddychania, w tym istnienia centralnych bezdechów i wzmocnionych oddechów. Ważną kwestią dla UBP jest uzyskanie segmentu oddechowego o minimalnym wpływie zachowań lękowych lub aktywnych, aby wyjaśnić reakcję na wyzwania związane z oddychaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który pozwala na uzyskanie krótkich, cichych linii bazowych u starszych myszy, porównywalnych z oczekiwaniem na dłuższe napady cichego oddychania. Stosowanie krótszych odcinków czasowych jest cenne, ponieważ niektóre szczepy myszy mogą być coraz bardziej pobudliwe lub niespokojne, a dłuższe okresy spokojnego oddychania mogą nie zostać osiągnięte w rozsądnych ramach czasowych. Umieściliśmy 22-miesięczne myszy w komorze UBP i porównaliśmy cztery 15-sekundowe segmenty cichego oddychania między minutami 60-120 z dłuższym 10-minutowym okresem spokojnego oddychania, który trwał 2-3 godziny. Uzyskaliśmy również liczbę centralnych bezdechów i wzmocnionych oddechów przed segmentami spokojnego oddychania, po 30-minutowym okresie zapoznawczym. Pokazujemy, że 10 minut spokojnego oddychania jest porównywalne ze znacznie krótszym czasem trwania wynoszącym 15 sekund. Dodatkowo, czas prowadzący do tych 15-sekundowych segmentów spokojnego oddychania może być wykorzystany do zebrania danych dotyczących bezdechów pochodzenia centralnego. Protokół ten pozwala badaczom zbierać dane dotyczące wzorca oddychania w określonym czasie i umożliwia ciche pomiary wyjściowe dla myszy, które mogą wykazywać zwiększoną ilość pobudliwego zachowania. Sama metodologia UBP zapewnia użyteczny i nieinwazyjny sposób zbierania danych o wzorcu oddychania i pozwala na testowanie myszy w kilku punktach czasowych.

Przedstawiono wyniki UBP jako oceny wzorca oddychania u 16 starych myszy (w wieku 22 miesięcy), przeprowadzonych w warunkach normalnego składu powietrza (20,93% O2 z zrównoważonym N2). Analiza obejmowała w pierwszej kolejności porównanie dłuższego, 10-minutowego segmentu oddechu spoczynkowego (którego uzyskanie trwało ponad 2 h) ze średnią z czterech krótkich, 15-sekundowych segmentów (ilościowo określonych w minutach 60–120). Reprezentatywny zapis przepływu oddechu spoczynkowego, w którym oddychani...

Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna służy do ilościowego określenia wzorca oddychania u obudzonych myszy. Pokazujemy, że 15-sekundowe segmenty w ustandaryzowanym protokole wyświetlają podobne wartości do wydłużonego czasu cichego oddychania. Metodologia ta pozwala również na ilościowe określenie bezdechu i przyspieszonych oddechów w ciągu pierwszej godziny w komorze.

Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej

Unrestrained barometric plethysmography (UBP) is a method for quantifying the pattern of breathing in mice, where breathing frequency, tidal volume, and ...

Protokół ten może być używany do pomiaru wzorców oddychania u myszy. Co ważne, może zminimalizować wpływ aktywnych zachowań w genetycznie zmodyfikowanych szczepach, które mogą zafałszować wyniki. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest nieinwazyjna i nie wymaga stosowania środków znieczulających lub wywołujących stres.Zacznij od upewnienia się, że wszystkie węże i rurki są podłączone do komory pletyzmografu barometrycznego oraz od podłączenia rurki doprowadzającej gaz i rurki odpływowej podciśnienia bezpośrednio do komory pletyzmografii barometrycznej. Aby skalibrować niski przepływ do komory, ustaw przepływ do i z komory na zero i wyjmij rurkę przepływową do komory. Wyłącz próżnię i wprowadź zero do dolnej komórki elementarnej, aby zarejestrować zerowy przepływ w konfiguracji wzmacniacza 7700 oprogramowania pletyzmografu barometrycznego.Następnie ponownie podłącz rurkę dopływową i włącz przepływ podciśnienia, aby skalibrować wysoki przepływ i umożliwić przepływ 20,93% azotu o zrównoważonym poziomie tlenu przez komorę pletyzmografii barometrycznej z mieszalnika gazów. Następnie przelicz wartość dopływu zmierzoną przez przepływomierz z litrów na minutę na mililitry na sekundę i kliknij komórkę jednostki wysokiej, aby wprowadzić wartość w mililitrach na sekundę. Kliknij dwukrotnie pozycję High Cal, zmień czas na trzy sekundy i kliknij przycisk Measure (Zmierz).Następnie pozostaw otwartą kartę ustawień wzmacniacza 7700, aby skalibrować analizatory metaboliczne z oprogramowaniem pletyzmografii barometrycznej. Aby skalibrować analizator metaboliczny, w programie mieszalnika gazów ustaw mieszalnik gazów na 20,93% tlenu i 79,07% azotu. A w analizatorze metabolicznym ustaw poziom kalibracji tlenu na 20,93%a dwutlenek węgla na 0%Przekręć pokrętło z powrotem, aby pobrać próbkę po wprowadzeniu odpowiednich wartości w analizatorach gazów, aby ustawić wysoki procent tlenu i niskiego stężenia dwutlenku węgla.Kliknij zakładkę ABCD 4 w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej i wprowadź 20.93 pod wysoką jednostką linii C2 dla tlenu. W obszarze Wysoka kalibracja zmień czas na trzy sekundy i kliknij przycisk Zmierz. Wprowadź zero pod niską kalkulacją linii C3 dla dwutlenku węgla.Następnie zmień czas na trzy sekundy i kliknij Zmierz pod niską kalkulacją. W programie mieszalnika gazów zmień wartość tlenu na 10%, a wartość dwutlenku węgla na 5% i poczekaj kilka minut, aż przepływ gazu dostosuje się do tych wartości. W analizatorach metabolicznych przekręć pokrętła regulacyjne, aby skalibrować dwutlenek węgla do 5%, uważając, aby po kalibracji wartości przekręcić pokrętło z powrotem na próbkę.Po sprawdzeniu, czy odczyty analizatora są stabilne, kliknij wysoką jednostkę pod C3 i wprowadź pięć dla dwutlenku węgla. Następnie zmień wysoką kalibrację na trzy sekundy i kliknij przycisk Zmierz. Kliknij niską jednostkę pod opcją C2 i wprowadź 10 dla tlenu, a następnie kliknij niska kalibracja, wprowadź trzy sekundy i kliknij Zmierz.Zmień mieszalnik gazów z powrotem na 20,93% tlenu i 79,07% azotu i poczekaj kilka minut, aż komora dostosuje się do tych wartości. Rutynowo przeprowadzaj dodatkowe kalibracje z certyfikowanymi zbiornikami gazu, aby potwierdzić, że mieszalnik przepływowy i analizatory tlenu i dwutlenku węgla działają prawidłowo. Po skalibrowaniu analizatorów metabolicznych należy ponownie sprawdzić przepływomierze podłączone do komory pletyzmografu barometrycznego i dostosować przepływ powietrza do i z komory do szybkości odpowiedniej dla eksperymentu.Gdy wszystkie ustawienia zostaną zastosowane do oprogramowania pletyzmografii barometrycznej, kliknij przycisk Zamknij na karcie Akwizycja. Naciśnij Rozpocznij akwizycję, nazwij plik i kliknij OK, aby rozpocząć nagrywanie. W przypadku nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej zapisz wagę i początkową temperaturę ciała myszy przed powrotem myszy do klatki domowej.Odczekaj 10 minut, aby zebrać dane dotyczące tlenu i dwutlenku węgla w tle z pustej komory przed umieszczeniem myszy w komorze. W ciągu pierwszej godziny udokumentuj zachowanie zwierzęcia, robiąc szczegółowe notatki, które zawierają konkretne wartości wdechu i odpływu z komory. Pod koniec habituacji w komorze obserwuj segmenty spokojnego oddychania przez następne 60 minut, wykonując pomiary temperatury ciała co 10 minut podczas korzystania z urządzenia do implantacji.Zadbaj o to, aby zapoznać się z ogólnymi zachowaniami myszy, aby można było odpowiednio zidentyfikować przypadki spokojnego oddychania bez wąchania, pielęgnacji lub eksploracji. Pod koniec eksperymentu włóż mysz z powrotem do klatki i dokładnie wyczyść i wytrzyj sprzęt. Aby przeprowadzić analizę metabolizmu, otwórz panel metaboliczny w oprogramowaniu i uzyskaj średnią z pierwszych 10 minut poziomu tlenu i dwutlenku węgla od momentu, gdy komora była pusta.Wyświetl panel przepływu w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej i kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Analizuj atrybut, aby ustawić odpowiednie parametry. Aby uzyskać wzorzec analizy oddechu, potwierdź czasy dla 15 sekund cichego oddychania, korzystając z notatek na temat zachowania zwierząt, a także śledzenia na panelu przepływu. Następnie wprowadź czasy w otwartym oknie dialogowym parsera na karcie parsera danych i kliknij Tryb widoku parsera, aby wyświetlić tylko określone 15-sekundowe segmenty, które Cię interesują.Aby przeanalizować bezdechy i przyspieszony oddech, w otwartym pliku przeglądu wyjdź z trybu widoku parsera i kliknij opcję Ustawienia P3 i Ustawienia wykresu, aby wybrać Widok strony jako typ i pięć jako liczbę paneli. Wprowadź minus dwa w polu oznaczonym jako niskie, a dwa w polu oznaczonym jako wysokie dla miar przepływu w mililitrach na sekundę i zastosuj zmiany. Następnie przewiń do znaku 30 minut na panelu śledzenia przepływu i ręcznie policz bezdechy i przyspieszone oddechy w okresie od 30 do 60 minut po umieszczeniu myszy w komorze.Na potrzeby tej analizy okresy wstrzymania oddechu trwające dłużej lub równe 0,5 sekundy wskazują na bezdech. Wzmocnione oddechy są wskazywane przez gwałtowny wzrost śladu oddechowego powyżej 1,25 mililitra na sekundę, po którym następuje gwałtowny spadek poniżej minus 0,75 mililitra na sekundę. To reprezentatywne śledzenie przepływu cichego oddechu u 22-miesięcznej myszy jest typowe dla wzorca, w którym oddychanie jest zgodne z brakiem aktywnych zachowań oddechowych.Ten wzorzec oddychania pochodzi z bardziej aktywnego segmentu, podczas którego myszy eksplorowały komorę, wąchając i/lub pielęgnując, i nie jest idealny dla rodzaju zbierania oddechów używanego w tej metodologii. Parametrami wybranymi do oceny możliwego wzorca różnic oddechowych między dwoma punktami czasowymi były: częstotliwość oddychania, objętość oddechowa, wentylacja minutowa, stosunek czasu wdechu objętości oddechowej oraz minutowy stosunek wydalanego dwutlenku węgla przez wentylację. Dalszą analizę przeprowadzono dla każdego z czterech 15-sekundowych segmentów linii bazowej pod kątem częstotliwości, objętości oddechowej, wentylacji minutowej, stosunku czasu wdechu objętości oddechowej i minutowego stosunku wydalanego dwutlenku węgla przez wentylację.Nie stwierdzono istotnych różnic między którymkolwiek z punktów czasowych ani różnic w zmienności między którymkolwiek z czterech segmentów czasowych dla jakiegokolwiek wzorca pomiaru oddychania. Kwantyfikacja liczby bezdechów i przyspieszonych oddechów obserwowanych dla każdego zwierzęcia w ciągu 30 do 60 minut nieskrępowanego protokołu pletyzmografii barometrycznej ujawniła, że starsze zwierzęta wykazywały dużą liczbę bezdechów i obecność zwiększonych oddechów w ciągu 30 minut. Naukowcy mogą również wykorzystać wyzwania gazowe, takie jak hipoksja lub hiperkapnia, aby udokumentować wszelkie zmiany we wzorcu oddychania wynikające z interwencji lub terapii.Technika ta zapewnia środki do scharakteryzowania wzorców oddychania u małych gryzoni i genetycznie zmodyfikowanych szczepów zwierząt, które mogą wykazywać wyraźne różnice behawioralne.

method-to-obtain-pattern-breathing-senescent-mice-through

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Ocena fizjologii układu oddechowego tradycyjnie opierała się na technikach, które wymagają unieruchomienia lub uspokojenia zwierzęcia. Nieskrępowana pletyzmografia całego ciała zapewnia jednak precyzyjną, nieinwazyjną, ilościową analizę fizjologii układu oddechowego w modelach zwierzęcych. Ponadto technika ta umożliwia wielokrotną ocenę układu oddechowego myszy, co pozwala na badania podłużne.

Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała

Ten artykuł przedstawia metodę wielokrotnych pomiarów wentylacji i aktywności mięśni oddechowych w swobodnie zachowującym się modelu myszy ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) podczas postępu choroby za pomocą pletyzmografii całego ciała i elektromiografii za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego.

Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Tutaj opisujemy dwie miary funkcji płuc - pletyzmografię barometryczną, która pozwala na pomiar objętości płuc, oraz kapnografię wolumetryczną, narzędzie do pomiaru anatomicznej martwej przestrzeni i jednorodności dróg oddechowych. Techniki te mogą być stosowane niezależnie lub w połączeniu do oceny funkcji dróg oddechowych przy różnych objętościach płuc.

Połączenie kapnografii wolumetrycznej i pletyzmografii barometrycznej w celu pomiaru zależności między strukturą a funkcją płuc

Nasze badanie skupia się na wpływie sygnalizacji leptyny w tętnicy szyjnej (CB) na niedotlenienie reakcji oddechowej (HVR). Przeprowadziliśmy eksperymenty "utraty funkcji" mierzące wpływ leptyny na HVR po odnerwieniu CB oraz eksperymenty "wzmocnienia funkcji" mierzące HVR po nadekspresji receptora leptyny w CB.

Eksperymentalne podejście do badania sygnalizacji leptyny w ciałach szyjnych i jej wpływu na kontrolę oddechu

Ten protokół przedstawia budowę i wykorzystanie uproszczonego aparatu do pletyzmografii całego ciała do nieinwazyjnego monitorowania postępu bakteryjnej choroby układu oddechowego.

Uproszczona pletyzmografia całego ciała w celu scharakteryzowania funkcji płuc podczas melioidozy oddechowej

Pokazujemy, jak obiektywna miara może być zastosowana w powszechnie stosowanym paradygmacie iluzji gumowej ręki. Miara ta jest uzyskiwana przez modyfikację dobrze ugruntowanego zadania kongruencji intermodalnej. Zadanie to pozwala na zbadanie procesów multisensorycznych, które są krytyczne dla modulacji reprezentacji ciała, jak w iluzji gumowej ręki.

Zadanie kongruencji intermodalnej jako sposób na uzyskanie obiektywnej miary behawioralnej w paradygmacie iluzji gumowej ręki

Zadania behawioralne, które pozwalają na ocenę zdolności percepcyjnych i sensomotorycznych w populacji ogólnej (tj. nie-muzykach) są przedstawione. Synchronizacja stukania palcami w rytm bodźców słuchowych i wykrywanie nieprawidłowości rytmicznych pozwala na wykrycie zaburzeń rytmu.

Odkrywanie głuchoty rytmu: wykrywanie zaburzeń rytmu za pomocą zsynchronizowanych zadań stukania palcami i percepcyjnego pomiaru czasu

Poznaj nieinwazyjną metodę pomiaru wzorców oddychania u myszy przy użyciu nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej. Technika ta eliminuje wpływ aktywnych zachowań i nie wymaga znieczulenia.

Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej

Przeglądaj więcej filmów