Name: Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę indukowalnej ekspresji specyficznej dla typu komórki w merystemach Arabidopsis thaliana przy użyciu systemu green gate. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę funkcji genów w biologii rozwoju roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w naszych laboratoriach jest wspierana przez granty Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) WO 1660/6-1 (dla S.W.) i GR 2104/4-1 (dla T.G.) i SFB1101 (dla T.G. i J.U.L) oraz przez grant konsolidacyjny Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (PLANTSTEMS 647148) dla T.G. S.W. jest wspierany przez stypendium Emmy Noether DFG poprzez Grant WO 1660/2.

<ol><li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp%2FLhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li>
<li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pOp%2FLhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li>
<li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li>
<li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pOp6%2FLhGR%3A+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li>
<li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li>
<li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible%2C+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li>
<li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li>
<li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGreen%3A+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABI-Kat+SimpleSearch%3A+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li>
<li>GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+%28SAQPCR%29%3A+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489(2013).</li>
<li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li>
<li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li>
<li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC%2FGFP%2FGUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9(2005).</li>
<li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li>
<li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-%2C+tissue-%2C+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy kroki niezbędne do wygenerowania i zastosowania wszechstronnego i wszechstronnego zestawu narzędzi do indukowalnej, specyficznej dla typu komórki transaktywacji. Krzyżowanie się linii przenoszących kasety efektorowe pod kontrolą promotora pOp z liniami sterującymi pozwala na badanie efektów błędnej ekspresji w pokoleniu F1, umożliwiając szybką ocenę zaburzeń genetycznych w szerokim zakresie typów komórek. Alternatywnie, konstrukty efektorowe mogą być używane do przekształcania li...

Głównym ograniczeniem w biologii w erze postgenomicznej jest rozszyfrowanie specyficznej dla kontekstu roli danego czynnika lub perturbacji genetycznej. Konstytutywne zaburzenia genetyczne, takie jak podejście polegające na utracie funkcji i wzmocnieniu funkcji, często pozwalają jedynie na analizę punktów końcowych procesów adaptacyjnych trwających całe życie, zacierając różnicę między skutkami pierwotnymi i wtórnymi. Ponadto funkcje specyficzne dla kontekstu mogą być maskowane lub osłabiane przez efekty na dużą skalę w odległych tkankach lub podczas innych faz rozwoju. Co więcej, w skrajnych przypadkach śmiertelność może wykluczyć jakikolwiek mechanistyczny wgląd. Idealnie, aby obejść te problemy, można by przeanalizować wpływ ostrych zaburzeń genetycznych w określonym kontekście, takim jak określony typ komórki, w sposób rozwiązany w czasie. Aby to osiągnąć, potrzebne są narzędzia genetyczne do indukowalnej, specyficznej dla typu komórki ekspresji1. Aby zapewnić zasoby do szybkiej oceny czasoprzestrzennej dynamiki odpowiedzi na dany efektor, połączyliśmy łatwość klonowania zapewnianą przez system GreenGate2 z udowodnioną skutecznością systemu GR-LhG43,4,5,6. Wygenerowaliśmy zestaw linii wyrażających chimeryczny czynnik transkrypcyjny LhG4 połączony z domeną wiążącą ligand receptora kortykoidowego szczura (GR) 7 pod kontrolą dobrze scharakteryzowanych promotorów specyficznych dla typu komórki8. W stanie spoczynku czynnik transkrypcyjny pozostaje poza jądrem, ponieważ domena GR jest związana przez cytozolowy HSP90. Po dodaniu syntetycznego ligandu deksametazonu (Dex) indukowana jest translokacja jądrowa, a LhG4 będzie pośredniczyć w transkrypcji kaset ekspresyjnych pod kontrolą pokrewnego syntetycznego promotora typu pOp, takiego jak reporter mTurquoise2 zawarty w liniach sterownika w celu wizualizacji domeny ekspresji po indukcji. W związku z tym linie sterujące technicznie zawierają również kasetę efektorową. Skrzyżowanie zestawu linii sterujących z linią przenoszącą kasetę efektorową z, na przykład, genem będącym przedmiotem zainteresowania pod kontrolą tego samego promotora typu pOp, pozwala zatem na szybką ocenę ostrych lub długoterminowych konsekwencji ekspresji efektorowej w szerokim zakresie typów komórek.
Tutaj udostępniamy protokół opisujący procedury niezbędne do wygenerowania linii sterownika i efektora oraz pokazujemy, jak można indukować i śledzić ekspresję specyficzną dla typu komórki w merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium Arabidopsis. Aby zilustrować sprawność i specyfikę tego podejścia, wykorzystujemy dobrze znany czynnik transkrypcyjny VND7, który jest w stanie ektopowo napędzać wtórne pogrubienia ściany komórkowej podobne do ksylemu9. Traktowanie F1 z krzyżówki między klasą pSCR 10,11 linią sterownika a linią efektora pOp6:VND7 prowadzi do powstania ektopowych komórek podobnych do ksylemu w komórkach osłonki skrobiowej łodygi Arabidopsis.
Aby ułatwić generowanie dużych zespołów DNA wymaganych do budowy plazmidów ekspresyjnych sterowników i efektorów, użyliśmy szybkiej i efektywnej metody klonowania GreenGate2. Klonowanie GreenGate opiera się na enzymach restrykcyjnych typu II S, takich jak Eco31I lub jego izoschizomer BsaI2. Enzymy te przecinają kolejne miejsca rozpoznawania asymetrycznego, tworząc nawisy o różnym składzie zasadowym. Poprzez włączenie miejsc restrykcyjnych Eco31I/BsaI do oligonukleotydów i przypisanie określonych sekwencji zwisów do elementów DNA, uzyskuje się klonowanie modułowe, ułatwiając generowanie dużych zespołów. W ramach GreenGate moduły DNA należą do kategorii A-F w oparciu o sekwencję zwisów, które służą jako adaptery i są montowane w tej kolejności. W związku z tym podkłady zaprojektowane w celu wzmocnienia pożądanego produktu powinny być zgodne z wybranym modułem2 (Rysunek 1A). Jeśli istnieje wewnętrzna lokalizacja Eco31I/BsaI, a sekwencja nie jest kompatybilna z modułami wejściowymi i docelowymi GreenGate, można kontynuować bez mutagenizacji, ale z mniejszą wydajnością. Alternatywnie, użyj mutagenezy ukierunkowanej w celu usunięcia miejsc restrykcyjnych Eco31I/BsaI, uważając, aby nie zmieniać aminokwasów w produktach genowych.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.1</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie kolumny Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>QIAquick PCR (250)</td><td></td></tr><tr><td>Komora hodowlana do obrazowania</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>1-dołkowa komora do hodowli tkankowej, na szkle nakrywkowym II</td><td></td></tr><tr><td>Desamethazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4903</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>D139-1</td><td></td></tr><tr><td>Eco31I</td> Kaniula iniekcyjna <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0294</td><td></td></tr><tr><td>(0,30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td><td>Sterican, Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda niebieski 63x zanurzenie w wodzie objectiv</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Duchefa, Haarlem, Holandia</td><td>M0221.0050</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&nbsp; 1.1 NA Obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Nikon, Minato, Tokio, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 35/10 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Niemcy</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 60/150 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Niemcy</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 120/120/17</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Niemcy</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>Agar roślinny</td><td>Duchefa, Haarlem, Holandia</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakcja plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>QIAprep Spin Miniprep Zestaw</td><td></td></tr> do przygotowania <tr><td>jodku propidyny (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td><td>7005115E</td><td></td></tr><tr><td>Probówki reakcyjne</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>AppliChem GmbH</td><td>3834.001</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfadiazyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6387</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>AppliChem GmbH</td><td>2228.0025</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza 5 U/&mikro; l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza 30 U/&mikro; l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0013</td><td></td></tr></tbody></table>

indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem lhgr

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Indukowalna, specyficzna tkankowo ekspresja jest ważnym i potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennej dynamiki perturbacji genetycznych. Łącząc elastyczny i wydajny system klonowania GreenGate ze sprawdzonym i przetestowanym systemem LhGR (tutaj określanym jako GR-LhG4) dla indukowalnej ekspresji, wygenerowaliśmy zestaw transgenicznych linii Arabidopsis, które mogą sterować ekspresją kasety efektorowej w szeregu określonych typów komórek w trzech głównych merystemach roślinnych. W tym celu wybraliśmy opracowany wcześniej system GR-LhG4 oparty na chimerycznym czynniku transkrypcyjnym i pokrewnym promotorze typu pOp, zapewniającym ścisłą kontrolę nad szerokim zakresem poziomów ekspresji. Ponadto, aby uwidocznić domenę ekspresji, w której aktywny jest syntetyczny czynnik transkrypcyjny, w liniach sterownika kodowany jest zlokalizowany przez ER fluorescencyjny reporter mTurquoise2 pod kontrolą promotora pOp4 lub pOp6. W tym miejscu opisujemy kroki niezbędne do wygenerowania linii sterującej lub efektorowej i pokazujemy, w jaki sposób można indukować i śledzić ekspresję specyficzną dla typu komórki w merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium Arabidopsis. Wykorzystując kilka lub wszystkie linie sterujące, można szybko ocenić kontekstowy efekt ekspresji jednego lub wielu czynników (efektorów) pod kontrolą syntetycznego promotora pOp, na przykład w zakładach F1 krzyżowania się jednego efektora i wielu linii sterownika. Przykładem tego podejścia jest ektopowa ekspresja VND7, czynnika transkrypcyjnego NAC zdolnego do indukowania ektopowego wtórnego odkładania się ściany komórkowej w sposób autonomiczny komórki.

Generowanie linii driver i efektorowych za pomocą klonowania GreenGate
System klonowania GreenGate opiera się na klonowaniu GoldenGate i wykorzystuje endonukleazę restrykcyjną typu IIS BsaI lub jej izoschizomer Eco31I. Ponieważ enzym ten generuje nadwiszące końce w odległości od asymetrycznej sekwencji rozpoznawania, skład zasad tych końców może być dowolnie wybrany, co stanowi podstawę modularności systemu. Każdy element wygenerowany metodą PCR, na przykład ...

Tutaj opisujemy wytwarzanie i zastosowanie zestawu transgenicznych linii Arabidopsis thaliana umożliwiających indukowalną, specyficzną tkankowo ekspresję w trzech głównych merystemach, merystemie wierzchołkowym pędu, merystemie wierzchołkowym korzenia i kambium.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Kluczowym celem biologii rozwoju jest zrozumienie kontekstowej roli genu. A to może być trudne do osiągnięcia przez konwencjonalne mutanty nokautujące lub konstytutywne linie nadekspresji. Wykorzystaliśmy modułowy system klonowania zielonej bramki do wygenerowania zasobu do indukowalnej ekspresji specyficznej dla cyto-jelita w trzech głównych merystemach modelowej rośliny Arabidopsis thaliana.Stosując tę samą modułową strategię klonowania, metodę tę można zastosować do innych gatunków roślin, które są niezmienne w procesie transformacji. Wizualna demonstracja tej procedury jest cenna, ponieważ analiza wpływu transaktywacji w merystemach łodygi i krótkiego wierzchołka wymaga sekcji przed obrazowaniem, co może być dość trudne. Na początek wysterylizuj nasiona zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie przygotuj pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog o pH 5,8 i dodaj jeden procent sacharozy i 0,9% agaru. Po autoklawowaniu dodać Dex rozpuszczony w DMSO do płytek indukcyjnych w końcowym stężeniu od 10 do 30 mikromolowych. Dodaj równą ilość DMSO do płytek kontrolnych.Umieść nasiona do obrazowania korzeni na płytkach i rozwarstwiaj je przez 48 godzin w ciemności i w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść płytki w pozycji pionowej w inkubatorze roślin i hoduj je przez pięć dni. Pięć dni po wykiełkowaniu użyj konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, aby zobrazować sadzonki.Aby rozpocząć, przygotuj i wyhoduj nasiona zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Sześć do siedmiu dni po wykiełkowaniu przenieś każdą sadzonkę do gleby w osobnej doniczce. Jeśli indukujesz rośliny przez podlewanie, użyj 25 mikromolowego roztworu DEX w wodzie, przygotowanego z zapasu 25 milimolowych DEX rozpuszczonych w etanolu.Podlewaj co dwa do trzech dni, aż do pożądanego czasu indukcji. W przypadku indukcji przez zanurzanie należy przygotować jednolitrową zlewkę z 750 mililitrami wody zawierającej 0,02% Silwet L77 i DEX o końcowym stężeniu 25 mikromolowym lub równoważnej ilości DMSO do leczenia DEX i próby. Zanurz pojedynczą roślinę w roztworze indukcyjnym lub próbnym na 30 sekund.Powtarzaj co dwa do trzech dni, aż do pożądanego czasu obrazowania. Aby rozpocząć, przygotuj i wyhoduj nasiona zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Sześć do siedmiu dni po wykiełkowaniu przenieś każdą sadzonkę do gleby w osobnej doniczce.Gdy łodyga ma około jednego centymetra długości, spryskaj fluorescencyjny SAM od 10 do 50 mikromolowym roztworem DEX w wodzie. W celu indukcji i obrazowania na późniejszych etapach rozwoju należy indukować SAM o dłuższych łodygach lub pędach bocznych. 24 do 48 godzin po indukcji należy przeciąć SAM i przystąpić do obrazowania.Najpierw przenieś sadzonki z płytki do roztworu jodku propidyny o stężeniu 10 mikrogramów na mililet i przeciwbarwić je przez pięć minut. Umieść korzenie w komorze obrazowania mikroskopowego i zobrazuj je za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem 63-krotnym zanurzeniem w wodzie. Aby zobrazować fluorescencję jodku propidyny, użyj długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i zbierz emisję od 590 do 660 nanometrów.W przypadku fluorescencji mTurquoise2 użyj wzbudzenia 458 nanometrów i zbierz emisję od 460 do 615 nanometrów za pomocą skanowania sekwencyjnego. Najpierw przymocuj łodygę palcem po przeciwnej stronie żądanej sekcji. Za pomocą żyletki wytnij segment o długości około trzech centymetrów i wykonaj kilka drobnych cięć.Opłucz żyletkę na szalce Petriego zawierającej wodę z kranu i zbierz kawałki łodygi. Albo zabarwić sekcje, albo zamontować je bezpośrednio na szkiełkach mikroskopowych. Do barwienia przygotuj jeden mililitr roztworu jodku propidyny o stężeniu 250 mikrogramów na mililitr w probówce reakcyjnej.Usuń wodę z kranu z szalki Petriego za pomocą pipety i zastąp ją roztworem jodku propidyny i plam przez pięć minut. Następnie usuń roztwór jodku propidyny i spłucz wodą. Za pomocą cienkich kleszczyków lub cienkiego pędzla przenieś poplamione fragmenty na szkiełka mikroskopowe.Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z soczewką zanurzaną w wodzie 25x, aby zobrazować próbki. Użyj światła laserowego o długości fali 561 nanometrów, aby wzbudzić fluorescencję jodku propidyny i zebrać emisję od 570 do 620 nanometrów. Użyj światła laserowego o długości 405 nanometrów, aby wzbudzić efektor fluoroforowy mTurquoise2 kodowany przez konstrukcje linii sterującej i zebrać emisję od 425 do 475 nanometrów.Najpierw użyj kleszczy, aby przeciąć łodygę dwa centymetry poniżej końcówki pędu. Trzymaj łodygę jedną ręką i użyj drobnych kleszczyków, aby usunąć pąki kwiatowe i duże zawiązki. Aby usunąć młode zawiązki, umieść SAM w pozycji pionowej na szalce Petriego zawierającej trzy procent agarozy.Następnie użyj lornetki i kleszczy, aby usunąć wszelkie młode zawiązki w pobliżu SAM. Przenieść rozcięty SAM do probówki zawierającej 250 mikrogramów na mililitr roztworu jodku propidyny. Pozostaw próbkę do barwienia przez pięć do 10 minut, upewniając się, że próbka pozostaje całkowicie zanurzona podczas procedury barwienia.Umieść poplamiony SAM na małej szalce Petriego zawierającej trzy procent pożywki agarozowej. Przykryj SAM wodą podwójnie destylowaną. Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w 25-krotną soczewkę zanurzeniową w wodzie, aby zobrazować wypreparowane SAM.Użyj światła laserowego o długości 561 nanometrów, aby wzbudzić fluorescencję jodku propidyny i zebrać emisje od 570 do 620 nanometrów. Użyj światła laserowego o długości 405 nanometrów, aby wzbudzić fluorofor mTurquoise2 i zebrać emisję od 425 do 475 nanometrów. Rejestruj stosy obrazów o długości 50 mikrometrów w kierunku Z z krokiem o wielkości 0,5 mikrometra.Indukcja za pomocą DEX prowadzi do specyficznej dla typu komórki ekspresji mTurquoise2 w endodermie korzenia, prekursorach łyka i kambium oraz komórkach macierzystych w merystemie wierzchołkowym pędu. Jako przypadek testowy transaktywacji generowana jest linia efektorowa kodująca wtórny główny czynnik transkrypcyjny ściany komórkowej VND7 połączony z domeną aktywacji V16. Po pięciu dniach pojedynczego leczenia 15 mikrolitrami DEX lub DMSO, skrawki łodygi są przygotowywane do wizualizacji ektopowego zdrewnienia w pochewce startowej.Początkowe komórki osłonki w próbkach indukowanych wykazują silny sygnał dla kanału jodku propidyny, a niektóre komórki wykazują typowe siatkowate pogrubienie ściany komórkowej w komórkach ksylemu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak indukować ekspresję genów w różnych tkankach i jak przygotować próbki do obrazowania. Zgodnie z tą procedurą, ustalone linie sterujące mogą być używane z szeroką gamą konstruktów efektorowych generowanych przez innych użytkowników zgodnie z ich zainteresowaniami badawczymi.Ten skrót powinien pomóc badaczom roślin w szybkiej ocenie wpływu ekspresji lub knockdownu genu będącego przedmiotem zainteresowania w określonym dla danego typu komórki w sposób zarezerwowany czasowo. Ten specyficzny dla typu komórki system indukcji wymaga użycia kortykosteroidu deksametazonu. Należy unikać bezpośredniego kontaktu, dlatego ważne jest, aby podczas zabiegu nosić rękawiczki i maskę na twarz.

inducible-cell-type-specific-expression-arabidopsis-thaliana-through

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

System Lateral Root Induible System (LRIS) pozwala na synchroniczną indukcję korzeni bocznych i jest prezentowany dla Arabidopsis thaliana i kukurydzy.

System indukowany korzeniami bocznymi u Arabidopsis i kukurydzy

Ten protokół przedstawia metodę obserwacji embriogenezy u Arabidopsis poprzez usuwanie zalążków, a następnie kontrolę tworzenia się wzorów zarodków pod mikroskopem.

Metoda charakteryzowania embriogenezy u Arabidopsis

Przedstawiono ulepszony protokół pomiaru przejściowej ekspresji genów z konstruktów reporterowych w komórkach aleuronowych jęczmienia po bombardowaniu cząsteczkami. Połączenie zautomatyzowanego mielenia ziarna z 96-dołkowymi testami enzymatycznymi na płytkach zapewnia wysoką wydajność zabiegu.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) oferuje możliwość analizowania programów rozwojowych przy minimalnym przetwarzaniu narządów i tkanek. Protokół zapewnia wysokiej jakości RNA z komórek ukierunkowanych na podjednostkę rybosomalną znakowaną zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Narzędzia do dalszej analizy, takie jak qRT-PCR lub sekwencja RNA, ujawniają profile ekspresji specyficzne dla typu tkanki i komórki.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) w celu zbadania rozwoju korzeni rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) w skali specyficznej dla typu komórki

Poznaj metodę indukowalnej ekspresji specyficznej dla typu komórki w merystemach Arabidopsis thaliana przy użyciu systemu green gate. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę funkcji genów w biologii rozwoju roślin.

Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Przeglądaj więcej filmów