Name: Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę fotoaktywacji w mieszanym modelu chimerycznym autoimmunizacji do badania autoreaktywnych ośrodków rozrodczych. Technika łączy lokalizację komórkową in vivo z analizami molekularnymi w immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SE Degn jest stypendystą Lundbeckfonden i wyróżnionym członkiem Fundacji Carlsberg. Prace te były częściowo dodatkowo wspierane przez grant biomedyczny NNF (SE Degn).

<ol><li>Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+World+Incidence+and+Prevalence+of+Autoimmune+Diseases+is+Increasing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Celiac+Disease%22%5BJournal%5D)">The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing.</a> International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+individual+cells+in+developing+organotypic+brain+slices+revealed+by+the+photoconvertable+protein+Kaede%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede.</a> Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%E2%80%9CKaede%E2%80%9D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+quantification+of+dendritic+cell+migration+and+antigen+trafficking+between+the+skin+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes.</a> Scientific Reports. 4, 6030(2014).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+single-molecule+photoswitching+in+the+GFP-like+fluorescent+protein+Dronpa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Degn, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Evolution+of+Autoreactive+Germinal+Centers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers.</a> Cell. 170 (5), 913-926 (2017).</li>
<li>Berland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+7-dependent+loss+of+B+cell+tolerance+in+pathogenic+autoantibody+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice.</a> Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).</li>
<li>Chatterjee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C4+maintains+peripheral+B-cell+tolerance+in+a+myeloid+cell+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner.</a> European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).</li>
<li>Toubai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+GVHD+by+sex-mismatched+H-Y+antigens+in+the+absence+of+functional+radiosensitive+host+hematopoietic-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+germinal+centers+in+autoimmune+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice.</a> Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).</li>
<li>Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+through+mixed+chimerism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance through mixed chimerism.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępnych jest wiele mysich modeli autoimmunizacji, z których wiele ma spontaniczne centra rozrodcze16. Jednak wiele z dostępnych modeli zawiera złożone tło genetyczne lub mutacje w centralnych regulatorach proliferacji lub aktywacji limfocytów, co sprawia, że nie nadają się one odpowiednio do krzyżowania z liniami reporterowymi i badań nad normalnym zachowaniem limfocytów w autoimmunizacji. Obecny model, przeciwnie, pozwala na podejście "plug-and-play" do dogłębnych analiz autoreaktywnych komórek B centrum rozrodczego pochodzących z dzikiego typu przy użyciu dowolnej pożądanej kombinacji transgenów, nokautów i reporterów, w tym przypadku reprezentowanych przez fotoaktywowaną GFP. Korzystając ze strategii znakowania in vivo, pojedyncze centra rozrodcze można wizualizować w eksplantowanych tkankach limfatycznych i ich składnikach komórkowych fotoaktywowanych za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Limfocyty aktywowane fotoaktywem z pojedynczych centrów rozrodczych mogą być następnie analizowane lub sortowane metodą cytometrii przepływowej, jako pojedyncze komórki lub luzem. Komórki te mogą być następnie poddane dodatkowym analizom molekularnym i funkcjonalnym, aby zapewnić nowe informacje w dziedzinie autoimmunizacji.
Istnieje kilka krytycznych kroków do pomyślnego wykonania tej procedury. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, napromienianie (1100 Rad) i rekonstytucja szpiku kostnego dawcy z powodzeniem zastępują przedział szpiku kostnego biorcy, powodując prawie całkowity chimeryzm w przedziale komórek B. Jest to ważny punkt, ponieważ resztkowe limfocyty B pochodzące od biorcy sprawiłyby, że podzbiór populacji centrum rozrodczego byłby "ciemny". Niezależnie od źródła użytego do napromieniowania, dawka/czas napromieniania musi być zoptymalizowany, aby uzyskać maksymalny efekt mieloablacyjny przy minimalnym ubocznym uszkodzeniu tkanek zwierząt. Stwierdzono, że w przypadku rekonstytucji protokół zgniatania kości i rekonstytucji z 20 milionami komórek dawcy zapewnia wysoki stopień rekonstytucji. Praca w sterylnej i zimnej / na lodzie do ekstrakcji szpiku kostnego zapewnia wysoką żywotność szpiku dawcy. Aby osiągnąć pożądane proporcje szpiku kostnego od dawcy, należy zachować szczególną ostrożność podczas liczenia porcji komórek, zarówno przy samym liczeniu, jak i przy pobieraniu podpróbki szpiku kostnego do liczenia. Mieszanie i kogranulowanie szpiku dawcy, zamiast odwirowywania i ponownego zawieszania oddzielnie, a następnie mieszania, służy zapobieganiu wszelkim odchyleniom w proporcjach dawców po zliczaniu komórek.
Generacja mieszanych chimer szpiku kostnego w protokole może działać samodzielnie i umożliwia generowanie chimer z autoreaktywnymi centrami rozrodczymi z dowolnym pożądanym reporterem, transgenem lub nokautem. Jednak jednym z ograniczeń w tym zakresie jest konieczność korzystania z dawców zgodnych z tkankami histologicznymi. Szczep 564Igi znajduje się na tle kongenicznym C57Bl/6J, w związku z czym pozostali dawcy (dawcy) i biorcy powinni mieć tło kongeniczne H-2b (lub alternatywnie, szczep 564Igi powinien zostać skrzyżowany wstecznie z pożądanym szczepem, a fenotyp autoimmunologiczny zweryfikowany na nowym tle). Procedura napromieniania ma tendencję do faworyzowania środowiska tolerogennego17, a niezgodności niektórych drobnych antygenów zgodności tkankowej mogą być tolerowane. Jednak ten aspekt powinien być dokładnie rozważony, szczególnie w przypadku mieszania dawców i/lub biorców płci męskiej i żeńskiej, ze względu na możliwość reaktywności samic z antygenami Y ograniczonymi dla mężczyzn.
Podobnie, aspekt fotoaktywacji protokołu może występować samodzielnie i może być stosowany w wielu różnych kontekstach. Jednak reporter PA-GFP jest obecnie dostępny tylko z promotorem UBC, który jest aktywny we wszystkich komórkach linii krwiotwórczej, ale nie w komórkach zrębowych. Jak wspomniano we Wprowadzeniu, dostępne są inne fotoaktywowane, fotoprzełączalne lub fotokonwertowalne szczepy reporterowe, które mogą być zastąpione PA-GFP, po odpowiednim dostosowaniu warunków doświadczalnych.
Ważne jest, aby unikać niezamierzonej fotoaktywacji niepożądanych obszarów, utrzymując laser znacznie powyżej 900 nm podczas obrazowania, ponieważ ta długość fali nie spowoduje fotoaktywacji PA-GFP. W przypadku samej fotoaktywacji określone ustawienia, takie jak moc lasera i czas przebywania pikseli, będą zależeć od głębokości tkanki, konkretnej użytej tkanki i systemu obrazowania, a każda aplikacja musi być zoptymalizowana pod kątem konkretnego używanego systemu obrazowania. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić komórek w wyniku fotouszkodzenia, ale jednocześnie konieczne jest uzyskanie skutecznej fotoaktywacji w całym stosie, aby uzyskać wystarczającą reprezentację aktywowanych komórek do dalszych analiz. Komórki B centrum rozrodczego na ogół stanowią od 0,5% do ~ 2% komórek B śledziony lub skórnych węzłów chłonnych, a jak widać z reprezentatywnych wyników (Figura 5), fotoaktywowane pojedyncze komórki B centrum rozrodczego mogą stanowić ~ 1% całkowitej populacji obecnej w pojedynczym wycinku śledziony. W związku z tym pomyślna analiza lub sortowanie znacznej liczby komórek wymaga przetworzenia dużej liczby zdarzeń.

Częstość występowania chorób autoimmunologicznych gwałtownie wzrosła w ostatnich dziesięcioleciach, szczególnie w społeczeństwach zachodnich. Obecnie choroba autoimmunologiczna zajmuje trzecie miejsce na liście najczęstszych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w świecie zachodnim1. Fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i progresji chorób autoimmunologicznych pozostają bez odpowiedzi. Jednym z wymogów postępu w naszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw choroby i dynamiki komórkowej jest precyzyjne sprzężenie mikroanatomicznej lokalizacji podzbiorów komórek z dalszymi analizami molekularnymi lub funkcjonalnymi. W ciągu ostatniej dekady opracowanie wielu stabilnych fotokonwertowalnych, fotoaktywowalnych lub fotoprzełączalnych fluoroforów biologicznych oraz ich integracja ze szczepami reporterowymi umożliwiło precyzyjne mikroanatomiczne znakowanie i śledzenie podzbiorów komórkowych w modelach mysich.
Kaede, fotokonwertowalne białko fluorescencyjne pochodzące z kamiennego koralowca, ulega nieodwracalnej fotokonwersji z zielonej fluorescencji na czerwoną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła fioletowego lub ultrafioletowego2. Początkowo wykorzystany do śledzenia dynamicznego zachowania poszczególnych komórek podczas tworzenia organotypowych wycinków mózgu3, generacja myszy typu knock-in Kaede umożliwiła następnie monitorowanie ruchu komórkowego in vivo, a system został zastosowany do analiz migracji komórek odpornościowych do i z węzłów chłonnych4. To podejście zostało następnie udoskonalone za pomocą drugiej generacji reporter5. Podobnym raportem jest Dendra6, który był ostatnio używany do śledzenia przerzutów do węzłów chłonnych in vivo7.
Pierwszym opracowanym białkiem fotoaktywowanym było zielone białko fluorescencyjne (GFP) z jednopunktową mutacją (T203H), prowadzącą do bardzo niskiej absorbancji w zakresie długości fali od 450 do 550 nm8. Po fotoaktywacji światłem fioletowym, to fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP) zmienia swoje maksimum absorpcji z ~400 na ~500 nm, dając około 100-krotny wzrost intensywności po wzbudzeniu o długości fali 488 nm. Generacja myszy transgenicznych, u których wszystkie komórki hematopoetyczne wykazują ekspresję PA-GFP, pozwoliła po raz pierwszy na dogłębne analizy selekcji komórek B w anatomicznie zdefiniowanych jasnych i ciemnych strefach centrum rozrodczego9.
Podczas gdy fotoaktywacja to nieodwracalna konwersja ze stanu niefluorescencyjnego na stan fluorescencyjny, a fotokonwersja to jednokierunkowe przejście z jednej długości fali na drugą, fotoprzełączalne białka są w stanie przemieszczać się między obydwoma warunkami10. Ta ostatnia zdolność została niedawno wykorzystana do opracowania optycznej kontroli aktywności białek11.
Korzystając z reportera PA-GFP, niedawno scharakteryzowaliśmy repertuar limfocytów B pojedynczych centrów zarodkowych w nowym modelu spontanicznej autoimmunizacji podobnej do tocznia12. Model ten opiera się na mieszanych chimerach z 1 częścią szpiku kostnego zawierającą autoreaktywny receptor komórek B knock-in ze swoistością dla kompleksów rybonuclear-protein (564Igi13,14) w połączeniu z 2 częściami szpiku kostnego od dowolnego pożądanego dawcy. Po około 6 tygodniach od rozpuszczenia uzyskuje się warunki homeostatyczne, w których spontaniczne autoreaktywne centra rozrodcze są obecne w śledzionie i węzłach chłonnych skóry. Warto zauważyć, że populacja komórek B centrum rozrodczego składa się prawie wyłącznie (~ 95%) z komórek pochodzących z przedziału innego niż 564Igi, a te komórki B pochodzące z typu dzikiego stały się autoreaktywne. W związku z tym model umożliwia podejście typu "plug-and-play" do analiz autoreaktywnych komórek B centrum rozrodczego przy użyciu różnych transgenów, nokautów i reporterów. Tutaj opisujemy procedurę generowania mieszanych chimer ze spontanicznymi autoreaktywnymi centrami rozrodczymi wypełnionymi limfocytami przenoszącymi reporter PA-GFP. Korzystając ze strategii znakowania in vivo, pojedyncze centra rozrodcze można wizualizować w eksplantowanych tkankach limfatycznych i ich składnikach komórkowych fotoaktywowanych za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Limfocyty aktywowane fotoaktywem z pojedynczych centrów rozrodczych mogą być następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej lub sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorochromem (FACS) i poddawane dodatkowym analizom molekularnym i funkcjonalnym. Możliwość analizy autoreaktywnych limfocytów z pojedynczych ośrodków rozrodczych może być bezpośrednio zastosowana w celu uzyskania nowych spostrzeżeń w dziedzinie autoimmunizacji, ale opisane techniki i podejścia mogą dodatkowo znaleźć odpowiednie zastosowania w badaniach nad chorobami zakaźnymi i przerzutami nowotworowymi.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało, 9D11-A568</td> Hybrydoma 9D11 <td>generowana we własnym zakresie</td><td>, uprzejmie dostarczona przez MC Carroll, oznaczona zestawem: Przeciwciało Biotium 92255</td>, 9D11-A647 Hybrydoma 9D11 generowana we własnym zakresie, uprzejmie dostarczona przez MC Carroll, oznaczona zestawem: Przeciwciało Nordic Biosite ABD-1031, FITC anty-mysie CD45.1 Biolegend 110705 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało, anty-mysie / ludzki antygen GL7 Pacific Blue (marker aktywacji limfocytów T i B)</td> Przeciwciało <td>144613</td><td></td> <td>Biolegend</td></tr>, <tr><td>przeciwciało anty-mysie CD169 PE (Siglec-1)</td> Przeciwciało <td>142403</td><td></td> <td>Biolegend</td></tr>, <tr><td>przeciwciało PE / Cy7 przeciwko myszom CD38</td><td>Biolegend</td><td>102717</td><td></td></tr>, <tr><td>PerCP / Cy5.5 anty-mysie / ludzkie CD45R/B220</td><td>Biolegend</td><td>103235</td><td></td></tr><tr><td>rurka kapilarna, Owinięty mylarem, heparynizowany</td> sitko <td>Fisher Scientific</td><td>211766</td><td></td></tr><tr><td>Cell, 70 i mikro; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe, 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe, kwadratowe, 22x22 mm, 0,13-0,17 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22X22-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 70%</td><td>VWR</td><td>8301.360</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy, FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy, LSRFortessa SORP</td><td>BD Biosciences-Produkt</td><td></td> <td>na specjalne zamówienie z 4 laserami (405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm)</td></tr><tr><td>Smar, wysoka próżnia, Dow Corning</td><td></td><td>VWR DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr, Burker-T&uuml; rk</td><td>VWR</td><td>630-1544</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, weterynarz IsoFlo.</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do separacji limfocytów (Lympholyte-M Cell Separation Media)</td><td>Cedarlane</td><td>CL5035</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek, 1,5 ml (Eppendorf)</td><td>Mikroskop Sarstedt</td><td>72.690.550</td><td></td></tr><tr><td>, Two-photon</td><td>Prairie Technologies (obecnie Bruker)</td><td>-</td><td>Specjalne zamówienie Ultima In Vivo Two Photon Microscope</td></tr><tr><td>Moździerz z wargą, nieszkliwiony, 75 ml</td><td>VWR</td><td>410-0110</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1063290500</td><td></td></tr><tr><td>Igła, 18 gauge</td><td>BD Medical</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>VWR</td><td>87,769,290</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>d8537</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tłuczka</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek, nieszkliwiony, 175 mm</td><td>VWR</td><td>410-0122</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta, serologiczna, 10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa, plastikowa</td><td>Sarstedt</td><td>861,172,001</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa folia parafinowa (Parafilm M)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Płytka, 96-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne, Student Dumont #5 Kleszcze</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne, Kleszcze Student Dumont #7</td><td>FST - Narzędzia do nauki o sztuce</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, Cienkie nożyczki studenckie, proste</td><td>FST - Narzędzia do nauki o nauce</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 10 ml</td><td>Terumo</td> Strzykawka <td>SS-10ES1</td><td></td></tr><tr><td>, 20 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-05S1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, insulina, 0,3 ml</td><td>BD Medical</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Tribrissen weterynarz 24% inj., zawierająca 200 mg sulfadiazyny i 40 mg trimetoprimu/ml</td><td>MSD 431577</td><td></td><td></td>zdrowia zwierząt</tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>VWR</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik żywotności, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

Choroby autoimmunologiczne stanowią znaczne obciążenie dla zdrowia. Fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i progresji chorób autoimmunologicznych pozostają bez odpowiedzi. Jednym z wymogów postępu w naszym zrozumieniu podstawowych mechanizmów chorobowych i dynamiki komórkowej jest precyzyjne sprzężenie mikroanatomicznej lokalizacji podzbiorów komórek z dalszymi analizami molekularnymi lub funkcjonalnymi; Cel, który tradycyjnie był trudny do osiągnięcia. Opracowanie stabilnych fotoaktywowalnych fluoroforów biologicznych i ich integracja ze szczepami reporterowymi umożliwiło ostatnio precyzyjne znakowanie mikroanatomiczne i śledzenie podzbiorów komórkowych w modelach mysich. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób zdolność do analizy autoreaktywnych limfocytów z pojedynczych centrów rozrodczych może pomóc w dostarczeniu nowych informacji na temat autoimmunizacji, na przykładzie połączenia nowatorskiego chimerycznego modelu autoimmunizacji z fotoaktywowanym reporterem. Demonstrujemy procedurę generowania mieszanych chimer ze spontanicznymi autoreaktywnymi centrami rozrodczymi wypełnionymi limfocytami przenoszącymi fotoaktywowalny reporter białka zielonej fluorescencji. Korzystając ze strategii znakowania in vivo, pojedyncze centra rozrodcze można wizualizować w eksplantowanych tkankach limfatycznych i ich składnikach komórkowych fotoaktywowanych za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Limfocyty aktywowane fotoaktywem z pojedynczych centrów rozrodczych mogą być następnie analizowane lub sortowane metodą cytometrii przepływowej, jako pojedyncze komórki lub luzem, i mogą być poddawane dodatkowym analizom molekularnym i funkcjonalnym. Podejście to może być bezpośrednio zastosowane w celu uzyskania nowych spostrzeżeń w dziedzinie autoimmunizacji, ale procedura generowania chimer szpiku kostnego i procedura fotoaktywacji mogą dodatkowo znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad chorobami zakaźnymi i przerzutami nowotworowymi.

Generowanie mieszanych chimer szpiku kostnego
Niniejszy protokół pozwala na skuteczne uzyskanie mieszanych chimer szpiku kostnego z niemal pełnym chimeryzmem w populacji limfocytów B, co przedstawiono na reprezentatywnym wyniku na Rysunku 1 (istotność statystyczną opisano w 12). Serotypowanie wykazuje znormalizowaną liczbę limfocytów B w 6 tygodniu po rekonstytucji (Rysunek 1A), przy niskiej częstotliwości krążących limfocytów B dodatnich pod względem 9D1 (idiotyp), pochodzących z populacji 564Igi (Rysunek 1B). W obrębie bramki dla wszystkich limfocytów stwierdzono niską częstotliwość pozostałych komórek pochodzących od biorcy, ~6% CD45.1 (Q1), co wskazuje na ogólny stopień chimeryzmu na poziomie ~94% (Rysunek 1C). W obrębie populacji donora (CD45.1-, Q4+Q3) stosunek 564Igi (Q4) do PA-GFP (Q3) wynosi około 23% do 7%. Ten nieco niższy niż początkowy stosunek (3% do 6%) wynika z silnej selekcji negatywnej limfocytów B pochodzących z populacji 564Igi 12. Jak widać na Rysunku 1D, w populacji limfocytów B występuje praktycznie pełny chimeryzm (9,9% CD45.1-) oraz dominacja limfocytów B pochodzących z szpiku kostnego PA-GFP (Q3), co jest konsekwencją silnej selekcji negatywnej limfocytów B pochodzących z 564Igi.
Pobieranie tkanek, przetwarzanie i ocena cytometryczna
Rysunek 2 oraz Rysunek 3 przedstawiają procedury i wyniki eksplantacji świeżo wyizolowanych węzłów chłonnych oraz skrawków śledziony. Rysunek 4 prezentuje reprezentatywny wynik znakowania in vivo i fotoaktywacji pojedynczego obszaru centrum rozmnażania w eksplantowanym skrawku śledziony. Jak widać (Rysunek 4A), znakowanie in vivo CD169-PE pozwoliło na silne oznakowanie strefy marginalnej (na czerwono, oznaczonej jako „MZ”). Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w elementach strukturalnych zawierających kolagen oraz w głównych naczyniach (na niebiesko), w tym w tętniczce centralnej okołotętniczego pierścienia chłonnego (PALS). Silnie autofluoryzujące, aktywowane makrofagi z ciałkami żernymi wiążą się z aktywnością centrum rozmnażania (groty strzałek). Wspólnie identyfikacja strefy marginalnej, PALS oraz makrofagów z ciałkami żernymi pozwala na wyznaczenie obszaru zainteresowania, który prawdopodobnie zawiera pojedyncze centrum rozmnażania. Obszar zainteresowania zostaje poddany fotoaktywacji, co zilustrowano na Rynku 4B. Jak wykazano, fotoaktywacja jest precyzyjna pod względem mikroanatomicznym9, co daje zdefiniowany obszar aktywacji. Przedstawione wyniki służą dodatkowo jako potwierdzenie wysokiej gęstości limfocytów PA-GFP+ w zrekonstruowanych chimerach oraz obecności spontanicznych centrów rozmnażania. Dalsza ocena cytometryczna potwierdza znormalizowaną liczbę komórek w przedziale limfocytów B (Rysunek 5D), obecność populacji spontanicznych centrów rozmnażania (Rysunek 5E) oraz obecność podgrupy limfocytów B centrum rozmnażania, które zostały poddane fotoaktywacji (Rysunek 5F).
W związku z tym niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę generowania mieszanych chimer szpiku kostnego z samoaktywnymi centrami blastycznymi, które składają się głównie z limfocytów B pochodzących od osobników typu dzikiego, niosących fotoaktywowalny reporter. Pozwala to z kolei na późniejsze analizy poszczególnych centrów blastycznych (przegląd graficzny na Rysunku 6).
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, wykresy kropkowe, markery komórkowe, fluorescencja, FSC-H, B20-PerCP-Cy5.5, CD45.1-FITC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Ocena cytometryczna przepływowa stopnia chimeryzmu we krwi mieszanych chimer 564Igi (CD45.1-, PA-GFP-):PA-GFP (CD45.1-, PA-GFP+) u letalnie napromieniowanych biorców CD45.1 (CD45.1+, PA-GFP-), 6 tygodni po rekonstrukcji. AWykres przedstawiający bramkowanie limfocytów B B20+, po wstępnym bramkowaniu singletów limfocytów. B) Podgrupa (subgate) z wykresu A, przedstawiająca częstotliwość występowania komórek 9D1+ (idiotyp) w populacji limfocytów B. C) Wykres PA-GFP w funkcji CD45.1, po wstępnym bramowaniu na limfocyty pojedyncze. D) Wykres PA-GFP w funkcji CD45.1 w podgrupie limfocytów B z wykresu A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Procedura wstrzykiwania do ucha i ekstrakcji tkanek u gryzoni; sekwencja obrazów w zbliżeniu z wynikami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Procedura pobierania i montowania węzłów chłonnych podkolanowych do obrazowania i fotoaktywacji. A) Wykonuje się nacięcie poniżej kolana, przedłużając je aż do stawu biodrowego, a następnie odsuwa brzegi nacięcia na boki, aby odsłonić dół podkolanowy (grot strzałki). B) Nadkładka tłuszczowa zostaje otwarta, a węzeł chłonny podkolanowy zostaje odsłonięty (grot strzałki). C) Węzeł chłonny podkolanowy zostaje wyjęty z dołka. DProcedurę powtórzono dla strony przeciwległej, a oba węzły zamontowano w komorze z osłonką szkiełkiem nakrywkowym i smarem próżniowym, wypełnionej buforem BM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ekstrakcja tkanek; Układ doświadczalny, wynik sekcji, analiza potencjalnego guza, badanie mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Procedura pobierania i montowania śledziony do obrazowania i fotoaktywacji. A) Wykonuje się nacięcie w linii przednio-środkowej tuż poniżej klatki piersiowej, przedłużając je wokół ciała do linii pachowej tylnej, a następnie rozchyla się brzegi nacięcia, aby odsłonić wierzchołek śledziony (grot strzałki). BŚledzionę odsuwa się i wycina, a następnie kroi na cienkie (1-2 mm) plastry, które umieszcza się w komorze z dwustronną okładką szkiełkiem/smarami próżniowymi wypełnionej buforem BM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej: analiza ośrodka rozmnażania, tkanka limfatyczna, powiększona struktura komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Fotoaktywacja. A) Mikrografia dwufotonowa centrum rozmnażania w śledzionie przed fotoaktywacją. Przed pobraniem śledziony wykonano znakowanie in vivo przeciwciałami anty-CD169-PE w celu oznakowania strefy marginalnej (kolor czerwony, oznaczenie „MZ”). Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w strukturach zawierających kolagen, związanych z okliwką i głównymi naczyniami (kolor niebieski). Groty strzałek wskazują silnie autofluorescencyjne, aktywne makrofagi z ciałkami pożerającymi, związane z aktywnością centrum rozmnażania. Obrazowanie wykonano przy pobudzeniu długością fali 940 nm. Pasek skali w lewym górnym rogu wskazuje 200 µm. B) Podobnie jak w punkcie A, ale po fotoaktywacji przy 830 nm. Fotoaktywowane komórki są teraz widoczne (kolor zielony) w określonym obszarze zainteresowania, ograniczonym przez strefę marginalną i obejmującym wcześniej zidentyfikowane makrofagi z ciałkami odchudzeniowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schematy analizy cytometrii przepływowej; identyfikacja limfocytów, singletów, żywych komórek, B20+ oraz komórek B centrum germinalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Analiza cytometryczna przepływowa fotoaktywowanych limfocytów B ośrodka rozmnażania. A) Wykres rozrzutu światła przedniego (forward scatter) względem światła bocznego (side scatter) oraz bramka dla limfocytów. B) Wykres powierzchni rozprosiania przedniego (forward scatter area) jako funkcji wysokości rozprosiania przedniego (forward scatter height) w obrębie bramki limfocytów oraz wynikająca z tego bramka singletów. C) Wykres wykluczenia barwnika żywotności w obrębie bramki singletów oraz wynikowa bramka komórek żywych. D) Bramkowanie limfocytów B20+. E) Gating limfocytów B ośrodka rozmnażania, zidentyfikowanych jako komórki CD38lo GL7hi w obrębie bramki B20+. F) Gating fotoaktywowanych komórek w populacji limfocytów B centrum germinalnego (GC), zidentyfikowanych jako podgrupa komórek koekspresujących nieaktywne i fotoaktywne PA-GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Proces chimeryzmu szpiku kostnego; schemat z wynikami cytometrii przepływowej, serotypowania, fotokonwersji i obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6: Graficzny przegląd protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

Ten fizjologicznie istotny chimeryczny model spontanicznych autoreaktywnych centrów rozrodczych pozwala na powiązanie lokalizacji komórkowej in vivo z dalszymi analizami molekularnymi. Główną zaletą mieszanego chimerycznego modelu autoreaktywnych centrów rozrodczych jest jego wszechstronny i marginalny charakter, pozwalający na badanie praktycznie każdego pożądanego podzbioru komórkowego lub szlaku molekularnego. Fizjologiczne znaczenie tego modelu rozwoju chorób autoimmunologicznych umożliwia nowe spostrzeżenia, które mogą pomóc w rozwoju nowych terapii.Ten model chimery szpiku kostnego może być stosowany w immunologii, immunoonkologii i badaniach nad komórkami macierzystymi. Komponent fotoaktywacji ma szerokie zastosowanie, ponieważ łączy lokalizację tkanki z dalszą analizą komórek. Przygotowanie i rekonstytucja szpiku kostnego oraz etapy znakowania in vivo i eksplantacji tkanek to technicznie złożone procedury, które dobrze nadają się do wizualnych demonstracji.Aby wydobyć kość udową i piszczelową myszy 564Igi dawcy, usuń skórę z jednej tylnej kończyny i wysuń stawy kolanowe i skokowe, mocno ciągnąc za stopę. Przystąp do złamania stawu skokowego. Następnie pociągnij stopę w kierunku ciała, trzymając się za kość piszczelową, pozbawiając w ten sposób ścięgna i mięśnie kości piszczelowej.Złam staw kolanowy, aby uwolnić kość piszczelową i pociągnij kość w kierunku ciała, trzymając się za kość udową, aby usunąć ścięgna i mięśnie z kości udowej. Następnie wykonaj nacięcie w stawie biodrowym i przetnij ścięgna przed wyciągnięciem kości udowej z panewki biodrowej. Po usunięciu przeciwległych kości kończyn tylnych w podobny sposób, ostrożnie przetrzyj kości grubym ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną, a następnie opłucz odcięte kości w lodowatym buforze szpiku kostnego.Następnie użyj kleszczy Dumonta numer siedem, aby przenieść kości do pojemnika ze świeżym buforem szpiku kostnego na lodzie. Aby wyekstrahować komórki szpiku kostnego, przepłucz moździerz w lodowatym buforze szpiku kostnego i użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby zastąpić bufor do przemywania 10 mililitrami świeżego, lodowatego buforu szpiku kostnego. Użyj kleszczy, aby przenieść kości do moździerza i użyj tłuczka, aby zmiażdżyć i zmielić kości, aby uwolnić szpik kostny.Użyj 10-mililitrowej pipety, aby zebrać ekstrakt ze szpiku kostnego przed przepuszczeniem roztworu szpiku kostnego przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki na lodzie. Następnie przepłucz moździerz dodatkowymi 10 mililitrami świeżego, lodowatego buforu szpiku kostnego, aby zapewnić całkowitą regenerację komórek. Aby przygotować zawiesiny dawcy, należy wymieszać odpowiednie objętości fotoaktywowanego GFP i szpiku dawcy 564Igi w 50-mililitrowej stożkowej probówce i zagnieździć komórki przez odwirowanie.Ponownie zawiesić mieszany osad komórkowy w stężeniu od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr lodowatego buforu szpiku kostnego i przenieść komórki do wstępnie schłodzonej, 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie. Następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy biorcy CD45.1 i przesuń rurkę z komórkami szpiku kostnego dawcy, aby zapewnić odpowiednie podwieszenie. Załaduj 200 mikrolitrów mieszanki szpiku kostnego do jednej strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra i rozmiarze 30 i delikatnie rozciągając skórę nad i pod okiem, delikatnie rozciągając skórę nad i pod okiem, aby lekko wysunąć oko.Ostrożnie włożyć końcówkę strzykawki pod kątem około 30 stopni do przedniej części oczodołu, uważając, aby omijać oko i otaczające tkanki. Gdy końcówka igły dotknie kości podkreślającej oczodół, cofnij igłę na około 0,5 milimetra, a następnie użyj stałego nacisku, aby powoli wstrzyknąć szpik kostny dawcy. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce z wodą z antybiotykiem ad libitum, monitorując aż do pełnego wyzdrowienia.Aby oznaczyć węzeł chłonny podkolanowy, rozcieńczyć dwa mikrolitry znakowanego fikoerytryną szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD169 w 18 mikrolitrach PBS i dodać dwie 10-mikrolitrowe kropelki przeciwciała na kawałku plastikowej folii parafinowej. Załaduj każdą kroplę do pojedynczej strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 30 i wstrzyknij 10 mikrolitrów przeciwciała w poduszkę stopy znieczulonego zwierzęcia biorcę. Przed pobraniem węzła chłonnego umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe na płaskiej powierzchni i użyj próżniowej strzykawki o pojemności pięciu mililitrów, wypełnionej smarem, aby obrysować krawędzie szkiełka nakrywkowego smarem około jednego do dwóch milimetrów od każdej krawędzi.Przenieś komorę na zimną, płaską powierzchnię i napełnij komorę na tłuszcz próżniowy lodowatym buforem szpiku kostnego. Aby uzyskać dostęp do węzłów chłonnych podkolanowych, użyj prostych, cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze tuż pod kolanem uśpionego biorcy i przedłuż cięcie w górę wzdłuż linii ścięgna podkolanowego prawie do stawu biodrowego. Używając kleszczy Dumonta numer pięć lub siedem, pociągnij każdy z odsłoniętych płatów skóry na zewnątrz, aby odsłonić tkankę w dole podkolanowym, i użyj kleszczy, aby ostrożnie wejść do dołu tuż przyśrodkowo do żyły podkolanowej.Otwórz i zamknij kleszcze wzdłuż osi nogi, aby odsłonić leżący pod spodem węzeł chłonny podkolanowy, a następnie użyj kciuka i palca wskazującego, aby uszczypnąć mięsień czworogłowy uda od przedniej strony proksymalnie do kolana, aby wysunąć węzeł chłonny z dołu. Wsuń kleszcze pod węzeł chłonny, aby uwolnić węzeł z otaczającej tkanki i umieść go w komorze na tłuszcz próżniowy. Po pobraniu drugiego węzła chłonnego umieść drugie szkiełko nakrywkowe na obrzeżu smaru próżniowego i delikatnie dociśnij, aby zamknąć komorę, uważając, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.Aby zidentyfikować centra rozrodcze w pobranych próbkach tkanki śledziony, umieść komorę obrazowania na stoliku dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego i użyj plastikowej pipety transferowej o pojemności 3,5 mililitra, aby umieścić kroplę wody destylowanej na górnej szkiełku nakrywkowym. Opuść obiektyw aż do punktu kontaktu i użyj przechodzącego światła, aby skupić się na górnej części tkanki. Przełącz się na tryb ciemny i wzbudzenie dwufotonowe, a następnie dostrój laser do 940 nanometrów.Zlokalizuj poszczególne obszary białej miazgi otoczone barwieniem CD169 w pobliżu powierzchni tkanki i zidentyfikuj osłonkę limfoidalną okołotętnikową przez drugą generację harmonicznych związaną z tętniczką centralną. W strefie między osłonką limfoidalną okołotętnikową a strefą brzeżną zidentyfikuj obecność wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagów o barwieniu ciała i, korzystając z tych punktów orientacyjnych, narysuj obszar zainteresowania wokół pojedynczego obszaru centrum zarodkowego. Następnie ustaw stos Z o głębokości około 100 do 150 mikrometrów, zaczynając od powierzchni tkanki i używając kroku o wielkości około trzech mikrometrów, zanim przełączysz się na długość fali wzbudzenia 830 nanometrów.Wyłącz lub przyciemnij wszystkie kanały, aby zapobiec fotouszkodzeniom detektorów, i zobrazuj stos. Następnie przełącz się z powrotem na długość fali wzbudzenia 940 nanometrów i ponownie otwórz kanały, skanując stos, aby potwierdzić wydajną fotoaktywację i brak fotouszkodzeń w całym stosie obrazów. Serotypowanie mieszanych chimer szpiku kostnego ujawnia znormalizowaną liczbę komórek B po sześciu tygodniach od rekonstytucji, z niską częstotliwością krążących komórek B 9D11 pochodzących z przedziału 564Igi.W obrębie całkowitej bramki limfocytów występowała niska częstość występowania szczątkowych komórek pochodzących od biorcy, z których około 6% pochodzi z CD45.1, co wskazuje na ogólny stopień chimeryzmu wynoszący około 94%W przedziale komórek B występował praktycznie całkowity chimeryzm i dominacja fotoaktywowanych komórek B pochodzących ze szpiku kostnego GFP, co jest konsekwencją ciężkiej negatywnej selekcji komórek B pochodzących z 564Igi. Jak zaobserwowano, znakowanie in vivo za pomocą CD169 ułatwia solidną wizualizację strefy brzeżnej. Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w elementach strukturalnych zawierających kolagen i głównych naczyniach, w tym w centralnej tętniczce okołotętniczkowej osłonki limfatycznej i wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagach zabarwiających ciało związanych z aktywnością centrum zarodkowego.Podsumowując, dane te pozwalają na identyfikację obszaru zainteresowania, który prawdopodobnie zawiera pojedyncze, fotoaktywowane centrum rozrodcze. Ocena cytometrii przepływowej w dół dodatkowo potwierdza obecność znormalizowanej liczby przedziałów komórek B, spontanicznej populacji centrum rozrodczego i podzbioru fotoaktywowanych komórek B centrum rozrodczego. Ważne jest, aby ograniczyć całkowity czas realizacji etapów eksplantacji, fotoaktywacji i przetwarzania tkanek do czterech do sześciu godzin, aby zapewnić wystarczającą żywotność komórek.Fotoaktywowane komórki można sortować przepływowo i poddawać sekwencjonowaniu pojedynczych komórek, aby na przykład scharakteryzować repertuar receptorów komórek B pojedynczego centrum rozrodczego. Model chimery mieszanej pozwolił na zbadanie biologii autoreaktywnych centrów rozrodczych na nowej głębokości, na przykład dostarczając informacji o tym, jak przebiega proces rozprzestrzeniania się epitopów. Należy pamiętać, że źródłem światła do mikroskopii dwufotonowej są bardzo silne lasery impulsowe klasy 4, które mogą poważnie uszkodzić oczy.

interrogating-individual-autoreactive-germinal-centers

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W modelu zwierzęcym opisanym w niniejszej pracy, oczyszczone przeciwciała IgG przeciwko fragmentowi 200 aminokwasów (aa 757-967) kolagenu VII są wielokrotnie wstrzykiwane myszom, co pozwala na odtworzenie fenotypu pęcherzowego oraz cech histopatologicznych i immunopatologicznych charakterystycznych dla ludzkiego nabytego prątka pęcherzowego (EBA)1.

Granulocytozależne pęcherzowanie skóry indukowane autoprzeciwciałami

Ten film demonstruje metodę oceny alloreaktywności w mieszanych populacjach limfocytów T poprzez obserwację interakcji z komórkami dendrytycznymi przenoszącymi alloantygen, prowadzących do powstania synaps immunologicznych. Barwienie różnicowe i kwantyfikacja dubletów zawierających synapsy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia alloreaktywność limfocytów T.

Pomiar alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Tutaj opisujemy proteomiczne podejście pojedynczej komórki do oceny immunologicznych zmian fenotypowych i funkcjonalnych (indukcja cytokin wewnątrzkomórkowych) w próbkach krwi pełnej z obwodu, analizowanych za pomocą cytometrii masowej.

Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Poznaj metodę fotoaktywacji w mieszanym modelu chimerycznym autoimmunizacji do badania autoreaktywnych ośrodków rozrodczych. Technika łączy lokalizację komórkową in vivo z analizami molekularnymi w immunologii.

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji (Wideo) | JoVE Journal

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

Przeglądaj więcej filmów