Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji
April 11th, 2019
Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.
Ten fizjologicznie istotny chimeryczny model spontanicznych autoreaktywnych centrów rozrodczych pozwala na powiązanie lokalizacji komórkowej in vivo z dalszymi analizami molekularnymi. Główną zaletą mieszanego chimerycznego modelu autoreaktywnych centrów rozrodczych jest jego wszechstronny i marginalny charakter, pozwalający na badanie praktycznie każdego pożądanego podzbioru komórkowego lub szlaku molekularnego. Fizjologiczne znaczenie tego modelu rozwoju chorób autoimmunologicznych umożliwia nowe spostrzeżenia, które mogą pomóc w rozwoju nowych terapii.
Ten model chimery szpiku kostnego może być stosowany w immunologii, immunoonkologii i badaniach nad komórkami macierzystymi. Komponent fotoaktywacji ma szerokie zastosowanie, ponieważ łączy lokalizację tkanki z dalszą analizą komórek. Przygotowanie i rekonstytucja szpiku kostnego oraz etapy znakowania in vivo i eksplantacji tkanek to technicznie złożone procedury, które dobrze nadają się do wizualnych demonstracji.
Aby wydobyć kość udową i piszczelową myszy 564Igi dawcy, usuń skórę z jednej tylnej kończyny i wysuń stawy kolanowe i skokowe, mocno ciągnąc za stopę. Przystąp do złamania stawu skokowego. Następnie pociągnij stopę w kierunku ciała, trzymając się za kość piszczelową, pozbawiając w ten sposób ścięgna i mięśnie kości piszczelowej.
Złam staw kolanowy, aby uwolnić kość piszczelową i pociągnij kość w kierunku ciała, trzymając się za kość udową, aby usunąć ścięgna i mięśnie z kości udowej. Następnie wykonaj nacięcie w stawie biodrowym i przetnij ścięgna przed wyciągnięciem kości udowej z panewki biodrowej. Po usunięciu przeciwległych kości kończyn tylnych w podobny sposób, ostrożnie przetrzyj kości grubym ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną, a następnie opłucz odcięte kości w lodowatym buforze szpiku kostnego.
Następnie użyj kleszczy Dumonta numer siedem, aby przenieść kości do pojemnika ze świeżym buforem szpiku kostnego na lodzie. Aby wyekstrahować komórki szpiku kostnego, przepłucz moździerz w lodowatym buforze szpiku kostnego i użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby zastąpić bufor do przemywania 10 mililitrami świeżego, lodowatego buforu szpiku kostnego. Użyj kleszczy, aby przenieść kości do moździerza i użyj tłuczka, aby zmiażdżyć i zmielić kości, aby uwolnić szpik kostny.
Użyj 10-mililitrowej pipety, aby zebrać ekstrakt ze szpiku kostnego przed przepuszczeniem roztworu szpiku kostnego przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki na lodzie. Następnie przepłucz moździerz dodatkowymi 10 mililitrami świeżego, lodowatego buforu szpiku kostnego, aby zapewnić całkowitą regenerację komórek. Aby przygotować zawiesiny dawcy, należy wymieszać odpowiednie objętości fotoaktywowanego GFP i szpiku dawcy 564Igi w 50-mililitrowej stożkowej probówce i zagnieździć komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawiesić mieszany osad komórkowy w stężeniu od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr lodowatego buforu szpiku kostnego i przenieść komórki do wstępnie schłodzonej, 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy biorcy CD45.1 i przesuń rurkę z komórkami szpiku kostnego dawcy, aby zapewnić odpowiednie podwieszenie. Załaduj 200 mikrolitrów mieszanki szpiku kostnego do jednej strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra i rozmiarze 30 i delikatnie rozciągając skórę nad i pod okiem, delikatnie rozciągając skórę nad i pod okiem, aby lekko wysunąć oko.
Ostrożnie włożyć końcówkę strzykawki pod kątem około 30 stopni do przedniej części oczodołu, uważając, aby omijać oko i otaczające tkanki. Gdy końcówka igły dotknie kości podkreślającej oczodół, cofnij igłę na około 0,5 milimetra, a następnie użyj stałego nacisku, aby powoli wstrzyknąć szpik kostny dawcy. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z wodą z antybiotykiem ad libitum, monitorując aż do pełnego wyzdrowienia.
Aby oznaczyć węzeł chłonny podkolanowy, rozcieńczyć dwa mikrolitry znakowanego fikoerytryną szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD169 w 18 mikrolitrach PBS i dodać dwie 10-mikrolitrowe kropelki przeciwciała na kawałku plastikowej folii parafinowej. Załaduj każdą kroplę do pojedynczej strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 30 i wstrzyknij 10 mikrolitrów przeciwciała w poduszkę stopy znieczulonego zwierzęcia biorcę. Przed pobraniem węzła chłonnego umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe na płaskiej powierzchni i użyj próżniowej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów, wypełnionej smarem, aby obrysować krawędzie szkiełka nakrywkowego smarem około jednego do dwóch milimetrów od każdej krawędzi.
Przenieś komorę na zimną, płaską powierzchnię i napełnij komorę na tłuszcz próżniowy lodowatym buforem szpiku kostnego. Aby uzyskać dostęp do węzłów chłonnych podkolanowych, użyj prostych, cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze tuż pod kolanem uśpionego biorcy i przedłuż cięcie w górę wzdłuż linii ścięgna podkolanowego prawie do stawu biodrowego. Używając kleszczy Dumonta numer pięć lub siedem, pociągnij każdy z odsłoniętych płatów skóry na zewnątrz, aby odsłonić tkankę w dole podkolanowym, i użyj kleszczy, aby ostrożnie wejść do dołu tuż przyśrodkowo do żyły podkolanowej.
Otwórz i zamknij kleszcze wzdłuż osi nogi, aby odsłonić leżący pod spodem węzeł chłonny podkolanowy, a następnie użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć mięsień czworogłowy uda od przedniej strony proksymalnie do kolana, aby wysunąć węzeł chłonny z dołu. Wsuń kleszcze pod węzeł chłonny, aby uwolnić węzeł z otaczającej tkanki i umieść go w komorze na tłuszcz próżniowy. Po pobraniu drugiego węzła chłonnego umieść drugie szkiełko nakrywkowe na obrzeżu smaru próżniowego i delikatnie dociśnij, aby zamknąć komorę, uważając, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
Aby zidentyfikować centra rozrodcze w pobranych próbkach tkanki śledziony, umieść komorę obrazowania na stoliku dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego i użyj plastikowej pipety transferowej o pojemności 3,5 mililitra, aby umieścić kroplę wody destylowanej na górnej szkiełku nakrywkowym. Opuść obiektyw aż do punktu kontaktu i użyj przechodzącego światła, aby skupić się na górnej części tkanki. Przełącz się na tryb ciemny i wzbudzenie dwufotonowe, a następnie dostrój laser do 940 nanometrów.
Zlokalizuj poszczególne obszary białej miazgi otoczone barwieniem CD169 w pobliżu powierzchni tkanki i zidentyfikuj osłonkę limfoidalną okołotętnikową przez drugą generację harmonicznych związaną z tętniczką centralną. W strefie między osłonką limfoidalną okołotętnikową a strefą brzeżną zidentyfikuj obecność wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagów o barwieniu ciała i, korzystając z tych punktów orientacyjnych, narysuj obszar zainteresowania wokół pojedynczego obszaru centrum zarodkowego. Następnie ustaw stos Z o głębokości około 100 do 150 mikrometrów, zaczynając od powierzchni tkanki i używając kroku o wielkości około trzech mikrometrów, zanim przełączysz się na długość fali wzbudzenia 830 nanometrów.
Wyłącz lub przyciemnij wszystkie kanały, aby zapobiec fotouszkodzeniom detektorów, i zobrazuj stos. Następnie przełącz się z powrotem na długość fali wzbudzenia 940 nanometrów i ponownie otwórz kanały, skanując stos, aby potwierdzić wydajną fotoaktywację i brak fotouszkodzeń w całym stosie obrazów. Serotypowanie mieszanych chimer szpiku kostnego ujawnia znormalizowaną liczbę komórek B po sześciu tygodniach od rekonstytucji, z niską częstotliwością krążących komórek B 9D11 pochodzących z przedziału 564Igi.
W obrębie całkowitej bramki limfocytów występowała niska częstość występowania szczątkowych komórek pochodzących od biorcy, z których około 6% pochodzi z CD45.1, co wskazuje na ogólny stopień chimeryzmu wynoszący około 94%W przedziale komórek B występował praktycznie całkowity chimeryzm i dominacja fotoaktywowanych komórek B pochodzących ze szpiku kostnego GFP, co jest konsekwencją ciężkiej negatywnej selekcji komórek B pochodzących z 564Igi. Jak zaobserwowano, znakowanie in vivo za pomocą CD169 ułatwia solidną wizualizację strefy brzeżnej. Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w elementach strukturalnych zawierających kolagen i głównych naczyniach, w tym w centralnej tętniczce okołotętniczkowej osłonki limfatycznej i wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagach zabarwiających ciało związanych z aktywnością centrum zarodkowego.
Podsumowując, dane te pozwalają na identyfikację obszaru zainteresowania, który prawdopodobnie zawiera pojedyncze, fotoaktywowane centrum rozrodcze. Ocena cytometrii przepływowej w dół dodatkowo potwierdza obecność znormalizowanej liczby przedziałów komórek B, spontanicznej populacji centrum rozrodczego i podzbioru fotoaktywowanych komórek B centrum rozrodczego. Ważne jest, aby ograniczyć całkowity czas realizacji etapów eksplantacji, fotoaktywacji i przetwarzania tkanek do czterech do sześciu godzin, aby zapewnić wystarczającą żywotność komórek.
Fotoaktywowane komórki można sortować przepływowo i poddawać sekwencjonowaniu pojedynczych komórek, aby na przykład scharakteryzować repertuar receptorów komórek B pojedynczego centrum rozrodczego. Model chimery mieszanej pozwolił na zbadanie biologii autoreaktywnych centrów rozrodczych na nowej głębokości, na przykład dostarczając informacji o tym, jak przebiega proces rozprzestrzeniania się epitopów. Należy pamiętać, że źródłem światła do mikroskopii dwufotonowej są bardzo silne lasery impulsowe klasy 4, które mogą poważnie uszkodzić oczy.
Przegląd
Ten protokół szczegółowo opisuje generację mieszanych chimer kostnomózgowych myszy z spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami germinalnymi, zawierającymi autoreaktywne limfocyty z fotoaktywowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym (PA-GFP) jako reporterem. Ten model ułatwia korelację lokalizacji komórkowej in vivo z późniejszymi analizami molekularnymi.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Autoimmunologia
- Badania nad komórkami macierzystymi
Tło
- Model zapewnia wgląd w rozwój chorób autoimmunologicznych.
- Umożliwia wszechstronne badanie podzbiorów komórek i szlaków molekularnych.
- Fotoaktywacja łączy lokalizację tkankową z późniejszą analizą komórkową.
- Techniczna złożoność sprawia, że jest odpowiedni do wizualnych demonstracji.
Cel badania
- Stworzenie modelu chimerycznego do badania autoreaktywnych centrów germinalnych.
- Poprawa rozumienia lokalizacji komórkowej i interakcji molekularnych in vivo.
- Zaawansowanie potencjalnych terapii chorób autoimmunologicznych.
Stosowane metody
- Ekstrakcja kości udowej i piszczelowej myszy donora do przygotowania kostnego mózgu.
- Ekstrakcja komórek kostnego mózgu i przygotowanie zawiesin donorskich.
- Wstrzyknięcie kostnego mózgu donora do myszy odbiorczych.
- Znakowanie i zbieranie węzłów chłonnych do analizy.
Główne wyniki
- Sukcesywne generowanie mieszanych chimer kostnomózgowych.
- Skuteczna korelację lokalizacji komórkowej z analizami molekularnymi.
- Wykazanie fizjologicznego znaczenia modelu chimerycznego.
- Wgląd w dynamikę autoreaktywnych limfocytów.
Wnioski
- Model zapewnia cenne narzędzie do badania odpowiedzi autoimmunologicznych.
- Umożliwia nowe wglądy w mechanizmy rozwoju chorób.
- Potencjalne zastosowania w immunologii i rozwoju terapii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This approach enables precise interrogation of autoreactive germinal centers by linking in vivo cellular localization with downstream molecular analysis, addressing a critical gap in autoimmune disease mechanism elucidation. The chimeric model provides physiological relevance for studying spontaneous germinal center formation, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By enabling single-germinal-center resolution, it enhances predictive confidence in B-cell receptor repertoire and epitope spreading studies, informing portfolio decisions in immunology and autoimmune therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of individual autoreactive germinal centers to clarify pathogenic B-cell subsets and molecular drivers of autoimmunity.
- Operational Value: Links spatial cellular localization in lymphoid tissue with molecular phenotypes, supporting hypothesis testing of autoimmune mechanisms.
- Therapeutic Value: Facilitates identification of clonal B-cell populations involved in epitope spreading, informing target selection for biologic intervention.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates photoactivated lymphocytes from single germinal centers for flow cytometric sorting and single-cell sequencing, enabling high-resolution immune profiling.
- Operational Value: Standardizes isolation of germinal center-derived B cells for reproducible downstream molecular and functional assays.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems suitable for antigen specificity, receptor signaling, and clonal expansion analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling mechanistic analysis of autoreactive lymphocytes in a disease-relevant system.
- Predictive Confidence: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., clonal frequency, activation state) that help assess target engagement and biological de-risking.
- Preclinical Model: The mixed chimera model serves as a physiologically relevant platform for evaluating immunomodulatory interventions prior to lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven interrogation of germinal center biology, supporting lead identification through mechanistic de-risking of autoimmune targets, and informing preclinical continuity via translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking germinal center localization with B-cell receptor repertoire and functional state.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible isolation of photoactivated germinal center B cells for antigen specificity and signaling profiling.
- Analytics: Generates quantitative flow cytometric and sequencing readouts that allow comparison of clonal dynamics across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling biomarker-aligned analysis of autoreactive B-cell subsets in a spontaneous autoimmunity model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying cellular subsets and molecular pathways across immunology, immuno-oncology, and stem cell applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in autoreactive germinal center biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined photoactivation and cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets based on clonal and functional insights from single germinal centers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying high-confidence therapeutic targets through mechanistic dissection of autoimmune responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow transplantation, two-photon microscopy, and flow cytometric cell sorting.
- Depends on specialized instrumentation including two-photon lasers, microinjectors, and vacuum grease chambers for lymph node harvesting.
- Necessitates cross-team standardization for consistent photoactivation depth, timing, and tissue processing to maintain cell viability.
- Involves adaptation considerations when applying the model to non-lymphoid tissues or alternative disease models beyond autoimmunity.
- Limited by the technical complexity of bone marrow preparation and the four- to six-hour window for explantation and processing to preserve cell integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:16
Bone Harvest
2:26
Bone Marrow Cell Extraction
3:16
Bone Marrow Recipient Reconstitution
4:48
Popliteal Lymph Node Labelling and Harvest
6:54
Single Splenic Germinal Center Identification
8:43
Results: Representative Germinal Center Photoactivation
10:19
Conclusion
