Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji
11 kwietnia 2019
Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.
Ten fizjologicznie istotny chimeryczny model spontanicznych autoreaktywnych centrów rozrodczych pozwala na powiązanie lokalizacji komórkowej in vivo z dalszymi analizami molekularnymi. Główną zaletą mieszanego chimerycznego modelu autoreaktywnych centrów rozrodczych jest jego wszechstronny i marginalny charakter, pozwalający na badanie praktycznie każdego pożądanego podzbioru komórkowego lub szlaku molekularnego. Fizjologiczne znaczenie tego modelu rozwoju chorób autoimmunologicznych umożliwia nowe spostrzeżenia, które mogą pomóc w rozwoju nowych terapii.
Ten model chimery szpiku kostnego może być stosowany w immunologii, immunoonkologii i badaniach nad komórkami macierzystymi. Komponent fotoaktywacji ma szerokie zastosowanie, ponieważ łączy lokalizację tkanki z dalszą analizą komórek. Przygotowanie i rekonstytucja szpiku kostnego oraz etapy znakowania in vivo i eksplantacji tkanek to technicznie złożone procedury, które dobrze nadają się do wizualnych demonstracji.
Aby wydobyć kość udową i piszczelową myszy 564Igi dawcy, usuń skórę z jednej tylnej kończyny i wysuń stawy kolanowe i skokowe, mocno ciągnąc za stopę. Przystąp do złamania stawu skokowego. Następnie pociągnij stopę w kierunku ciała, trzymając się za kość piszczelową, pozbawiając w ten sposób ścięgna i mięśnie kości piszczelowej.
Złam staw kolanowy, aby uwolnić kość piszczelową i pociągnij kość w kierunku ciała, trzymając się za kość udową, aby usunąć ścięgna i mięśnie z kości udowej. Następnie wykonaj nacięcie w stawie biodrowym i przetnij ścięgna przed wyciągnięciem kości udowej z panewki biodrowej. Po usunięciu przeciwległych kości kończyn tylnych w podobny sposób, ostrożnie przetrzyj kości grubym ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną, a następnie opłucz odcięte kości w lodowatym buforze szpiku kostnego.
Następnie użyj kleszczy Dumonta numer siedem, aby przenieść kości do pojemnika ze świeżym buforem szpiku kostnego na lodzie. Aby wyekstrahować komórki szpiku kostnego, przepłucz moździerz w lodowatym buforze szpiku kostnego i użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby zastąpić bufor do przemywania 10 mililitrami świeżego, lodowatego buforu szpiku kostnego. Użyj kleszczy, aby przenieść kości do moździerza i użyj tłuczka, aby zmiażdżyć i zmielić kości, aby uwolnić szpik kostny.
Użyj 10-mililitrowej pipety, aby zebrać ekstrakt ze szpiku kostnego przed przepuszczeniem roztworu szpiku kostnego przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki na lodzie. Następnie przepłucz moździerz dodatkowymi 10 mililitrami świeżego, lodowatego buforu szpiku kostnego, aby zapewnić całkowitą regenerację komórek. Aby przygotować zawiesiny dawcy, należy wymieszać odpowiednie objętości fotoaktywowanego GFP i szpiku dawcy 564Igi w 50-mililitrowej stożkowej probówce i zagnieździć komórki przez odwirowanie.
Ponownie zawiesić mieszany osad komórkowy w stężeniu od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr lodowatego buforu szpiku kostnego i przenieść komórki do wstępnie schłodzonej, 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy biorcy CD45.1 i przesuń rurkę z komórkami szpiku kostnego dawcy, aby zapewnić odpowiednie podwieszenie. Załaduj 200 mikrolitrów mieszanki szpiku kostnego do jednej strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra i rozmiarze 30 i delikatnie rozciągając skórę nad i pod okiem, delikatnie rozciągając skórę nad i pod okiem, aby lekko wysunąć oko.
Ostrożnie włożyć końcówkę strzykawki pod kątem około 30 stopni do przedniej części oczodołu, uważając, aby omijać oko i otaczające tkanki. Gdy końcówka igły dotknie kości podkreślającej oczodół, cofnij igłę na około 0,5 milimetra, a następnie użyj stałego nacisku, aby powoli wstrzyknąć szpik kostny dawcy. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z wodą z antybiotykiem ad libitum, monitorując aż do pełnego wyzdrowienia.
Aby oznaczyć węzeł chłonny podkolanowy, rozcieńczyć dwa mikrolitry znakowanego fikoerytryną szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD169 w 18 mikrolitrach PBS i dodać dwie 10-mikrolitrowe kropelki przeciwciała na kawałku plastikowej folii parafinowej. Załaduj każdą kroplę do pojedynczej strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 30 i wstrzyknij 10 mikrolitrów przeciwciała w poduszkę stopy znieczulonego zwierzęcia biorcę. Przed pobraniem węzła chłonnego umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe na płaskiej powierzchni i użyj próżniowej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów, wypełnionej smarem, aby obrysować krawędzie szkiełka nakrywkowego smarem około jednego do dwóch milimetrów od każdej krawędzi.
Przenieś komorę na zimną, płaską powierzchnię i napełnij komorę na tłuszcz próżniowy lodowatym buforem szpiku kostnego. Aby uzyskać dostęp do węzłów chłonnych podkolanowych, użyj prostych, cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze tuż pod kolanem uśpionego biorcy i przedłuż cięcie w górę wzdłuż linii ścięgna podkolanowego prawie do stawu biodrowego. Używając kleszczy Dumonta numer pięć lub siedem, pociągnij każdy z odsłoniętych płatów skóry na zewnątrz, aby odsłonić tkankę w dole podkolanowym, i użyj kleszczy, aby ostrożnie wejść do dołu tuż przyśrodkowo do żyły podkolanowej.
Otwórz i zamknij kleszcze wzdłuż osi nogi, aby odsłonić leżący pod spodem węzeł chłonny podkolanowy, a następnie użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć mięsień czworogłowy uda od przedniej strony proksymalnie do kolana, aby wysunąć węzeł chłonny z dołu. Wsuń kleszcze pod węzeł chłonny, aby uwolnić węzeł z otaczającej tkanki i umieść go w komorze na tłuszcz próżniowy. Po pobraniu drugiego węzła chłonnego umieść drugie szkiełko nakrywkowe na obrzeżu smaru próżniowego i delikatnie dociśnij, aby zamknąć komorę, uważając, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
Aby zidentyfikować centra rozrodcze w pobranych próbkach tkanki śledziony, umieść komorę obrazowania na stoliku dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego i użyj plastikowej pipety transferowej o pojemności 3,5 mililitra, aby umieścić kroplę wody destylowanej na górnej szkiełku nakrywkowym. Opuść obiektyw aż do punktu kontaktu i użyj przechodzącego światła, aby skupić się na górnej części tkanki. Przełącz się na tryb ciemny i wzbudzenie dwufotonowe, a następnie dostrój laser do 940 nanometrów.
Zlokalizuj poszczególne obszary białej miazgi otoczone barwieniem CD169 w pobliżu powierzchni tkanki i zidentyfikuj osłonkę limfoidalną okołotętnikową przez drugą generację harmonicznych związaną z tętniczką centralną. W strefie między osłonką limfoidalną okołotętnikową a strefą brzeżną zidentyfikuj obecność wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagów o barwieniu ciała i, korzystając z tych punktów orientacyjnych, narysuj obszar zainteresowania wokół pojedynczego obszaru centrum zarodkowego. Następnie ustaw stos Z o głębokości około 100 do 150 mikrometrów, zaczynając od powierzchni tkanki i używając kroku o wielkości około trzech mikrometrów, zanim przełączysz się na długość fali wzbudzenia 830 nanometrów.
Wyłącz lub przyciemnij wszystkie kanały, aby zapobiec fotouszkodzeniom detektorów, i zobrazuj stos. Następnie przełącz się z powrotem na długość fali wzbudzenia 940 nanometrów i ponownie otwórz kanały, skanując stos, aby potwierdzić wydajną fotoaktywację i brak fotouszkodzeń w całym stosie obrazów. Serotypowanie mieszanych chimer szpiku kostnego ujawnia znormalizowaną liczbę komórek B po sześciu tygodniach od rekonstytucji, z niską częstotliwością krążących komórek B 9D11 pochodzących z przedziału 564Igi.
W obrębie całkowitej bramki limfocytów występowała niska częstość występowania szczątkowych komórek pochodzących od biorcy, z których około 6% pochodzi z CD45.1, co wskazuje na ogólny stopień chimeryzmu wynoszący około 94%W przedziale komórek B występował praktycznie całkowity chimeryzm i dominacja fotoaktywowanych komórek B pochodzących ze szpiku kostnego GFP, co jest konsekwencją ciężkiej negatywnej selekcji komórek B pochodzących z 564Igi. Jak zaobserwowano, znakowanie in vivo za pomocą CD169 ułatwia solidną wizualizację strefy brzeżnej. Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w elementach strukturalnych zawierających kolagen i głównych naczyniach, w tym w centralnej tętniczce okołotętniczkowej osłonki limfatycznej i wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagach zabarwiających ciało związanych z aktywnością centrum zarodkowego.
Podsumowując, dane te pozwalają na identyfikację obszaru zainteresowania, który prawdopodobnie zawiera pojedyncze, fotoaktywowane centrum rozrodcze. Ocena cytometrii przepływowej w dół dodatkowo potwierdza obecność znormalizowanej liczby przedziałów komórek B, spontanicznej populacji centrum rozrodczego i podzbioru fotoaktywowanych komórek B centrum rozrodczego. Ważne jest, aby ograniczyć całkowity czas realizacji etapów eksplantacji, fotoaktywacji i przetwarzania tkanek do czterech do sześciu godzin, aby zapewnić wystarczającą żywotność komórek.
Fotoaktywowane komórki można sortować przepływowo i poddawać sekwencjonowaniu pojedynczych komórek, aby na przykład scharakteryzować repertuar receptorów komórek B pojedynczego centrum rozrodczego. Model chimery mieszanej pozwolił na zbadanie biologii autoreaktywnych centrów rozrodczych na nowej głębokości, na przykład dostarczając informacji o tym, jak przebiega proces rozprzestrzeniania się epitopów. Należy pamiętać, że źródłem światła do mikroskopii dwufotonowej są bardzo silne lasery impulsowe klasy 4, które mogą poważnie uszkodzić oczy.
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje generowanie mieszanych chimer szpiku kostnego myszy z samoistnymi autoimmunologicznymi centrami rozmnażania, w których autoreaktywne limfocyty posiadają reporter w postaci fotoaktywowanej zielonej białka fluorescencyjnego (PA-GFP). Model ten umożliwia korelację lokalizacji komórkowej in vivo z późniejszymi analizami molekularnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Autoimmunologia
- Badania nad komórkami macierzystymi
Wstęp
- Model ten dostarcza informacji na temat rozwoju chorób autoimmunologicznych.
- Umożliwia on wszechstronną analizę subpopulacji komórkowych i szlaków molekularnych.
- Fotoaktywacja wiąże lokalizację w tkance z późniejszą analizą komórek.
- Złożoność techniczna sprawia, że model ten nadaje się do demonstracji wizualnych.
Cel badania
- Stworzenie modelu chimerycznego do badania autoreaktywnych centrów rozmnażania.
- Pogłębienie zrozumienia lokalizacji komórkowej i oddziaływań molekularnych in vivo.
- Rozwój potencjalnych terapii chorób autoimmunologicznych.
Zastosowane metody
- Wyizolowanie kości udowej i piszczelowej myszy donora w celu przygotowania szpiku kostnego.
- Izolacja komórek szpiku kostnego i przygotowanie zawiesin donora.
- Iniekcja szpiku kostnego donora do myszy biorców.
- Oznakowanie i pobranie węzłów chłonnych do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczne generowanie mieszanych chimer szpiku kostnego.
- Efektywne powiązanie lokalizacji komórkowej z analizami molekularnymi.
- Wykazanie istotności fizjologicznej modelu chimerycznego.
- Wnioski dotyczące dynamiki limfocytów autoreaktywnych.
Wnioski
- Model ten stanowi cenne narzędzie do badania odpowiedzi autoimmunologicznych.
- Umożliwia on uzyskanie nowych informacji na temat mechanizmów rozwoju choroby.
- Potencjalne zastosowania w immunologii i opracowywaniu terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podejście to umożliwia precyzyjną analizę autoreaktywnych ośrodków rozmnażania poprzez powiązanie lokalizacji komórkowej in vivo z późniejszą analizą molekularną, co pozwala wypełnić krytyczną lukę w wyjaśnianiu mechanizmów chorób autoimmunologicznych. Model chimeryczny zapewnia istotność fizjologiczną w badaniu spontanicznego tworzenia się ośrodków rozmnażania, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Dzięki możliwości rozdzielczości na poziomie pojedynczego ośrodka rozmnażania, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad repertuarem receptorów komórek B oraz rozprzestrzenianiem epitopów, co dostarcza istotnych informacji dla decyzji portfelowych w immunologii i rozwoju terapii autoimmunologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie poszczególnych autoreaktywnych centrów rozmnażania w celu doprecyzowania patogennych subpopulacji limfocytów B oraz molekularnych czynników napędzających autoimmunizację.
- Wartość operacyjna: Łączy przestrzenną lokalizację komórek w tkance limfatycznej z fenotypami molekularnymi, co wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów autoimmunologicznych.
- Wartość terapeutyczna: Ułatwia identyfikację klonalnych populacji limfocytów B biorących udział w rozprzestrzenianiu epitopów, co pomaga w wyborze celów dla interwencji biologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie fotoaktywowanych limfocytów z pojedynczych ośrodków rozmnażania do sortowania cytometrycznego i sekwencjonowania pojedynczych komórek, co umożliwia profilowanie odpornościowe o wysokiej rozdzielczości.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację limfocytów B pochodzących z ośrodka rozmnażania w celu zapewnienia powtarzalności późniejszych analiz molekularnych i funkcjonalnych.
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne odpowiednie do analiz specyficzności antygenowej, sygnalizacji receptorowej oraz ekspansji klonalnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Wspiera ciągłość procesu od odkrycia do walidacji przedklinicznej, umożliwiając analizę mechanistyczną autoreaktywnych limfocytów w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
- Pewność prognostyczna: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennych zależnych (np. częstości klonalnej, stanu aktywacji), które pomagają ocenić stopień związania z celem oraz zredukować ryzyko biologiczne.
- Model przedkliniczny: Model chimery mieszanej służy jako fizjologicznie istotna platforma do oceny interwencji immunomodulacyjnych przed optymalizacją związku wiodącego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, umożliwiając badanie biologii ośrodków rozmnażania w oparciu o postawione hipotezy, wspierając identyfikację wiodących kandydatów poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów autoimmunologicznych oraz zapewniając ciągłość badań przedklinicznych poprzez dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez powiązanie lokalizacji w ośrodku zarodkowym z repertuarem receptorów komórek B i ich stanem funkcjonalnym.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testów dzięki powtarzalnej izolacji fotoaktywowanych komórek B ośrodka zarodkowego w celu analizy swoistości antygenowej i profilowania sygnalizacji.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty z cytometrii przepływowej i sekwencjonowania, które pozwalają na porównanie dynamiki klonalnej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie analizy podzbiorów autoreaktywnych komórek B zgodnej z biomarkerami w spontanicznym modelu autoimmunizacji.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania podzbiorów komórkowych i szlaków molekularnych w immunologii, immuno-onkologii oraz zastosowaniach związanych z komórkami macierzystymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w biologii autoreaktywnych centrów rozmnażania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym przepływom pracy w zakresie fotoaktywacji i izolacji komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, umożliwiając wczesną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów na podstawie wglądów klonalnych i funkcjonalnych z pojedynczych centrów rozmnażania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację wysokopewnościowych celów terapeutycznych dzięki mechanistycznej analizie odpowiedzi autoimmunologicznych.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga doświadczenia w zakresie przeszczepiania szpiku kostnego myszy, mikroskopii dwufotonowej oraz sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej.
- Zależne od specjalistycznej aparatury, w tym laserów dwufotonowych, mikroinjektorów oraz komór z tłuszczem próżniowym do pobierania węzłów chłonnych.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej głębokości fotoaktywacji, czasu trwania oraz sposobów przetwarzania tkanek w celu utrzymania żywotności komórek.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania modelu przy jego zastosowaniu do tkanek innych niż limfatyczne lub w alternatywnych modelach chorób poza autoimmunologią.
- Ograniczone przez złożoność techniczną przygotowania szpiku kostnego oraz czterogodzinne do sześciogodzinne okno czasowe na eksplantację i przetwarzanie w celu zachowania integralności komórek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:16
Bone Harvest
2:26
Bone Marrow Cell Extraction
3:16
Bone Marrow Recipient Reconstitution
4:48
Popliteal Lymph Node Labelling and Harvest
6:54
Single Splenic Germinal Center Identification
8:43
Results: Representative Germinal Center Photoactivation
10:19
Conclusion
