Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej
April 28th, 2020
Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna służy do ilościowego określenia wzorca oddychania u obudzonych myszy. Pokazujemy, że 15-sekundowe segmenty w ustandaryzowanym protokole wyświetlają podobne wartości do wydłużonego czasu cichego oddychania. Metodologia ta pozwala również na ilościowe określenie bezdechu i przyspieszonych oddechów w ciągu pierwszej godziny w komorze.
Protokół ten może być używany do pomiaru wzorców oddychania u myszy. Co ważne, może zminimalizować wpływ aktywnych zachowań w genetycznie zmodyfikowanych szczepach, które mogą zafałszować wyniki. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest nieinwazyjna i nie wymaga stosowania środków znieczulających lub wywołujących stres
.Zacznij od upewnienia się, że wszystkie węże i rurki są podłączone do komory pletyzmografu barometrycznego oraz od podłączenia rurki doprowadzającej gaz i rurki odpływowej podciśnienia bezpośrednio do komory pletyzmografii barometrycznej. Aby skalibrować niski przepływ do komory, ustaw przepływ do i z komory na zero i wyjmij rurkę przepływową do komory. Wyłącz próżnię i wprowadź zero do dolnej komórki elementarnej, aby zarejestrować zerowy przepływ w konfiguracji wzmacniacza 7700 oprogramowania pletyzmografu barometrycznego.
Następnie ponownie podłącz rurkę dopływową i włącz przepływ podciśnienia, aby skalibrować wysoki przepływ i umożliwić przepływ 20,93% azotu o zrównoważonym poziomie tlenu przez komorę pletyzmografii barometrycznej z mieszalnika gazów. Następnie przelicz wartość dopływu zmierzoną przez przepływomierz z litrów na minutę na mililitry na sekundę i kliknij komórkę jednostki wysokiej, aby wprowadzić wartość w mililitrach na sekundę. Kliknij dwukrotnie pozycję High Cal, zmień czas na trzy sekundy i kliknij przycisk Measure (Zmierz).
Następnie pozostaw otwartą kartę ustawień wzmacniacza 7700, aby skalibrować analizatory metaboliczne z oprogramowaniem pletyzmografii barometrycznej. Aby skalibrować analizator metaboliczny, w programie mieszalnika gazów ustaw mieszalnik gazów na 20,93% tlenu i 79,07% azotu. A w analizatorze metabolicznym ustaw poziom kalibracji tlenu na 20,93%a dwutlenek węgla na 0%Przekręć pokrętło z powrotem, aby pobrać próbkę po wprowadzeniu odpowiednich wartości w analizatorach gazów, aby ustawić wysoki procent tlenu i niskiego stężenia dwutlenku węgla.
Kliknij zakładkę ABCD 4 w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej i wprowadź 20.93 pod wysoką jednostką linii C2 dla tlenu. W obszarze Wysoka kalibracja zmień czas na trzy sekundy i kliknij przycisk Zmierz. Wprowadź zero pod niską kalkulacją linii C3 dla dwutlenku węgla.
Następnie zmień czas na trzy sekundy i kliknij Zmierz pod niską kalkulacją. W programie mieszalnika gazów zmień wartość tlenu na 10%, a wartość dwutlenku węgla na 5% i poczekaj kilka minut, aż przepływ gazu dostosuje się do tych wartości. W analizatorach metabolicznych przekręć pokrętła regulacyjne, aby skalibrować dwutlenek węgla do 5%, uważając, aby po kalibracji wartości przekręcić pokrętło z powrotem na próbkę.
Po sprawdzeniu, czy odczyty analizatora są stabilne, kliknij wysoką jednostkę pod C3 i wprowadź pięć dla dwutlenku węgla. Następnie zmień wysoką kalibrację na trzy sekundy i kliknij przycisk Zmierz. Kliknij niską jednostkę pod opcją C2 i wprowadź 10 dla tlenu, a następnie kliknij niska kalibracja, wprowadź trzy sekundy i kliknij Zmierz.
Zmień mieszalnik gazów z powrotem na 20,93% tlenu i 79,07% azotu i poczekaj kilka minut, aż komora dostosuje się do tych wartości. Rutynowo przeprowadzaj dodatkowe kalibracje z certyfikowanymi zbiornikami gazu, aby potwierdzić, że mieszalnik przepływowy i analizatory tlenu i dwutlenku węgla działają prawidłowo. Po skalibrowaniu analizatorów metabolicznych należy ponownie sprawdzić przepływomierze podłączone do komory pletyzmografu barometrycznego i dostosować przepływ powietrza do i z komory do szybkości odpowiedniej dla eksperymentu.
Gdy wszystkie ustawienia zostaną zastosowane do oprogramowania pletyzmografii barometrycznej, kliknij przycisk Zamknij na karcie Akwizycja. Naciśnij Rozpocznij akwizycję, nazwij plik i kliknij OK, aby rozpocząć nagrywanie. W przypadku nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej zapisz wagę i początkową temperaturę ciała myszy przed powrotem myszy do klatki domowej.
Odczekaj 10 minut, aby zebrać dane dotyczące tlenu i dwutlenku węgla w tle z pustej komory przed umieszczeniem myszy w komorze. W ciągu pierwszej godziny udokumentuj zachowanie zwierzęcia, robiąc szczegółowe notatki, które zawierają konkretne wartości wdechu i odpływu z komory. Pod koniec habituacji w komorze obserwuj segmenty spokojnego oddychania przez następne 60 minut, wykonując pomiary temperatury ciała co 10 minut podczas korzystania z urządzenia do implantacji.
Zadbaj o to, aby zapoznać się z ogólnymi zachowaniami myszy, aby można było odpowiednio zidentyfikować przypadki spokojnego oddychania bez wąchania, pielęgnacji lub eksploracji. Pod koniec eksperymentu włóż mysz z powrotem do klatki i dokładnie wyczyść i wytrzyj sprzęt. Aby przeprowadzić analizę metabolizmu, otwórz panel metaboliczny w oprogramowaniu i uzyskaj średnią z pierwszych 10 minut poziomu tlenu i dwutlenku węgla od momentu, gdy komora była pusta.
Wyświetl panel przepływu w oprogramowaniu pletyzmografii barometrycznej i kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Analizuj atrybut, aby ustawić odpowiednie parametry. Aby uzyskać wzorzec analizy oddechu, potwierdź czasy dla 15 sekund cichego oddychania, korzystając z notatek na temat zachowania zwierząt, a także śledzenia na panelu przepływu. Następnie wprowadź czasy w otwartym oknie dialogowym parsera na karcie parsera danych i kliknij Tryb widoku parsera, aby wyświetlić tylko określone 15-sekundowe segmenty, które Cię interesują.
Aby przeanalizować bezdechy i przyspieszony oddech, w otwartym pliku przeglądu wyjdź z trybu widoku parsera i kliknij opcję Ustawienia P3 i Ustawienia wykresu, aby wybrać Widok strony jako typ i pięć jako liczbę paneli. Wprowadź minus dwa w polu oznaczonym jako niskie, a dwa w polu oznaczonym jako wysokie dla miar przepływu w mililitrach na sekundę i zastosuj zmiany. Następnie przewiń do znaku 30 minut na panelu śledzenia przepływu i ręcznie policz bezdechy i przyspieszone oddechy w okresie od 30 do 60 minut po umieszczeniu myszy w komorze.
Na potrzeby tej analizy okresy wstrzymania oddechu trwające dłużej lub równe 0,5 sekundy wskazują na bezdech. Wzmocnione oddechy są wskazywane przez gwałtowny wzrost śladu oddechowego powyżej 1,25 mililitra na sekundę, po którym następuje gwałtowny spadek poniżej minus 0,75 mililitra na sekundę. To reprezentatywne śledzenie przepływu cichego oddechu u 22-miesięcznej myszy jest typowe dla wzorca, w którym oddychanie jest zgodne z brakiem aktywnych zachowań oddechowych.
Ten wzorzec oddychania pochodzi z bardziej aktywnego segmentu, podczas którego myszy eksplorowały komorę, wąchając i/lub pielęgnując, i nie jest idealny dla rodzaju zbierania oddechów używanego w tej metodologii. Parametrami wybranymi do oceny możliwego wzorca różnic oddechowych między dwoma punktami czasowymi były: częstotliwość oddychania, objętość oddechowa, wentylacja minutowa, stosunek czasu wdechu objętości oddechowej oraz minutowy stosunek wydalanego dwutlenku węgla przez wentylację. Dalszą analizę przeprowadzono dla każdego z czterech 15-sekundowych segmentów linii bazowej pod kątem częstotliwości, objętości oddechowej, wentylacji minutowej, stosunku czasu wdechu objętości oddechowej i minutowego stosunku wydalanego dwutlenku węgla przez wentylację.
Nie stwierdzono istotnych różnic między którymkolwiek z punktów czasowych ani różnic w zmienności między którymkolwiek z czterech segmentów czasowych dla jakiegokolwiek wzorca pomiaru oddychania. Kwantyfikacja liczby bezdechów i przyspieszonych oddechów obserwowanych dla każdego zwierzęcia w ciągu 30 do 60 minut nieskrępowanego protokołu pletyzmografii barometrycznej ujawniła, że starsze zwierzęta wykazywały dużą liczbę bezdechów i obecność zwiększonych oddechów w ciągu 30 minut. Naukowcy mogą również wykorzystać wyzwania gazowe, takie jak hipoksja lub hiperkapnia, aby udokumentować wszelkie zmiany we wzorcu oddychania wynikające z interwencji lub terapii.
Technika ta zapewnia środki do scharakteryzowania wzorców oddychania u małych gryzoni i genetycznie zmodyfikowanych szczepów zwierząt, które mogą wykazywać wyraźne różnice behawioralne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nieinwazyjną metodę ilościowego określania wzorców oddychania u czuwanych myszy przy użyciu nieograniczającej się pletyzmografii barometrycznej. Technika minimalizuje wpływ aktywnych zachowań, co sprawia, że jest odpowiednia dla szczepów genetycznie zmodyfikowanych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Fizjologia układu oddechowego
- Zachowanie zwierząt
Tło
- Wzorce oddychania są kluczowe dla zrozumienia funkcji oddechowych.
- Tradycyjne metody często wymagają środków znieczulających lub ograniczeń, które mogą wpływać na wyniki.
- Nieograniczająca się pletyzmografia barometryczna oferuje rozwiązanie tych ograniczeń.
- Ta metoda pozwala na monitorowanie oddychania w czasie rzeczywistym bez stresu.
Cel badania
- Opracowanie protokołu pomiaru wzorców oddychania u czuwanych myszy.
- Ocenienie wiarygodności krótkotrwałych pomiarów w porównaniu z dłuższymi.
- Ilościowe określenie określonych zdarzeń oddechowych, takich jak apnea i zwiększone oddechy.
Zastosowane metody
- Ustawianie komory pletyzmografii barometrycznej z dopływem gazu i odpływem próżni.
- Kalibracja niskiego przepływu do komory.
- Pomiar wzorców oddychania w standaryzowanych odcinkach czasowych.
- Analiza danych w celu identyfikacji wzorców oddechowych i zdarzeń.
Główne wyniki
- 15-sekundowe segmenty wzorców oddychania korelują z przedłużonymi okresami ciszego oddychania.
- Metodologia skutecznie ilościowo określa apnea i zwiększone oddechy.
- Wyniki pokazują wykonalność nieinwazyjnego monitorowania u czuwanych myszy.
Wnioski
- Nieograniczająca się pletyzmografia barometryczna jest niezawodną metodą badania wzorców oddechowych.
- To podejście może poprawić badania nad funkcją oddechową w różnych modelach mysich.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do badania reakcji oddechowych w różnych warunkach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Unrestrained barometric plethysmography enables noninvasive, quantitative assessment of respiratory patterns in awake mice, supporting mechanistic de-risking in preclinical respiratory and neuroscience target validation. The method provides reliable, short-duration baseline measurements that reduce behavioral confounding, improving data consistency for compound screening and pathway analysis in aged or excitable strains. This approach enhances predictive confidence in early discovery by quantifying breathing frequency, tidal volume, apneas, and augmented breaths without anesthetic or restraint artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies neural respiratory output including central apneas and augmented breaths to interrogate brainstem and neuromuscular targets.
- Operational Value: Enables repeated, non-stressful measurements in the same animal across time points for longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Provides baseline respiratory phenotypes to de-risk mechanistic hypotheses in aging, neurodegeneration, or neuromuscular disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative endpoints (tidal volume, minute ventilation, breathing frequency) for compound effect screening.
- Operational Value: Uses 15-second quiet breathing segments to achieve reliable baselines faster than prolonged waiting, increasing throughput in behavioral-sensitive strains.
- Assay Readiness: Supports platform reuse across studies by establishing consistent quiet breathing acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase respiratory phenotyping to preclinical validation by capturing disease-relevant breathing abnormalities in aged mice.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies apnea and augmented breath incidence to inform go/no-go decisions on targets affecting respiratory control.
- Mechanistic De-risking: Isolates neural vs. behavioral contributors to respiratory output, reducing false positives in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing respiratory phenotyping that informs mechanism-based compound selection and safety profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neural targets regulating respiratory rhythm by quantifying apneas and augmented breaths as functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible baseline measurements in awake mice, reducing variability from stress or movement.
- Analytics: Generates multiparametric outputs (frequency, volume, ventilation, ratios) for comparative analysis across genotypes or treatment conditions.
- Translational Research: Connects early respiratory phenotyping to preclinical continuity by modeling age-related breathing dysregulation in 22-month-old mice.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, noninvasive respiratory phenotyping workflow applicable across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity from anesthetic or restraint confounds.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through standardized quiet breathing segment acquisition and rapid baseline collection.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing early, translatable respiratory safety and efficacy signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on breathing pattern and neural respiratory control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology and behavioral observation to identify quiet breathing segments.
- Needs barometric plethysmography chamber, gas mixing system, flow and metabolic analyzers, and synchronized software for multiparametric recording.
- Demands cross-team standardization of quiet breathing definition and apnea/augmented breath scoring criteria.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, ages, and behavioral phenotypes affecting baseline acquisition time.
- Limited by the need for post-habituation waiting periods to capture natural quiet breathing, though mitigated by using short 15-second segments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Barometric Plethysmograph Chamber Calibration
1:46
Metabolic Analyzer Calibration
4:18
Unrestrained Barometric Plethysmography (UBP)
5:22
Metabolism and Breathing Pattern Analyses
6:07
Apneas and Augmented Breath Analysis
7:08
Results: Representative Mouse Breathing Pattern Analyses
8:42
Conclusion
