Indukowalna, specyficzna dla typu komórki ekspresja u Arabidopsis thaliana poprzez transaktywację za pośrednictwem LhGR

Kluczowym celem biologii rozwoju jest zrozumienie kontekstowej roli genu. A to może być trudne do osiągnięcia przez konwencjonalne mutanty nokautujące lub konstytutywne linie nadekspresji. Wykorzystaliśmy modułowy system klonowania zielonej bramki do wygenerowania zasobu do indukowalnej ekspresji specyficznej dla cyto-jelita w trzech głównych merystemach modelowej rośliny Arabidopsis thaliana.

Stosując tę samą modułową strategię klonowania, metodę tę można zastosować do innych gatunków roślin, które są niezmienne w procesie transformacji. Wizualna demonstracja tej procedury jest cenna, ponieważ analiza wpływu transaktywacji w merystemach łodygi i krótkiego wierzchołka wymaga sekcji przed obrazowaniem, co może być dość trudne. Na początek wysterylizuj nasiona zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie przygotuj pożywkę o połowie mocy Murashige i Skoog o pH 5,8 i dodaj jeden procent sacharozy i 0,9% agaru. Po autoklawowaniu dodać Dex rozpuszczony w DMSO do płytek indukcyjnych w końcowym stężeniu od 10 do 30 mikromolowych. Dodaj równą ilość DMSO do płytek kontrolnych.

Umieść nasiona do obrazowania korzeni na płytkach i rozwarstwiaj je przez 48 godzin w ciemności i w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umieść płytki w pozycji pionowej w inkubatorze roślin i hoduj je przez pięć dni. Pięć dni po wykiełkowaniu użyj konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, aby zobrazować sadzonki.

Aby rozpocząć, przygotuj i wyhoduj nasiona zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Sześć do siedmiu dni po wykiełkowaniu przenieś każdą sadzonkę do gleby w osobnej doniczce. Jeśli indukujesz rośliny przez podlewanie, użyj 25 mikromolowego roztworu DEX w wodzie, przygotowanego z zapasu 25 milimolowych DEX rozpuszczonych w etanolu.

Podlewaj co dwa do trzech dni, aż do pożądanego czasu indukcji. W przypadku indukcji przez zanurzanie należy przygotować jednolitrową zlewkę z 750 mililitrami wody zawierającej 0,02% Silwet L77 i DEX o końcowym stężeniu 25 mikromolowym lub równoważnej ilości DMSO do leczenia DEX i próby. Zanurz pojedynczą roślinę w roztworze indukcyjnym lub próbnym na 30 sekund.

Powtarzaj co dwa do trzech dni, aż do pożądanego czasu obrazowania. Aby rozpocząć, przygotuj i wyhoduj nasiona zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Sześć do siedmiu dni po wykiełkowaniu przenieś każdą sadzonkę do gleby w osobnej doniczce.

Gdy łodyga ma około jednego centymetra długości, spryskaj fluorescencyjny SAM od 10 do 50 mikromolowym roztworem DEX w wodzie. W celu indukcji i obrazowania na późniejszych etapach rozwoju należy indukować SAM o dłuższych łodygach lub pędach bocznych. 24 do 48 godzin po indukcji należy przeciąć SAM i przystąpić do obrazowania.

Najpierw przenieś sadzonki z płytki do roztworu jodku propidyny o stężeniu 10 mikrogramów na mililet i przeciwbarwić je przez pięć minut. Umieść korzenie w komorze obrazowania mikroskopowego i zobrazuj je za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem 63-krotnym zanurzeniem w wodzie. Aby zobrazować fluorescencję jodku propidyny, użyj długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i zbierz emisję od 590 do 660 nanometrów.

W przypadku fluorescencji mTurquoise2 użyj wzbudzenia 458 nanometrów i zbierz emisję od 460 do 615 nanometrów za pomocą skanowania sekwencyjnego. Najpierw przymocuj łodygę palcem po przeciwnej stronie żądanej sekcji. Za pomocą żyletki wytnij segment o długości około trzech centymetrów i wykonaj kilka drobnych cięć.

Opłucz żyletkę na szalce Petriego zawierającej wodę z kranu i zbierz kawałki łodygi. Albo zabarwić sekcje, albo zamontować je bezpośrednio na szkiełkach mikroskopowych. Do barwienia przygotuj jeden mililitr roztworu jodku propidyny o stężeniu 250 mikrogramów na mililitr w probówce reakcyjnej.

Usuń wodę z kranu z szalki Petriego za pomocą pipety i zastąp ją roztworem jodku propidyny i plam przez pięć minut. Następnie usuń roztwór jodku propidyny i spłucz wodą. Za pomocą cienkich kleszczyków lub cienkiego pędzla przenieś poplamione fragmenty na szkiełka mikroskopowe.

Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z soczewką zanurzaną w wodzie 25x, aby zobrazować próbki. Użyj światła laserowego o długości fali 561 nanometrów, aby wzbudzić fluorescencję jodku propidyny i zebrać emisję od 570 do 620 nanometrów. Użyj światła laserowego o długości 405 nanometrów, aby wzbudzić efektor fluoroforowy mTurquoise2 kodowany przez konstrukcje linii sterującej i zebrać emisję od 425 do 475 nanometrów.

Najpierw użyj kleszczy, aby przeciąć łodygę dwa centymetry poniżej końcówki pędu. Trzymaj łodygę jedną ręką i użyj drobnych kleszczyków, aby usunąć pąki kwiatowe i duże zawiązki. Aby usunąć młode zawiązki, umieść SAM w pozycji pionowej na szalce Petriego zawierającej trzy procent agarozy.

Następnie użyj lornetki i kleszczy, aby usunąć wszelkie młode zawiązki w pobliżu SAM. Przenieść rozcięty SAM do probówki zawierającej 250 mikrogramów na mililitr roztworu jodku propidyny. Pozostaw próbkę do barwienia przez pięć do 10 minut, upewniając się, że próbka pozostaje całkowicie zanurzona podczas procedury barwienia.

Umieść poplamiony SAM na małej szalce Petriego zawierającej trzy procent pożywki agarozowej. Przykryj SAM wodą podwójnie destylowaną. Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w 25-krotną soczewkę zanurzeniową w wodzie, aby zobrazować wypreparowane SAM.

Użyj światła laserowego o długości 561 nanometrów, aby wzbudzić fluorescencję jodku propidyny i zebrać emisje od 570 do 620 nanometrów. Użyj światła laserowego o długości 405 nanometrów, aby wzbudzić fluorofor mTurquoise2 i zebrać emisję od 425 do 475 nanometrów. Rejestruj stosy obrazów o długości 50 mikrometrów w kierunku Z z krokiem o wielkości 0,5 mikrometra.

Indukcja za pomocą DEX prowadzi do specyficznej dla typu komórki ekspresji mTurquoise2 w endodermie korzenia, prekursorach łyka i kambium oraz komórkach macierzystych w merystemie wierzchołkowym pędu. Jako przypadek testowy transaktywacji generowana jest linia efektorowa kodująca wtórny główny czynnik transkrypcyjny ściany komórkowej VND7 połączony z domeną aktywacji V16. Po pięciu dniach pojedynczego leczenia 15 mikrolitrami DEX lub DMSO, skrawki łodygi są przygotowywane do wizualizacji ektopowego zdrewnienia w pochewce startowej.

Początkowe komórki osłonki w próbkach indukowanych wykazują silny sygnał dla kanału jodku propidyny, a niektóre komórki wykazują typowe siatkowate pogrubienie ściany komórkowej w komórkach ksylemu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak indukować ekspresję genów w różnych tkankach i jak przygotować próbki do obrazowania. Zgodnie z tą procedurą, ustalone linie sterujące mogą być używane z szeroką gamą konstruktów efektorowych generowanych przez innych użytkowników zgodnie z ich zainteresowaniami badawczymi.

Ten skrót powinien pomóc badaczom roślin w szybkiej ocenie wpływu ekspresji lub knockdownu genu będącego przedmiotem zainteresowania w określonym dla danego typu komórki w sposób zarezerwowany czasowo. Ten specyficzny dla typu komórki system indukcji wymaga użycia kortykosteroidu deksametazonu. Należy unikać bezpośredniego kontaktu, dlatego ważne jest, aby podczas zabiegu nosić rękawiczki i maskę na twarz.